一種利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法
【專利摘要】一種利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，先利用超微粉碎技術(shù)將黃姜粉碎成細(xì)顆粒，再通過中空纖維膜截留得到皂苷溶液，利用單酶水解或混合酶水解，初步將50?70％的皂苷轉(zhuǎn)化為皂素；接下來加入黃芪提取液、低聚異麥芽糖和金銀花藥液等可以促進(jìn)益生菌生長的物質(zhì)，接入一定量植物乳桿菌，利用生物轉(zhuǎn)化對(duì)酶解未完全轉(zhuǎn)化的皂苷進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，最終將70?85％的皂苷轉(zhuǎn)化為皂素；本過程采用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化的方法，通過二次轉(zhuǎn)化，提高了黃姜的利用率，降低了原材料成本，同時(shí)避免使用酸水解，較少了酸帶來的污染，降低了廢水中BOD和COD含量，屬于環(huán)境友好型生產(chǎn)技術(shù)。
【專利說明】
一種利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及黃姜皂素生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃姜皂素(D1sgenin)，又稱薯蕷皂苷元，是300多種留體激素類藥物的基礎(chǔ)原材料，有“藥用黃金”的美稱。黃姜皂素是從黃姜的根莖中提取出來的。黃姜又名盾葉薯蕷，是世界上薯蕷皂苷(元)含量最高的物種，也是目前最好的激素類藥源植物。
[0003]目前工業(yè)生產(chǎn)中，常采用酸水解法發(fā)進(jìn)行皂素的提取，該方法雖然便于操作，易于大規(guī)模生產(chǎn)，但是酸水解帶來廢水中較高的BOD和COD，對(duì)環(huán)境的帶來很大的威脅，不符合當(dāng)下環(huán)境友好型生產(chǎn)的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種采用清潔的生產(chǎn)方法替代污染較大的傳統(tǒng)酸水解法的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]I)采用超微粉碎機(jī)將黃姜磨成粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液；
[0007]2)將懸浮液離心得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為5-
7%的混合液，按每10ml混合液中加入0.5-2.0g的固定化果膠酶、固定化纖維素酶、固定化半纖維素酶中的一種或一種以上的混合物，調(diào)整PH為4-5后，于40-50 °C下進(jìn)行初步降解6-7h，向初步降解后的混合液中分別按照每I OOml加入0.01-0.05mg黃芪提取液、l_3g金銀花藥液、l_3g低聚異麥芽糖、0.5-lg(NH4)2S04、0.005-0.0lOml吐溫80及0.1-0.3g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基pH調(diào)整至6.0-7.0，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基3 %-9 %的接種量接入植物乳桿菌，在33-40 °C下發(fā)酵培養(yǎng)12-36h進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液；
[0008]3)將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液調(diào)pH至6.0-7.0，離心得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取l_3h，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。
[0009]所述步驟I)超微粉碎機(jī)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末。
[0010]所述步驟2)中懸浮液離心轉(zhuǎn)速為3000-5000r/min，離心時(shí)間為10_15min。
[0011]所述步驟2)中過濾采用改性聚砜中空纖維膜來實(shí)現(xiàn)，其中膜外徑為450-600μπι，截留相對(duì)分子量為3000-10000，水通量為80-100L/h/m2。
[0012]所述步驟2)固定化果膠酶制備采用明膠法即配制質(zhì)量濃度為10-20%的明膠作為載體，再向1mL載體中加入l-3mL質(zhì)量濃度為3-10%的戊二醛作為交聯(lián)劑和載體質(zhì)量3-10%的果膠酶混合，凝固后置于4°C保溫5h得到固定化果膠酶。
[0013]所述步驟2)固定化纖維素酶的制備:將l_2g脫乙酰度為80-90%的球狀殼聚糖溶解到30-60mL質(zhì)量濃度為1-3%的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為1-3%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取
8.0-10.0g的殼聚糖載體向其中加入l-3mL質(zhì)量濃度為3-5%，pH=10.0的戊二醛和載體質(zhì)量15-25 %的纖維素酶液得到固定化纖維素酶。
[0014]所述步驟2)固定化半纖維素酶的制備:將l_2g脫乙酰度為80-90%的球狀殼聚糖溶解到30-60mL質(zhì)量濃度為1-3 %的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為1-3%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取
6.0-8.0g的殼聚糖載體向其中加入l-3mL質(zhì)量濃度為4-6%，pH=10.0的戊二醛和載體質(zhì)量10-15%的半纖維素酶液得到固定化半纖維素酶。
[0015]所述步驟2)黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量3-5倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)10_30min，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在3000-5000r/min離心10_15min，取上清，于121°C滅菌得到。
[0016]所述步驟2)金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡0.5-lh，煎煮30-50min后過濾2-3次，將濾液合并后再煎煮1_3次，混勻調(diào)藥液pH至6.0_7.0，于121°C滅菌得到。
[0017]所述步驟2)中混合液和培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)，均使用0.5-1.5mol/L的NaOH溶液；
[0018]所述步驟3)中發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液pH的調(diào)節(jié)使用0.75-1.0mol/L的NaOH溶液;離心條件為轉(zhuǎn)速5000-7000r/min，離心時(shí)間10-15min;沉淀物烘干條件為50-80°C。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì):
[0020]先利用超微粉碎技術(shù)將黃姜粉碎成細(xì)顆粒，再通過中空纖維膜截留得到皂苷溶液，利用單酶水解或混合酶水解解，初步將50-70 %的皂苷轉(zhuǎn)化為皂素;接下來加入黃芪提取液、低聚異麥芽糖和金銀花藥液等可以促進(jìn)益生菌生長的物質(zhì)，接入一定量植物乳桿菌，利用生物轉(zhuǎn)化對(duì)酶解未完全轉(zhuǎn)化的皂苷進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，最終將70-85 %的皂苷轉(zhuǎn)化為皂素。本過程采用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化的方法，通過二次轉(zhuǎn)化，提高了黃姜的利用率，降低了原材料成本，同時(shí)避免使用酸水解，較少了酸帶來的污染，降低了廢水中BOD和COD含量，屬于環(huán)境友好型生產(chǎn)技術(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]I)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液；
[0024]2)將懸浮液在轉(zhuǎn)速為3000r/min離心15min得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為5 %的混合液，按每10ml混合液中加入1.5g的固定化果膠酶，采用lmol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為4后，于45°C下進(jìn)行初步降解6.5h，向初步降解后的混合液中分別按照每10ml加入0.011^黃芪提取液、28金銀花藥液、18低聚異麥芽糖、0.58(1^4)2304、
0.005ml吐溫80及0.1g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，采用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至
6.0，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基6 %的接種量接入植物乳桿菌，在33 °C下發(fā)酵培養(yǎng)36h進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液；
[0025]其中中空纖維過慮膜采用改性聚砜中空纖維過慮膜，膜外徑為450?600μπι，截留相對(duì)分子量為3000?10000，水通量為80?100L/h/m2;
[0026]固定化果膠酶制備采用明膠法即配制質(zhì)量濃度為10%的明膠作為載體，再向1mL載體中加入ImL質(zhì)量濃度5%的戊二醛作為交聯(lián)劑和載體質(zhì)量6%的果膠酶混合，凝固后置于4°C保溫5h得到固定化果膠酶；
[0027]黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量3倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)lOmin，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在3000r/min離心15min，取上清，于121°C滅菌得到；
[0028]金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡0.5h，煎煮30min后過濾2次，將濾液合并后再煎煮I次，混勻調(diào)藥液pH至6.0，于121°C滅菌得到。
[0029]3)采用0.75mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至6.0，在轉(zhuǎn)速為5000r/min離心15min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀在50°C烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取lh，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。
[0030]實(shí)施例2:
[0031]I)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液；
[0032]2)將懸浮液在轉(zhuǎn)速為4000r/min離心12min得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為7 %的混合液，按每10ml混合液中加入Ig的固定化纖維素酶，采用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為4.5后，于40°C下進(jìn)行初步降解7h，向初步降解后的混合液中分別按照每10ml加入0.03mg黃芪提取液、Ig金銀花藥液、3g低聚異麥芽糖、lg(NH4)2S04、
0.0lml吐溫80及0.2g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，采用lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.5，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基3%的接種量接入植物乳桿菌，在36°C下發(fā)酵培養(yǎng)24h進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液；
[0033]其中中空纖維過慮膜采用改性聚砜中空纖維過慮膜，膜外徑為450?600μπι，截留相對(duì)分子量為3000?10000，水通量為80?100L/h/m2;
[0034]固定化纖維素酶的制備:將Ig脫乙酰度為80%的球狀殼聚糖溶解到30mL質(zhì)量濃度為1%的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為2%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取9.0g的殼聚糖載體向其中加入ImL質(zhì)量濃度5%，pH= 10.0的戊二醛和載體質(zhì)量20%的纖維素酶液得到固定化纖維素酶。
[0035]黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量4倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)20min，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在4000r/min離心13min，取上清，于121°C滅菌得到；
[0036]金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡lh，煎煮40min后過濾3次，將濾液合并后再煎煮2次，混勻調(diào)藥液pH至6.5，于121°C滅菌得到；
[0037]3)采用0.8mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至6.5，在轉(zhuǎn)速為700(^/111丨11離心1min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀在70°C烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取2h，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。
[0038]實(shí)施例3:
[0039]I)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液；
[0040]2)將懸浮液在轉(zhuǎn)速為4600r/min離心I Imin得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為6 %的混合液，按每10ml混合液中加入0.5g的固定化半纖維素酶，采用0.8mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為5后，于42°C下進(jìn)行初步降解7h，向初步降解后的混合液中分別按照每10ml加入0.05mg黃芪提取液、1.5g金銀花藥液、2g低聚異麥芽糖、0.8g(NH4)2S04、0.006ml吐溫80及0.15g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，采用1.5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基9 %的接種量接入植物乳桿菌，在40°C下發(fā)酵培養(yǎng)12h進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液；
[0041]其中中空纖維過慮膜采用改性聚砜中空纖維過慮膜，膜外徑為450?600μπι，截留相對(duì)分子量為3000?10000，水通量為80?100L/h/m2;
[0042]固定化半纖維素酶的制備:將1.3g脫乙酰度為83%的球狀殼聚糖溶解到40mL質(zhì)量濃度為2.5 %的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為1.5%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取6.0g的殼聚糖載體向其中加入ImL質(zhì)量濃度6%，pH= 10.0的戊二醛和載體質(zhì)量10 %的半纖維素酶液得到固定化半纖維素酶；
[0043]黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量5倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)30min，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在5000r/min離心1min，取上清，于121°C滅菌得到；
[0044]金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡lh，煎煮50min后過濾3次，將濾液合并后再煎煮3次，混勻調(diào)藥液pH至7.0，于121°C滅菌得到。
[0045]3)采用1.0mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至7.0，在轉(zhuǎn)速為6000r/min離心13min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀在80°C烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取3h，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。
[0046]實(shí)施例4:
[0047]I)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液；
[0048]2)將懸浮液在轉(zhuǎn)速為5000r/min離心1min得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為5.5 %的混合液，按每I OOml混合液中加入2.0g的固定化果膠酶與固定化纖維素酶的混合物，采用1.2mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為4.2后，于50°C下進(jìn)行初步降解6h，向初步降解后的混合液中分別按照每10ml加入0.02mg黃芪提取液、3g金銀花藥液、
1.5g低聚異麥芽糖、0.6g(NH4)2S04、0.008ml吐溫80及0.25g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，采用
0.8mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.0，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基5 %的接種量接入植物乳桿菌，在38 °C下發(fā)酵培養(yǎng)I Sh進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液；
[0049]其中中空纖維過慮膜采用改性聚砜中空纖維過慮膜，膜外徑為450?600μπι，截留相對(duì)分子量為3000?10000，水通量為80?100L/h/m2;
[0050]固定化果膠酶制備采用明膠法即配制質(zhì)量濃度為15%的明膠作為載體，再向1mL載體中加入3mL質(zhì)量濃度3%的戊二醛作為交聯(lián)劑和載體質(zhì)量3%的果膠酶混合，凝固后置于4°C保溫5h得到固定化果膠酶；
[0051 ]固定化纖維素酶的制備:將1.5g脫乙酰度為85%的球狀殼聚糖溶解到45mL質(zhì)量濃度為2 %的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為I %三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取8.0g的殼聚糖載體向其中加入2mL質(zhì)量濃度4%，pH= 10.0的戊二醛和載體質(zhì)量15%的纖維素酶液得到固定化纖維素酶；
[0052]黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量3.5倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)25min，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在3500r/min離心14min，取上清，于121°C滅菌得到；
[0053]金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡0.8h，煎煮45min后過濾2次，將濾液合并后再煎煮3次，混勻調(diào)藥液pH至6.0，于121°C滅菌得到。
[0054]3)采用0.9mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至6.0，在轉(zhuǎn)速為5500r/min離心14min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀在60°C烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取lh，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。
[0055]實(shí)施例5:
[0056]I)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液；
[0057]2)將懸浮液在轉(zhuǎn)速為3800r/min離心14min得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為6.5 %的混合液，按每10ml混合液中加入1.8g的固定化果膠酶、固定化纖維素酶和固定化半纖維素酶的混合物，采用1.5mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為4.8后，于48°(:下進(jìn)行初步降解6h，向初步降解后的混合液中分別按照每10ml加入0.04mg黃芪提取液、
2.5g金銀花藥液、2.5g低聚異麥芽糖、0.9g(NH4)2S04、0.009ml吐溫80及0.3g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，采用1.2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基8%的接種量接入植物乳桿菌，在34 V下發(fā)酵培養(yǎng)30h進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液；
[0058]其中中空纖維過慮膜采用改性聚砜中空纖維過慮膜，膜外徑為450?600μπι，截留相對(duì)分子量為3000?10000，水通量為80?100L/h/m2;
[0059]固定化果膠酶制備采用明膠法即制質(zhì)量濃度為20%的明膠作為載體，再向1mL載體中加入2mL質(zhì)量濃度10%的戊二醛作為交聯(lián)劑和載體質(zhì)量10%的果膠酶混合，凝固后置于4°C保溫5h得到固定化果膠酶；
[0060]固定化纖維素酶的制備:將2g脫乙酰度為90%的球狀殼聚糖溶解到60mL質(zhì)量濃度為3%的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為3%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取10.0g的殼聚糖載體向其中加入3mL質(zhì)量濃度3%，pH= 10.0的戊二醛和載體質(zhì)量25%的纖維素酶液得到固定化纖維素酶；
[0061 ]固定化半纖維素酶的制備:將1.8g脫乙酰度為88%的球狀殼聚糖溶解到50mL質(zhì)量濃度為1.5%的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為2.5%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取8.0g的殼聚糖載體向其中加入3mL質(zhì)量濃度4%，pH=10.0的戊二醛和載體質(zhì)量15%的半纖維素酶液得到固定化半纖維素酶；
[0062]黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量4.5倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)15min，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在4500r/ min離心12min，取上清，于121°C滅菌得到；
[0063]金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡0.5h，煎煮35min后過濾2次，將濾液合并后再煎煮2次，混勻調(diào)藥液pH至7.0，于121°C滅菌得到；
[0064]3)采用0.85mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至7.0，在轉(zhuǎn)速為6500r/min離心12min得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀在70°C烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取3h，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于: 1)采用超微粉碎機(jī)將黃姜磨成粉末，然后將黃姜粉末加入足量的水中，靜置，待產(chǎn)生沉淀分層，即上清液，懸濁液和沉淀共三層;倒出上清液，將懸濁液和沉淀進(jìn)行振蕩混勻，得到懸浮液； 2)將懸浮液離心得到懸浮液清液和沉淀層，利用中空纖維超濾膜對(duì)懸浮液清液進(jìn)行過濾，得到黃姜皂苷保留液;將保留液與懸浮液沉淀混合，并調(diào)整得到固形物含量為5-7%的混合液，按每I OOml混合液中加入0.5-2.0g的固定化果膠酶、固定化纖維素酶、固定化半纖維素酶中的一種或一種以上的混合物，調(diào)整PH為4-5后，于40-50°C下進(jìn)行初步降解6-7h，向初步降解后的混合液中分別按照每I OOml加入0.01-0.05mg黃芪提取液、I _3g金銀花藥液、l_3g低聚異麥芽糖、0.5-lg(NH4)2S04、0.005-0.0lOml吐溫80及0.1-0.3g醋酸鈉得到發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基pH調(diào)整至6.0-7.0，滅菌冷卻后按發(fā)酵培養(yǎng)基3%~9%的接種量接入植物乳桿菌，在33-40 V下發(fā)酵培養(yǎng)12-36h進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將黃姜皂苷轉(zhuǎn)化為黃姜皂素得發(fā)酵液； 3)將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液調(diào)pH至6.0-7.0，離心得到上清液和沉淀，倒掉上清液，將沉淀烘干至固形物，再將固形物置于索氏抽提儀中，以60-90沸程石油醚為萃取劑進(jìn)行索氏提取l-3h，再通過濃縮結(jié)晶得到黃姜皂素。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟I)超微粉碎機(jī)采用HMB-715型重壓研磨式超微粉碎機(jī)，對(duì)初始顆粒度為10-20目的黃姜粉末進(jìn)行粉碎制成1000-1500目的黃姜粉末。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)中懸浮液離心轉(zhuǎn)速為3000-5000r/min，離心時(shí)間為10_15min; 所述步驟2)中過濾采用改性聚砜中空纖維膜來實(shí)現(xiàn)，其中膜外徑為450?600μπι，截留相對(duì)分子量為3000?10000，水通量為80?100L/h/m2。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)固定化果膠酶制備采用明膠法即配制質(zhì)量濃度為10-20%的明膠作為載體，再向1mL載體中加入l-3mL質(zhì)量濃度為3-10%的戊二醛作為交聯(lián)劑和載體質(zhì)量3-10%的果膠酶混合，凝固后置于4 V保溫5h得到固定化果膠酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)固定化纖維素酶的制備:將l-2g脫乙酰度為80-90%的球狀殼聚糖溶解到30-60mL質(zhì)量濃度為1-3%的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為1-3%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取8.0-10.0g的殼聚糖載體，向其中加入l_3mL質(zhì)量濃度為3-5%，pH= 10.0的戊二醛和載體質(zhì)量15-25%的纖維素酶液得到固定化纖維素酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)固定化半纖維素酶的制備:將l_2g脫乙酰度為80-90%的球狀殼聚糖溶解到30-60mL質(zhì)量濃度為1-3%的乙酸溶液中得殼聚糖溶液，再將殼聚糖溶液注入到過量的質(zhì)量濃度為1-3%三聚磷酸鈉溶液中靜置后沖洗多余的三聚磷酸鈉制得殼聚糖載體，取6.0-8.0g的殼聚糖載體向其中加入l_3mL質(zhì)量濃度為4-6%，pH= 10.0的戊二醛和載體質(zhì)量10-15%的半纖維素酶液得到固定化半纖維素酶。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)黃芪提取液的制備方法為:向烘干后的黃芪粉中加入其質(zhì)量3-5倍的水浸泡，煮沸后用文火持續(xù)10_30min，經(jīng)過兩次過濾，合并濾液加熱濃縮，將濃縮液在3000-5000r/min離心10_15min，取上清，于121°C滅菌得到。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)金銀花藥液的制備方法如下:將金銀花加入足量水中浸泡0.5-lh，煎煮30-50min后過濾2-3次，將濾液合并后再煎煮1-3次，混勻調(diào)藥液pH至6.0-7.0，于121°C滅菌得到。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟2)中混合液和培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)，均使用0.5-1.5mol/L的NaOH溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素的方法，其特征在于:所述步驟3)中發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液pH的調(diào)節(jié)使用0.75-1.0mol/L的NaOH溶液;離心條件為轉(zhuǎn)速5000-7000r/min，離心時(shí)間10-15min ；沉淀物烘干條件為50-80°C。
【文檔編號(hào)】C12P33/20GK106086150SQ201610590815
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月25日 公開號(hào)201610590815.9, CN 106086150 A, CN 106086150A, CN 201610590815, CN-A-106086150, CN106086150 A, CN106086150A, CN201610590815, CN201610590815.9
【發(fā)明人】陳合, 汪卓, 舒國偉
【申請(qǐng)人】陜西科技大學(xué)