可誘導(dǎo)共表達系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】可誘導(dǎo)共表達系統(tǒng)
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年8月5日提交的美國臨時申請No. 61/679,751和2012年12 月29日提交的美國臨時申請No. 61/747,246的利益，其全部公開通過引用引入本文。
[0003] 序列表的引用
[0004] 本申請包括電子提交的序列表，其通過引用引入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明總體屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)生產(chǎn)的技術(shù)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明屬于 重組蛋白質(zhì)表達的技術(shù)領(lǐng)域。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 生物技術(shù)物質(zhì)的產(chǎn)生是復(fù)雜的過程，在所需的產(chǎn)物是不同基因編碼的分子的組合 (如由兩個或更多個不同多肽形成的多聚蛋白質(zhì)）時更是如此。多個基因產(chǎn)物的成功共 表達需要克服多種挑戰(zhàn)，而這由于多于一個基因產(chǎn)物的同時表達而復(fù)雜化。必須克服的問 題包括當(dāng)使用多于一個類型的載體時產(chǎn)生相容的表達載體；獲得正確化學(xué)計量比的產(chǎn)物； 產(chǎn)生正確折疊的和對于結(jié)合伴體的處于正確構(gòu)象的基因產(chǎn)物；從細胞和不希望的蛋白質(zhì)如 未正確折疊的和/或處于不正確構(gòu)象中的蛋白質(zhì)純化出所需的產(chǎn)物；和最小化包涵體的形 成，其作為最大化所需產(chǎn)物的產(chǎn)率的一個方面。已經(jīng)采取了許多不同的途徑來解決這些挑 戰(zhàn)，但仍有對于更好的共表達方法的需要。
[0008] 幾種可誘導(dǎo)的細菌蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)（包括含有Iac和ara啟動子的質(zhì)粒）已設(shè) 計用于表達單個蛋白質(zhì)。這些系統(tǒng)在難以表達的蛋白質(zhì)的共表達中具有有限的用途，因為 它們不能在野生型大腸桿菌的整個生長培養(yǎng)物群體內(nèi)同質(zhì)地（homogenously)誘導(dǎo)蛋白質(zhì) (Khlebnikov 和 Keasling, "Effect of IacY expression on homogeneity of induction from the Ptac and Ptrc promoter by natural and synthetic inducers", Biotechnol Prog 2002May-Jun ;18 (3) :672-674)。當(dāng)誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)運蛋白的表達依賴于誘導(dǎo)劑的存在時，如在 野生型大腸桿菌Iac和ara系統(tǒng)的情況中，誘導(dǎo)劑的細胞濃度必須達到閾值水平以啟動轉(zhuǎn) 運蛋白的產(chǎn)生，但一旦達到該閾值，非受控的正反饋環(huán)可以出現(xiàn)，其結(jié)果是細胞中誘導(dǎo)劑的 高水平和相應(yīng)地來自誘導(dǎo)型啟動子的高水平表達："全或無"現(xiàn)象。提高生長培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 劑的濃度增加了群體中處于高表達模式的細胞的比例。雖然這種類型的系統(tǒng)導(dǎo)致在群體規(guī) 模下蛋白質(zhì)表達的濃度依賴性誘導(dǎo)，但其對于需要對表達的緊密控制的蛋白質(zhì)（包括為毒 性的、具有不良溶解性或因為其它原因要求特定濃度的那些）的表達和產(chǎn)生不是最佳的。
[0009] 已經(jīng)進行了一些嘗試以通過消除誘導(dǎo)劑依賴性的誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)運而在單一啟動子表 達系統(tǒng)中解決"全或無"誘導(dǎo)的現(xiàn)象。一個實例是在乳糖滲透酶基因 （lac Yam)中產(chǎn)生無 效突變和使用Iac啟動子的可選誘導(dǎo)劑如IPTG (異丙基-硫代-D-半乳糖苷），其可以在 不存在轉(zhuǎn)運蛋白的情況下在一定程度上穿過細胞膜（Jensen等，"The use of lizc-type promoter in control analysis"，Eur J Biocheml993Jan 15 ;211 (1-2):181-191)〇 另 一途徑是在阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白基因缺陷但具有乳糖滲透酶基因中的突變IacY(A117C) (這允許其轉(zhuǎn)運阿拉伯糖到細胞中）的菌株中使用阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子（Morgan-Kiss 等,"Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coli araBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity", Proc Natl Acad Sci U S A 2002May 28;99(ll):7373-7377)。
[0010] 單個蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的成分通常是不相容的，排除了其在共表達系統(tǒng)中的使用， 因為它們可能受到不同誘導(dǎo)劑-啟動子系統(tǒng)之間"交互"效應(yīng)的不利影響，或需要相互排斥 的基因組修飾，或經(jīng)歷一般的代謝調(diào)節(jié)。解決Iac和ara誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)之間的"交互" 問題的嘗試包括AraC轉(zhuǎn)錄激活劑的定向進化以改善其在IPTG(lac啟動子的誘導(dǎo)劑）存 在下誘導(dǎo) araBAD 啟動子的能力（Lee 等，"Directed evolution of AraC for improved compatibility of arabinose-and lactose-inducible promoters"，Appl Environ Microbiol 2007S?。?3 (18) :5711-5715 ;Epub 2007Jul 20)。但是，基于 ara 和 lac 誘導(dǎo) 型啟動子的表達載體之間的相容性仍然由于對于相互排斥的基因組修飾的需要而受到限 制：對于通過阿拉伯糖對araBAD啟動子的同質(zhì)誘導(dǎo)需要IacY點突變（IacY(A117C))和 對于通過IPTG對Iac啟動子的同質(zhì)誘導(dǎo)需要無效IacY基因。一般代謝調(diào)節(jié)-例如，碳分 解代謝產(chǎn)物阻遏（CCR)-也可以影響誘導(dǎo)型啟動子的相容性。CCR特征在于當(dāng)存在更優(yōu) 選的化合物時含碳化合物利用所需的基因的阻遏，如在葡萄糖先于其它糖優(yōu)先利用中看 到的。在ara和prp誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)的情況中，阿拉伯糖的存在降低了丙酸鹽誘導(dǎo)來 自prpB⑶E啟動子的表達的能力，一種據(jù)信涉及CCR的效應(yīng)（Park等，"The mechanism of sugar-mediated catabolite repression of the propionate catabolic genes in Escherichia coli"，Gene2012Aug I ;504(l):116-121，Epub 2012May 3)。顯然存在著對 于克服這些問題的可誘導(dǎo)共表達系統(tǒng)的需要。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明提供了能夠受控地誘導(dǎo)各基因產(chǎn)物組分的可誘導(dǎo)共表達系統(tǒng)。
[0013] 本發(fā)明的一個實施方式是一種宿主細胞，其包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建 體，其中各類型的所述表達構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動子和編碼基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，所 述多核苷酸序列由所述誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄，其中（1)至少一個所述誘導(dǎo)型啟動子對其作出 響應(yīng)的誘導(dǎo)劑不是另一個所述誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)劑；且至少一個所述基因產(chǎn)物與另一個 所述基因產(chǎn)物形成多聚體；或（2)至少一個所述基因產(chǎn)物選自以下：（a)缺乏信號肽并形成 至少三個二硫鍵的多肽；(b)選自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶的多肽；和（C)選自木質(zhì) 素降解過氧化物酶的多肽。本發(fā)明的另一個實施方式是包含兩個或更多個類型的表達構(gòu) 建體的宿主細胞，其中各類型的所述表達構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動子和編碼基因產(chǎn)物的多核 苷酸序列，所述多核苷酸序列由所述誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄；其中各誘導(dǎo)型啟動子不是乳糖誘 導(dǎo)啟動子；且其中至少一個所述基因產(chǎn)物是形成至少兩個二硫鍵的多肽，或形成至少兩個 和少于十七個二硫鍵，或形成至少兩個和少于十個二硫鍵，或形成選自兩個、三個、四個、五 個、六個、七個、八個和九個的多個二硫鍵的多肽。在本發(fā)明的一些實施方式中，這一宿主 細胞是原核細胞，且在一些情況中，它是大腸桿菌細胞。在本發(fā)明的其它實施方式中，宿主 細胞是真核細胞，且在一些情況中，它是酵母細胞，且在進一步的情況中，它是釀酒酵母細 胞。在進一步的實施方式中，宿主細胞包含的表達構(gòu)建體各自包含至少一個誘導(dǎo)型啟動子， 其中所述誘導(dǎo)型啟動子是L-阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子或丙酸鹽誘導(dǎo)啟動子，或選自araBAD啟 動子、prpBCDE啟動子、rhaSR啟動子和xlyA啟動子，或者其中所述誘導(dǎo)型啟動子不是乳糖 誘導(dǎo)啟動子。在另外的實施方式中，宿主細胞包含的至少一個表達構(gòu)建體進一步包含編碼 與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的多核苷酸序列；在一些實施方式中，編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 的多核苷酸序列及所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子與其結(jié)合的誘導(dǎo)型啟動子在相同的表達構(gòu)建體中；且在 更進一步的情況中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子選自AraC、PrpR、RhaR和XylR ;或特別地為AraC或PrpR。 在某些實施方式中，宿主細胞包含的至少一個表達構(gòu)建體通過包括將多核苷酸序列插入選 自 pBAD18、pBAD18-Cm、pBAD18-Kan、pBAD24、pBAD28、pBAD30、pBAD33、pPR018、pPR018-Cm、 pPR018-Kan、pPR024、pPR030和pPR033的質(zhì)粒中，或特別地插入pBAD24或pPR033中的步 驟的方法產(chǎn)生。本發(fā)明的其它實施例包括包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建體的宿主細 胞，其中各類型的所述表達構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動子和編碼基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，其 中至少一個基因產(chǎn)物是多肽，或選自以下：(a)免疫球蛋白重鏈、(b)免疫球蛋白輕鏈和（c) (a)-(b)中任一的片段，或者是免疫球蛋白輕鏈，或者是免疫球蛋白重鏈；或者是英夫利昔 單抗重鏈或輕鏈或者其片段，或者分別在SEQ ID N0:30或SEQ ID N0:31的至少50%或 80%的長度上具有與SEQ ID N0:30或SEQ ID NO:31的至少80%或90%的氨基酸序列同 一性，或者具有SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
[0014] 在本發(fā)明的另外的實施方式中，宿主細胞包含兩個或更多個類型的表達構(gòu)建體， 其中各類型的所述表達構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動子和編碼基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，所述多 核苷酸序列由所述誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄；其中至少一個基因產(chǎn)物是缺乏信號肽并形成至少三 個二硫鍵，或者至少三個和少于十七個二硫鍵，或者至少