專(zhuān)利名稱(chēng)：一株抑制油菜菌核病菌危害的鏈霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鏈霉菌及其用于抑制油菜菌核病菌危害的用途，更具體地說(shuō)本發(fā) 明提供了抑制油菜菌核病菌危害的生防菌株，可大大地減輕油菜菌核病的危害。屬于防治 油菜菌核病危害油菜的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
油菜是一種栽培歷史悠久的古老作物，也是一種迅速發(fā)展的新興作物。上世紀(jì)60 年代后，油菜成為世界四大油料作物之一，隨著現(xiàn)代科學(xué)的進(jìn)步以及油菜育種和產(chǎn)品開(kāi)發(fā) 的成功，油菜的用途擴(kuò)展到蛋白質(zhì)、飼料、工業(yè)原料和醫(yī)藥等多方面。在中國(guó)，油菜的種植 面積和總產(chǎn)量自1978年以來(lái)躍居世界第一位。油菜在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常受到很多病害的侵 染，其中油菜菌核病是我國(guó)油菜重要的病害之一，引起的損失占總病害損失的80%左右。油 菜菌核病又稱(chēng)菌核軟腐病(俗稱(chēng)白桿、空桿、爛桿、霉兜)，是一種由核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)所致的一種世界性病害。油菜地上各部分均可感病，嚴(yán)重時(shí)病株整株枯死， 病莖內(nèi)產(chǎn)生大量黑色顆粒狀菌核。菌核散落在田間土壤或混雜在種子中，以及在用病桿殘 渣施肥又未經(jīng)腐熟的土雜肥中越夏越冬，次年氣候溫暖潮濕時(shí)，菌核大量萌發(fā)，產(chǎn)生子囊 盤(pán)，釋放出無(wú)數(shù)子囊孢子，隨風(fēng)傳播，侵染油菜，造成危害。該病害在我國(guó)是油菜三大病害 之首，冬、春栽培區(qū)均有發(fā)生，尤其以氣候相對(duì)涼爽和潮濕的地區(qū)嚴(yán)重，給生產(chǎn)帶來(lái)巨大損 失。早在1915年該病在印度就有報(bào)道。我國(guó)關(guān)于油菜菌核病的研究報(bào)道始見(jiàn)于1927年， 至今有80多年的歷史。近年來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，受氣候條件不利、品種繁雜、栽 培管理粗放、施肥水平提高等因素的影響，油菜菌核病為害呈加重趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了油菜的 產(chǎn)量和品質(zhì)。其中以長(zhǎng)江流域油菜主產(chǎn)區(qū)發(fā)生最為嚴(yán)重，每年發(fā)病面積470萬(wàn)hm2，產(chǎn)量損 失5% 25%，直接經(jīng)濟(jì)損失數(shù)億元。該病菌從油菜苗期到成熟期都可造成危害，以中、后 期發(fā)病最普遍，為害最嚴(yán)重。一般發(fā)病率10% 20%，嚴(yán)重的達(dá)80%以上。主要為害油菜 莖稈，引起植株早枯，角果減少，種子皺癟，千粒重和出油率降低，產(chǎn)量下降，已成為影響我 國(guó)油菜高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵因素。由于油菜菌核病菌所產(chǎn)生的菌核抗逆性極強(qiáng)，且田間的菌核可在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi) (50天)陸續(xù)萌發(fā)并形成有效的接種體，給防治帶來(lái)了極大困難。目前油菜菌核病的防治 主要依賴于化學(xué)防治。長(zhǎng)期以來(lái)生產(chǎn)上大量單一使用單方藥劑，造成病菌耐藥性日益增加， 防治效果越來(lái)越差。近年來(lái)環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問(wèn)題也日益嚴(yán)峻，農(nóng)產(chǎn)品安全問(wèn)題引起人 們的廣泛關(guān)注。采取摘除病葉、輪作和培育種植抗病品種等農(nóng)業(yè)防治措施，在一定程度上能 減輕病害造成的損失，但仍然不能達(dá)到徹底控制油菜菌核病的目的。因此，生物防治的研究 和應(yīng)用成為新的熱點(diǎn)。已研究發(fā)現(xiàn)約45種真菌和兩種細(xì)菌(假單胞桿菌、芽孢桿菌)對(duì)核 盤(pán)菌能產(chǎn)生拮抗作用。其中黏帚霉(Gliocladium spp.)、木霉(Trichodermaspp.)、盾殼霉 (Coniothyrium minitans)、鍵抱菌(Fusarium spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)對(duì)核盤(pán)菌 具有較強(qiáng)的生物防治潛能。上述微生物產(chǎn)生拮抗作用的機(jī)理大部分是微生物之間的寄生作 用。比如綠色木霉和盾殼霉能寄生在油菜菌核病的菌絲和菌核上，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)降解，細(xì)胞核破壞。這種生防機(jī)制受環(huán)境影響大，防效不穩(wěn)定。放線菌是一類(lèi)極其豐富的微生物資源，其 中很多、尤其是鏈霉菌屬能產(chǎn)生多種抗生素類(lèi)物質(zhì)，用于植物病害防治有著廣闊的前景。目 前國(guó)內(nèi)外大規(guī)模使用的防治水稻三大病害之一紋枯病的藥劑井R霉素就是放線菌的代謝 產(chǎn)物。井R霉素能導(dǎo)致紋枯病菌菌絲畸形，這種特殊的生防機(jī)制使得其在應(yīng)用的30多年來(lái) 未見(jiàn)明顯的抗藥性產(chǎn)生。JZG117是九寨溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)土壤樣品中分離篩選到的一個(gè)抗油菜菌核病 菌的放線菌菌株。該菌株發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，加入油菜菌核病菌培養(yǎng)基，與對(duì)照相 比，菌絲明顯褐化，不產(chǎn)生菌核。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)褐化的菌絲與正常菌絲相比，細(xì)胞 質(zhì)溶出，細(xì)胞“空胞化”。目前為止國(guó)內(nèi)未見(jiàn)放線菌株天然活性產(chǎn)物抗油菜菌核病菌的報(bào)道。 該菌的代謝產(chǎn)物能明顯抑制油菜菌核病菌產(chǎn)生菌核，從而從根本上切斷病害爆發(fā)流行的源 頭，具有很好的應(yīng)用前景。從保護(hù)農(nóng)業(yè)環(huán)境、提高食品安全性、保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的角度考慮，生物防 治前景十分廣闊。油菜菌核病的生物防治是保障油菜可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)重要技術(shù)，選用少 量低毒高效、無(wú)殘留的生物農(nóng)藥殺死或抑制病原菌，為研究開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥提供資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)油菜的毀滅性病害_油菜菌核病，提供一株生防活性菌 株，抑制其病原菌的生長(zhǎng)，從而有效控制該病害在油菜上的危害，提高油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，本發(fā)明第一個(gè)發(fā)明目的是提供一株鏈霉菌株D35 (Streptomyces misawanensis)，其中所述菌株已于2009年08月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo. 3250。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的鏈霉菌株JZG117的生理學(xué)特征是(1)在高氏一號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉 20g、K2HP040. 5g、KN03lg、FeS04 ·7Η20 0. Olg、 NaCIO. 5g、MgSO4O. 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、PH7. 2.)上生長(zhǎng)，菌落淺黃色。氣生菌絲和 基內(nèi)菌絲均很豐富，氣生菌絲體形成孢子鏈，孢子絲直形，中長(zhǎng)，孢子橢圓形，表面光滑；(2)能利用葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、菊糖、肌醇、甘露醇；不利用阿 拉伯糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、檸檬酸鈉；(3)菌株明膠液化弱，牛奶凝固，不胨化；(4)能水解淀粉，纖維素上生長(zhǎng)好，能轉(zhuǎn)化蔗糖、還原硝酸鹽；(5)不產(chǎn)生類(lèi)黑色素、酪氨酸酶和H2S ；(6) 28°C是菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最適生長(zhǎng)溫度，拮抗菌株在pH值5. 0 9. 0均能 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。由于通過(guò)上述鏈霉菌株JZG117所獲得的發(fā)酵液具有良好的抑制油菜菌核病菌的 效果，因此其菌株發(fā)酵液也是另一個(gè)具體實(shí)施方案。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，篩選所述的菌株JZG117的方法包括(1)從九寨溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)收集了 15份土壤樣品，分離了 137個(gè)放線菌菌 株；(2)以油菜菌核病菌為指示菌，采用平板對(duì)峙生長(zhǎng)法對(duì)各菌株拮抗活性進(jìn)行篩選， 得到一個(gè)抗菌活性高的放線菌菌株JZG117 ；
(3)菌株發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，在每個(gè)培養(yǎng)皿加入3mL稀釋5倍的濾液；(4)選取對(duì)油菜菌核病菌菌絲抑制率高的菌株，其中優(yōu)選抑制率為85. 6%。其中，加入放線菌發(fā)酵液濾液的培養(yǎng)基與對(duì)照相比，菌絲明顯褐化，不產(chǎn)生菌核。 電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，褐化的菌絲與正常菌絲相比，細(xì)胞質(zhì)溶出，細(xì)胞“空胞化”。本發(fā)明第二個(gè)發(fā)明目的是提供一種利用上述菌株在室內(nèi)培養(yǎng)基平板上抑制油菜 菌核病菌的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括(3)培養(yǎng)上述菌株JZGl 17，獲得JZGl 17的菌體；(4)將菌株JZG117的菌體接于培養(yǎng)基平板的四周抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將菌株JZG117的菌體接于培養(yǎng)基平板的四周，同時(shí)將油 菜菌核病菌接于培養(yǎng)基平板的中央，培養(yǎng)72小時(shí)后可見(jiàn)明顯的抑菌圈，直徑達(dá)8mm，并且菌 絲變褐，不產(chǎn)生菌核。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的方法包括(1)培養(yǎng)上述菌株JZG117，獲得JZG117的發(fā)酵液；(2)將菌株JZG117的發(fā)酵液與培養(yǎng)基混勻后抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將菌株JZG117的發(fā)酵液稀釋5倍后與培養(yǎng)基混勻， 在28°C下發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)好的發(fā)酵液首先用IOmL離心管分裝，在冷凍離心機(jī)中 15000rpm離心10分鐘，然后用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到培養(yǎng)濾液。測(cè)定抗菌活性時(shí)，在每個(gè)無(wú) 菌培養(yǎng)皿中加入3ml培養(yǎng)濾液與PDA培養(yǎng)基混勻，制成平板，平板培養(yǎng)基冷卻后，將事先裁 取的直徑5mm的菌餅倒置移入平板中央。靜置Ih后放入28°C溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)重復(fù)3次。 待對(duì)照全部長(zhǎng)滿，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈透明程度和邊緣整齊程度， 記錄結(jié)果并按下式計(jì)算抑制率菌落直徑=相垂直的兩直徑的平均值_菌餅直徑抑制率(％)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑_菌餅直 徑)X100%本發(fā)明第三個(gè)發(fā)明目的是保護(hù)利用上述菌株或菌株發(fā)酵液用于防治油菜菌核病 菌的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，利用上述菌株制備發(fā)酵液，或直接利用菌株發(fā)酵液，對(duì)油 菜進(jìn)行直接噴霧，來(lái)抑制油菜菌核病菌在油菜體內(nèi)的擴(kuò)散，從而減少油菜發(fā)病率，以實(shí)現(xiàn)提 高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的用途。技術(shù)效果1、本發(fā)明的鏈霉菌菌株，能夠有效抑制其病原菌的生長(zhǎng)，從而有效控制該病害在 油菜上的危害，提高油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)；2、本發(fā)明的鏈霉菌菌株，選用發(fā)酵液稀釋5倍與培養(yǎng)基混勻后，對(duì)油菜菌核病菌 的抑制率85. 6% ；3、本發(fā)明的鏈霉菌菌株，在溫室試驗(yàn)中，選用發(fā)酵液稀釋25、50倍，在油菜苗期進(jìn) 行噴霧防治，對(duì)油菜菌核病的防效作用分別為87. 8%和79. 3% ；4、本發(fā)明的鏈霉菌菌株，在田間試驗(yàn)中，選用發(fā)酵液稀釋25倍，在油菜盛花期時(shí) 進(jìn)行噴霧防治，對(duì)油菜菌核病的防效作用分別為80. 8%。具體實(shí)施方案實(shí)施例1 鏈霉菌株JZGl 17的篩選從九寨溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)收集了 15份土壤樣品，采用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基(可 溶性淀粉 20g、K2HPO4O. 5g、KN03lg、FeSO4 · 7H20 0. 01g、NaCI0. 5g、MgSO4O. 5g、瓊脂粉 20、蒸 餾水1000mL、PH7. 2)進(jìn)行篩選，篩選到137個(gè)菌株，逐一進(jìn)行平板拮抗實(shí)驗(yàn)，得到菌核病菌 抑制菌株JZG117，進(jìn)行生測(cè)實(shí)驗(yàn)。將分離純化的菌株JZG117接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基 (可溶性淀粉 20g、K2HPO4O. 5g、KNO3lg> FeSO4 · 7H20 0. Olg、NaCIO. 5g、MgSO4O. 5g、蒸餾水 1000mL、PH7. 2)。28°C下?lián)u瓶發(fā)酵72h，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾發(fā)酵液，用無(wú)菌水稀釋5倍。在 每個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入稀釋液3mL，倒入PDA培養(yǎng)基(55°C左右)，搖勻，制成平板，待培養(yǎng)基 冷卻后，用無(wú)菌打孔器將培養(yǎng)在PDA上的油菜菌核病菌打成4 5mm的小菌餅，菌絲生長(zhǎng)面 朝下移放到加有JZG117發(fā)酵液的平板培養(yǎng)基中央。重復(fù)3次。靜置Ih后放入溫箱，28°C 下培養(yǎng)5d。用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈透明程度和邊緣整齊程度。實(shí)施例2 鏈霉菌株JZGl 17的生理生化特征及其保藏將篩選的菌株JZG1172009年08月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No. 3251。該菌株的生理學(xué)特征JZG117菌株具有典型的鏈霉菌屬的特征，該菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落 淺黃色。氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均很豐富，氣生菌絲體形成孢子鏈，孢子絲螺旋形，中長(zhǎng)；孢 子橢圓形，表面光滑。JZG117菌株能利用利用葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、菊糖、 肌醇、甘露醇；不利用阿拉伯糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、檸檬酸鈉。菌株明膠液化弱。 牛奶凝固，不胨化。淀粉水解。纖維素上生長(zhǎng)好。蔗糖轉(zhuǎn)化。硝酸鹽還原。不產(chǎn)生類(lèi)黑色 素、酪氨酸酶和H2S。28°C是菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最適生長(zhǎng)溫度，拮抗菌株在pH值5. 0 9.0均能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。該菌株的鑒定根據(jù)放線菌16S rDNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，正向 引物 16sF :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；反向引物 16sR :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。由上海生物 工程公司合成。以基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA, PCR擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)變性5min ；94°C變性Imin，56°C復(fù)性Imin，72°C延伸2min, 25個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min。采 用1.0%的瓊脂糖對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)。采用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司硅膠模型 TMPCR產(chǎn)物純化試劑盒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收。天根生化科技(北京)有限公司pGM-T 克隆試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化好的菌株，送上海生工 測(cè)序。經(jīng)測(cè)序獲得菌株16S rDNA序列，通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST 與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的放線菌16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。菌株JZG117的16S rDNA部分核苷酸序列1500bp，將其與BLAST搜索到的相近菌 株進(jìn)行16S rDNA序列比較，用MEGA4. 1軟件以相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明JZG117 的 16S rDNA 序列與綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomyces viridochromogenes)的 16SrDNA 序列 同源性非常高，達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征分析，將其鑒定為鏈霉 菌屬的綠色產(chǎn)色鏈霉菌。實(shí)施例3 鏈霉菌株JZGl 17發(fā)酵液的制備(1)菌株的培養(yǎng)
配制高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基，接種，放入28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，保存?zhèn)溆谩?2)制備發(fā)酵液配制高氏一號(hào)培養(yǎng)液，滅菌前分裝三角瓶(500mL瓶、裝IOOmL 液)，121°C高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后在超凈工作臺(tái)上接種。用無(wú)菌水法直接洗下斜面培 養(yǎng)基上的菌體接入發(fā)酵三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)，280C，200r/min,培養(yǎng)48h。馬上轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐發(fā) 酵，參照發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制(配方大米粉10g，黃豆粉5g，葡萄糖10g，碳酸鈣3g，氯化鈉 lg，蛋白胨Ig,水1000毫升PH = 1.2),滅菌，冷卻后接種與發(fā)酵，280C，200r/min,培養(yǎng)72h 中止發(fā)酵，馬上用罐裝塑料袋包裝發(fā)酵液。實(shí)施例4 鏈霉菌株JZG117菌體及其發(fā)酵液用于在室內(nèi)培養(yǎng)基平板上抑制油菜菌 核病菌的工藝JZGl 17菌體抑制油菜菌核病菌的工藝用打孔器將油菜菌核病菌打成5mm小菌 餅，在PDA平板中央菌絲生長(zhǎng)面朝下放置油菜菌核病菌菌餅，在距離中央3. 5cm的圓周上等 距離接種菌株JZG117的菌體。放入25°C溫箱種培養(yǎng)3 5天。觀察抑菌圈大小，透明程度 和邊緣整齊程度。其中，用菌株JZG117的發(fā)酵液與培養(yǎng)基混勻后抑制油菜菌核病菌的工藝在28°C 下發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)好的發(fā)酵液首先用IOmL離心管分裝，在冷凍離心機(jī)中15000rpm 離心10分鐘，然后用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到培養(yǎng)濾液，用無(wú)菌水稀釋5倍。測(cè)定抗菌活性時(shí)， 在每個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入3ml培養(yǎng)濾液與PDA培養(yǎng)基混勻，制成平板，平板培養(yǎng)基冷卻后， 將事先裁取的直徑5mm的菌餅倒置移入平板中央。靜置Ih后放入28°C溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)重 復(fù)3次。待對(duì)照全部長(zhǎng)滿，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈透明程度和邊緣整 齊程度，記錄結(jié)果并按下式計(jì)算抑制率菌落直徑=相垂直的兩直徑的平均值_菌餅直徑抑制率(％)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑_菌餅直 徑)X100%放線菌JZG117菌株的發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌的生長(zhǎng)有較高的抑制率，達(dá)85.6%。實(shí)施例5 鏈霉菌株JZG117發(fā)酵液用于溫室防治油菜菌核病菌將本產(chǎn)品用于溫室盆栽試驗(yàn)。將油菜籽單株播種在營(yíng)養(yǎng)缽中，20天后將JZG117發(fā) 酵液分別稀釋25倍和50倍直接噴霧于油菜上。24小時(shí)后將事先裁取的直徑5mm的油菜菌 核病菌的小菌餅菌絲生長(zhǎng)面朝下，貼于油菜最嫩葉片正面，透明膠固定。每個(gè)處理重復(fù)50 次，5天后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果如下表1溫室利用JZGl 17菌株發(fā)酵液噴霧防油菜菌核病
處理發(fā)病率/%防治效果/%~~
25倍發(fā)酵液(噴霧) 9287^8
50倍發(fā)酵液(噴霧)20.7%79.3
CK(噴霧)100.00實(shí)施例6 鏈霉菌株JZG117發(fā)酵液用于田間防治油菜菌核病菌選擇多年的重病田進(jìn)行田間防治效果試驗(yàn)。待全田95%以上的油菜主莖開(kāi)花時(shí)，
7采用JZG117發(fā)酵液稀釋25倍直接噴霧于油菜。7天后，再噴霧防治一次。油菜采收前7天 調(diào)查統(tǒng)計(jì)防治效果。結(jié)果顯示，JZG117菌株發(fā)酵液稀釋25倍后對(duì)油菜菌核病的田間防治 效果可達(dá)80. 8%。油菜菌核病嚴(yán)重度分級(jí)指標(biāo)0級(jí)無(wú)病；1級(jí)1/3以下分枝數(shù)發(fā)病，或主莖病斑不超過(guò)3cm ；2級(jí)1/3_2/3分枝數(shù)發(fā)病，或發(fā)病分枝數(shù)在1/3以下及主莖病斑超過(guò)3cm以上；3級(jí)2/3以上分枝數(shù)發(fā)病，或發(fā)病分枝數(shù)在2/3以下及主莖中下部病斑超過(guò)3cm 以上。病情指數(shù)=Σ (各級(jí)株數(shù)X該病級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)X最高級(jí)值)XlOO防治效果=(對(duì)照病指_處理病指)/對(duì)照病指X 100% .
權(quán)利要求
一種具有抑制油菜菌核病菌的綠色產(chǎn)色鏈霉菌JZG117(Streptomycesviridochromogenes)，其中所述菌株已于2009年08月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.3251。
2.權(quán)利要求1所述的鏈霉菌株JZG117，其生理學(xué)特征是(1)在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落淺黃色。氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均很豐富，氣生菌絲 體形成孢子鏈，孢子絲直形，中長(zhǎng)，孢子橢圓形，表面光滑；(2)能利用葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、菊糖、肌醇、甘露醇；不利用阿拉伯 糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、檸檬酸鈉；(3)菌株明膠液化弱，牛奶凝固，不胨化；(4)能水解淀粉，纖維素上生長(zhǎng)好，能轉(zhuǎn)化蔗糖、還原硝酸鹽；(5)不產(chǎn)生類(lèi)黑色素、酪氨酸酶和H2S；(6)28°C是菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最適生長(zhǎng)溫度，拮抗菌株在pH值5. O 9. O均能產(chǎn)生 抗菌物質(zhì)。
3.—種通過(guò)權(quán)利要求1或2所述的綠色產(chǎn)色鏈霉菌JZG117獲得的菌株發(fā)酵液及其制劑。
4.一種用于篩選權(quán)利要求1或2所述菌株JZG117的方法，主要包括以油菜菌核病菌 為指示菌，采用平板對(duì)峙生長(zhǎng)法對(duì)各菌株拮抗活性進(jìn)行篩選，得到抗菌活性高的放線菌菌 株。
5.一種利用權(quán)利要求1或2的菌株在室內(nèi)培養(yǎng)基平板上抑制油菜菌核病菌的方法，包括(1)培養(yǎng)上述菌株JZG117，獲得JZG117的菌體；(2)將菌株JZG117的菌體接于培養(yǎng)基平板的四周抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中步驟2中將菌株JZG117的菌體接于培養(yǎng)基平板的四周，同 時(shí)將油菜菌核病菌接于培養(yǎng)基平板的中央，培養(yǎng)72小時(shí)后可見(jiàn)明顯的抑菌圈，直徑達(dá)8mm， 并且菌絲變褐，不產(chǎn)生菌核。
7.一種利用權(quán)利要求3的菌株發(fā)酵液在室內(nèi)培養(yǎng)基平板上抑制油菜菌核病菌的方法， 主要包括將菌株JZG117的發(fā)酵液與培養(yǎng)基混勻后抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng)。
8.一種利用權(quán)利要求1或2的菌株或權(quán)利要求3菌株發(fā)酵液及其制劑的用于防治油菜 菌核病菌的用途。
9.權(quán)利要求7的用途，其中利用上述菌株制備發(fā)酵液或直接利用菌株發(fā)酵液，對(duì)油菜 進(jìn)行直接噴霧或灌根，來(lái)抑制油菜菌核病菌在油菜體內(nèi)的擴(kuò)散，從而減少油菜發(fā)病率，以實(shí) 現(xiàn)提高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的用途。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有防治油菜菌核病的不足，提供一種具有抑制油菜菌核病菌的綠色產(chǎn)色鏈霉菌JZG117(Streptomyces viridochromogenes)，其中所述菌株已于2009年08月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.3251。本發(fā)明還提供了利用該菌株來(lái)有效抑制菜菌核病菌在油菜體內(nèi)的擴(kuò)散，減少發(fā)病率，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，并有助于生物防治產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，進(jìn)而促進(jìn)該病害的安全控制。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101935620SQ201010004639
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日
發(fā)明者向華 申請(qǐng)人:向華