專利名稱：一種分離凱氏帶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中一種分離凱氏帶的方法。
技術背景 凱氏帶是高等植物皮層細胞徑向壁和橫向壁的木栓化和木質化的帶狀增厚部分， 主要功能是阻止水分向組織滲透，控制著皮層和維管柱之間的物質運輸。其寬度隨不同植 物而有較大的差異。凱氏帶主要分布于初生根的內皮層和外皮層，而在莖、葉等氣生器官中 是否存在則仍有爭議。凱氏帶在植物根部水與無機養(yǎng)分的運輸中主要影響外質體運輸途 徑，亦即水與無機養(yǎng)分經由表皮、外皮層及皮層細胞之細胞壁間質傳遞運輸。水與無機養(yǎng)分 來到內皮層細胞時，因凱氏帶之不透水性質而轉由內皮細胞之細胞膜間質傳遞，最終進入 中柱內的木質部細胞。長期以來，凱氏帶的確切化學成分一直沒有得到深入研究，主要原因是還未找到 一種簡單可行，而且可以獲得大量凱氏帶的實驗方法。早期通常使用自然酶解分離內皮層， 但其效率很低(幾個毫克)，而且酶解時間長(在10天以上)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種分離凱氏帶的方法。本發(fā)明提供的分離凱氏帶的方法，包括以下步驟1)用離析液浸泡植物初生根， 將浸泡后的植物初生根記作離析后植物初生根；2)將所述離析后植物初生根進行酶解，將 酶解后的植物初生根記作酶解后植物初生根；3)從所述酶解后植物初生根中分離得到凱 氏帶；所述離析液為(7-12)% (質量百分比)鉻酸水溶液和(7-12)% (質量百分比)硝酸 水溶液的等體積混合液；所述浸泡的溫度為(24-26) °C，所述浸泡的時間為(20-30)分鐘。所述酶解采用的酶液為將(12-32) U果膠酶和(18-48) U纖維素酶加入2ml檸檬酸 鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為(0. 01-0. 05)mol/L，pH值為3. 0 ；所述 酶解的溫度為(24-26) °C，所述酶解的時間為(3-4)天。所述離析液優(yōu)選為7%、10%或12% (質量百分比)鉻酸水溶液和7%、10%或 12% (質量百分比)硝酸水溶液的等體積混合液；所述浸泡的溫度優(yōu)選為24°C、25°C或 26°C，所述浸泡時間優(yōu)選為20分鐘、25分鐘或30分鐘。所述酶液為將12U、20U或32U果膠酶和18U、30U或48U纖維素酶加入2ml檸 檬酸鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為0. 01mol/L、0. 03mol/L或 0. 05mol/L ；所述酶解的溫度優(yōu)選為24°C、25°C或26°C，時間優(yōu)選為3天、3. 5天或4天。所述纖維素酶具體為纖維素酶R-10，英文名稱為cellulose" Onozuka“ R-10， 購自北京欣經科生物技術有限公司，產品編號為6008 ；所述果膠酶具體為果膠酶Y-23，英 文名稱為Pectolyase Y_23，購自北京欣經科生物技術有限公司產品編號為6038。所述酶解過程通常為每隔1天更換一次所述酶液。所述方法還包括在步驟3)前將所述酶解后植物初生根進行振蕩的步驟，所述振蕩的時間通常為(4-5)小時，優(yōu)選為4小時、4. 5小時或5小時，搖床轉速通常為(50-60) rpm,優(yōu)選為50rpm、55rpm或60rpm,方寵轉半徑為50mm。所述植物初生根為長度為(0. 5-1) cm的植物初生根段，優(yōu)選為0. 5cm、0. 8cm或Icm 的植物初生根段。所述植物可以為單子葉植物，優(yōu)選為禾本科植物，尤其優(yōu)選為水稻。所述水稻可以為如下品種的水稻遼旱109、日本晴或田豐202。本發(fā)明提供的凱氏帶分離方法，其具有以下優(yōu)點1)操作簡單、快速縮短了分離 的時間；2)酸液處理后再使用纖維素酶和果膠酶進行溫和酶解，減少了酶的使用量，節(jié)省 了成本；3)分離效果好可通過小檗堿_苯胺蘭雙重染色在熒光顯微鏡下清晰地觀測到根 內皮層凱氏帶。
實驗證明，采用本發(fā)明提供的方法獲得凱氏帶的提取時間短，大約在3-5天即可 完成；纖維素酶的用量減少，達到節(jié)省成本的目的；為深入研究凱氏帶的細微結構和化學 成分提供了足夠的材料。由此可見，酸液處理結合酶解技術分離凱氏帶的方法為高等植物 凱氏帶的深入研究奠定了基礎，尤其在單子葉禾本科植物根內皮層凱氏帶的研究中發(fā)揮重 要作用，實際應用價值高。


圖1為在熒光顯微鏡下觀察到的遼旱109水稻根內皮層凱氏帶的結構圖2為在熒光顯微鏡下觀察到的日本晴水稻根內皮層凱氏帶的結構圖3為在熒光顯微鏡下觀察到的田豐202水稻根內皮層凱氏帶的結構圖4為水稻3個品種(遼旱109、日本晴和田豐202)根內皮層凱氏帶傅立葉變換 紅外光譜
具體實施例方式下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明 均為質量百分含量。實施例1、水稻根內皮層凱氏帶的分離及其顯微鏡觀測和化學成分分析將水稻(遼旱109)種子(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司)于20-25°C下催 芽，種子萌發(fā)后，置25士2°C溫室中用l/2XH0agland培養(yǎng)基進行水培種植，培養(yǎng)至三葉期， 取幼苗的初生根。1)將上述初生根切成0.5cm長的小段，用去離子水洗滌至去除初生根上的培養(yǎng) 基；2)將步驟1)獲得的20段初生根放入2ml離析液中，抽氣至材料下沉以后，在24°C 浸泡25分鐘至根尖透明呈米黃色，用去離子水沖洗2-3次，獲得離析后植物初生根。所述 離析液為10% (質量百分比)鉻酸水溶液和10% (質量百分比)硝酸水溶液的等體積混 合液；3)將離析后植物初生根放入酶液中置24°C下酶解3天后用去離子水沖洗2_3 次獲得酶解后植物初生根；酶解過程中每隔1天更換酶液一次；所述酶液為將20U果膠酶和30U纖維素酶加入2ml檸檬酸鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為 0.01mol/L。所述纖維素酶具體為纖維素酶R-10，英文名稱為cellulose" Onozuka“ R-10， 購自北京欣經科生物技術有限公司，產品編號為6008 ；所述果膠酶具體為果膠酶Y-23，英 文名稱為Pectolyase Y_23，購自北京欣經科生物技術有限公司產品編號為6038。4)將酶解后植物初生根置于去離子水中在搖床上振蕩4小時，搖速50rpm，旋轉半 徑為50mm ；
5)在解剖鏡下從經步驟4)的酶解后植物初生根中分離得到水稻(遼旱109)根內 皮層凱氏帶；6)將水稻(遼旱109)根內皮層凱氏帶用去離子水清洗2-3次，保存在去離子水 中，低溫冷凍干燥，備用。采用同樣的方法分別從水稻(日本晴)(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司) 和水稻(田豐202)(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司)獲得根內皮層凱氏帶。將上述獲得的水稻(遼旱109)、水稻(日本晴)、和水稻(田豐202)的根內皮層 凱氏分別用小檗堿-苯胺蘭雙重染色，在紫外光激發(fā)波長為365nm的熒光顯微鏡下觀察，結 果分別如圖1-3所示，從圖1-3中可以看出凱氏帶具有網狀結構，證明分離得到凱氏帶。實施例2、水稻根內皮層凱氏帶的分離及其顯微鏡觀測和化學成分分析將水稻(遼旱109)種子(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司)于20-25°C下催 芽，種子萌發(fā)后，置25士2°C溫室中用l/2XH0agland培養(yǎng)基進行水培種植，培養(yǎng)至三葉期， 取幼苗的初生根。1)將上述初生根切成0.8cm長的小段，用去離子水洗滌至去除初生根上的培養(yǎng) 基；2)將步驟1)獲得的20段初生根放入2ml離析液中，抽氣至材料下沉以后，在25°C 浸泡20分鐘至根尖透明呈米黃色，用去離子水沖洗2-3次，獲得離析后植物初生根。所述 離析液為7%(質量百分比)鉻酸水溶液和7%(質量百分比)硝酸水溶液的等體積混合 液；3)將離析后植物初生根放入酶液后置25°C下酶解3. 5天后用去離子水沖洗2_3 次獲得酶解后植物初生根；酶解過程中每隔1天更換酶液一次；所述酶液為將12U果膠 酶和18U纖維素酶加入2ml檸檬酸鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為 0.03mol/L。4)然后將酶解后植物初生根置于去離子水中在搖床上振蕩4. 5小時，搖速55rpm， 旋轉半徑為50mm ；5)在解剖鏡下從經步驟4)的酶解后植物初生根中分離得到水稻(遼旱109)根內 皮層凱氏帶；6)將水稻(遼旱109)根內皮層凱氏帶用去離子水清洗2-3次，保存在去離子水 中，低溫冷凍干燥，備用。采用同樣的方法分別從水稻(日本晴)(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司) 和水稻(田豐202)(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司)獲得根內皮層凱氏帶。將上述獲得的水稻(遼旱109)、水稻(日本晴)、和水稻(田豐202)的根內皮層凱氏分別用小檗堿-苯胺蘭雙重染色，在紫外光激發(fā)波長為365nm的熒光顯微鏡下觀察，結 果與圖1-3所示一致，均可以看出凱氏帶具有網狀結構。實施例3、水稻根內皮層凱氏帶的分離及其顯微鏡觀測和化學成分分析將水稻(遼旱109)種子(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司)于20-25°C下催 芽，種子萌發(fā)后，置25士2°C溫室中用l/2XH0agland培養(yǎng)基進行水培種植，培養(yǎng)至三葉期， 取幼苗的初生根。
1)將上述初生根切成Icm長的小段，用去離子水洗滌至去除初生根上的培養(yǎng)基；2)將步驟1)獲得的20段初生根放入2ml離析液中，抽氣至材料下沉以后，在26°C 浸泡30分鐘至根尖透明呈米黃色，用去離子水沖洗2-3次，獲得離析后植物初生根。所述 離析液為12% (質量百分比)鉻酸水溶液和12% (質量百分比)硝酸水溶液的等體積混 合液；3)將離析后植物初生根放入酶液后置26°C下酶解4天后用去離子水沖洗2-3 次獲得酶解后植物初生根；酶解過程中每隔1天更換酶液一次；所述酶液為將32U果膠 酶和48U纖維素酶加入2ml檸檬酸鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為 0.05mol/L。4)然后將酶解后植物初生根置于去離子水中在搖床上振蕩5小時，搖速60rpm，旋 轉半徑為50mm ；5)在解剖鏡下從經步驟4)的酶解后植物初生根中分離得到水稻(遼旱109)根內 皮層凱氏帶；6)將水稻(遼旱109)根內皮層凱氏帶用去離子水清洗2-3次，保存在去離子水 中，低溫冷凍干燥，備用。采用同樣的方法分別從水稻(日本晴)(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司，請 提供出售公司名稱)和水稻(田豐202)(遼寧盤錦北方農業(yè)技術開發(fā)有限公司，請?zhí)峁┏?售公司名稱)獲得根內皮層凱氏帶。將上述獲得的水稻(遼旱109)、水稻(日本晴)、和水稻(田豐202)的根內皮層 凱氏分別用小檗堿-苯胺蘭雙重染色，在紫外光激發(fā)波長為365nm的熒光顯微鏡下觀察，結 果與圖1-3 —致，均可以看出凱氏帶具有網狀結構。實施例4、水稻根內皮層凱氏帶的紅外吸收光譜將由實施例1獲得的三個品種水稻的根內皮層凱氏帶用溴化鉀壓片，分別在傅 立葉變換紅外光譜儀下測量紅外吸收光譜，結果如圖4所示，Liaohanl09為遼旱109， Oryzasativa cv. Nipponbare為日本晴，Tianf eng202為田豐202，由于木栓質是凱氏 帶的重要成分，亞甲基CH2反對稱及對稱伸縮振動的吸收峰是木栓質的特征吸收峰。而 這種特征吸收峰在遼旱109、日本晴和田豐202根的外部組織中分別出現在2855CHT1、 2854cnT和2854CHT1 ；以此為參照，在遼旱109、日本晴和田豐202根內層凱氏帶中分別出現 在2854CHT1、2854CHT1和2855CHT1的峰，因此可以證明提取得到的物質即為凱氏帶。采用同樣的方法檢測由實施例2和實施例3獲得的三個品種水稻的根內皮層凱氏 帶，紅外吸收光譜均與圖4 一致，因此也同樣證明提取得到的物質即為凱氏帶。
權利要求
一種分離凱氏帶的方法，包括以下步驟1)用離析液浸泡植物初生根，將浸泡后的植物初生根記作離析后植物初生根；2)將所述離析后植物初生根進行酶解，將酶解后的植物初生根記作酶解后植物初生根；3)從所述酶解后植物初生根中分離得到凱氏帶；所述離析液為由(7-12)％(質量百分比)鉻酸水溶液和(7-12)％(質量百分比)硝酸水溶液等體積混合得到的混合液；所述浸泡的溫度為(24-26)℃，所述浸泡的時間為(20-30)分鐘。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述酶解采用的酶液為將(12-32)U果 膠酶和(18-48)U纖維素酶加入2ml檸檬酸鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖液的 濃度為(0. 01-0. 05)mol/L, pH值為3. 0 ；所述酶解的溫度為(24-26) °C，所述酶解的時間為 (3-4)天。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述離析液為7%、10%或12%(質 量百分比)鉻酸水溶液和7%、10%或12% (質量百分比)硝酸水溶液的等體積混合液；所 述浸泡的溫度為24°C、25°C或26°C，所述浸泡時間為20分鐘、25分鐘或30分鐘。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述酶液為將12U、20U或32U果 膠酶和18U、30U或48U纖維素酶加入2ml檸檬酸鹽緩沖液中得到酶液；所述檸檬酸鹽緩沖 液的濃度為0. 01mol/L、0. 03mol/L或0. 05mol/L ；所述酶解的溫度為24°C、25°C或26°C，所 述酶解時間為3天、3. 5天或4天。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述酶解為每隔1天更換一次 所述酶液。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括在步驟3)前將 所述酶解后植物初生根進行振蕩的步驟，所述振蕩的時間為(4-5)小時，優(yōu)選為4小時、4. 5 小時或5小時，搖速為(50-60) rpm，優(yōu)選為50rpm、55rpm或60rpm，旋轉半徑為50mm。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述植物初生根為長度為 (0. 5-1) cm的植物初生根段，優(yōu)選為0. 5cm、0. 8cm或Icm的植物初生根段。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物，所述單 子葉植物為禾本科植物。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述禾本科植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離凱氏帶的方法。本發(fā)明提供的分離凱氏帶的方法包括以下步驟1)用離析液浸泡植物初生根，將浸泡后的植物初生根記作離析后植物初生根；2)將所述離析后植物初生根進行酶解，將酶解后的植物初生根記作酶解后植物初生根；3)從所述酶解后植物初生根中分離得到凱氏帶；所述離析液為(7-12)％(質量百分比)鉻酸水溶液和(7-12)％(質量百分比)硝酸水溶液的等體積混合液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)操作簡單、快速縮短了分離的時間；2)酸液處理后再使用纖維素酶和果膠酶進行溫和酶解，減少了酶的使用量，節(jié)省了成本；3)分離效果好。
文檔編號C12N5/04GK101845415SQ20101017860
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權日2010年5月17日
發(fā)明者林金星, 蔡霞, 陳彤 申請人:中國科學院植物研究所