專利名稱：分離細(xì)胞的方法
分離細(xì)胞的方法本發(fā)明涉及用于從樣品中分離細(xì)胞的方法和試劑盒。用包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液處理樣品，這導(dǎo)致分離優(yōu)選活細(xì)胞。
背景技術(shù)：
從復(fù)雜樣品中分離細(xì)胞用于其鑒定或表征或簡(jiǎn)單地進(jìn)一步用于處理變得越來(lái)越重要，尤其是鑒定樣品中的病原體，所述樣品如食品樣品或臨床樣品，如血液、組織或糞便。 然而，為了明確鑒定并任選定量測(cè)定包含在樣品中的細(xì)胞，必須提供用于分離細(xì)胞的方法。一般而言，實(shí)時(shí)PCR大大地提高了 PCR作為分子生物學(xué)中的定量工具和用于定量測(cè)定及鑒定微生物(尤其病原體)的實(shí)際應(yīng)用范圍。實(shí)時(shí)PCR使得每個(gè)PCR反應(yīng)可可靠地檢測(cè)和定量到一個(gè)單核苷酸靶標(biāo)，但要求高度純化的模板DNA。特別是當(dāng)將其用于如食品等復(fù)雜環(huán)境中細(xì)菌的常規(guī)診斷和定量檢測(cè)時(shí)，這些要求起到重要作用，因?yàn)檫@些環(huán)境成分引起的抑制作用可影響或甚至抑止PCR反應(yīng)。此外，用于從如食品等復(fù)雜樣品中分離目標(biāo)生物體，使用可靠和有效回收方法是至關(guān)重要的。由于如食品等樣品通常涉及大樣品容量，因此通常用微生物學(xué)方法來(lái)分離和富集微生物。這些方法代表"金標(biāo)準(zhǔn)"方法，新備選技術(shù)必須與它們比較進(jìn)行評(píng)估。為了建立用于從食品分離微生物(例如細(xì)菌)的滿足實(shí)時(shí)PCR及用于微生物下游分析的其它分子方法的高要求的方法，已作出大量努力。亦嘗試使用常用于分子生物學(xué)的DNA分離方法直接從食品中分離DNA。其它方法利用生物分子對(duì)微生物表面結(jié)構(gòu)的親和力，其中所述生物分子可以是例如任選與磁珠、硅烷化載玻片或直接集菌落印跡結(jié)合的抗體、來(lái)自噬菌體的細(xì)菌結(jié)合蛋白和抗菌肽(AMP)。例如，為了直接檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，可以使用水性兩相分離系統(tǒng)(Lantz 等，Appl Environ Microbiol. (1994)60:3416-3418)。據(jù)報(bào)道浮力密度梯度離心為用于從食品基質(zhì)中分離細(xì)菌的工具(Wolffs P.等， Appl Environ Microbiol. (2005)71:5759-5764)。其它方法基于物理分離，如簡(jiǎn)單的離心和過濾。亦闡述了以下方法使用蛋白酶K和鏈霉蛋白酶進(jìn)行食品基質(zhì)的酶消化方法，和/ 或使用硫氰酸胍/苯酚/氯仿、二乙基醚/氯仿和檸檬酸鈉/聚乙二醇從食品中化學(xué)提取細(xì)菌的方法。目前用于從復(fù)雜樣品中分離細(xì)胞尤其是微生物的方法闡述于例如乂6%118 KA 和 Jaykus L-A (Crit Rev Microbiol (2004) 30 7-24)中。這些方法中大多數(shù)有缺點(diǎn)，如處理的樣品體積不夠大、高檢測(cè)限、低回收率、不能定量分離活細(xì)胞、程序耗時(shí)和高費(fèi)用。另外，在大部分情況下這些方法的應(yīng)用限制于僅僅一種或有限數(shù)量的不同食品基質(zhì)?；谥苯佣渴称分屑?xì)菌的以下要求必須提供用于分離細(xì)胞和微生物(如食品病原體單核細(xì)胞增生李斯特菌)的新方案(i)大樣品體積；(ii)大范圍靶標(biāo)濃度內(nèi)的可再現(xiàn)回收率；和(iii)除去抑制劑以助于用于下游分析的備選分子方法。WO 2008/017097揭示用于從復(fù)雜基質(zhì)如食品分離細(xì)胞的方法。該方法使用包含與去污劑組合的離液劑的提取緩沖液。食品分析中的另一個(gè)關(guān)鍵問題是確定污染細(xì)菌的生存力。迄今為止，大部分方法
3不能區(qū)分活的和死的細(xì)菌細(xì)胞。另外，為裂解食品樣品通常復(fù)雜的基質(zhì)，需要對(duì)從所述樣品中分離的生存力有負(fù)面影響的裂解條件。該問題減少了使用例如用于食品分析的常規(guī)監(jiān)測(cè)的PCR方法的益處。一方面，某些細(xì)胞在提取過程中被殺死，另一方面，在提取前存在于樣品中的代謝損傷的細(xì)胞或不能存活細(xì)胞也被提取和鑒定，但是它們對(duì)于樣品質(zhì)量沒有任何其他影響。0. F. D' Urso 等，F(xiàn)ood Microbiology 26 0009) 311-316 開發(fā)了基于過濾的分離活細(xì)胞的方法。該方法中使用的緩沖液包含大量離液劑硫氰酸胍，硫氰酸胍經(jīng)常干擾下游處理，并因此不得不用復(fù)雜的洗滌程序除去。因此，明顯需要用于從如食品和血液等復(fù)雜基質(zhì)中分離細(xì)胞且可能是分離活細(xì)胞的定量和可重復(fù)的方法。發(fā)明簡(jiǎn)述業(yè)已發(fā)現(xiàn)可用包含至少氯化鎂(MgCl2)和/或離子液體的緩沖液，容易地并極為有效地從復(fù)雜基質(zhì)中分離如細(xì)菌等細(xì)胞污染物。另外，由于極為溫和但有效的提取條件，該方法允許分離活細(xì)胞。因此，本發(fā)明涉及用于從復(fù)雜樣品中分離細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟a)提供復(fù)雜樣品；b)將所述樣品與包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液一起孵育；c)優(yōu)選通過離心、親和結(jié)合和/或過濾從步驟b)的混合物分離所述細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于從復(fù)雜樣品中分離細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括-包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液；和-至少一種生物降解酶。發(fā)明說(shuō)明出乎意料的結(jié)果是，復(fù)雜樣品與包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液一起孵育，導(dǎo)致樣品溶解而不影響在所述樣品中包含的含有細(xì)胞壁或細(xì)胞壁圍繞的細(xì)胞。因此，本發(fā)明方法能夠合適地用于分離所述細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，可優(yōu)選將所述方法用于分離細(xì)胞壁圍繞的細(xì)胞，此處術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞壁圍繞的細(xì)胞"，指所有已知具有或包含細(xì)胞壁作為對(duì)環(huán)境的屏障的細(xì)胞。具有細(xì)胞壁的生物體或細(xì)胞的實(shí)例是細(xì)菌、古生菌、真菌、植物和藻類。與其相反，動(dòng)物和大部分其它原生生物具有細(xì)胞膜而沒有圍繞的細(xì)胞壁。術(shù)語(yǔ)"復(fù)雜樣品"指包含或多或少數(shù)目的不同主要有機(jī)來(lái)源的化合物的樣品或樣品基質(zhì)，其中某些是液體，其它是固體。本發(fā)明的復(fù)雜樣品可包括包含肽、多肽、蛋白質(zhì) (也包括酶)、碳水化合物(復(fù)雜的和簡(jiǎn)單的碳水化合物)、脂質(zhì)、脂肪酸、脂肪、核酸等的基質(zhì)。本發(fā)明樣品優(yōu)選包含少量纖維/淀粉。本文所用術(shù)語(yǔ)"含少量纖維/淀粉的樣品“以廣義使用，旨在包括含有或可能含有細(xì)胞的各種樣品。優(yōu)選樣品包含少于20% (w/w)、更優(yōu)選少于10%、更優(yōu)選少于5%、特別優(yōu)選少于 1%、尤其是沒有(低于或在檢測(cè)限周圍)纖維/淀粉。本文所用"纖維"包含植物以及動(dòng)物(如膠原纖維)來(lái)源的纖維。例示性樣品包括但不限于食品，例如奶牛、母綿羊、雌山羊、母馬、驢、駱駝、牦牛、CN 水牛和馴鹿等的奶，乳制品，牛肉、山羊、羔羊、成羊肉、豬肉、田雞腿、小牛肉、嚙齒動(dòng)物、馬、 袋鼠、禽類(包括雞、火雞、鴨、鵝、鴿(pigeon or dove)、鴕鳥、鴯鹋)、海鮮包括長(zhǎng)須鯨例如鮭魚和羅非魚以及貝類如軟體動(dòng)物和甲殼類動(dòng)物和蝸牛的肉，肉產(chǎn)品，植物產(chǎn)品；種子； 禾本科谷物，包括玉米、小麥、大米、大麥、高粱和小米；非禾本科谷物，包括蕎麥、莧菜和昆諾阿藜；豆類，包括扁豆、花生、豌豆和小扁豆；堅(jiān)果，包括杏仁、核桃和松仁；含油種子，包括向日葵、油菜和芝麻；蔬菜如，根菜，包括馬鈴薯、木薯和蕪菁；葉菜，包括莧菜、菠菜和羽衣甘藍(lán)；海洋蔬菜，包括紅皮藻、昆布和翅菜(dabberlocks)；莖菜，包括竹筍、胭脂仙人掌 (nopales)和蘆筍；花序蔬菜，包括洋薊、花椰菜和金針；以及果菜，包括南瓜、黃秋葵和茄子；水果；草本植物和香料；全血、尿、痰、唾液、羊水、血漿、血清、肺灌洗液；和組織，包括但不限于肝、脾、腎、肺、腸、腦、心臟、肌肉、胰腺等等。技術(shù)人員應(yīng)明白，自上述任何例示性樣品或所述例示性樣品混合物獲得的裂解物、提取物或(勻漿的)材料或包含一種或多種例示性樣品的組合物，亦為本發(fā)明范圍內(nèi)的樣品。本文所用術(shù)語(yǔ)"緩沖液"，指當(dāng)將酸或堿加入到溶液或組合物中時(shí)抵抗PH變化的水溶液或組合物。這種對(duì)PH變化的抗性是由于這種溶液的緩沖性質(zhì)。因此，表現(xiàn)緩沖活性的溶液或組合物被稱為緩沖液或緩沖溶液。緩沖液一般沒有保持溶液或組合物PH的無(wú)限能力。相反，它們通常能夠?qū)H值保持在一定范圍內(nèi)，例如保持在pH 7-pH 9之間。通常緩沖液能夠保持PH在其pKa上下一個(gè)log范圍內(nèi)(參見例如，C. Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，GALBIOCHEM，1999)。 通常自緩沖鹽或優(yōu)選自非-離子緩沖組分如TRIS和HEPES制備緩沖液和緩沖溶液。加入到提取液中的緩沖液保證基質(zhì)溶解過程中的PH值穩(wěn)定。穩(wěn)定的pH值有助于可重復(fù)結(jié)果、 有效裂解和分離細(xì)胞的保存。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，分離細(xì)胞為活細(xì)胞。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明方法分離的細(xì)胞為活細(xì)胞(占分離的全部完整細(xì)胞的至少10 %、優(yōu)選至少30 %、更優(yōu)選至少50 %、甚至更優(yōu)選至少70 %、最優(yōu)選至少90 % )，并
可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培育。本文所用"活細(xì)胞"包括具有活性新陳代謝的細(xì)胞，優(yōu)選可增殖，特別是能夠繁殖的細(xì)胞。用本發(fā)明方法分離的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞(優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞)、真菌細(xì)胞、古生菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞或植物細(xì)胞。特別優(yōu)選選自以下的細(xì)胞李斯特氏菌屬(Listeria spp.)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、P. paratuberculosis、沙門氏菌屬 (Salmonella spp.)、空腸彎曲桿菌(C. jejuni)和婁地青霉(Penicillum roquefortii)。本發(fā)明方法允許分離具有或包含細(xì)胞壁的細(xì)胞。本發(fā)明特別允許分離一般的微生物細(xì)胞，優(yōu)選食品和病原微生物，特別是與人相關(guān)的微生物，例如可能存在于人食品中的微生物或與臨床相關(guān)的病原體。因此，本發(fā)明方法允許從高度復(fù)雜的樣品(如食品)中分離細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、古生菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞和植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述樣品為食品樣品、體液，尤其是血液、血漿或血清、水或組織樣品。特別優(yōu)選的樣品是具有復(fù)雜基質(zhì)(即尤其包含蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物等)和/
5或高粘度的樣品。食品樣品優(yōu)選為乳制品，優(yōu)選奶，尤其鮮奶、奶粉、酸奶、干酪或冰淇淋；魚產(chǎn)品， 優(yōu)選生魚；肉產(chǎn)品，優(yōu)選生肉、肉醬(meat rinse)或香腸；沙拉醬(salad rinse)、巧克力； 蛋或蛋產(chǎn)品，如蛋黃醬。特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法的食品樣品是通常已知包含可能的病原生物體(如單核細(xì)胞增生李斯特菌)的樣品，以及由于復(fù)雜的基質(zhì)用本領(lǐng)域已知方法從中幾乎不能提取細(xì)胞的樣品。尤其干酪是已知有復(fù)雜基質(zhì)和高粘度的食品。根據(jù)本發(fā)明，作為基質(zhì)溶解系統(tǒng)使用的提取液包含MgCl2和/或離子液體。如果存在，那么MgCl2通常以0. 5-3M、優(yōu)選0. 5-2M、更優(yōu)選1-2M的濃度存在。如果存在，那么離子液體通常以基于混合物重量的0. 5-20%重量、優(yōu)選1-10%重量的濃度存在。離子液體可以是一種離子液體或兩種以上離子液體的混合物。MgCl2*/或離子液體的最佳濃度主要視待溶解的樣品和待分離的細(xì)胞種類而定。 這些參數(shù)易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)試。在優(yōu)選實(shí)施方案中，提取液包含MgCl2或離子液體。本發(fā)明提取液為水溶液或緩沖溶液。其通常具有大于5和小于9的pH值，優(yōu)選大于6和小于8，更優(yōu)選6. 5-7. 5之間。提取液可另外包含可達(dá)20%的一種或多種水混溶性有機(jī)溶劑?？捎糜诒景l(fā)明方法的緩沖液優(yōu)選選自以下磷酸緩沖液、磷酸緩沖鹽緩沖液 (PBS)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(TRIS)緩沖液、TRIS緩沖鹽緩沖液(TBS)和TRIS/ EDTA (TE)。與已知方法相反，本發(fā)明方法優(yōu)選無(wú)去污劑，意即不將離子去污劑、兩性離子去污劑或非離子去污劑(如十二烷基硫酸鈉、CHAPS、Lutensol A0-7)加入到提取液中。當(dāng)然將一種或多種添加物加入到提取液中是可能的，添加物如去穩(wěn)定劑或有助于降解存在于特定樣品中的物質(zhì)的生物聚合物降解酶。如以下所論述，一個(gè)實(shí)施例是將淀粉降解酶加到包含大量膠原和/或淀粉的食品樣品中。通常在18°C -50°C、優(yōu)選25°C _45°C、更優(yōu)選30°C -42°C的溫度實(shí)施孵育。樣品通常與提取液孵育10分鐘-6小時(shí)、優(yōu)選20分鐘-1小時(shí)的時(shí)間。為了更加有效并以縮短時(shí)間溶解樣品，在升高的溫度下實(shí)施孵育有利。然而，應(yīng)注意視需要，升高的溫度不可以影響待分離細(xì)胞的生存力。樣品與提取液孵育并由此溶解和裂解樣品基質(zhì)后，可通過任何已知方法分離細(xì)胞，所述方法例如離心、過濾、介電電泳和超聲或親和結(jié)合，親和結(jié)合例如用優(yōu)選固定在珠粒上的抗體、凝集素、病毒結(jié)合蛋白、適配體或抗菌肽(AMP)。優(yōu)選通過過濾或離心來(lái)分離細(xì)胞，最優(yōu)選通過離心。離心通常在500-10000g、更優(yōu)選在1500_6000g、甚至更優(yōu)選在2000_5000g進(jìn)行。
離心步驟后，可在沉淀中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞，并可棄掉上清液。如果過濾樣品/提取液混合物，那么在過濾器的孔徑與待分離的細(xì)胞大小相適應(yīng)時(shí)，細(xì)胞留在所述過濾器表面。當(dāng)然，也可以使用有不同孔徑的不同過濾器進(jìn)行不止一次過濾步驟。過濾步驟后，可從過濾器表面洗滌細(xì)胞(參見例如Mevens KA和Jaykus L-A, Crit Rev Microbiol Q004) 30 :7_24)。當(dāng)復(fù)雜樣品包含幾乎不能或不能用本發(fā)明方法裂解的材料時(shí)，尤其需要過濾裂解的樣品。通常這些材料包含淀粉和/或纖維。然而，用于從裂解混合物分離細(xì)胞的優(yōu)選方法是離心。當(dāng)然，也可能從在離心步驟后形成的溶解的沉淀分離細(xì)胞，其通過用涉及抗體的免疫學(xué)方法，尤其是固定在珠粒(優(yōu)選磁珠)上的抗體，所述抗體針對(duì)待分離細(xì)胞上存在的表位。因?yàn)槭褂梅蛛x細(xì)胞的抗體珠粒在某些情況下造成回收率降低，所以所述方法可優(yōu)選主要用于定性分離。為有助于溶解樣品，所述樣品可在例如與提取液孵育前用stomacher勻漿。當(dāng)在孵育過程中攪動(dòng)樣品/提取液混合物時(shí)，進(jìn)一步支持和/或加速溶解。視樣品基質(zhì)而定，孵育步驟可以重復(fù)一次或幾次，例如兩次、三次、四次、五次或十次。在這些孵育步驟之間，細(xì)胞和殘余樣品基質(zhì)可通過例如離心與上清液分離?？蓪⒂帽景l(fā)明方法分離的細(xì)胞用于定量或定性測(cè)定樣品中的細(xì)胞。這可通過例如以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)；PCR方法，尤其是實(shí)時(shí)PCR ；用凝集素；或用涉及針對(duì)所述細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的抗體、病毒結(jié)合蛋白、適配體或抗菌肽(AMP)的方法(如細(xì)胞特異性ELISA或 RIA)。分離步驟后優(yōu)選用水、緩沖溶液和/或包含去污劑的溶液洗滌細(xì)胞。然而，在洗滌緩沖液中加入一種或多種添加物當(dāng)然是可能的。洗滌步驟可以重復(fù)若干次(例如2、3、4、5 或10次)或僅僅一次。在洗滌步驟過程中，通常將細(xì)胞重新懸浮在緩沖液中并隨后過濾或離心。如果在溶解樣品中存在不溶顆粒(例如干酪中的磷酸鈣顆粒)，那么可通過低轉(zhuǎn)速離心或通過顆粒隨時(shí)間沉降來(lái)去掉所述顆粒(在兩種情況下細(xì)胞都保留在上清液中)。也可用包含去污劑的溶液洗滌細(xì)胞。這將允許進(jìn)一步除去可能包含在細(xì)胞懸液中的脂肪殘余物。在該方法步驟中使用的優(yōu)選去污劑是那些常規(guī)用于脂肪除去的去污劑。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是提取液只包含中等濃度的MgCl2和/或離子液體而不包含去污劑。結(jié)果，相比于提取緩沖液通常包含去污劑和大量離液劑的已知方法，如果樣品基質(zhì)允許，意即如果所述基質(zhì)不包含例如需要用包含去污劑的洗滌緩沖液除去的脂肪殘余物，則可省去或顯著減少洗滌步驟。本方法的這一特征使可能縮短提取時(shí)間，并使可能在僅僅一次或兩次洗洗滌步驟后就可直接或至少近乎直接用在其它情況下會(huì)受離液物質(zhì)或去污劑的存在干擾的方法(如ELISA)來(lái)分析細(xì)胞。由于優(yōu)選提取液中不存在去污劑的事實(shí)，直接用與優(yōu)選固相支持體(如珠粒，尤其磁珠)結(jié)合的抗體分離細(xì)胞也是可能的。細(xì)胞與抗體的結(jié)合允許特異性分離特定類型的細(xì)胞。當(dāng)樣品包含多于一個(gè)細(xì)胞種類時(shí)，這尤其令人關(guān)注。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，測(cè)定樣品中的細(xì)胞數(shù)量?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)定樣品中的細(xì)胞數(shù)量，尤其是通過微生物學(xué)方法(如系列稀釋)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、FACS分析、實(shí)時(shí)PCR等。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案，分離細(xì)胞DNA或RNA。視細(xì)胞而定，可采取各種方法用于提取DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒)或RNA(如 mRNA)。本領(lǐng)域已知所有這些方法，單個(gè)方案主要取決于待裂解的細(xì)胞。分離可能進(jìn)一步要求加入例如溶菌酶等酶。為了增加樣品的裂解，尤其高粘度樣品(如干酪)，在與提取液孵育前用 stomacher或混合器處理所述樣品。
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為了測(cè)定或監(jiān)測(cè)分離程序的效率，樣品可摻入規(guī)定量的對(duì)照細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞通常為細(xì)菌細(xì)胞(優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞)、真菌細(xì)胞、古生菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞或植物細(xì)胞。優(yōu)選其與假設(shè)存在于樣品中的細(xì)胞相似，但優(yōu)選其與假設(shè)存在于樣品中的細(xì)胞不相同?；厥盏膿饺氲膶?duì)照細(xì)胞的數(shù)量使得可測(cè)定本發(fā)明方法的效率，并還可以表明初始樣品中存在的待分離及待測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量。亦可將樣品與對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)滲透脅迫保護(hù)特性的化合物預(yù)孵育。為了提高細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的抗性，包含(可能的)待分離細(xì)胞的樣品可以與至少一種能夠在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)滲透保護(hù)反應(yīng)的化合物一起孵育。表現(xiàn)所述特性并優(yōu)選用于本發(fā)明方法的化合物是甜菜堿和/或β -賴氨酸。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，樣品進(jìn)一步與至少一種生物聚合物降解酶一起孵育。從其中分離出細(xì)胞的某些樣品包含生物聚合物結(jié)構(gòu)，通過加入提取液不可或僅以低效率方式裂解生物聚合物。如果樣品尤其食品樣品，例如包含例如超過10%的膠原和/ 或淀粉的量，則所述樣品在與本發(fā)明的基質(zhì)裂解系統(tǒng)孵育前可用能夠至少部分降解膠原和淀粉成分的物質(zhì)處理。因此，樣品優(yōu)選進(jìn)一步與至少一種生物聚合物降解酶一起孵育。優(yōu)選與生物聚合物降解酶孵育的樣品為例如肉、魚等。冰淇淋、蛋、血、奶、乳制品等通常不需要加入生物聚合物降解酶。令人驚訝的結(jié)果是，單獨(dú)使用酶不能使得分離細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)"生物聚合物"，指蛋白質(zhì)、多肽、核酸、諸如纖維素、淀粉和糖原等多糖。因此，"生物聚合物降解酶"是能將可能不溶于水性緩沖液的生物聚合物(如淀粉、 纖維素)降解為低分子物質(zhì)或甚至單體的酶。因?yàn)樯锞酆衔锝到饷缚稍谔囟≒H和溫度條件下有活性(使用特定緩沖液也可以起作用)，所以在任選條件下與所述酶孵育是有利的。這些條件視所用的酶而定，且在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?。孵育時(shí)間也視外在因素如PH和溫度而定。因此孵育時(shí)間可以在10秒-6小時(shí)之間變化，優(yōu)選30秒-2小時(shí)。生物聚合物降解酶優(yōu)選選自蛋白酶、纖維酶和淀粉酶。這些酶的實(shí)例是Mvinase 24 GTT (枯草菌素)、CarenZyme 900T, Stainzyme GT0淀粉降解酶為例如環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶和異淀粉酶，特別是α-淀粉酶。在使用包含離液劑和去污劑的緩沖液的已知方法中，不能在基質(zhì)裂解步驟期間加入生物聚合物降解酶，因?yàn)殡x液劑和去污劑可以負(fù)面影響酶活性，使得生物聚合物不能有效降解為片段或單體。與此相反，在本發(fā)明方法中，可在步驟b)之前和/或步驟b)期間和/或步驟C) 之后將生物聚合物降解酶與樣品一起孵育(步驟b)為其中樣品與提取液一起孵育的裂解步驟，而步驟C)為分離步驟)。可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)通常是1-6小時(shí)內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法。本發(fā)明中所用的離子液體或液體鹽是由有機(jī)陽(yáng)離子和通常無(wú)機(jī)陰離子構(gòu)成的離子物類。它們不含有任何中性分子，并通常具有低于373K的熔點(diǎn)。離子液體領(lǐng)域目前正加緊研究，因?yàn)槠淇赡艿膽?yīng)用是多方面的。關(guān)于離子液體的綜述論文為例如R. Sheldon" Catalytic reactions in ionic liquids(離子液體中的催化反應(yīng))〃，Chem. Commun.，2001，2399-2407 ；M. J. Earle, K. R. Seddon “ Ionicliquids. Green solvent for the future (離子液體，未來(lái)的綠色溶齊[J )“,
Pure Appl.Chem. ,72 (2000),1391-1398 ；P.ffasserscheid, W.Keim “ Ionische
〃
Flussigkeiten-neue Losungen fur die Ubergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids-NovelSolutions for Transition-Metal Catalysis ( 1 ^ ^ - fflTilyJS^M 催化的新型溶液)]，Angew. Chem.，112 (2000), 3926-3945 ；Τ. Welton “ Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis (室溫離子液體，用于合成及催化的溶劑)“，Chem. Rev.，92 (1999)，2071-2083 ；或 R. Hagiwara, Ya. Ito “ Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions ( 唑陽(yáng)離子及氟代陰離子的室溫離子液體)“，J. Fluorine Chem.，105 (2000)，221-227)。一般情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有通式K+A_離子液體，尤其是與水混溶的離子液體，適于本發(fā)明方法。離子液體的陰離子A—優(yōu)選選自鹵化物、四氟硼酸鹽、六氟磷酸鹽、氰胺、硫氰酸鹽或通式[N(Rf)2F或通式[N(XRf)2F的酰亞胺，其中&代表具有1至8個(gè)C原子的部分地或完全被氟-取代的烷基，X代表或C0。本文鹵化物陰離子可選自氯化物、溴化物和碘化物陰離子，優(yōu)選氯化物和溴化物陰離子。離子液體的陰離子Α—優(yōu)選為鹵化物陰離子，尤其溴化物和碘化物陰離子，或四氟硼酸鹽或氰胺或硫氰酸鹽。有關(guān)離子液體的陽(yáng)離子K+的選擇本身沒有限制。然而，優(yōu)選有機(jī)陽(yáng)離子，尤其優(yōu)選的是銨、鱗、IItg、硫脲輸、胍揭 1或雜環(huán)陽(yáng)離子。銨陽(yáng)離子可例如通過式(1)來(lái)描述[NR4]+ (1)，其中在所有情況下R都彼此獨(dú)立，其代表H，其中不能所有取代基R同時(shí)為H ；OR' ,NR' 2，前提為式(1)中至多一個(gè)取代基R為OR' ,NR' 2 ；具有1-20個(gè)C原子的直鏈或支鏈烷基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈烯基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈炔基；具有3-7個(gè)C原子的飽和、部分或完全不飽和的環(huán)烷基，其可以被具有1-6個(gè)C 原子的烷基取代，其中一個(gè)或多個(gè)R可部分或完全被鹵素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) 0H、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2 取代，且R中不是在α-位置的一個(gè)或兩個(gè)非相鄰碳原子可被選自以下的原子和/或原子基團(tuán)置換-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N+R' -P (O)R' O-,-C(O) NR' -SO2NR' -、-OP (O)R' 0_、-P(O) (NR' 2) NR' -、-PR' 2 = N-或-P (O)R'-，其中 R'可=H、未氟化、部分氟化或全氟化的C1-至C6-烷基、C3-至C7-環(huán)烷基、未取代或取代的苯基，且X可=鹵素。鱗陽(yáng)離子可例如通過式O)闡述[PR24]+ (2)，其中在所有情況下R2彼此獨(dú)立，其表示
H、OR，或 NR' 2 ；具有1-20個(gè)C原子的直鏈或支鏈烷基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈烯基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈炔基；具有3-7個(gè)C原子的飽和、部分或完全不飽和的環(huán)烷基，其可以被具有1-6個(gè)C 原子的烷基取代，其中一個(gè)或多個(gè)R2可部分或完全被鹵素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) OH、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2 取代，且R2中不在α -位置的一個(gè)或兩個(gè)非相鄰碳原子可被選自以下的原子和/或原子基團(tuán)置換-0_、-S-、-S(0)-、-SO2-, -SO2O-, -C(O)-, C(0)0-、-N+R' 2_、-P(O)R' 0_、-C(O) NR' -SO2NR' -、-OP (O)R' 0_、-P(O) (NR' 2) NR' -、-PR' 2 = N-或-P (O)R'-，其中 R'為H、未氟化、部分氟化或全氟化的C1-至C6-烷基、C3-至C7-環(huán)烷基、未取代或取代的苯基，且X =鹵素。然而，排除其中所有四個(gè)或三個(gè)取代基R和R2完全被鹵素取代的式(1)和O)中的陽(yáng)離子，所述情況例如三(三氟甲基)甲基銨陽(yáng)離子、四(三氟甲基)銨陽(yáng)離子或四(九氟丁基)銨陽(yáng)離子。脲餘祁日離子可例如通過式(3)闡述[ (R3R4N) -C ( = OR5) (NR6R7) ] + (3)，而硫脲鍋t陽(yáng)離子通過式⑷闡述[ (R3R4N) -C ( = SR5) (NR6R7) ] + (4),其中R3至R7各自彼此獨(dú)立地表示氫，其中對(duì)于R5排除氫；具有1-20個(gè)C原子的直鏈或支鏈烷基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈烯基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈炔基；具有3-7個(gè)C原子的飽和、部分或完全不飽和的環(huán)烷基，其可以被具有1-6個(gè) C原子的烷基取代，其中取代基R3至R7中的一個(gè)或多個(gè)可部分或完全被鹵素取代，尤其-F 和 / 或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) OH、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2取代，且R3至R7中不在α -位置的一個(gè)或兩個(gè)非相鄰碳原子可被選自以下的原子和/或原子基團(tuán)置換-o-、-S-、-S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, C(O) 0-、-N+R ‘ 2_、-P(O)R ‘ 0-、-C(O)NR ‘ -、-SO2NR ‘ -、-OP(O)R ‘ 0_、-P(O) (NR ‘ 2) NR' -,-PR' 2 = Ν-或-P(O)R' _，其中R' = H、未氟化、部分氟化或全氟化的C「至C6-烷基、C3-至C7-環(huán)烷基、未取代或取代的苯基，且X =鹵素。胍麵t陽(yáng)離子可例如通過式(5)來(lái)闡述[C (NR8R9) (NR10Rn) (NR12R13) ] + (5)，其中R8至R13各自彼此獨(dú)立地表示氫、-CN、NR'2、-0R'；具有1-20個(gè)C原子的直鏈或支鏈烷基；
具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈烯基；具有2-20個(gè)C原子和一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈炔基；具有3-7個(gè)C原子的飽和、部分或完全不飽和的環(huán)烷基，其可以被具有1-6個(gè) C原子的烷基取代，其中取代基R8至R13中的一個(gè)或多個(gè)可部分或完全被鹵素取代，尤其-F 和 / 或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) OH、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2取代，且R8至R13中不在α -位置的的一個(gè)或兩個(gè)非相鄰碳原子可被選自以下的原子和/或原子基團(tuán)置換-o-、-S-、-S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, C (0) 0-、-N+R ‘ 2_、-P (0) R ‘ 0-、-C (0) NR ‘ -、-SO2NR ‘ -、-OP (0) R ‘ 0_、-P (0) (NR ‘ 2) NR' -,-PR' 2 = Ν-或-P(O)R' _，其中R' = H、未氟化、部分氟化或全氟化的C「至C6-烷基、C3-至C7-環(huán)烷基、未取代或取代的苯基，且X =鹵素。此外，可利用通式(6)的陽(yáng)離子[HetN]+ (6)，其中HetN+表示選自以下基團(tuán)的雜環(huán)陽(yáng)離子
權(quán)利要求
1.用于從復(fù)雜樣品中分離細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟a)提供復(fù)雜樣品；b)將所述樣品與包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液孵育；c)從步驟b)的混合物中分離所述細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟c)中分離的所述細(xì)胞至少30%是活細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述復(fù)雜樣品為食品或臨床樣品。
4.權(quán)利要求1-3中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，所述提取液包含濃度為0.5-3M的 MgCl2。
5.權(quán)利要求1-4中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1-5中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，所述提取液不包含去污劑。
7.權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，在步驟b)之前向所述樣品中摻入規(guī)定量的對(duì)照細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1-7中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，將所述樣品與表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的滲透脅迫保護(hù)特性的化合物預(yù)孵育。
9.權(quán)利要求1-8中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，將所述樣品進(jìn)一步與至少一種生物聚合物降解酶孵育。
10.權(quán)利要求1-9中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于，在另外的步驟d)中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、PCR方法、通過使用凝集素或通過涉及針對(duì)所述細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的抗體、抗菌肽(AMP)、適配體或病毒結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，來(lái)分析細(xì)胞。
11.用于從復(fù)雜樣品中分離細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括 -包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液，和-至少一種生物降解酶。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其特征在于，所述生物降解酶選自蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從樣品中分離細(xì)胞的方法和試劑盒。用包含至少M(fèi)gCl2和/或離子液體的提取液處理樣品，這導(dǎo)致分離優(yōu)選活細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N1/02GK102459567SQ201080027681
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者M·瓦格納, P·J·梅斯特, P·羅斯馬尼特 申請(qǐng)人:默克專利股份公司