一種毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]檢測堿基序列的方法有桑格法、待測序法、單分子測序等，但是檢測一般都需要較大型的檢測儀器，檢測費(fèi)用也較高。
[0003]熒光染料是一種可吸收紫外線或可見光并將其由短波長轉(zhuǎn)化為較長波長的可見光并反射出來，可用肉眼看見其反射出來的明亮色彩。熒光染料由于其靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記，其廣泛應(yīng)用于熒光探針，細(xì)胞染色，特異性DNA
染色等。
[0004]另一方面，毛細(xì)管電泳作為一種快速有效、高靈敏、低樣品消耗的微分離技術(shù)，在生物分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，通過將熒光檢測與毛細(xì)管電泳相結(jié)合，大大提高了檢測限，拓展了毛細(xì)管的應(yīng)用。且毛細(xì)管內(nèi)的方法相對(duì)毛細(xì)管外的方法更靈敏、更迅速、樣品消耗更低。
[0005]本方法通過DNAl-FAM熒光探針與互補(bǔ)DNA在毛細(xì)管內(nèi)雜交的電泳峰變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，來快速檢測互補(bǔ)DNA中的不匹配堿基數(shù)目。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測互補(bǔ)DNA中不匹配堿基數(shù)目的不足，提供一種毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，拓寬其在生物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為，一種毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，步驟如下:(I)設(shè)計(jì)3’端偶聯(lián)熒光染料的DNA，形成熒光探針；
[0008](2)設(shè)計(jì)若干與步驟⑴所述DNA片段具有不同數(shù)量不匹配堿基的互補(bǔ)DNA ;
[0009](3)分別將若干互補(bǔ)DNA與熒光探針在毛細(xì)管內(nèi)雜交，經(jīng)熒光檢測，計(jì)算峰面積比(Si/SuJ，得到峰面積比與不匹配堿基數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品與熒光探針毛細(xì)管內(nèi)雜交后，計(jì)算其電泳峰面積比(S1Z^cital)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測樣品的不匹配堿基數(shù)。
[0010]進(jìn)一步地，所述的熒光染料為6-FAM。
[0011]進(jìn)一步地，所述互補(bǔ)DNA與熒光探針在毛細(xì)管內(nèi)的進(jìn)樣順序?yàn)橄冗M(jìn)電泳迀移速度慢的熒光探針，再進(jìn)電泳迀移速度快的互補(bǔ)DNA，所述互補(bǔ)DNA與熒光探針進(jìn)樣時(shí)間差保證兩者能在毛細(xì)管內(nèi)雜交。
[0012]作為優(yōu)選，所述熒光探針中DNA為5’ -GGT TGG TGT GGT TGG-3’。
[0013]作為優(yōu)選，所述的毛細(xì)管采用內(nèi)徑75 μ m，全長60cm，有效長度35cm的石英毛細(xì)管，通過18kV的高壓電源使待測樣品及緩沖液在毛細(xì)管內(nèi)流動(dòng)。
[0014]采用上述的技術(shù)方案后，本發(fā)明所取得的有益效果是，本發(fā)明提供的毛細(xì)管內(nèi)快速檢測不匹配堿基數(shù)的方法，操作簡單，可重復(fù)性高，能方便快捷的檢測出樣品中不匹配堿基數(shù)量，進(jìn)一步拓展了 DNA熒光探針在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0015]圖1:DNA1-FAM與含有不同數(shù)量不匹配堿基的互補(bǔ)DNA在毛細(xì)管內(nèi)雜交的電泳圖。(a，DNAl-FAM ;b，互補(bǔ)鏈為 5’-CCA ACC ACA CCA ACC-3’；c，互補(bǔ)鏈為 5’-CCA ACC ACACCA ACG-3> ;d，互補(bǔ)鏈為 5’ -CCA ACC ACA CCA AGG-3> ;e，互補(bǔ)鏈為 5’ -CCA ACC ACA CCGGGG-3，;f，互補(bǔ)鏈為 5’ -CCA ACC ACA GGG GGG-3，)
[0016]圖2 =S1Z^cital與不匹配堿基數(shù)量的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明將就以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但應(yīng)了解的是，這些實(shí)施例僅為例示說明之用，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實(shí)施的限制。
[0018]實(shí)施例1
[0019]1、毛細(xì)管米用內(nèi)徑75 μπι，全長60cm，有效長度35cm的石英毛細(xì)管，通過18kV的高壓電源使待測樣品及緩沖液在毛細(xì)管內(nèi)流動(dòng)。
[0020]2、(I)設(shè)計(jì)DNAl-FAM熒光探針，該探針包括熒光染料6-FAM和DNAl兩部分。DNAl為5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’，3’端偶聯(lián)熒光染料；(2)設(shè)計(jì)五種互補(bǔ)DNA，分別為5’_CCAACC ACA CCA ACC-3’(零個(gè)不匹配堿基)，5’ -CCA ACC ACA CCA ACG-3> ( 一個(gè)不匹配堿基)，5’ -CCA ACC ACA CCA AGG-3> (兩個(gè)不匹配堿基)，5’ -CCA ACC ACA CCG GGG-3，(四個(gè)不匹配堿基)，5’ -CCA ACC ACA GGG GGG-3，(六個(gè)不匹配堿基);(3) DNAl-FAM與含有不同數(shù)量(O個(gè)，I個(gè)，2個(gè)，4個(gè)，6個(gè))不匹配堿基的互補(bǔ)DNA按相同的濃度比2: 2，在毛細(xì)管內(nèi)間隔20s，分別進(jìn)樣20s，熒光毛細(xì)管電泳檢測(圖1)。發(fā)現(xiàn)隨著不匹配堿基數(shù)的增大，復(fù)合物(熒光探針與互補(bǔ)DNA雜交)的電泳峰逐漸減小，DNAl-FAM電泳峰逐漸增大，S1ZSlotal逐漸增大，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。
[0021 ] 3、將待檢測DNA2，序列為5’ -CCA ACC ACA CCA AGC-3’，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到S1/sTcital為0.1，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，檢測其不匹配數(shù)量為I。
[0022]實(shí)施例2
[0023]1-2步驟同實(shí)施例1。
[0024]3、將待檢測DNA3，序列為5’ -CCA AGG ACA CCA ACC-3’，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到S1/Slotal^ 0.2，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，檢測其不匹配數(shù)量為2。
[0025]以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，其特征在于:(1)設(shè)計(jì)3’端偶聯(lián)熒光染料的DNA，形成熒光探針； (2)設(shè)計(jì)若干與步驟⑴所述DNA片段具有不同數(shù)量不匹配堿基的互補(bǔ)DNA; (3)分別將若干互補(bǔ)DNA與熒光探針在毛細(xì)管內(nèi)雜交，經(jīng)熒光檢測，計(jì)算峰面積比(S1/Slotal)(其中，S1為熒光探針峰面積，S Tcital為所有峰面積)，得到峰面積比與不匹配堿基數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品與熒光探針毛細(xì)管內(nèi)雜交后，計(jì)算其電泳峰面積比(Si/SuJ，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測樣品的不匹配堿基數(shù)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，其特征在于:所述的熒光染料為6-FAM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，其特征在于:所述互補(bǔ)DNA與熒光探針在毛細(xì)管內(nèi)的進(jìn)樣順序?yàn)橄冗M(jìn)電泳迀移速度慢的熒光探針，再進(jìn)電泳迀移速度快的互補(bǔ)DNA，所述互補(bǔ)DNA與熒光探針進(jìn)樣時(shí)間差保證兩者能在毛細(xì)管內(nèi)雜交。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，其特征在于:所述熒光探針中 DNA 為 5’ -GGT TGG TGT GGT TGG-3’。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，其特征在于:所述的毛細(xì)管采用內(nèi)徑75 μ m，全長60cm，有效長度35cm的石英毛細(xì)管，通過18kV的高壓電源使待測樣品及緩沖液在毛細(xì)管內(nèi)流動(dòng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物分析技術(shù)領(lǐng)域，一種毛細(xì)管電泳快速檢測堿基不匹配數(shù)量的方法，步驟如下：(1)設(shè)計(jì)3’端偶聯(lián)熒光染料的DNA，形成熒光探針；(2)設(shè)計(jì)若干與步驟(1)所述DNA片段具有不同數(shù)量不匹配堿基的互補(bǔ)DNA；(3)分別將若干互補(bǔ)DNA與熒光探針在毛細(xì)管內(nèi)雜交，經(jīng)熒光檢測，計(jì)算峰面積比(S1/STotal)，得到峰面積比與不匹配堿基數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品與熒光探針毛細(xì)管內(nèi)雜交后，計(jì)算其電泳峰面積比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測樣品的不匹配堿基數(shù)。本發(fā)明提供的毛細(xì)管內(nèi)快速檢測不匹配堿基數(shù)的方法，操作簡單，可重復(fù)性高，能方便快捷的檢測出樣品中不匹配堿基數(shù)量，進(jìn)一步拓展了DNA熒光探針在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。
【IPC分類】G01N27/447
【公開號(hào)】CN105181778
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510559851
【發(fā)明人】王建浩, 秦玉琴, 滕一萬, 陳瑤, 李進(jìn)晨, 蔣鵬舉, 邱琳, 王車禮, 楊麗, 張晨澄, 樊杰, 柳麗
【申請(qǐng)人】常州大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月6日