專利名稱：牛胚胎性別簡易鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中胚胎性別鑒定方法，尤其是涉及一種牛胚胎性別簡易鑒定方法。
背景技術(shù)：
隨著動物繁殖技術(shù)的不斷進(jìn)步，奶牛胚胎移植工業(yè)得到了快速發(fā)展，如同期發(fā)情，超數(shù)排卵，胚胎移植等技術(shù)都趨于成熟，為良種奶牛的迅速繁育提供了技術(shù)支持。而在奶牛的繁育過程中，產(chǎn)犢的性別對經(jīng)濟(jì)效益有著巨大的影響，生產(chǎn)母牛成為該領(lǐng)域急需要克服的技術(shù)難點(diǎn)。目前，性控胚胎的生產(chǎn)主要有胚胎性別鑒定和使用性控精液兩種，這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，傳統(tǒng)的胚胎性別鑒定主要用PCR方法，設(shè)計(jì)兩對特異引物，用幾個(gè)卵裂球就可以擴(kuò)增目的片斷。但是操作繁瑣耗時(shí)，且需要PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)等昂貴設(shè)備。
目前，國內(nèi)外還沒有用dNTP沉淀法來鑒定反應(yīng)結(jié)果的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述背景技術(shù)中的不足之處，提供一種牛胚胎性別簡易鑒定方法，其操作簡便、鑒定快速、準(zhǔn)確率高、實(shí)用性強(qiáng)，并可利用此項(xiàng)方法生產(chǎn)出胚胎性別診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種牛胚胎性別簡易鑒定方法，其特殊之處在于包括以下步驟1)首先根據(jù)牛特異序列和牛雄性特異序列設(shè)計(jì)下列引物，每條引物分別有6條，能夠識別6個(gè)位點(diǎn)，其序列是
雄性特異引物S1P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS1P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCCS1P3 ATCCCATGGATGGAGGAGCS1P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCCS1P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTATS1P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS2P1 CCATGGACTGTCGCCTATS2P2 AGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS2P3 ATCCCATGGATGGAGGAGCS2P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCCS2P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTATS2P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS3P1 GAAAGTGAAAGAAATTAGTTGCS3P2 CTGATTTACATTTTGCTAAGGGCS3P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAGS3P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS3P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS3P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC牛特異性引物B1P1 AGGGCCAATAGACCTCATCTB1P2 TCGCGACCTCTCTCCAAACB1P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB1P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB1P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB1P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTTB2P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB2P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB2P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB2P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB2P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB2P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTTB3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB3P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
2)將上述引物置入反應(yīng)液A中，其中各成份終濃度為引物P1、P2各為40～60pMol/L；P3、P4各為20～40pmol/L；P5、P6各為8～25pmol/L；配制dNTPs反應(yīng)底物為1.5～3.0mM，貝它定為0.6～1.0M，Mg2+為2～8mM；3)將含有所要鑒定胚胎卵裂球蒸餾水，與20μL A溶液混合，反應(yīng)總體積為25μL；95～100℃加熱5min，冰浴，再加B液，B液各成份濃度為8000u/mlBstDNA聚合酶，50mM KCL，10mM Tris-HCL(pH 7.5)，0.1mM EDTA，1mMDTT，0.1％TritonX-100和50％甘油，聚合酶58～67℃恒溫?cái)U(kuò)增30～60min；4)根據(jù)以上引物合成產(chǎn)物序列呈大小不同的片斷，電泳結(jié)果見陽性泳道有多條大小不同的序列條帶，而且不同引物之間所生成的條帶紋不同，根據(jù)條帶分布特征，即可判定是哪組引物反應(yīng)的結(jié)果；5)反應(yīng)結(jié)束后，鑒定結(jié)果時(shí)，在反應(yīng)體系中加入C液，即0.5～5μLdNTP沉積液，如果反應(yīng)管中15s內(nèi)呈現(xiàn)白色沉淀聚集，特別在沉積液與反應(yīng)液界面出現(xiàn)環(huán)狀白色沉淀，而上下液面清澈，隨后沉淀層顏色變暗，最后沉淀于反應(yīng)管底部。此結(jié)果證明反應(yīng)體系中還有大量的dNTP存在，表明反應(yīng)沒有進(jìn)行，據(jù)此可判定結(jié)果為陰性。相反，當(dāng)加入沉淀液后，反應(yīng)管內(nèi)無顯著變化，表明反應(yīng)體系中，反應(yīng)底物dNTP消耗殆盡，結(jié)果判定為陽性。
包括胚胎性鑒定試劑盒，盒中包括3部分，A管為反應(yīng)體系液，包括引物；B管為恒溫?cái)U(kuò)增酶；C管為反應(yīng)鑒定所用的dNTPs沉積液。
上述的每條引物其中的4條短引物長度18～25bp，兩條長引物長度在38～43bp。
反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入無毒無副作用的重金屬陽離子供體試劑，通過觀察有無沉淀反應(yīng)來判定結(jié)果，若反應(yīng)液中部出現(xiàn)典型的白色條帶為陰性，反之則為陽性，添加后15s得出結(jié)論，所述的重金屬陽離子供體試劑為0.01～1.0mMCuSO4溶液。
將所取胚胎細(xì)胞直接加于反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)，無需分步處理。
擴(kuò)增時(shí)使用PCR儀恒溫?cái)U(kuò)增或水浴鍋，恒溫?cái)U(kuò)增溫度為63℃，擴(kuò)增時(shí)間為45min，反應(yīng)結(jié)束后，80℃下2min終止反應(yīng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1、本發(fā)明針對牛特異序列和牛雄性特異序列設(shè)計(jì)引物，采用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Notomi T.，et al.，Nucleic Acids Res 2000；28e63)完成反應(yīng)。該反應(yīng)體系僅需要水浴鍋，且反應(yīng)迅速(1h內(nèi)反應(yīng)完全)，鑒定效率提高，而且靈敏度比PCR高，為胚胎性別的鑒定提供了新的方法和途徑。結(jié)果判定上采用了獨(dú)立發(fā)明的dNTP沉淀法，替代濁度儀，使胚胎性別鑒定程序更加簡化。該項(xiàng)發(fā)明成本僅為同類產(chǎn)品的1/10，而且操作簡便，完全可應(yīng)用于臨床生產(chǎn)。
2、本發(fā)明血液基因組鑒定率達(dá)100％，胚胎性別鑒定率為99.0％以上，由于要求技術(shù)簡單，易操作，形成的胚胎性別鑒定試劑盒完全可以應(yīng)用于生產(chǎn)，且成本僅為同類產(chǎn)品的1/10。該方法在加樣，反應(yīng)過程和鑒定結(jié)果都簡化，為此也稱ABC法。
3、本發(fā)明反應(yīng)過程無需使用價(jià)值昂貴的PCR儀，僅需要58～67℃水浴鍋等簡單設(shè)備。
4、本發(fā)明在反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果鑒定無需采用電泳法，直接采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的dNTPs沉淀法，即反應(yīng)體系中引入無毒無副作用的重金屬陽離子供體試劑，通過觀察有無沉淀反應(yīng)來判定結(jié)果。若反應(yīng)液中部出現(xiàn)典型的白色條帶為陰性，反之則為陽性，15s得出結(jié)論。
四

圖1是恒溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)位置示意圖；圖2是擴(kuò)增反應(yīng)體系中，形成DNA產(chǎn)物的基本單元結(jié)構(gòu)示意圖，形成啞鈴型。
圖3為胚胎鑒定后，即使用雄性引物反應(yīng)后，體系中添加dNTP沉積液，中間出現(xiàn)的沉淀效果圖，1、2、4和6號有沉淀出現(xiàn)。3、5和7號沒有。
圖4為胚胎性別鑒定后，電泳驗(yàn)證結(jié)果，即1、2、4和6號有條帶出現(xiàn)，3、5和7號沒有。
圖5為用牛特異性引物電泳結(jié)果圖，全部為陽性，說明基因全部來源于牛胚胎細(xì)胞。
五具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是鑒定牛胚胎性別。發(fā)明設(shè)計(jì)了一組引物，并且建立了一套快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、簡單且實(shí)用的牛早期胚胎性別鑒定方法。
本發(fā)明因整個(gè)鑒定程序簡化，所以命名為ABC法A在英文為Adding，義為加樣簡化；B為Bathing，取水浴之意，反應(yīng)條件即為恒溫水浴即可；C為Checking，結(jié)果判定簡單化。
本發(fā)明將此試劑盒分為3部分，分別為A管，B管和C管。A管內(nèi)包含緩沖液、Mg2+、引物、貝它定(Sigma)、dNTP和純水；B管為BstDNA恒溫聚合酶(NewEngland Biolabs，USA)C管為dNTP沉淀液。
引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)中，采用識別6個(gè)位點(diǎn)，提高了反應(yīng)靈敏性，準(zhǔn)確性。針對每一特異序列設(shè)計(jì)6條引物，設(shè)計(jì)原則為(見圖1)引物1 A1引物2 B1引物3 C1引物4 C2
引物5 A2+A3引物6 B3+B2其中A1與B1間距不超過350bp，A3與B3間距為0～60bp，A2與A3間距為20～100bp，而且A1(B1)可以與A2(B2)重疊。
根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，反應(yīng)獲得啞鈴型序列結(jié)構(gòu)單元(見圖2)，以該單元為核心，進(jìn)行裂變式增值或延長，基本無反應(yīng)抑制，使反應(yīng)得以迅速進(jìn)行。
在引物設(shè)計(jì)中，A1與B1的Tm值設(shè)定在58℃～66℃，其它引物則為50℃～66℃。
P1、P4引物序列長17～25bp；P5、P6為36～43bp。
本試驗(yàn)依據(jù)Genbank中公布的牛特異性序列(gnV00125)和雄性特異性序列(gnD16357)設(shè)計(jì)下列幾組引物。
雄性特異引物S1P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS1P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCCS1P3 ATCCCATGGATGGAGGAGCS1P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCCS1P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTATS1P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS2P1 CCATGGACTGTCGCCTATS2P2 AGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS2P3 ATCCCATGGATGGAGGAGCS2P4 CAGGAATCCAAACCCAGGTCTCCS2P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGAS2P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS3P1 GAAAGTGAAAGAAATTAAGTTGC
S3P2 CTGATTTACATTTTGCTAAGGGCS3P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAGS3P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS3P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS3P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAGS4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC牛特異性引物B1P1 AGGGCCAATAGACCTCATCTB1P2 TCGCGACCTCTCTCCAAACB1P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB1P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB1P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB1P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTTB2P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB2P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB2P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB2P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB2P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB2P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB3P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT根據(jù)以上引物合成產(chǎn)物序列呈大小不同的片斷，電泳結(jié)果見陽性泳道有多條大小不同的序列條帶。而且不同引物之間所生成的條帶紋不同，據(jù)條帶分布特征，即可判定是哪組引物反應(yīng)的結(jié)果。
反應(yīng)液A含有P1～P6六條引物，引物終濃度為P1、P2各為40～60pMol/L；P3、P4各為20～40pmol/L；P5、P6各為8～25pmol/L。dNTPs為1.5～3.0mM，Betaine(sigma)為0.6～1.0M，Mg2+為2～8mM。
胚胎細(xì)胞的采集方法本發(fā)明采用了切割法和抽吸法，胚胎切割液和抽吸液為磷酸緩沖液，含1mg/mL聚乙烯吡絡(luò)烷酮。
胚胎DNA提取方法本發(fā)明采用加熱變性法，將含有所要鑒定胚胎卵裂球5μL的提取液(磷酸緩沖液，含1mg/mL聚乙烯吡絡(luò)烷酮)與20μL A溶液混合，反應(yīng)總體積為25μL。95～100℃加熱5min，冰浴，再加B液聚合酶58～67℃恒溫?cái)U(kuò)增30～60min。
在水浴反應(yīng)中，由變性水浴和恒溫水浴組成，也可用其他設(shè)備替代水浴鍋，如PCR儀，加熱板等。
反應(yīng)結(jié)束后，加C液即沉淀液，觀察結(jié)果。
本發(fā)明的胚胎性別結(jié)果鑒定，不是使用傳統(tǒng)的電泳法來鑒定反應(yīng)產(chǎn)物，而是根據(jù)反應(yīng)體系特有的反應(yīng)迅速徹底，反應(yīng)底物dNTPs含量在反應(yīng)前后的顯著變化，設(shè)計(jì)出底物沉淀法來鑒定反應(yīng)結(jié)果。試驗(yàn)中通過凝膠電泳法驗(yàn)證，結(jié)果一致。
鑒定結(jié)果時(shí)，在反應(yīng)體系中加入0.5～5μLdNTP沉積液，如果反應(yīng)管中15s內(nèi)呈現(xiàn)白色沉淀聚集，特別在沉積液與反應(yīng)液界面出現(xiàn)環(huán)狀白色沉淀，而上下液面清澈，隨后沉淀層顏色變暗，最后沉淀于反應(yīng)管底部。此結(jié)果證明反應(yīng)體系中還有大量的dNTP存在，表明反應(yīng)沒有進(jìn)行，據(jù)此可判定結(jié)果為陰性。相反，當(dāng)加入沉淀液后，反應(yīng)管內(nèi)無顯著變化，表明反應(yīng)體系中，反應(yīng)底物dNTP消耗殆盡，結(jié)果判定為陽性。
本發(fā)明經(jīng)過多次試驗(yàn)表明，金屬離子可以使dNTP產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，特別是重金屬離子。在配制沉積液時(shí)，將一定濃度的金屬離子加入超純水或反應(yīng)液的緩沖液中(以緩沖液為佳)，充分混溶，室溫保存。
本發(fā)明選用一定濃度的硝酸銀，硫酸銅等作為離子供體，說明沉淀液與dNTP的共沉淀現(xiàn)象。
本發(fā)明在反應(yīng)管選擇上，應(yīng)用了管壁薄，無色透明的反應(yīng)管，利于肉眼判定結(jié)果。
本發(fā)明的反應(yīng)體系中采用了恒溫?cái)U(kuò)增法，將反應(yīng)結(jié)果與普通PCR法的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)靈敏性比PCR高。該P(yáng)CR反應(yīng)體系使用的引物為CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAGGAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT引物濃度為30pmoL，Taq聚合酶(Takara)為1μL。反應(yīng)條件為95℃，30s；52℃，45s；72℃，45s；擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)總時(shí)間為3h。反應(yīng)結(jié)果鑒定采用3.0％瓊脂糖凝膠電泳。出現(xiàn)兩條帶為雄性，一條帶為雌性，總時(shí)間在4h左右。
實(shí)施例1采集公母牛血液，其中添加20％ACD血液抗凝劑，使用全血基因組提取試劑盒(Takara)提取基因組DNA，并且稀釋到5ng/μL備用。
本試驗(yàn)采用牛特異性引物和牛雄性特異性引物，引物序列如下
B3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB3P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTTS4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAGS4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC反應(yīng)容積為25μL，包括1×緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 8.8；10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，dNTP各3.0mM，1.6mM貝它定，2mM MgSO4，1μL Bst DNA聚合酶，1μL DNA模板，引物濃度P1、P2分別為50pmol/L；P3、P4為30pmol/L；P5、P6為15pmol/L。
反應(yīng)條件使用PCR儀恒溫?cái)U(kuò)增，恒溫?cái)U(kuò)增溫度為63℃，擴(kuò)增時(shí)間為45min，反應(yīng)結(jié)束后，80℃下2min終止反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)置分別使用牛特異性引物和雄性特異性引物反應(yīng)，每一反應(yīng)設(shè)置3管，模板分別為雄性基因組DNA，雌性基因組DNA和空白對照，試驗(yàn)重復(fù)10次。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2％得瓊脂糖凝膠電泳與dNTPs沉淀法鑒定結(jié)果。
使用牛雄性引物組，電泳結(jié)果為有公?；蚪M反應(yīng)呈現(xiàn)陽性，而其他兩個(gè)反應(yīng)體系為陰性。用dNTPs沉淀法，陰性管出現(xiàn)典型的白色沉淀聚集，與電泳鑒定結(jié)果一致。使用牛特異性引物，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照為陰性，公母組全部出現(xiàn)條帶，沉淀法與其電泳結(jié)果一致，而且準(zhǔn)確率100％。
實(shí)施例2此試驗(yàn)在生產(chǎn)基地(楊凌示范區(qū)科元公司)進(jìn)行，將牛鮮胚胎包括囊胚與桑椹胚胎(A級)，使用顯微操作儀進(jìn)行切割，切割約為10％，然后用此次方法做胚胎的性別鑒定并且移植受體牛。
使用引物為P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGP2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCCP3 ATCCCATGGATGGAGGAGCP4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCCP5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTATP6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTP1 AGGGCCAATAGACCTCATCTP2 TCGCGACCTCTCTCCAAACP3 AGATCCCTGTCGCCCCTP4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGP5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTP6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT將含有胚胎細(xì)胞的操作液(5μL)加入透明的PCR管，然后加入19μL試劑盒中的A液，包括1×緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，dNTP各3.0mM，1.6mM貝它定，2mM MgSO4，引物濃度P1、P2各為50pmol/L；P3、P4為30pmol/L；P5、P6為15pmol/L。然后100℃水浴5min，提取胚胎細(xì)胞基因組DNA，然后快速冷卻至冰點(diǎn)，再將1μL B液加入反應(yīng)管中(BstDNA聚合酶)，65℃水浴擴(kuò)增50min。判定結(jié)果用沉淀法，即在反應(yīng)結(jié)束后，將C液加入反應(yīng)管，觀察沉淀出現(xiàn)結(jié)果(見圖3)。再用電泳法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證(見圖4，圖5)。并將判定結(jié)果為雌性的胚胎移植受體牛。
應(yīng)用該技術(shù)先后鑒定胚胎3368枚，獲得雌性胚胎1609枚，可疑胚胎69枚，雄性胚胎1690枚。將1609枚雌性胚胎移植于1609頭受體母牛，668頭受體妊娠，妊娠率為42％；其中12頭受體流產(chǎn)，其余受體產(chǎn)犢656頭，其中雌性牛犢653頭，雄性牛犢3頭性別準(zhǔn)確率達(dá)99％。
權(quán)利要求
1.一種牛胚胎性別簡易鑒定方法，其特征在于包括以下步驟1)首先根據(jù)牛特異序列和牛雄性特異序列設(shè)計(jì)下列引物，每條引物分別有6條，能夠識別6個(gè)位點(diǎn)，其序列是雄性特異引物S1P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS1P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCCS1P3 ATCCCATGGATGGAGGAGCS1P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCCS1P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTATS1P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS2P1 CCATGGACTGTCGCCTATS2P2 AGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS2P3 ATCCCATGGATGGAGGAGCS2P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCCS2P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTATS2P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCTS3P1 GAAAGTGAAAGAAATTAAGTTGCS3P2 CTGATTTACATTTTGCTAAGGGCS3P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAGS3P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS3P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS3P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCGS4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTCS4P3 AGTGATGGAGGAGCCTGATAGS4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCCS4P5 TGAAACTCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCGS4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC牛特異性引物B1P1 AGGGCCAATAGACCTCATCTB1P2 TCGCGACCTCTCTCCAAACB1P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB1P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB1P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB1P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTTB2P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB2P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB2P3 AGATCCCTGTCGCCCCTB2P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTGB2P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB2P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTTB3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTTB3P3 AGATCCCTGTCGCGCCCTB3P4 GGGTATCTCTTGGAGGCTCACTGB3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGTB3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT2)將上述引物置入反應(yīng)液A中，其中各成份終濃度為引物P1、P2各為40～60pMol/L；P3、P4各為20～40pmol/L；P5、P6各為8～25pmol/L；配制dNTPs反應(yīng)底物為1.5～3.0mM，貝它定為0.6～1.0M，Mg2+為2～8mM；3)將含有所要鑒定胚胎卵裂球蒸餾水，與20μL A溶液混合，反應(yīng)總體積為25μL；95～100℃加熱5min，冰浴，再加B液，B液各成份濃度為8000u/mlBstDNA聚合酶，50mM KCL，10mM Tris-HCL(pH 7.5)，0.1mM EDTA，1mMDTT，0.1％TritonX-100和50％甘油，聚合酶58～67℃恒溫?cái)U(kuò)增30～60min；4)根據(jù)以上引物合成產(chǎn)物序列呈大小不同的片斷，電泳結(jié)果見陽性泳道有多條大小不同的序列條帶，而且不同引物之間所生成的條帶紋不同，據(jù)條帶分布特征，即可判定是哪組引物反應(yīng)的結(jié)果；5)反應(yīng)結(jié)束后，鑒定結(jié)果時(shí)，在反應(yīng)體系中加入0.5～5μLdNTP沉積液，如果反應(yīng)管中15s內(nèi)呈現(xiàn)白色沉淀聚集，特別在沉積液與反應(yīng)液界面出現(xiàn)環(huán)狀白色沉淀，而上下液面清澈，隨后沉淀層顏色變暗，最后沉淀于反應(yīng)管底部。此結(jié)果證明反應(yīng)體系中還有大量的dNTP存在，表明反應(yīng)沒有進(jìn)行，據(jù)此可判定結(jié)果為陰性。相反，當(dāng)加入沉淀液后，反應(yīng)管內(nèi)無顯著變化，表明反應(yīng)體系中，反應(yīng)底物dNTP消耗殆盡，結(jié)果判定為陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛胚胎性別簡易鑒定方法，其特征在于包括胚胎性鑒定試劑盒，盒中包括3部分，A管為反應(yīng)體系液，包括引物；B管為恒溫?cái)U(kuò)增酶；C管為反應(yīng)鑒定所用的dNTPs沉積液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的牛胚胎性別簡易鑒定方法，其特征在于所述的每條引物其中的4條短引物長度18～25bp，兩條長引物長度在38～43bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛胚胎性別簡易鑒定方法，其特征在于，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入無毒無副作用的重金屬陽離子供體試劑，通過觀察有無沉淀反應(yīng)來判定結(jié)果，若反應(yīng)液中部出現(xiàn)典型的白色條帶為陰性，反之則為陽性，添加后15s得出結(jié)論，所述的重金屬陽離子供體試劑為0.01～1.0mMCuSO1溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛胚胎性別簡易鑒定方法，其特征在于將所取胚胎細(xì)胞直接加于反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)，無需分步處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛胚胎性別鑒定方法，其特征在于擴(kuò)增時(shí)使用PCR儀恒溫?cái)U(kuò)增，恒溫?cái)U(kuò)增溫度為63℃，擴(kuò)增時(shí)間為45min，反應(yīng)結(jié)束后，80℃下2min終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛胚胎性別簡易鑒定方法，其血液基因組鑒定率達(dá)100％，胚胎性別鑒定率為99.0％以上，操作簡便、靈敏度高、鑒定快速、實(shí)用性強(qiáng)、使用設(shè)備簡單，并可以在1h內(nèi)鑒定出胚胎性別，形成的胚胎性別鑒定試劑盒完全可以應(yīng)用于生產(chǎn)，且成本僅為同類產(chǎn)品的1/10。本發(fā)明根據(jù)牛特異性序列和雄性特異性序列，設(shè)計(jì)出6條特異性引物，能夠識別6個(gè)特異位點(diǎn)，反應(yīng)目的序列形成一個(gè)啞鈴型結(jié)構(gòu)單元，并以此為核心，短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出大量大小不等的DNA片斷。反應(yīng)過程中，僅需要60～65℃恒溫水浴即可；結(jié)果鑒定采用dNTPs沉淀法(反應(yīng)管中部出現(xiàn)白色條帶為陰性)。
文檔編號C12Q1/68GK1896274SQ20051009609
公開日2007年1月17日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者張志平, 張涌, 劉俊平, 安志興, 張君濤, 張立, 權(quán)富生, 鄭月茂, 賽務(wù)加甫, 蔡欣 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)生物工程研究所