一種單分子測(cè)序芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA測(cè)序芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單分子測(cè)序芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]進(jìn)入21世紀(jì)后，人類基因組計(jì)劃的完成對(duì)當(dāng)代的生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了巨大的影響。就基因序列分析而言，后基因組時(shí)代的重點(diǎn)已由單個(gè)物種的全基因組序列測(cè)定轉(zhuǎn)移到了對(duì)某一物種在基因組DNA序列層次上對(duì)個(gè)體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。靶向基因重測(cè)序?qū)?huì)是未來臨床基因檢測(cè)的主流技術(shù)。單分子測(cè)序技術(shù)被譽(yù)為第三代測(cè)序技術(shù)，其顯著特征是可以高保真地對(duì)DNA片段直接進(jìn)行識(shí)別，單分子測(cè)序技術(shù)由于能識(shí)別到單個(gè)核酸分子，其具有比高通量測(cè)序技術(shù)(統(tǒng)稱為二代測(cè)序技術(shù))更高的檢測(cè)靈敏度。
[0003]基因芯片是測(cè)序技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵部件。然而，二代測(cè)序芯片是目前市場(chǎng)上的主流產(chǎn)品，它們大多是采用半導(dǎo)體納米加工工藝得到高密度的納米陣列，加工工藝精細(xì)且復(fù)雜，成本非常高，且需要大型的高精度儀器和超高級(jí)別的潔凈室來完成。另外，二代測(cè)序芯片為了實(shí)現(xiàn)高通量的測(cè)序目的，芯片通道的寬度通常較大，在負(fù)壓抽液方式進(jìn)樣進(jìn)行生化反應(yīng)時(shí)，通常會(huì)存在流體的流場(chǎng)分布不均問題和蓋玻片易變形的問題。流場(chǎng)分布不均問題會(huì)造成試劑切換不干凈，并使生化反應(yīng)受影響，蓋玻片變形會(huì)影響芯片的質(zhì)量，更會(huì)影響堿基光學(xué)信號(hào)的采集。
[0004]單分子測(cè)序技術(shù)由于在測(cè)序數(shù)據(jù)量上要求不高，無需像二代測(cè)序芯片要求超高密度的納米陣列，因此傳統(tǒng)的二代測(cè)序芯片已無法匹配單分子測(cè)序技術(shù)，所以，有必要提供一種適用于單分子測(cè)序的芯片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于此，本發(fā)明提供了一種單分子測(cè)序芯片，所述單分子測(cè)序芯片的流場(chǎng)分布情況良好，芯片的變形率低，流體的沖刷切換徹底。
[0006]本發(fā)明提供了一種單分子測(cè)序芯片，所述單分子測(cè)序芯片包括基片和所述基片壓合設(shè)置的基底層，所述基片包括相對(duì)設(shè)置的第一表面和第二表面，所述基片第一表面間隔設(shè)置有多個(gè)流道形成的反應(yīng)池陣列，每個(gè)所述流道相對(duì)設(shè)置的兩個(gè)側(cè)壁沿所述流道的長(zhǎng)度方向延伸并在所述流道的兩端交匯形成兩個(gè)帶有夾角的錐形末端，所述兩個(gè)錐形末端表面分別設(shè)置有與所述基片第二表面連通的流體輸入孔和流體輸出孔，所述基底層包括透明基底和設(shè)置在所述透明基底表面的間隔層，所述間隔層與所述基片第一表面接觸且所述間隔層對(duì)應(yīng)所述流道所在的位置設(shè)置有腐蝕凹槽。
[0007]優(yōu)選地，所述反應(yīng)池陣列包括15-25個(gè)流道。
[0008]優(yōu)選地，所述間隔層沿與所述流道的長(zhǎng)度方向垂直的方向之間的寬度為1-1.5mm。
[0009]如本發(fā)明所述的，相鄰流道之間的間距為1-1.5mm。
[0010]優(yōu)選地，所述錐形末端的夾角為30-60°。
[0011]優(yōu)選地，每個(gè)所述流道相對(duì)設(shè)置的兩個(gè)側(cè)壁的交匯處的距離為每個(gè)流道的長(zhǎng)度，每個(gè)所述流道的長(zhǎng)度為50-75mm。
[0012]優(yōu)選地，每個(gè)所述流道相對(duì)設(shè)置的兩個(gè)側(cè)壁之間的距離為每個(gè)流道的寬度，每個(gè)所述流道的寬度為I_2mm。
[0013]優(yōu)選地，每個(gè)所述流道的深度為0.6-lmm。
[0014]將流道的深度優(yōu)選為0.6-1_，根據(jù)矩形流道流體力學(xué)阻力規(guī)律，厚度方向每增加一倍，流阻降低為原來的1/8，小的流阻，有利于流體的流動(dòng)，便于單分子測(cè)序過程中，流體在流道內(nèi)進(jìn)行生化反應(yīng)。
[0015]更優(yōu)選地，每個(gè)流道的長(zhǎng)度50_，寬度為1mm，深度為0.6_。
[0016]在流體上來說，寬度更窄的流道更有利于流體間的沖刷切換，將流道兩端的縱截面設(shè)計(jì)成為三角形，當(dāng)流體流過該流道內(nèi)，可使流道內(nèi)不存在回流現(xiàn)象。
[0017]優(yōu)選地，所述基片具有與所述流道的長(zhǎng)度方向垂直的第一邊長(zhǎng)，每個(gè)流道相對(duì)設(shè)置的兩個(gè)側(cè)壁的交匯處距所述基片的第一邊長(zhǎng)的距離為0.5-lcmo
[0018]優(yōu)選地，所述流體輸入孔和流體輸出孔同軸。
[0019]優(yōu)選地，所述流體輸入孔的孔徑大小為300-500 μ m0
[0020]優(yōu)選地，所述流體輸出孔的孔徑大小為300-500 μ m。
[0021]如發(fā)明所述的，所述基片第一表面間隔設(shè)置有多個(gè)流道組成單分子測(cè)序芯片的反應(yīng)池陣列，每個(gè)流道的兩個(gè)錐形末端表面開設(shè)有流體輸入孔和輸出孔，以供流體的流入與流出。
[0022]如本發(fā)明所述的，所述流體輸入孔和流體輸出孔用于連接流體的輸入、輸出裝置，例如，可以在所述流體輸入孔和流體輸出孔分別插上移液槍頭、管接頭等，以分散每個(gè)流道內(nèi)流體的輸入點(diǎn)、輸出點(diǎn)，便于每個(gè)流道內(nèi)流體的輸入、輸出不受干擾。
[0023]優(yōu)選地，所述基片的材質(zhì)包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、EVA(乙烯-醋酸乙烯)和PUA(聚胺脂)中一種或多種，但不限于此，只要能實(shí)現(xiàn)澆筑工藝即可。
[0024]優(yōu)選地，所述透明基底包括表面帶有官能團(tuán)為環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基中的一種的透明的玻璃、石英或有機(jī)聚合物材料。
[0025]更優(yōu)選地，所述透明基底為表面帶有環(huán)氧基的透明玻璃或石英。
[0026]優(yōu)選地，所述間隔層的材質(zhì)為聚甲基戊二酰亞胺(PMGI)。所述間隔層用于阻隔各流道內(nèi)的樣本之間的接觸，保證每個(gè)流道內(nèi)樣本的單獨(dú)控制。
[0027]優(yōu)選地，所述間隔層是向每個(gè)流道內(nèi)注入試劑以清洗掉與各流道接觸的透明基底上的聚甲基戊二酰亞胺層，以使透明基底上表面帶有的官能團(tuán)(環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基等)暴露出來。所述間隔層用于阻隔各流道內(nèi)的樣本之間的接觸，保證每個(gè)流道內(nèi)樣本的單獨(dú)控制。
[0028]優(yōu)選地，所述腐蝕凹槽的深度為1-5 μ m。
[0029]所述透明基底表面的官能團(tuán)(如環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基)，可與單分子測(cè)序儀的基因樣本的官能團(tuán)(如羧基、磷酸基、氨基等)發(fā)生作用，使得基因樣本(如DNA、RNA)固定在芯片的透明基底上，從而便于測(cè)序的進(jìn)行。如透明基底上的環(huán)氧基可與修飾有_順2的DNA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，通過新的-CH2-NH-鍵將待測(cè)序的DNA單鏈固定在修飾有環(huán)氧基團(tuán)的基底表面。
[0030]所述單分子測(cè)序芯片在應(yīng)用時(shí)，在下層透明基底的外部設(shè)有熒光檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器為光電耦合器件CCD或互補(bǔ)性氧化金屬半導(dǎo)體CMOS中的一種。經(jīng)過微流體通道中的生化反應(yīng)，可用多種光學(xué)波長(zhǎng)來檢測(cè)固定在透明基底上的DNA分子中某一特定位置的堿基，從而確定固定在透明基底上的DNA序列。
[0031]本發(fā)明提供的單分子測(cè)序芯片具有一定數(shù)目的流道，每個(gè)流道帶有夾角的錐形末端，可使流道內(nèi)流體的流場(chǎng)分布情況良好，流道內(nèi)不存在回流現(xiàn)象，流場(chǎng)分布情況遠(yuǎn)好于二代測(cè)序芯片，同時(shí)集成化的多流道的設(shè)計(jì)增加了基底的支撐點(diǎn)，基底的變形問題幾乎可以忽略。該單分子測(cè)序芯片可以實(shí)現(xiàn)每個(gè)流道內(nèi)樣本的單獨(dú)控制，保證了樣本間無交叉污染，同時(shí)可以簡(jiǎn)化后期數(shù)據(jù)處理工作。另外，該單分子測(cè)序芯片無需像二代測(cè)序芯片中，在每個(gè)樣本進(jìn)樣之前都要加入特定的一段序列“barcode”，以便從測(cè)序之后的生物信息分析可以識(shí)別出每個(gè)樣本。
[0032]本發(fā)明提供的所述單分子測(cè)序芯片的制備方法，包括以下步驟:
[0033](I)取一基板，根據(jù)設(shè)計(jì)好的反應(yīng)池陣列的圖形模板，采用光刻法在基板的表面制作反應(yīng)池陣列的陽膜；
[0034](2)用模型膠澆注所述陽膜，經(jīng)過真空除氣后，在90-100°C下固化l_3h，使所述反應(yīng)池陣列的陽膜轉(zhuǎn)移在所述模型膠的底部，揭膜，得到帶有多個(gè)流道的模型膠層，并在每個(gè)流道的兩端各打一個(gè)孔，形成流體輸入孔和流體輸出孔，得到基片；
[0035](3)基底修飾:取一透明基底，在所述透明基底的表面制備一聚甲基戊二酰亞胺(PMGI)層，得到表面修飾的透明基底；
[0036](4)封裝芯片:將上述基片與所述表面修飾的透明基底進(jìn)行氧等離子體清洗，之后將所述基片與透明基底壓合形成容納流體的空間；然后往每個(gè)流道內(nèi)注入N-甲基吡咯烷酮(簡(jiǎn)寫為NMP)，反應(yīng)時(shí)間為10min-15min，以清洗掉與各流道接觸的聚甲基戊二酰亞胺層，得到位于所述透明基底表面的間隔層，完成單分子測(cè)序芯片的制作，所述單分子測(cè)序芯片包括基片和所述基片壓合設(shè)置的基底層，所述基片包括相對(duì)設(shè)置的第一