專利名稱：一種生物法多級定向轉化鄰甲酚的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及用生物法轉化鄰甲酚類化合物的方法。
背景技術：
甲酚類化合物是酚類化合物中具有代表性的一種物質，是生產殺螟松、倍硫磷、速滅威、二氯苯醚菊酯等殺蟲劑以及彩色膠片、樹脂、增塑劑和香料合成的中間體，具有強烈的腐蝕性及毒性，被美國EPA列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的名單。關于含甲酚廢水的處理方法，與物化法相比較，生物法具有經濟、安全、處理閾值低、殘留少、無二次污染等方面的優(yōu)點。目前，人們在無害化生物降解甲酚類化合物研究中，發(fā)現在甲酚類化合物污染的土壤、水體中存在的很多細菌、真菌、藻類及水生動植物都具有降解甲酚的能力，在好氧微生物治理過程中，幾乎所有的甲酚類化合物被微生物不同程度的氧化/降解為小分子化合物(X)2和H2O。同時，研究發(fā)現微生物代謝甲酚類化合物能夠形成二醇類、苯甲酸及粘糠酸半醛類中間產物，而這些物質正是現代化工、制藥工業(yè)中的重要有機中間體，應用前景十分廣泛。因此，對鄰甲酚及其同系物的污染物的處理可以從傳統(tǒng)意義上的降低COD、將污染物完全降解礦化為(X)2和H2O,改變?yōu)樯捎杏弥虚g體的生物轉化，以最大程度地實現污染物資源化。2002年，BUhler等利用惡臭假單胞菌Pseudomonas putida mt_2的二甲苯單加氧酶基因工程菌多級轉化甲苯和偏甲基苯，分別生成相應的醇和醛。(Characterization and Application of Xylene Monooxygenase for MultistepBiocatalysis. Applied Environmental Microbiology, 2002,68 :560-568)該工程菌對底物的多級轉化是通過二甲苯單加氧酶基因對甲基進行三步轉化生成相應羧酸。這種多級生物轉化方法很難控制各級轉化過程，該方法在轉化過程中，未轉化的底物如甲苯和偏甲基苯抑制了第二步和第三步轉化反應，第二步轉化所得的相應的醇類抑制了第三步反應，很難實現甲苯和偏甲基苯可控、定向轉化。大連理工大學從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. W1，結合生理生化鑒定、菌株的形態(tài)觀察、Biolog鑒定及16S rDNA 序列分析，該菌株屬于ArthrcAacter種屬，在GenBank中的注冊號為EU339930。曲媛媛等人在 Applied Biochemistry and Biotechnology (159 (3). 623-633，2009)上發(fā)表題為“Biodegradation of Mixed PhenolicCompounds Under High Salt Conditions and Salinity Fluctuations byArthrobacter sp. Wl”的文章中提到，該菌能在溫度20 30°C， PH 5. O 9. O和鹽度10 100g/L NaCl條件下以苯酚為唯一碳源進行生長，能夠降解鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、苯甲酸、水楊酸、對甲基酚、氨基酚、對苯二酚等多種芳香化合物。根據苯酚羥化酶的保守序列合成一對引物，以ArthrcAacter sp. Wl的基因組DNA為模板，通過PCR反應，擴增出的基因保守序列，再根據該苯酚羥化酶基因保守序列，采用染色體步移的方法，獲得了總長為^90bp的ArthrcAacter sp. Wl菌株的苯酚羥化酶基因全長序列，其Genbank注冊號為FJ610336。由該基因構建的基因工程菌對酚類同系物具有降解作用。大連理工大學從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到高效的聯(lián)苯降解菌株Dyella ginsengisoli sp. LA-4，結合生理生化鑒定、菌株的形態(tài)觀察、Biolog鑒定及16S rDNA序列分析，該菌株歸屬于Dyellaginsengisoli種屬，其16S rDNA序列在GenBank中的注冊號為EF1913M。該菌株已保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，入冊編號為CGMCC No. 2723。利用染色體步移的方法從菌株LA-4的基因組DNA中擴增得到完整的bph基因簇，全長為12186bp，全序列登錄GenBank，序列號為EU258607，其中聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因BphC為bph基因簇中的5281bp到61%bp。由該基因構建的基因工程菌能將3-甲基兒茶酚、兒茶酚、4-氯兒茶酚和4-甲基兒茶酚轉化為相應的粘康酸類物質。上述兩種菌株的發(fā)現及其相關基因工程菌的構建，為鄰甲酚類化合物的生物轉化提供了有效的微生物資源。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的，是提供一種利用苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，實現鄰甲酚可控的、多級定向轉化的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的一種生物法多級定向轉化鄰甲酚方法，其特征在于，采用苯酚羥化酶基因工程菌 PH_IND全細胞，對鄰甲酚進行第一級生物轉化，得到的產物為3-甲基兒茶酚，然后采用聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4全細胞，對3-甲基兒茶酚進行第二級生物轉化；生物轉化反應液成分和含量及反應條件為第一級生物轉化反應時，反應液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_IND全細胞干重為 20 40g/L，鄰甲酚濃度為50 700mg/L，葡萄糖濃度為5 40mmol/L ；在20 40°C溫度下，控制搖床轉速為50 200r/min，振蕩反應時間為10 MOmin ；第二級生物轉化反應時，在第一級生物轉化反應后的反應液中加入全細胞干重為20 40g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在20 40°C溫度下，控制搖床轉速為50 200r/min，振蕩反應時間為5 50min。苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind是通過獲取高效苯酚降解菌ArthrcAactersp. Wl中苯酚羥化酶基因全長序列，連接至載體質粒(pET28a (+) Vector)，并轉化至宿主細胞大腸桿菌中構建的，該工程菌PH_ind經擴大培養(yǎng)即得全細胞培養(yǎng)物，能夠作為全細胞催化劑對鄰甲酚及其同系物進行生物轉化。高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. Wl是從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,入冊編號為CGMCC No. 4763，該菌株的16SrDNA序列的GenBank注冊號為EU339930 ；通過PCR反應，擴增獲得高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. Wl的苯酚羥化酶基因保守區(qū)序列，并采用染色體步移法獲取未知的側翼序列，得到含有6個閱讀框、按KLMNOP六組分順序排列的M90bp苯酚羥化酶基因全長序列，其Genbank注冊號為FJ610336。聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA_4，是通過獲取高效聯(lián)苯降解菌Dyella ginsengisoli LA-4中的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因，連接至載體質粒(pEI^8a(+) Vector)， 并轉化至宿主細胞大腸桿菌中構建的，該工程菌BphC_LA-4經擴大培養(yǎng)即得全細胞培養(yǎng)物，能夠將3-甲基兒茶酚及其同系物轉化為粘糠酸類物質；高效聯(lián)苯降解菌株Dyella ginsengisoli sp. LA-4是從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，入冊編號為CGMCC No. 2723，該菌株的 IBSrDNA序列的GenBank注冊號為EF191354，利用染色體步移的方法從該菌株的基因組DNA 中擴增得到完整的bph基因簇，全長為12186bp，其Genbank注冊號為EU258607，其中聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因BphC為bph基因簇中的5281bp到61%bp。上述第一級生物轉化是通過工程菌PH_ind的苯酚羥化酶作用，將鄰甲酚轉化為 3-甲基兒茶酚，第二級生物轉化是通過工程菌BphC_LA_4的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶作用，將 3-甲基兒茶酚轉化為粘糠酸類物質。生物轉化的反應液成分、含量和反應條件最佳參數為第一級生物轉化反應時，反應液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind全細胞干重為35 40g/L，鄰甲酚濃度為75 125mg/ L,葡萄糖濃度為15 20mmol/L，在25 35°C溫度下，控制搖床轉速為100 180r/min，振蕩反應時間為180 MOmin ；第二級生物轉化反應時，在第一級生物轉化反應后的反應液中加入全細胞干重為30 35g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在25 35°C溫度下，控制搖床轉速為100 180r/min，振蕩反應時間為30 40min。生物轉化反應前，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4的擴大培養(yǎng)按常規(guī)條件進行。擴大培養(yǎng)苯酚羥化酶基因工程菌PH_im時，首先將工程菌PH_im接種到固體平板 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)(即平板活化種子)，再將其接種到液體LB培養(yǎng)基中，制得種子培養(yǎng)液， 然后按體積百分比2 5%的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長至對數期 OD600 = 0 . 4 0. 6，加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，誘導2h，離心收集菌體，經 PH值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其全細胞干重達到20 40g/L。擴大培養(yǎng)工程菌BphC_LA_4的條件與工程菌PH_IND的基本相同，但在加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG后需誘導3h，再離心收集菌體。本發(fā)明的多級定向轉化鄰甲酚的方法反應條件溫和、產物單一、提取步驟簡單，可對產物進行資源化回收利用，使生產過程定向可控，生產周期短，成本低，生產清潔，適合工業(yè)生產和應用。該方法也可以用于多級定向轉化鄰甲酚的同系物對甲酚和間甲酚。


圖1為本發(fā)明第一級生物轉化反應時，3-甲基兒茶酚的生成量(mg/mL)隨工程菌 PH_IND全細胞干重(g/L)變化的曲線，其他參數不變。圖2為本發(fā)明第二級生物轉化反應時，3-甲基兒茶酚的轉化率(％ )隨工程菌 BphC_LA-4全細胞干重(g/L)變化的曲線，其他參數不變。圖3為本發(fā)明生物轉化反應時3-甲基兒茶酚的生成量(曲線a，mg/L)和3_甲基兒茶酚轉化率(曲線b，%)隨鄰甲酚濃度(mg/L)變化的曲線，其他參數不變。圖4為本發(fā)明生物轉化反應時3-甲基兒茶酚的生成量(mg/L)隨時間變化的曲線，其他參數不變。圖5為本發(fā)明生物轉化反應時3-甲基兒茶酚轉化率(％ )隨時間變化的曲線，其他參數不變。
本發(fā)明涉及的高效聯(lián)苯降解菌的生物保藏信息保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)大屯路、中國科學院微生物研究所，日期為 2008 年 10 月 24 日，編號 CGMCC No. 2723，分類命名為=Dyella ginsengisoli ；
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級定向轉化鄰甲酚，并考察部分參數對3-甲基兒茶酚的生成量和轉化率的影響。工程菌PH_ind和工程菌BphC_LA_4擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基，配方為 10g/L NaCl, 10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，調節(jié)pH至7. 0 7. 2，121°C條件下滅菌 20min，培養(yǎng)基冷卻后添加終濃度為10 20mmol/L卡那霉素作為抗生素。固體平板培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基基礎上添加15 20g/L瓊脂?；蚬こ叹臄U大培養(yǎng)和生物轉化鄰甲酚反應步驟和參數如下1、分別將工程菌ΡΗ_ΙΝΙ^Π工程菌BphC_LA_4接種到固體平板LB培養(yǎng)基上，于 37°C靜置培養(yǎng)2天，4°C冰箱保存，作為平板活化種子；2、將步驟1所得的工程菌PH_im和工程菌BphC_LA_4的平板活化種子分別接種到液體LB培養(yǎng)基中，在30°C下150r/min振蕩培養(yǎng)12h，制得種子培養(yǎng)液；3、使用步驟2所得的工程菌PH_im種子培養(yǎng)液，按體積百分比2 5%的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長至對數期(0D· = 0. 4 0. 6)，加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，誘導2h，誘導至OD600 = 1. 0 1. 2，離心收集菌體，經pH 值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重為35g/L ；使用步驟2所得的工程菌BphC_LA-4種子培養(yǎng)液，按體積百分比2 5% 的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長至對數期(0D_ = 0. 4 0. 6)，加入 80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，誘導3h，離心收集菌體，經pH值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重為30g/L ；4、制備鄰甲酚溶液(IOg鄰甲酚溶于IOOmL無菌水)，然后用濾膜過濾除菌，使溶液中鄰甲酚濃度為lX105mg/L;5、制備葡萄糖儲備液，取198. 16g葡萄糖溶于IL去離子水，儲備液中葡萄糖濃度為 lmol/L ；6、第一級生物轉化反應在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制備出的工程菌PH_ IND全細胞、步驟4制備出的鄰甲酚溶液20 μ L、步驟5制備出的葡萄糖儲備液400 μ L，使反應液中鄰甲酚的濃度為100mg/L，葡萄糖的濃度為20mmol/L(加入鄰甲酚和葡萄糖后反應液中的工程菌PH_ind全細胞干重變化很小，可以忽略不計)，在30°C下，搖床轉速150r/min， 振蕩反應180min ；7、第二級生物轉化反應在第一級生物轉化后的反應液中加入5mL全細胞干重為 30g/L的工程菌BphC_LA-4，在30°C溫度下，控制搖床轉速在150r/min，振蕩反應30min。測定3-甲基兒茶酚的生成量和3-甲基兒茶酚轉化率第一級生物轉化反應結束時，取2mL反應液，利用濃鹽酸調節(jié)反應液pH值至2. 0， 然后以等體積的乙醚萃取2次，用旋轉蒸發(fā)器濃縮蒸干，放入-20°C冰箱備用。檢測時以氯仿(液體)二甲基甲酰胺(液體)=2 1(體積比，共3mL)回溶旋轉蒸發(fā)器濃縮蒸干的產物，并用0. 22 μ m有機膜過濾；第二級生物轉化反應結束時，取2mL反應液，利用濃鹽酸調節(jié)反應液PH值至2. 0，然后以等體積的乙醚萃取2次，用旋轉蒸發(fā)器濃縮蒸干，放入_20°C 冰箱備用。檢測時以氯仿(液體)二甲基甲酰胺(液體)=2 1(體積比，共3mL)回溶旋轉蒸發(fā)器濃縮蒸干的產物，并用0. 22 μ m有機膜過濾；利用Agilent 1100高效液相色譜儀檢測第一、二級反應萃取液，檢測波長276nm，流速1. OmL/min，進樣量為10 μ L，柱溫為室溫；流動相A為甲醇，流動相B為超純水。每個樣品的測定時間為30min，其中第1 20min 時，流動相A為30 40%，流動相B為70 60%，第20. 10 30min時流動相A為30%， 流動相B為70%。測得第一級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的生成量為83. 51mg/L，第二級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的轉化率為99%。最后，就全細胞干重、鄰甲酚濃度、反應時間對3-甲基兒茶酚的生成量、3-甲基兒茶酚的轉化率的影響進行實驗，結果如下1)當其他參數采用本實施例的數值時，3-甲基兒茶酚的生成量隨工程菌PH_ind全細胞干重變化的曲線如圖1所示。2)當其他參數采用本實施例的數值時，3-甲基兒茶酚轉化率隨工程菌BphC_LA_4 全細胞干重變化的曲線如圖2所示。3)當其他參數采用本實施例的數值時，3-甲基兒茶酚的生成量和3-甲基兒茶酚轉化率隨鄰甲酚濃度變化的曲線如圖3 (a, b)所示。如圖3 (a)所示，當鄰甲酚濃度為IOOmg/ L時，3-甲基兒茶酚的生成量最大；從圖3(b)可以看出，3-甲基兒茶酚轉化率均在98%以上。4)當其他參數采用本實施例的數值時，3-甲基兒茶酚的生成量和3-甲基兒茶酚轉化率隨時間變化的曲線如圖4和圖5所示。實施例2，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級定向轉化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴大培養(yǎng)和生物轉化鄰甲酚反應步驟1 5同實施例1，通過控制所收集的菌體質量使步驟3制得的工程菌PH_ind全細胞干重為20g/L，工程菌BphC_LA-4全細胞干重為25g/L。第一級生物轉化反應在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液15 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲備液600 μ L，使反應液中鄰甲酚的濃度為50mg/L，葡萄糖的濃度為30mmol/L，在40°C下，搖床轉速180r/min，振蕩反應 60mino第二級生物轉化反應在第一級生物轉化后的反應液中加入5mL全細胞干重為 25g/L的工程菌BphC_LA-4，在40°C溫度下，控制搖床轉速在180r/min，振蕩反應5min。按實施例1所述的測量方法，測得第一級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的生成量為 30. 51mg/L，第二級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的轉化率為84%。實施例3，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級定向轉化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴大培養(yǎng)和生物轉化鄰甲酚反應步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的工程菌PH_ind全細胞干重為25g/L，工程菌BphC_LA-4全細胞干重為 20g/L。第一級生物轉化反應在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液40 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲備液100 μ L，使反應液中鄰甲酚的濃度為200mg/L，葡萄糖的濃度為5mmol/L，在35°C下，搖床轉速200r/min，振蕩反應 240min ；第二級生物轉化反應在第一級生物轉化后的反應液中加入5mL全細胞干重為 20g/L的工程菌BphC_LA-4，在35°C溫度下，控制搖床轉速200r/min，振蕩反應50min。按實施例1所述的測量方法，測得第一級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的生成量 44. 38mg/L，第二級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的轉化率95%。實施例4，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級定向轉化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴大培養(yǎng)和生物轉化鄰甲酚反應步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的工程菌PH_ind全細胞干重為30g/L，工程菌BphC_LA-4全細胞干重為 40g/L。第一級生物轉化反應在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液140 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲備液300 μ L，使反應液中鄰甲酚的濃度為700mg/L，葡萄糖的濃度為15mmol/L，在25°C下，搖床轉速50r/min，振蕩反應 120min ；第二級生物轉化反應在第一級生物轉化后的反應液中加入5mL全細胞干重為 40g/L的工程菌BphC_LA-4，在25°C溫度下，控制搖床轉速在50r/min，振蕩反應20min。按實施例1所述的測量方法，測得第一級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的生成量 17. 45mg/L，第二級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的轉化率98%。實施例5，苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind和聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多級定向轉化鄰甲酚。LB培養(yǎng)基配方及基因工程菌的擴大培養(yǎng)和生物轉化鄰甲酚反應步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的工程菌PH_ind全細胞干重為40g/L，工程菌BphC_LA-4全細胞干重為 35g/L。第一級生物轉化反應在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的工程菌PH_IND 全細胞，步驟4制備的鄰甲酚溶液40 μ L，步驟5制備的葡萄糖儲備液400 μ L，使反應液中鄰甲酚的濃度為125mg/L，葡萄糖的濃度為40mmol/L，在20°C下，搖床轉速lOOr/min，振蕩反應IOmin ；第二級生物轉化反應在第一級生物轉化后的反應液中加入5mL全細胞干重為 35g/L的工程菌BphC_LA-4，在20°C溫度下，控制搖床轉速在lOOr/min，振蕩反應40min。按實施例1所述的測量方法，測得第一級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的生成量 10. 56mg/L，第二級生物轉化反應3-甲基兒茶酚的轉化率98%。
權利要求
1.一種生物法多級定向轉化鄰甲酚的方法，其特征在于，采用苯酚羥化酶基因工程菌 PH_IND全細胞，對鄰甲酚進行第一級生物轉化，得到的產物為3-甲基兒茶酚，再采用聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4全細胞，對3-甲基兒茶酚進行第二級生物轉化；苯酚羥化酶基因工程菌PH_im是通過獲取中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心入冊編號為CGMCC No. 4763的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. Wl中總長為5490bp、Genbank 注冊號為FJ610336的苯酚羥化酶基因全長序列，連接至載體質粒(pED8a(+) Vector)，并轉化至宿主細胞大腸桿菌中構建的；聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4是通過獲取中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心入冊編號為CGMCC No. 2723的高效聯(lián)苯降解菌Dyella ginsengisoli LA-4中的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因，連接至載體質粒 (pET28a(+) Vector)，并轉化至宿主細胞大腸桿菌中構建的；生物轉化的反應液成分和含量及反應條件為第一級生物轉化反應時，反應液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_IND全細胞干重為20 40g/L，鄰甲酚濃度為50 700mg/L，葡萄糖濃度為5 40mmol/L，在20 40°C溫度下，控制搖床轉速為50 200r/min，振蕩反應時間為10 MOmin ；第二級生物轉化反應時，在第一級生物轉化反應后的反應液中加入全細胞干重為20 40g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在20 40°C溫度下，控制搖床轉速為50 200r/min，振蕩反應時間為 5 50min。
2.如權利要求1所述的生物法多級定向轉化鄰甲酚的方法，其特征在于，生物轉化的反應液成分和含量及反應條件為第一級生物轉化反應時，反應液中苯酚羥化酶基因工程菌PH_ind全細胞干重為35 40g/L，鄰甲酚濃度為75 125mg/L，葡萄糖濃度為15 20mmol/L，在25 35°C溫度下，控制搖床轉速為100 180r/min，振蕩反應時間為180 240min ；第二級生物轉化反應時，在第一級生物轉化反應后的反應液中加入全細胞干重為 30 35g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在25 35°C溫度下，控制搖床轉速為100 180r/min，振蕩反應時間為30 40min。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及用生物法轉化鄰甲酚類化合物。其特征在于，第一級生物轉化反應時，反應液中苯酚羥化酶基因工程菌PH IND全細胞干重為20～40g/L，鄰甲酚濃度為50～700mg/L，葡萄糖濃度為5～40mmol/L，在20～40℃溫度下，控制搖床轉速為50～200r/min，振蕩反應時間為10～240min，得到的產物為3-甲基兒茶酚；第二級生物轉化反應時，在反應液中加入全細胞干重為20～40g/L的聯(lián)苯外二醇雙加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，控制搖床轉速為50～200r/min，振蕩反應時間為5～50min。本發(fā)明反應條件溫和，產物單一，提取步驟簡單，可對產物進行資源回收利用，適合工業(yè)生產和應用。
文檔編號C12P7/44GK102226205SQ20111011835
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權日2011年5月9日
發(fā)明者周豪, 周集體, 孔春雷, 張旭旺, 張瑞杰, 時勝男, 曲媛媛, 李新亮, 許炳雯, 馬橋 申請人:大連理工大學