專利名稱：一種單克隆抗體、以其為活性成分的組合物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種新型單克隆抗體，更具體而言，涉及一種新型抗VEGF人源化ScFV-FC基因工程抗體，和包含該新型單克隆抗體的藥物組合物， 以及該新型單克隆抗體在治療CNV類眼部疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
下面對本發(fā)明背景技術(shù)的論述僅僅提供用于幫助讀者理解本發(fā)明，并沒有承認(rèn)所作描述都構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。眼新生血管形成(CNV)是很多眼部疾病的共同病理改變，最常發(fā)生于角膜、虹膜、 脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜，包括角膜新生血管形成、老年性黃斑病變(AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、新生血管性青光眼等，其伴隨的滲出、水腫、增生以及瘢痕化可嚴(yán)重破壞眼部正常視覺功能結(jié)構(gòu)和功能，造成視力損壞，甚至失明。單單是糖尿病人，中國就有 9240萬人，其中80%為II型糖尿病，也就是7392萬人有糖尿病引起的CNV毛病。解決了 CNV就可以解決每年數(shù)十萬人的失明問題，數(shù)千萬人的視力衰退問題。正常的角膜是透明無血管的，在各種致病因素的作用下，形成角膜新生血管 (corneal neovascularization, CNV)。雖然新生血管增強了角膜的防御能力，促進了損傷和炎癥的修復(fù)，但CNV可破壞角膜正常微環(huán)境，使相關(guān)免疫偏離消失，顯著增加了角膜移植片排斥反應(yīng)的危險，而且瘢痕形成使角膜失去透明，嚴(yán)重影響視力?，F(xiàn)在由角膜新生血管而致盲的患者日益增加。其治療很棘手，近年來，國內(nèi)外針對CNV治療研究的動物實驗和臨床試驗亦大量進行，其中的許多結(jié)果顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是新生血管形成過程中的關(guān)鍵性因子。VEGF家族有6個異構(gòu)體 VEGF-A、-B、-C、-D、-E及胎盤生長因子；其分子量為35 44，分別特異地與血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR-l、-2、及-3)相結(jié)合。VEGF及其受體系統(tǒng)在眼血管形成過程中起著非常重要的作用。保持眼內(nèi)VEGF在一定的水平是確保正常眼部血液供應(yīng)，維持和保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能必不可少的，但過量表達可誘發(fā)病理性新生血管形成。因此，通過控制VEGF-A 可以大大抑制CNV以及CNV類眼部疾病。然而不幸的是，盡管本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出了各種用于CNV治療的抗體，但是這些現(xiàn)有的抗體普遍存在著人源化程度低，免疫原性大，副作用明顯，安全性差；相對分子量大，穿透力和親和力差；注射量大；成本相對高的各種缺點。本申請的發(fā)明人通過反復(fù)實驗和不斷努力獲得了明顯改善上述缺點的用于CNV治療的新型單克隆抗體。目前還沒有與本發(fā)明的單克隆抗體完全一樣的抗體。本發(fā)明的單克隆抗體能夠解決CNV引起的失明問題和視力衰退問題，且對上述存在的缺點有顯著的改善，因此將會得到廣泛應(yīng)用，并帶來巨大的社會及經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種新型單克隆抗體，具體而言，一種新型抗VEGF-A人源化ScFV-FC基因工程抗體，該抗體的總分子式為C2156H3272N561O681S12，分子量為46KD，其特點是特異性針對VEGF-A的、可與其發(fā)生高親和力結(jié)合的全人源化抗體分子，可用于各種CNV 類眼病的治療。本發(fā)明的又一個目的是提供編碼該單克隆抗體的核酸分子，和包含該核酸分子的載體，以及包含該核酸分子和載體的細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含作為活性成分的上述單克隆抗體。本發(fā)明的還有一個目的提供上述單克隆抗體在治療CNV類眼病中的應(yīng)用，該CNV 類眼病包括角膜新生血管形成、老年性黃斑病變(AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、新生血管性青光眼等等。本發(fā)明單克隆抗體的獲得，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的公知方法進行。例如可以用多肽自動合成儀進行化學(xué)合成，也可以通過生物學(xué)的方法產(chǎn)生，這些方法都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的單克隆抗體能有效治療CNV眼病，同時具有人源化程度高，免疫原性低， 副作用小，安全性高；相對分子量小，穿透力和親和力強；注射量?。怀杀镜土娘@著優(yōu)點。本發(fā)明的藥物組合物以本發(fā)明的單克隆抗體為活性成分，含有治療有效量的本發(fā)明的單克隆抗體。需要的時候，在上述藥物組合物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體， 所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。本發(fā)明的藥物可以制成液體、半固體、固體、膏狀、粉末、膠囊等多種劑型，優(yōu)選液體和膏狀形式。根據(jù)不同的藥劑形式，本發(fā)明的藥物可以通過點滴、涂敷、口服、注射、輸注等方式給藥。本發(fā)明抗體的用量可根據(jù)患者的年齡、性別、體重、疾病的嚴(yán)重程度等各種因素進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，這在醫(yī)師的能力范圍之內(nèi)。


圖1為單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株制備及單克隆抗體培養(yǎng)制備過程的示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明的下述實施列用于舉例說明的目的，并不是對本發(fā)明范圍的限制。實施列1.本發(fā)明單克隆抗體的生產(chǎn)方法單抗采用單克隆方法生產(chǎn)，是目前比較流行實用的制備單抗的工藝。Georges J. F. Kohler和Cesar Milstein在1975年首先在世界上制備了單克隆抗體。由于他們提出了單克隆抗體的制備方法而在1984年獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎?？茖W(xué)家早就知道怎樣來制備抗體。他們在動物上注射抗原(比如病毒和腫瘤細(xì)胞)。動物免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞就會把抗體分子(與抗原特異性結(jié)合的分子)釋放在血液里。但是，從血清中成批提取所需要的純抗體幾乎是不可能的。利用抗體的實驗，比如疾病診斷試驗，以前都依靠非純制品，這樣使試驗標(biāo)準(zhǔn)化以及獲得一致的重復(fù)結(jié)果顯得非常的困難。既然單個的B細(xì)胞及其后代只產(chǎn)生一種抗體，獲得純抗體制品的一條顯而易見的途徑就是在實驗室內(nèi)培養(yǎng)B細(xì)胞。但是，這是一個不現(xiàn)實的方法，因為B細(xì)胞不能在培養(yǎng)基上長時間生存。Kohker和Milstein的歷史性突破的發(fā)現(xiàn)就是，在實驗室中一個B細(xì)胞可以與一種能無限增生的脊髓癌細(xì)胞融合，從而獲得“永生”(immortal)。由此得到的雜合細(xì)胞被稱為“雜交瘤”(hybridoma)。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長在培養(yǎng)液中時，它的在遺傳上相同的后代會繼續(xù)產(chǎn)生具有B母細(xì)胞特征的抗體。在那群遺傳上相同的后代中的一個被稱為一個純種細(xì)胞系(克隆，clone)，因此由單個雜交瘤純種細(xì)胞產(chǎn)生的抗體就叫做單克隆抗體。為了生成雜交瘤，Kohler和Milstein首先在一只老鼠上注射抗原，老鼠的B細(xì)胞開始產(chǎn)生與之對抗的抗體。然后他們割去老鼠的脾臟，再把脾臟細(xì)胞分開，然后與骨髓腫瘤中的瘤細(xì)胞(myeloma cells)培養(yǎng)在一起。脾臟組織含有大量的B細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下， 一些B細(xì)胞能與骨髓瘤融合產(chǎn)生雜合細(xì)胞。兩位科學(xué)家篩選出能產(chǎn)生他們所需抗體的雜交瘤細(xì)胞(hybridoma)，并進行選擇性培養(yǎng)。“雜交瘤”被證明具有所希望的、來自兩個親本的特性它們能無限地生長，同時無休止地釋放出單種抗體。由于象骨髓瘤細(xì)胞一樣生長非常迅速，它們能快速產(chǎn)生大量的抗體。新興的生物技術(shù)工業(yè)在前幾年中發(fā)展了大規(guī)模生產(chǎn)雜交瘤的方法。各種提高培養(yǎng)液中細(xì)胞的密度的技術(shù)包括氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)(一種最初用來大量培養(yǎng)細(xì)菌的方法)，或者是能截獲抗體的包囊法。在加富培養(yǎng)基(如含牛血清)里培養(yǎng)，同樣能增加產(chǎn)量。此外， 還有一些防止骨髓瘤細(xì)胞生成自身的抗體，并能促進B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的新技術(shù)。 這些改進的方法使工廠以克甚至千克計，而不是以前實驗室內(nèi)毫克數(shù)量級地生產(chǎn)純抗體。 但生產(chǎn)雜交瘤的基本技術(shù)與Kohler和Milstein的最初實驗方法是一樣的。Kohler和Milstein從未為他們的技術(shù)申請過專利，該技術(shù)現(xiàn)在已被全世界的實驗室自由采用，并且已經(jīng)成為商業(yè)性抗體生產(chǎn)的基礎(chǔ)。此外，還有許多制備單克隆抗體的方法，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知并熟練掌握的，本發(fā)明也可以用這些單克隆抗體制備方法中的任一種方法制備，但不限于這些方法。實施列2.本發(fā)明單克隆抗體有效性的鑒定對制備的單抗的有效性進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述5個方面的鑒定。第一，抗體特異性的鑒定。除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其他抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA法、IFA法。第二，單抗的Ig類與亞類的鑒定。一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第2抗體進行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或 IgM，則檢測出的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG(3% )更有利于沉淀線的形成。第三，單抗中和活性的鑒定。用動物或細(xì)胞的保護實驗來確定單抗的生物學(xué)活性。 如果是確定本發(fā)明的單克隆抗體的中和活性，則可用抗體和VEGF同時接種于敏感細(xì)胞，來觀察細(xì)胞是否受到抗體的影響。
第四，單抗識別抗原表位的鑒定。用競爭結(jié)合實驗測相加指數(shù)的方法測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別表位是否相同。第五，單抗親和力的鑒定。用ELISA或RIA競爭結(jié)合實驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。經(jīng)實驗鑒定，本發(fā)明的單克隆抗體在上述五個方面都符合所述領(lǐng)域的要求。輔歹丨丨3· H日月I·秘·斯口口口·愧本申請的發(fā)明人將本發(fā)明的單克隆抗體與目前市場上已有的兩種同類產(chǎn)品 AVASTIN和LUCENTIS進行了比較，顯示出具有優(yōu)異的特性。(1).本發(fā)明單克降抗體與Avastin的比較Avastin (阿瓦斯汀)是美國Genentech公司生產(chǎn)的抗癌藥物，于2004年2月26日獲得FDA批準(zhǔn)上市，用于一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。它是第1個被批準(zhǔn)上市的VEGF抑制劑。 Avastin為一種重組的全長人源化單克隆IgGl抗體，相對分子質(zhì)量為148，000，包含93% 人類片段和7%鼠源結(jié)構(gòu)，人源化部分可以延長其半衰期，降低其免疫源性。其作用機制是 Avastin對VEGF-A的所有亞型都具有親和力，以VEGF為靶點，能競爭性地與內(nèi)源性VEGF受體(VEGFR 1和VEGFR 2)結(jié)合，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，防止血管滲漏，減少新生血管形成。Avastin沒有被美國FDA批準(zhǔn)用來治療CNV，原因是制造商美國Genentech公司沒有向FDA申請。但是，它被美國眼科醫(yī)生廣泛應(yīng)用。根據(jù)美國法律，醫(yī)生將已被FDA批準(zhǔn)上市的藥物，用在治療未被FDA批準(zhǔn)的領(lǐng)域(俗稱off-label)是合法的。Avastin與本發(fā)明的單克隆抗體相比，一是其仍然含有7%的鼠源結(jié)構(gòu)，比本發(fā)明的單克隆抗體的副作用大，二是其相對分子質(zhì)量大，為148，000 (而本發(fā)明的單克隆抗體僅為46，000)，穿透力與親和力都明顯不如本發(fā)明的單克隆抗體。三其是注射量大，每次0. 05 毫升，而本發(fā)明的單克隆抗體則只需要0. 02毫升。Avastin每兩周注射一次，而本發(fā)明的單克隆抗體每月注射一次。故本發(fā)明的單克隆抗體明顯優(yōu)于Avastin。(2).本發(fā)明單克隆抗體與Lucentis的比較Lucentis由美國Genentech公司生產(chǎn)，2006年6月FDA批準(zhǔn)其用于CNV治療。 Lucentis抗體是第二代人源化重組抗VEGF單克隆抗體片段Fab部分，相對分子質(zhì)量為 48，000，含5個可變區(qū)和1個恒定區(qū)，由可降低免疫原性的非結(jié)合性人源化片段以及鼠高親和力抗原決定簇兩部分組成。Lucentis抗體對人類VEGF的所有亞型均有特異性的親和力， 由于分子量小，能很好地穿透視網(wǎng)膜，藥物經(jīng)玻璃體腔內(nèi)注射可大部分到達視網(wǎng)膜內(nèi)，抑制新生血管的形成，故可對CNV起到治療作用。臨床研究證實，Lucentis對于眼底新生血管疾病如濕性老年性黃斑變性、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變和黃斑囊樣水腫等疾病均有確切的療效。但是由于其價格和重復(fù)注射率高，造成Lucentis治療成本極高，故多項試驗(包括 P IER、Pronto、SAILOR)正在探求減少重復(fù)治療的可能性。與Lucentis相比，申請人的本發(fā)明的單克隆抗體，相對分子質(zhì)量更低(46，000對比48，000)，穿透力與親和力更好，Lucentis每次注射0. 05毫升，而本發(fā)明的單克隆抗體只需要0.02毫升。本發(fā)明的單克隆抗體的優(yōu)勢在于成本明顯低。目前Lucentis的售價為每次注射為1，900美元，每個療程8 20次注射。平均費用達到15萬人民幣。我們的本發(fā)明的單克隆抗體，大約只需4 6次注射，可以將總的費用控制在2萬元人民幣以內(nèi)，同時療效相當(dāng)。故本發(fā)明的單克隆抗體在上述方面明顯優(yōu)于Lucentis。
由上面的比較可知，本發(fā)明的單克隆抗體具有人源化程度高，免疫原性低，副作用小，安全性高；相對分子量小，穿透力和親和力強；注射量?。怀杀镜土谋姸鄡?yōu)點，同時能有效治療CNV眼部疾病。輔歹丨14.絲日月I·秘白低M勿·云力力對式I發(fā)明人也對本發(fā)明單克隆抗體進行了藥代動力學(xué)研究。對兔子和猴子進行的藥代動力學(xué)研究表明，眼內(nèi)注射，眼睛玻璃體內(nèi)單克隆抗體濃度在六小時后達到最高水平，半衰期為3天?？贵w從眼睛經(jīng)過體循環(huán)到達人體內(nèi)后，血液中的克隆抗體水平非常低，僅僅是眼內(nèi)玻璃體0. 005%的水平。_歹丨丨5. H日肪口口口_師、劑U合··伺潴本發(fā)明的藥物可以制成液體、膏狀、半固體、固體、粉末、膠囊等多種形式，優(yōu)選液體和膏狀形式。根據(jù)不同的藥劑形式，本發(fā)明的藥物可以口服、注射、點滴等方式給藥。本發(fā)明的藥物可以是單劑型或多劑型形式。本發(fā)明單克隆抗體非限制性地可以制成無色透明，PH值為7的無菌液體。包裝可以采用1毫升一次性玻璃小瓶和0. 02毫升一次性注射微型針筒，于2°C 8°C環(huán)境中避光保存。每小瓶例如含單克隆抗體10毫克。每個針筒含0.2毫克。每次注射0.2毫克。直接接觸藥品的是玻璃小瓶，這是被工業(yè)界認(rèn)可的最廣泛使用單抗包裝瓶?？紤]到單克隆抗體的單次注射量非常小，只有0. 2毫克，采用一次性微型針筒，方便患者的使用，劑量準(zhǔn)確。 而使用1毫升的小品，是考慮到?？漆t(yī)院的使用，方便一次為多個患者提供治療。包括藥品瓶標(biāo)簽、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，發(fā)明人參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《藥物說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。雖然參照示例性實施方式和實施例描述了本發(fā)明，所述描述不意圖于被解釋為限制性意義。因此，參考本說明書后，示例性實施方式以及本發(fā)明其它實施方式的各種修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此考慮，所附權(quán)利要求書將覆蓋任何這樣的修改或?qū)嵤┓绞健?br> 權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其總分子式為C2156H3272N561O681S1215
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，進一步的特征是其為特異性針對VEGF-A的、可與其發(fā)生高親和力結(jié)合的全人源化抗體分子。
3.—種核酸，其編碼如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體。
4.一種藥物組合物，包含作為活性成分的如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
6.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，所述載體選自藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體和潤滑劑。
7.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備用于治療眼部疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述眼部疾病為眼新生血管形成引起的眼部疾病， 選自角膜新生血管形成、老年性黃斑病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和新生血管性青光眼。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述藥物是液體、半固體、固體或膏狀形式的。
10.一種試劑盒，其包括如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，以及其使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種單克隆抗體、以其為活性成分的組合物與應(yīng)用。本發(fā)明的單克隆抗體是一種新型抗VEGF-A人源化ScFv-Fc基因工程抗體，該抗體的總分子式為C2156H3272N561O681S12，分子量為46KD，其特點是特異性針對VEGF-A的、可與其發(fā)生高親和力結(jié)合的全人源化抗體分子，可用于CNV類眼病的治療。本發(fā)明的單克隆抗體將會得到廣泛應(yīng)用，并帶來巨大的社會及經(jīng)濟效益。
文檔編號C12N15/12GK102190727SQ201010136079
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者葉亞東, 理查德·霍普 申請人:葉亞東