專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法。
背景技術(shù)：
糖酯是由碳水化合物作為親水基團，脂肪酸作為疏水基團的非離子表面活性劑， 具有無毒、易生物降解、HLB值范圍廣(1-16)及良好的表面活性等優(yōu)點，并且具有分散潤滑、去污、起泡、調(diào)節(jié)粘度、防止老化、防止結(jié)晶、抑菌性等作用，因此被廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用的食品添加劑。目前市售的糖酯產(chǎn)品基本上是化學(xué)合成的，產(chǎn)物為復(fù)雜的混合物，要得到高純度的產(chǎn)品需進行繁雜的分離工作。脂肪酶是目前糖酯合成中使用最廣泛的酶，但是生產(chǎn)成本高、固定化過程繁雜費時大大局限了其商業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法，可顯著降低葡萄糖豆蔻酸酯生產(chǎn)成本，同時達到較高的酯化反應(yīng)效率和產(chǎn)率。一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法，包括將葡萄糖和豆蔻酸溶于有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，于50 60°C反應(yīng)10 14小時，分離、純化制得葡萄糖豆蔻酸酯。優(yōu)選的，所述的有機溶劑為丙酮。優(yōu)選的，每升有機溶劑中葡萄糖、豆蔻酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 100g、l 2g。所述反應(yīng)置于水浴搖床中進行，水浴搖床轉(zhuǎn)速為150 200轉(zhuǎn)/分鐘。優(yōu)選的，在分離純化前加入分子篩，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 12h，鎖住水分，促進酯化
反應(yīng)進一步進行。所述的分離、純化為離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，水洗后溶于正己烷，
重結(jié)晶。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體pPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從^witrogen公司購得。它的細胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。
載體PPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時該載體內(nèi)信號肽序列上游存在AOXl啟動子(Genbank號 Ζ46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)改變，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明通過將脂肪酶基因和細胞壁α凝集素基因?qū)氘叧嘟湍讣毎鸊S115，畢赤酵母細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，脂肪酶表達并分泌到胞外，同時利用細胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細胞表面。利用該酵母展示脂肪酶對酯化反應(yīng)進行催化，可有效提高操作穩(wěn)定性、耐熱性以及重復(fù)性，由于酶反應(yīng)的特異性該酶能大幅度抑制副反應(yīng)的發(fā)生，酯化轉(zhuǎn)化率在85% 以上。
具體實施例方式實施例1制備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進行PCR擴增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應(yīng)體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運行條件為94°C 3分鐘，；35個循環(huán)(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒，并在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質(zhì)粒，通過電泳檢驗并回收質(zhì)粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發(fā)生His 4單位點置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質(zhì)粒進行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準備好的畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25uF條件下電擊10ms，并加入約Iml預(yù)冷的山梨醇。將上述混勻的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物約400μ 1涂于MD平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子涂于不同濃度的G418平板上，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收集細胞；再將細胞置于含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)144h，離心收集細胞， 用水沖洗后，接種至YGC培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)120h，然后3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌后再用50mM pH7. 0磷酸緩沖液洗滌，然后與2倍體積油酸混合，-80°C下預(yù)凍后再經(jīng)德國 Christ真空冷凍干燥機干燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進行再真空干燥去除己烷，即得到經(jīng)生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。
實施例2酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯實例1取葡萄糖0. 2g、豆蔻酸0. 5g，加入含有IOmL丙酮的具塞三角瓶，混合、預(yù)熱 IOmin,然后加入酵母展示脂肪酶0. Olg，置于水浴搖床開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在50°c，反應(yīng)1 后加入0. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子篩，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得葡萄糖豆蔻酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實例2取葡萄糖lg、豆蔻酸lg，加入含有IOmL丙酮的具塞三角瓶，混合、預(yù)熱 IOmin,然后加入酵母展示脂肪酶0. 02g,置于水浴搖床開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在，反應(yīng)1 后加入0. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子篩，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得葡萄糖豆蔻酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成葡萄糖豆蔻酸酯取葡萄糖0. 2g、豆蔻酸0. 5g，加入含有IOmL丙酮的具塞三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin， 置于水浴搖床開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在50°C，反應(yīng)1 后加入0. 5g 分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后，離心沉淀除去分子篩，取上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得葡萄糖豆蔻酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實施例4測定反應(yīng)轉(zhuǎn)化率將反應(yīng)液離心，取上清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，用甲醇(色譜純)溶解，經(jīng) 0. 45 μ m濾膜過濾，上樣測定。液相色譜(HPLC)檢測條件色譜柱SunfireTM C18 (5 μ m, 4. 6mm X 150mm)；流動相為V (甲醇)V(水)=95 5 ；流速lmL/min，柱溫，蒸發(fā)光檢測器，進樣量2 μ L。平行測定三次，取平均值。酯化轉(zhuǎn)化率計算公式如下轉(zhuǎn)化率(％ )=(單酯摩爾數(shù)/糖摩爾數(shù))X 100%通過上述方法檢測計算，實施例2中，實例1合成葡萄糖豆蔻酸酯的轉(zhuǎn)化率達 80. 5%，實例2合成葡萄糖豆蔻酸酯的轉(zhuǎn)化率達79. 6%。而實施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成葡萄糖豆蔻酸酯的轉(zhuǎn)化率僅為50%左右。
權(quán)利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法，包括將葡萄糖和豆蔻酸溶于有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，于50 60°C反應(yīng)10 14 小時，分離、純化制得葡萄糖豆蔻酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細胞壁α凝集素基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升有機溶劑計，葡萄糖、豆蔻酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為20 100g、50 100g、l 2g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有機溶劑為丙酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物印跡中采用的配體為油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法，包括將葡萄糖和豆蔻酸溶于有機溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反應(yīng)10～14小時，分離、純化制得葡萄糖豆蔻酸酯；將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；本發(fā)明通過將脂肪酶展示在細胞外，利用該酶制劑催化合成葡萄糖豆蔻酸酯，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，而且縮短了反應(yīng)時間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N15/63GK102212579SQ201110110318
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 迪拉熱木, 阮暉 申請人:浙江大學(xué)