一種基因重組纖維素分解酵母菌方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因重組纖維素分解酵母菌方法，屬于生物方法領(lǐng)域。包括如下步驟：1、纖維素酶基因cDNA模板制備；2、基因克隆片段制備；3、將目標(biāo)基因克隆片段嵌入載體質(zhì)粒，構(gòu)建基因重組質(zhì)粒；4、基因重組質(zhì)粒的篩選與鑒別；5、基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母表達(dá)系統(tǒng)；6、基因重組酵母菌的篩選與鑒別；7、重組基因表達(dá)的誘導(dǎo)。本發(fā)明解決了混合菌種在使用過程中存在的天然不可調(diào)和矛盾，減少了分解體系內(nèi)部之間的排斥作用，最終有效的提高纖維素的利用效率，減少分解時(shí)間，增加其商業(yè)價(jià)值，從根本上解決了自然界中最大可再生資源的高效利用問題，為資源的可持續(xù)發(fā)展提供新的思路與方向。
【專利說明】一種基因重組纖維素分解酵母菌方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物方法，具體地說，涉及一種基因重組纖維素分解酵母菌方法。【背景技術(shù)】
[0002]纖維素、木質(zhì)素一直是世界上總量最為巨大的可再生資源，所有植物中均含有，其最終分解物為各種小分子糖類:如葡萄糖、果糖等。都是許多其他生產(chǎn)活動(dòng)所必須的優(yōu)質(zhì)的原材料，特別是在可再生生物能源領(lǐng)域。然而，由于纖維素結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，其分解的生物學(xué)變化比較復(fù)雜，在自然界中極難被充分降解，并且即便能夠適當(dāng)降解，其耗時(shí)也過長，很難從經(jīng)濟(jì)角度產(chǎn)生價(jià)值。
[0003]目前，社會(huì)上現(xiàn)有的對(duì)于纖維素、木質(zhì)素這類儲(chǔ)量龐大的可再生資源的利用還基本停留在細(xì)胞層面，特別是在國內(nèi)。由于纖維素等的分解需要多種酶和生化反應(yīng)的參與，現(xiàn)有的技術(shù)主要通過將具有不同能力的多種微生物混合，通過各種微生物在整個(gè)分解過程中的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮各自的作用，以最終分解纖維素。然而，從微生物學(xué)角度來說，在同一生態(tài)體系中的各微生物之間多存在拮抗作用。也就是說，由于營養(yǎng)物質(zhì)的總量或空間大小固定，各菌種生長過程中為爭奪營養(yǎng)物質(zhì)或生存空間，確保自己是優(yōu)勢菌株，都會(huì)盡量抑制其他菌種的生長。同時(shí)，各不同菌種對(duì)于最佳生長環(huán)境的溫度、濕度等要求不同。因此，多種菌種混合，很難使得各菌種都能同時(shí)獲得最好生長條件。也就是說每一種菌株在實(shí)際過程中，很難有效的發(fā)揮其預(yù)計(jì)的在纖維素分解中特定環(huán)節(jié)的作用，從而使得纖維素分解的整個(gè)生化流程出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)瓶頸點(diǎn)，最終嚴(yán)重影響纖維素分解的效率，增加分解所需的時(shí)間。
[0004]PCR方法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction),是利用單鏈寡核苷酸引物對(duì)特定DNA片 段進(jìn)行體外快速擴(kuò)增的一種方法。
[0005]電擊法，利用高壓電脈沖的電擊穿孔作用將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入植物原生質(zhì)體的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種基因重組纖維素分解酵母菌的方法。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種基因重組纖維素分解酵母菌方法，其特征在于:包括如下步驟:
[0009]1、纖維素酶基因cDNA模板制備
[0010]以里氏木霉或者枯草芽孢桿菌作為供體菌株，將供體菌株中的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ;以獲得的cDNA為目標(biāo)基因|旲板備用；
[0011]2、基因克隆片段制備
[0012]在NCBI數(shù)據(jù)庫中確定供體菌株的纖維素酶系中的Cx酶、Cl酶和beta-葡萄糖苷酶3個(gè)目標(biāo)基因的cDNA基因片段圖譜，并針對(duì)基因片段圖譜設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的上下游引物；
[0013]以具有發(fā)酵產(chǎn)生酒精能力的酵母菌作為載體菌株，利用PCR反應(yīng)，將載體菌株所需的3種特定基因表達(dá)片段的cDNA克隆，獲得目標(biāo)基因克隆片段；[0014]3、將目標(biāo)基因克隆片段嵌入載體質(zhì)粒，構(gòu)建基因重組質(zhì)粒
[0015]以pPICZ a作為載體質(zhì)粒，將步驟2中所述的3組PCR產(chǎn)物分別與pPICZ a在緩沖液中進(jìn)行三次酶切，酶切時(shí)溫度控制在37°C，酶切時(shí)間2小時(shí)；
[0016]每次酶切完成后，均用T4-DNA連接酶將3個(gè)目標(biāo)基因片段中的每一個(gè)都插入pPICZ a中，獲得基因重組質(zhì)粒；
[0017]4、基因重組質(zhì)粒的篩選與鑒別
[0018]將步驟3獲得的基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，在含有25ug/ml博來霉素的低鹽LB平板培養(yǎng)基上篩選抗性生長良好的菌落；
[0019]選取5-8個(gè)抗性生長良好的單菌落，純化后提取基因重組質(zhì)粒；
[0020]測序鑒定基因重組質(zhì)粒，獲得擴(kuò)增好的基因重組質(zhì)粒；
[0021]5、基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母表達(dá)系統(tǒng)
[0022]將步驟4中獲得的基因重組質(zhì)粒用SacI酶進(jìn)行線性化后，用電擊法將構(gòu)建好的基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入載體菌株中，獲得基因重組酵母菌；
[0023]6、基因重組酵母菌的篩選與鑒別
[0024]電擊結(jié)束后，立即加入溫度為0°C、濃度為lmol/L的山梨醇1ml，非劇烈快速混勻后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博來霉素的YPDS培養(yǎng)皿上，正方I小時(shí)后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30°C的恒溫條件下培養(yǎng)3-5天，直至形成生產(chǎn)良好的陽性單克??；選取10-20個(gè)單菌落在含100ug/ml博來霉素的LB平板培養(yǎng)基上純化，獲得目標(biāo)菌株；
`[0025]7、重組基因表達(dá)的誘導(dǎo)
[0026]挑選步驟6中得到的純化的目標(biāo)菌株，在Yro培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；WYro培養(yǎng)基中取IOOul培養(yǎng)液置于BMGY培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；在41:的恒溫條件下，3500g離心IOmin ;去細(xì)胞沉淀懸浮于盛有25ml培養(yǎng)液的BMMY培養(yǎng)基中，并加入甲醇，至甲醇的終濃度為0.5%，在30°C的恒溫條件下，震蕩培養(yǎng)3-4天，誘導(dǎo)目標(biāo)重組基因表達(dá)。
[0027]進(jìn)一步地說:
[0028]所述載體菌株為畢赤酵母菌GS115。
[0029]所述PCR反應(yīng)的上下游引物序列如下:
[0030]Cx 酶:上游引物 ATGGCGCCCTCAGTTACACT[0031 ] 下游引物 GAITTCCGTAACGCTCATCA
[0032]Cl 酶:上游引物 ATGTATCGGAAGITGGCCGT
[0033]下游引物 TTACAGGCACTGAGAGTAGT
[0034]beta-葡萄糖苷酶:上游引物 ATGCGTTACCGAACAGCAGC
[0035]下游引物 CTACGCTACCGACAGAGTGCT。
[0036]步驟3中所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶XhoI進(jìn)行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZa用限制性內(nèi)切酶Xba I進(jìn)行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行酶切。
[0037]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是利用當(dāng)今世界主流及前沿的分子遺傳學(xué)、微生物基因重組等技術(shù)，從生物學(xué)的本質(zhì)上對(duì)纖維素等的分解提出的新的思路和方法。具體地說，本發(fā)明是通過基因克隆及重組技術(shù)，賦予單一菌種多項(xiàng)功能，實(shí)現(xiàn)了單一菌株完整分解纖維素的可能，消除了現(xiàn)有技術(shù)在中遇到的不可避免的拮抗作用，避開了由于多菌株發(fā)酵而必須要考慮的平衡各菌種之間最佳發(fā)酵條件的難題，保證了菌種在發(fā)酵過程中的最佳生長和發(fā)酵條件，從而可以最大程度的使得菌株在發(fā)酵體系中充分發(fā)揮其應(yīng)有的功能和作用，提高纖維素等的利用率及有效減少反應(yīng)所需時(shí)間。因而，本發(fā)明是一種全新的、從生物學(xué)本質(zhì)層面更加有效的、更具有發(fā)展及推廣前景的纖維素、木質(zhì)素資源開發(fā)和利用的方法，解決了混合菌種在使用過程中存在的天然不可調(diào)和矛盾，減少了分解體系內(nèi)部之間的排斥作用，最終有效的提高纖維素的利用效率，減少分解時(shí)間，增加其商業(yè)價(jià)值，從根本上解決了自然界中最大可再生資源的高效利用問題，為資源的可持續(xù)發(fā)展提供新的思路與方向。
[0038]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例:
[0040]一種基因重組纖維素分解酵母菌方法，包括如下步驟:
[0041]1、纖維素酶基因cDNA模板制備
[0042]以里氏木霉或者枯草芽孢桿菌作為供體菌株，將供體菌株中的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；以獲得的cDNA為目標(biāo)基因|旲板備用。
[0043]2、基因克隆片段制備
[0044]在NCBI數(shù)據(jù)庫中確定供體菌株的纖維素酶系中的Cx酶、Cl酶和beta-葡萄糖苷酶3個(gè)目標(biāo)基因的cDNA基因片段圖譜，并針對(duì)基因片段圖譜設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的上下游引物；
[0045]以具有發(fā)酵產(chǎn)生酒精能力的酵`母菌作為載體菌株，本實(shí)施例中，所述載體菌株優(yōu)選為畢赤酵母菌GSl 15 ；
[0046]利用PCR反應(yīng)，將載體菌株所需的3種特定基因表達(dá)片段的cDNA克隆，獲得目標(biāo)基因克隆片段；
[0047]所述PCR反應(yīng)的上下游引物序列如下:
[0048]Cx 酶:上游引物 ATGGCGCCCTCAGTTACACT
[0049]下游引物 GAITTCCGTAACGCTCATCA
[0050]Cl 酶:上游引物 ATGTATCGGAAGITGGCCGT[0051 ] 下游引物 TTACAGGCACTGAGAGTAGT
[0052]beta-葡萄糖苷酶:上游引物 ATGCGTTACCGAACAGCAGC
[0053]下游引物 CTACGCTACCGACAGAGTGCT。
[0054]3、將目標(biāo)基因克隆片段嵌入載體質(zhì)粒，構(gòu)建基因重組質(zhì)粒
[0055]以pPICZ a作為載體質(zhì)粒，將步驟2中所述的3組PCR產(chǎn)物分別與pPICZ a在緩沖液中進(jìn)行三次酶切，酶切時(shí)溫度控制在37°C，酶切時(shí)間2小時(shí)；
[0056]所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶Xho I進(jìn)行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶Xba I進(jìn)行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行酶切；
[0057]每次酶切完成后，均用T4-DNA連接酶將3個(gè)目標(biāo)基因片段中的每一個(gè)都插入pPICZ a中，獲得基因重組質(zhì)粒。
[0058]4、基因重組質(zhì)粒的篩選與鑒別
[0059]將步驟3獲得的基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，在含有25ug/ml博來霉素的低鹽LB平板培養(yǎng)基上篩選抗性生長良好的菌落；
[0060]選取5-8個(gè)抗性生長良好的單菌落，純化后提取基因重組質(zhì)粒；
[0061]測序鑒定基因重組質(zhì)粒，獲得擴(kuò)增好的基因重組質(zhì)粒。
[0062]5、基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母表達(dá)系統(tǒng)
[0063]將步驟4中獲得的基因重組質(zhì)粒用SacI酶進(jìn)行線性化后，用電擊法將構(gòu)建好的基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入載體菌株中，獲得基因重組酵母菌。
[0064]6、基因重組酵母菌的篩選與鑒別
[0065]電擊結(jié)束后，立即加入溫度為0°C、濃度為lmol/L的山梨醇1ml，非劇烈快速混勻后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博來霉素的YPDS培養(yǎng)皿上，正方I小時(shí)后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30°C 的恒溫條件下培養(yǎng)3-5天，直至形成生產(chǎn)良好的陽性單克隆；選取10-20個(gè)單菌落在含100ug/ml博來霉素的LB平板培養(yǎng)基上純化，獲得目標(biāo)菌株。
[0066]7、重組基因表達(dá)的誘導(dǎo)
[0067]挑選步驟6中得到的純化的目標(biāo)菌株，在Yro培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；WYro培養(yǎng)基中取IOOul培養(yǎng)液置于BMGY培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；在41:的恒溫條件下，3500g離心IOmin ;去細(xì)胞沉淀懸浮于盛有25ml培養(yǎng)液的BMMY培養(yǎng)基中，并加入甲醇，至甲醇的終濃度為0.5%，在30°C的恒溫條件下，震蕩培養(yǎng)3-4天，誘導(dǎo)目標(biāo)重組基因表達(dá)。
[0068]最后，對(duì)重組酵母進(jìn)行鑒定，具體操作如下:
[0069]將培養(yǎng)物4°C的恒溫條件下，3500g離心lOmin，取上清液透析，濃縮后進(jìn)行SDS_PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)，與陰性對(duì)照菌(導(dǎo)入不含插入目標(biāo)基因片段的pPICZ a質(zhì)粒)相比，重組工程菌培養(yǎng)上清液多出45-50KD的特異條帶。
[0070]同時(shí)，將培養(yǎng)物離心得到的細(xì)胞沉淀收集，破碎細(xì)胞后提取胞內(nèi)總DNA，利用3個(gè)酶基因的特異PCR引物分別做PCR，將產(chǎn)物在100V下進(jìn)行SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)30min，EB染色后，紫外拍攝，確定重組菌是否出現(xiàn)特異基因擴(kuò)增的DNA片段。
【權(quán)利要求】
1.一種基因重組纖維素分解酵母菌方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)纖維素酶基因cDNA模板制備 以里氏木霉或者枯草芽孢桿菌作為供體菌株，將供體菌株中的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；以獲得的cDNA為目標(biāo)基因I旲板備用； (2)基因克隆片段制備 在NCBI數(shù)據(jù)庫中確定供體菌株的纖維素酶系中的Cx酶、Cl酶和beta-葡萄糖苷酶3個(gè)目標(biāo)基因的cDNA基因片段圖譜，并針對(duì)基因片段圖譜設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的上下游引物； 以具有發(fā)酵產(chǎn)生酒精能力的酵母菌作為載體菌株，利用PCR反應(yīng)，將載體菌株所需的3種特定基因表達(dá)片段的cDNA克隆，獲得目標(biāo)基因克隆片段； (3)將目標(biāo)基因克隆片段嵌入載體質(zhì)粒，構(gòu)建基因重組質(zhì)粒 以pPICZ a作為載體質(zhì)粒，將步驟(2)中所述的3組PCR產(chǎn)物分別與pPICZ a在緩沖液中進(jìn)行三次酶切，酶切時(shí)溫度控制在37°C，酶切時(shí)間2小時(shí)； 每次酶切完成后，均用T4-DNA連接酶將3個(gè)目標(biāo)基因片段中的每一個(gè)都插入pPICZ a中，獲得基因重組質(zhì)粒； (4)基因重組質(zhì)粒的篩選與鑒別 將步驟(3)獲得的基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，在含有25ug/ml博來霉素的低鹽LB平板培養(yǎng)基上篩選抗性生長良好`的菌落； 選取5-8個(gè)抗性生長良好的單菌落，純化后提取基因重組質(zhì)粒； 測序鑒定基因重組質(zhì)粒，獲得擴(kuò)增好的基因重組質(zhì)粒； (5)基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母表達(dá)系統(tǒng) 將步驟(4)中獲得的基因重組質(zhì)粒用SacI酶進(jìn)行線性化后，用電擊法將構(gòu)建好的基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入載體菌株中，獲得基因重組酵母菌； (6)基因重組酵母菌的篩選與鑒別 電擊結(jié)束后，立即加入溫度為0°C、濃度為lmol/L的山梨醇1ml，非劇烈快速混勻后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博來霉素的YPDS培養(yǎng)皿上，正方I小時(shí)后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30°C的恒溫條件下培養(yǎng)3-5天，直至形成生產(chǎn)良好的陽性單克??；選取10-20個(gè)單菌落在含100ug/ml博來霉素的LB平板培養(yǎng)基上純化，獲得目標(biāo)菌株； (7)重組基因表達(dá)的誘導(dǎo) 挑選步驟(6)中得到的純化的目標(biāo)菌株，在YH)培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；從YH)培養(yǎng)基中取IOOul培養(yǎng)液置于BMGY培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；在4°C的恒溫條件下，3500g離心-1Omin ;去細(xì)胞沉淀懸浮于盛有25ml培養(yǎng)液的BMMY培養(yǎng)基中，并加入甲醇，至甲醇的終濃度為0.5%，在30°C的恒溫條件下，震蕩培養(yǎng)3-4天，誘導(dǎo)目標(biāo)重組基因表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因重組纖維素分解酵母菌方法，其特征在于:所述載體菌株為畢赤酵母菌GS115。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因重組纖維素分解酵母菌方法，其特征在于:所述PCR反應(yīng)的上下游引物序列如下: Cx 酶:上游引物 ATGGCGCCCTCAGTTACACT 下游引物 GAITTCCGTAACGCTCATCA Cl 酶:上游引物 ATGTATCGGAAGITGGCCGT下游引物 TTACAGGCACTGAGAGTAGT beta-葡萄糖苷酶:上游引物ATGCGTTACCGAACAGCAGC 下游引物 CTACGCTACCGACAGAGTGCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因重組纖維素分解酵母菌方法，其特征在于:步驟(3)中所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶Xho I進(jìn)行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a用限制性內(nèi)切酶Xba I進(jìn)行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分別與pPICZ a`用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行酶切。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103773703SQ201210429311
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月23日
【發(fā)明者】李毅 申請(qǐng)人:貴州愛微生物技術(shù)有限責(zé)任公司