專利名稱：一種辛德畢斯病毒xj-160缺陷型復(fù)制子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種辛德畢斯病毒XJ-160缺陷型復(fù)制子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別是涉及一種含有報(bào)告基因的辛德畢斯病毒缺陷型復(fù)制子及其構(gòu)建過(guò)程，以及利用該缺陷型復(fù)制子進(jìn)行甲病毒檢測(cè)的方法
背景技術(shù)：
甲病毒屬病毒(Alphavirus)是一類由蚊蟲(chóng)傳播的蟲(chóng)媒病毒，包括30多個(gè)成員，可 引起人類或哺乳動(dòng)物發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)炎、嚴(yán)重腦炎癥狀乃至神經(jīng)錯(cuò)亂或死亡，是一類對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生危害嚴(yán)重的病原體。該屬病毒具有世界性分布的特點(diǎn)，經(jīng)常引起大流行，例如基孔肯亞病毒(Chikungunya Virus, CHIK)引發(fā)的基孔肯亞熱自1999年以來(lái)在非洲、亞洲和印度次大陸多次暴發(fā)；又如西部馬腦炎、東部馬腦炎和委內(nèi)瑞拉馬腦炎常年流行于北美洲。另外，西部馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus,WEEV)、東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus, EEEV)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VenezuelanEquine Encephalitis Virus, VEEV)等烈性甲病毒被列為病毒性生物戰(zhàn)劑。因此，建立針對(duì)所有甲病毒病原體的早期快速甄別和篩查技術(shù)具有重要意義。辛德畢斯病毒(Sindbisvirus, SINV)是甲病毒屬的代表病毒。SINV的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、復(fù)制和翻譯等功能及發(fā)病機(jī)理均集中體現(xiàn)了動(dòng)物病毒的特征，已成為研究動(dòng)物病毒基本規(guī)律的模型病毒。SINV基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約11.7kb。全基因組共有兩個(gè)開(kāi)放讀碼框架，非結(jié)構(gòu)蛋白開(kāi)放讀碼框位于基因組5'端前2/3區(qū)，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；結(jié)構(gòu)蛋白開(kāi)放讀碼框位于病毒基因組3'端1/3區(qū)，編碼結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白、包膜蛋白E1、E2。甲病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制及結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)中起著非常重要作用。XJ-160病毒是1990年夏天從我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)伊犁地區(qū)霍城縣境內(nèi)捕獲的按蚊(Anopheles)中分離到的一株辛德畢斯病毒。我們課題組對(duì)該病毒株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定(GenBankAF103728)，構(gòu)建了該病毒的感染性克隆(見(jiàn)CN 200310115457. 9XJ-160病毒感染性全基因組cDNA克隆)。為了建立一種針對(duì)所有甲病毒的快速檢測(cè)方法，我們構(gòu)建了含有報(bào)告基因的非結(jié)構(gòu)基因區(qū)域部分缺失的XJ-160病毒缺陷型復(fù)制子。經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)利用缺陷型辛德畢斯病毒復(fù)制子進(jìn)行甲病毒檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種辛德畢斯病毒XJ-160缺陷型復(fù)制子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本檢測(cè)方法有較好的廣譜性，能夠檢測(cè)多種甲病毒感染；操作簡(jiǎn)單快速，所需儀器少，適于快速初篩；特異性高，只對(duì)甲病毒感染有反應(yīng)，對(duì)其它病毒感染沒(méi)有反應(yīng)；較高靈敏度，可以檢測(cè)到IPFU的病毒；直觀性強(qiáng)，可在熒光顯微鏡下直接觀察病毒感染情況；可持續(xù)性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)不需殺死病毒，可以對(duì)病毒繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)并分離活的病毒進(jìn)行下一步分析。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明的機(jī)理是由于非結(jié)構(gòu)基因區(qū)域存在部分缺失，該缺陷型復(fù)制子導(dǎo)入細(xì)胞后報(bào)告基因不能正常大量表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞中存在甲病毒感染時(shí)，病毒表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白可以彌補(bǔ)并反式作用于缺陷型復(fù)制子導(dǎo)致報(bào)告基因的大量表達(dá)。因此，本系統(tǒng)可以用于甲病毒感染的快速檢測(cè)。XJ-160缺陷型復(fù)制子的構(gòu)建方案為①XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體的構(gòu)建將辛德畢斯病毒XJ-160的全基因組序列中的結(jié)構(gòu)基因替換為多克隆位點(diǎn)(multiple clone sites，MCS)，將該片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl中構(gòu)建XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體pVa-XJ ；②含報(bào)告基因的XJ-160質(zhì)粒型復(fù)制子的構(gòu)建在質(zhì)粒型復(fù)制子載體的多克隆位點(diǎn)處分別插入兩種報(bào)告基因，即綠色突光蛋白基因(Enhanced green fluorecentprotein, EGFP)和海腎突光素酶基因(Gaussia Luciferase, GLUC),構(gòu)建XJ-160病毒報(bào)告基因標(biāo)記型復(fù)制子質(zhì)粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC ；
③XJ-160缺陷型復(fù)制子的構(gòu)建利用Acl I限制性內(nèi)切酶分別單酶切PVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，構(gòu)建非結(jié)構(gòu)基因處存在1139個(gè)堿基缺失的缺陷型質(zhì)粒pVaXJ-EGFP Λ和pVaXJ-GLUCΔ。一、缺陷型復(fù)制子pVaXJ-EGFP Λ的序列GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA 60ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 120ACTTACGGTA MTGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT 180AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA 240CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 300CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT 360ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT 420GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 480TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC 540AMATGTCGT MCAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA 600GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA 660AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CATTGACGGC GTAGTACACA 720CTATTGMTC MACAGCCGA CCAATAGCAC TACCATCATA ATGGAGAGGC CTGTAGTTAA 780CGTAGACGTA GACCCCCAGA GTCCGTTTGT CGCTCAACTG CAAAAGAGCT TCCCGCAATT 840CGAGGTAGTA GCACAGCAGG CCACACCAAA TGACCATGCT AATGCCAGAG CATTTTCGCA 900TCTGGCTAGT MATTMTCG AGCTGGAGGT TCCTACCACA GCGACGATTT TGGACATAGG 960CAGCGCACCG GCTCGTAGAA TGTTTTCCGA GCACCACTAT CACTGCGTCT GCCCTATGCG 1020GAGCCCCGAA GATCCCGACC GTATGATGAA ATACGCCAAT AAGTTGGCGG AGAAGGCAAA 1080TAAGATTACT AATAAAAATT TGCATGAGAA GATTAAAGAC CTCCGGATCG TACTCGATAC 1140TCCGGATGCT GAGACACCGT CGCTCTGCTT CCATAATGAC GTTACCTGCA GTACGCGTGC 1200AGAGTACTCC GTTATGCAAG ATGTGTATAT TAATGCACCC GGAACTATTT ACCATCAAGC 1260TATGAAAGGC GTGCGGACAC TTTACTGGAT TGGGTTTGAC ACCACTCAGT TCATGTTCTC 1320GGCTATGGCA GGATCATATC CTGCCTATAA TACTAACTGG GCCGATGAAA AAGTCCTTGA 1380
權(quán)利要求
1.一種辛德畢斯病毒XJ-160缺陷型復(fù)制子PVaXJ-EGFP Δ，其特征在于其序列為
2. 一種辛德畢斯病毒XJ-160缺陷型復(fù)制子pVaXJ-GLUC A，其特征在于
3.一種權(quán)利要求I或2所述的一種辛德畢斯病毒XJ-160缺陷型復(fù)制子的構(gòu)建方法，其特征在于 ①XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體的構(gòu)建將辛德畢斯病毒XJ-160的全基因組序列中的結(jié)構(gòu)基因替換為多克隆位點(diǎn)MCS，將該片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl中構(gòu)建XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體PVa-XJ ； ②含報(bào)告基因的XJ-160質(zhì)粒型復(fù)制子的構(gòu)建在質(zhì)粒型復(fù)制子載體的多克隆位點(diǎn)處分別插入兩種報(bào)告基因，即綠色熒光蛋白基因EGFP和海腎熒光素酶基因GLUC，構(gòu)建XJ-160病毒報(bào)告基因標(biāo)記型復(fù)制子質(zhì)粒PVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC ； ③XJ-160缺陷型復(fù)制子的構(gòu)建利用AclI限制性內(nèi)切酶分別單酶切pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，構(gòu)建非結(jié)構(gòu)基因處存在1139個(gè)堿基缺失的缺陷型質(zhì)粒pVaXJ-EGFP Λ和pVaXJ-GLUCΔ。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的缺陷型復(fù)制子的構(gòu)建方法，其特征在于所述的MCS序列為5，-CTCGAGCGCGCGGCCGCGATCGGCCGGCCTTAATTAAGGCGCGCCTCTTTTA TCAATTAACCAAAATTTTGTTTTTAACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAGGGCCCCCTTT-3，。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求I或2所述的缺陷型復(fù)制子檢測(cè)甲病毒的方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的缺陷型復(fù)制子檢測(cè)甲病毒的方法，其特征在于它包括以下步驟 1)細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中培養(yǎng)BHK細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿80% 90%時(shí)待用； 2)轉(zhuǎn)染缺陷型復(fù)制子質(zhì)粒使用羅氏公司的FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將O. 5ug的缺陷型復(fù)制子轉(zhuǎn)入BHK細(xì)胞，分為兩組，一組轉(zhuǎn)染pVaXJ-EGFP Δ，另一組轉(zhuǎn)染pVaXJ-GLUC Δ，同時(shí)設(shè)立不轉(zhuǎn)染復(fù)制子也不感染病毒的空白對(duì)照和只轉(zhuǎn)染復(fù)制子不感染病毒的對(duì)照； 3)樣品感染細(xì)胞轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，取200uL待測(cè)樣品加入細(xì)胞，吸附I小時(shí)后，每孔補(bǔ)加300uL培養(yǎng)基。
4)收樣轉(zhuǎn)染pVaXJ-GLUCΛ的組，每隔一定時(shí)間從細(xì)胞板的各孔中吸取20uL上清液加入I. 5mL的EP管中，置于_20°C冰箱，用于熒光素酶GLUC活性測(cè)定； 5)轉(zhuǎn)染pVaXJ-GLUCΛ的組進(jìn)行GLUC活性測(cè)定；轉(zhuǎn)染了 pVaXJ-EGFP Λ的組在熒光顯微鏡下進(jìn)行綠色熒光觀察。
全文摘要
本發(fā)明提供一種辛德畢斯病毒XJ-160缺陷型復(fù)制子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，其構(gòu)建包括XJ-160病毒質(zhì)粒型復(fù)制子載體pVa-XJ的構(gòu)建；含報(bào)告基因的XJ-160質(zhì)粒型復(fù)制子pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC的構(gòu)建；XJ-160缺陷型復(fù)制子的構(gòu)建利用Acl I限制性內(nèi)切酶分別單酶切pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，構(gòu)建非結(jié)構(gòu)基因處存在1139個(gè)堿基缺失的缺陷型質(zhì)粒pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ。本發(fā)明的機(jī)理是由于非結(jié)構(gòu)基因區(qū)域存在部分缺失，該缺陷型復(fù)制子導(dǎo)入細(xì)胞后報(bào)告基因不能正常大量表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞中存在甲病毒感染時(shí)，病毒表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白可以彌補(bǔ)并反式作用于缺陷型復(fù)制子導(dǎo)致報(bào)告基因的大量表達(dá)。本XJ-160缺陷型復(fù)制子能夠檢測(cè)多種甲病毒，對(duì)于非甲病毒無(wú)反應(yīng)，特異性高；具有較高靈敏度，可以檢測(cè)到1PFU的病毒；操作簡(jiǎn)單快速，所需儀器少；可持續(xù)性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)不需殺死病毒，適于快速監(jiān)別甲病毒。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102816781SQ20111015633
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者梁國(guó)棟, 朱武洋, 付士紅 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所