專利名稱：促進(jìn)植物生長(zhǎng)的蛋白復(fù)合物的制作方法
促進(jìn)植物生長(zhǎng)的蛋白復(fù)合物本發(fā)明涉及促進(jìn)植物生長(zhǎng)的蛋白復(fù)合物。更具體地，本發(fā)明涉及來(lái)自分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體(Anaphase Promoting Complex/Cyclosome)的特定蛋白質(zhì)在增加苗生長(zhǎng)速率(shoot growth rate)和/或增強(qiáng)細(xì)胞分裂速率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遍在蛋白化介導(dǎo)的蛋白酶解是控制調(diào)節(jié)蛋白水平的主要機(jī)制。底物遍在蛋白化過(guò)程包括三種酶的級(jí)聯(lián)活性，即遍在蛋白激活酶(El)、遍在蛋白綴合酶(E》以及遍在蛋白連接酶(Ε； )。遍在蛋白化的底物特異性和調(diào)節(jié)由E3遍在蛋白蛋白連接酶賦予，其直接結(jié)合靶蛋白質(zhì)，并且是遍在蛋白化級(jí)聯(lián)中的限速步驟(參見(jiàn)Hershko and Ciechanover，1998和 Peters,2002)。兩種結(jié)構(gòu)相關(guān)的多蛋白E3連接酶，即分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體(APC/C) 和Skpl/Cullin/F-box蛋白質(zhì)(SCF)復(fù)合物驅(qū)動(dòng)真核細(xì)胞周期行進(jìn)。SCF連接酶的活性主要控制從G1/S和G2/M的轉(zhuǎn)換(transition)，而APC/C主要為有絲分裂的行進(jìn)和退出所需 (Morgan,1999)。APC是已知催化遍在蛋白化反應(yīng)的最復(fù)雜的分子機(jī)構(gòu)之一，因?yàn)槠浜幸淮蛞陨系膩喕?Yoon et al. ,2002 ；Peters et al.，1996)。這種復(fù)雜性是不希望的，因?yàn)樵S多其它遍在蛋白連接酶僅由一或幾個(gè)亞基組成，意味著遍在蛋白連接酶活性非必然依賴于多個(gè)亞基。因此，仍費(fèi)解的是為什么APC由如此多的蛋白質(zhì)成分組成及其各個(gè)功能如何。APClO 是 APC/C 的亞基，其含有 Doc 1 (Destruction of Cyclin)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域也見(jiàn)于遍在蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)的一些其它蛋白質(zhì)中。已知酵母中APClO的突變體阻止底物與APC/CGdhl結(jié)合，提示這個(gè)亞基可能在底物識(shí)別起作用。I^assmore et al. (2003)已經(jīng)證實(shí)APC10有助于APC底物識(shí)別，不依賴于共激活物，及提示APC10起潛在的APC調(diào)節(jié)亞基的作用。芽殖酵母APC的生物化學(xué)分析示出APC10/D0C1通過(guò)增強(qiáng)APC-底物復(fù)合物的親和性而增加底物遍在蛋白化的進(jìn)程(Carrol et al.，2005)。重要地，APC與激活物⑶Hl和 ⑶C20之間的相互作用不受APC10/D0C1功能喪失的影響，提示APC10/D0C1直接或與其它核心APC亞基合作而促進(jìn)底物結(jié)合(Au et al.，2002)。擬南芥(Arabidopsis)中編碼APC亞基的整套基因的鑒別增進(jìn)了這樣的認(rèn)識(shí)，即植物中由遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶解控制的基本過(guò)程與其它真核生物相似(Eloy et al., 2006)。然而，基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的結(jié)果闡明植物APC的獨(dú)特特性，及示出可能特別為生長(zhǎng)應(yīng)答(適應(yīng)于變化的環(huán)境條件所需的)所需的柔性(flexible)復(fù)合物的前景(Eloy et al.， 2006)。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)APC10亞基以及APC10亞基的新相互作用物(Novel Interactor) (SAMBA)功能喪失的品系(line)示出增加的生長(zhǎng)。
本發(fā)明第一方面是APClO或者其變體在增加植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。如本文所示，所述應(yīng)用是所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，和/或編碼該蛋白質(zhì)的核酸或者其互補(bǔ)序列的應(yīng)用。其包括但不限于基因組DNA、cDNA、信使RNA(包括5’和3’非翻譯區(qū))以及RNAi。如本文所用，變體包括但不限于SEQ ID N0:1(APC10蛋白)的同源物、直系同源物和旁系同源物。蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋相對(duì)于所述未修飾的蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并具有與衍生其的未修飾的蛋白質(zhì)相似的生物活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。直系同源物和旁系同源物涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)通過(guò)祖先基因復(fù)制而起源的基因；直系同源物是來(lái)自通過(guò)物種形成而起源的不同生物體的基因，并且也衍生自共同的祖先基因。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物在蛋白質(zhì)水平具有在BLASTp中測(cè)量(Altschul et al. ,1997 ；Altschul et al.， 2005)的至少 50%、51%、52%、53%、54%或55%、56%、57%、58%、59%，優(yōu)選地 60%, 61 %,62%,63 %,64%,65 %,66%,67%,68 %,69 %,更優(yōu)選地 70 %,71 %,72 %,73 %, 74%、75%、76%、77%、78%、79%，還更優(yōu)選地 80 % ,81 % ,82 % ,83 % ,84 % ,85 % ,86 %, 87%、88%、89%，最優(yōu)選地 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列相同性。作為非限制性例子，SEQ ID N0:1的直系同源物是Pt796785(楊樹(shù))、 Vv00024912001 (葡萄)、AC187383 (玉米)和0s05g50360 (稻)。植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量的增加通過(guò)將包含根據(jù)本發(fā)明使用的基因的測(cè)試植物與在相同條件下生長(zhǎng)的作為對(duì)照的親本未轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行對(duì)比而測(cè)量。優(yōu)選地，生長(zhǎng)的增加以生物量產(chǎn)生的增加進(jìn)行測(cè)量?！爱a(chǎn)量” 是指這樣的情況，即其中僅植物的部分、優(yōu)選植物的經(jīng)濟(jì)學(xué)重要部分如葉、根或者種子的生物量增加。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“增加”是指與本文所述對(duì)照植物相比，產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)增加至少5%、6%、7%、8%、9%或者10%，優(yōu)選至少15%或者20%，更優(yōu)選25%、30%、35%或者40%。如本文所用，植物生長(zhǎng)的增加優(yōu)選以葉生物量、根生物量和種子生物量中任一或多項(xiàng)的增加進(jìn)行測(cè)量。本發(fā)明另一方面涉及APClO相互作用蛋白或者其變體、或者編碼該蛋白質(zhì)的核酸或者其互補(bǔ)序列在增加植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。事實(shí)上，由于APClO是蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分， 其功能可以由該復(fù)合物中其他蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)或者低表達(dá)補(bǔ)償。優(yōu)選地，所述APClO相互作用蛋白選自 AT2G39090、AT2G20000、AT5G05560、AT3G48150、AT1G06590、AT1G78770、 AT4G21530、AT2G04660、AT1G32310、AT2G42260、AT4GA19210、AT3G57860、AT3G16320、 AT4G25550、AT5G13840、AT3G48750、AT3G56150 和 AT2G06210 中的任一或多種蛋白，或者其變體。更優(yōu)選地，所述APClO相互作用蛋白是SAMBA(SEQ ID NO :2)，或者其變體。如本文所用，變體包括但不限于SEQ ID N0:2(SAMBA蛋白)的同源物、直系同源物或者旁系同源物。蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋相對(duì)于所述未修飾的蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并具有與衍生其的未修飾的蛋白質(zhì)相似的生物活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。直系同源物和旁系同源物涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)通過(guò)祖先基因復(fù)制而起源的基因；直系同源物是來(lái)自通過(guò)物種形成起源的不同生物體的基因，并且也衍生自共同的祖先基因。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物在蛋白質(zhì)水平具有如在BLASTp 中測(cè)量(Altschul et al. , 1997 ；Altschul et al. ,2005) 的至少 40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%，優(yōu)選 50%、51%、52%、 53%、54%或55%、56%、57%、58%、59%，優(yōu)選 60 % ,61 % ,62 % ,63 % ,64 % ,65 % ,66 %,67%、68%、69%，更優(yōu)選 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、以及還更優(yōu)選 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%，最優(yōu)選 90% 91%,92%, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列相同性。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物包含一或多個(gè)如下保守基序K (D/E) EA和/或PRS (R/H/C) I，更優(yōu)選基序(R/幻 K (D/E) EA (M/L/V)和 / 或 F (E/Q/D/G/A) (G/A) PRS (R/H/C) I，最優(yōu)選基序 K (D/E) E AXXXLXXXXMXXLXXXVXXLXXXXWXFXXraSXI，其中X可以是任何氨基酸。保守基序在

圖15中示出。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物是植物蛋白質(zhì)，更優(yōu)選是具有所述相同性百分比和所述保守基序的植物蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物在體外或者在體內(nèi)是生物學(xué)活性的，如通過(guò)其與APClO的相互作用而測(cè)量。作為非限制性實(shí)例，SAMBA(SEQ ID NO 2)的直系同源物選自 SEQ ID NO :3_SEQ ID NO :21。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，APClO是過(guò)表達(dá)的。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，SAMBA 的表達(dá)被抑制或者完全消除。過(guò)表達(dá)或者抑制是指與未修飾的親本植物相比在相同條件下生長(zhǎng)的修飾的植物中的表達(dá)。使基因過(guò)表達(dá)或者抑制基因表達(dá)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。作為非限制實(shí)例，過(guò)表達(dá)可以通過(guò)將基因的編碼序列置于強(qiáng)啟動(dòng)子例如但非限于CMV 35S啟動(dòng)子的控制下而實(shí)現(xiàn)?；蛘?，過(guò)表達(dá)可以通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)而實(shí)現(xiàn)。作為非限制性實(shí)例，基因表達(dá)的抑制可以通過(guò)基因沉默、反義RNA或者通過(guò)RNAi實(shí)現(xiàn)。RNAi的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。作為非限制性實(shí)例,RNAi可以用Web micro RNA designer (Ossowki et al. ,2005-2009)設(shè)計(jì)。所述RNAi可以針對(duì)mRNA的5’非翻譯末端區(qū)域的一部分、針對(duì)編碼序列一部分，和/或針對(duì)3’末端區(qū)域。靶序列的一些非限制性實(shí)例在表1中列出。因此，本發(fā)明另一方面涉及如上述針對(duì)編碼SAMBA或者其變體的核酸的RNAi在增加植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。所述RNAi僅靶向所述核酸的一部分，從而可以使所述靶序列位于編碼序列中，或者位于編碼SAMBA或者其變體的所述核酸的5’或3’非翻譯區(qū)。靶基因的過(guò)表達(dá)或者表達(dá)抑制可以通過(guò)將旨在用于所述過(guò)表達(dá)或者所述表達(dá)抑制的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)植物中而獲得。將外源基因轉(zhuǎn)移進(jìn)植物基因組中被稱作轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)。有利地，幾種轉(zhuǎn)化方法中的任意方法均可用于將感興趣的基因?qū)牒线m的祖細(xì)胞中。描述的用于從植物組織或者植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化和再生植物的方法可用于瞬時(shí)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化合物、將DNA直接注射進(jìn)植物中、基因槍轟擊、使用病毒或者花粉的轉(zhuǎn)化以及微粒轟擊(microprojection)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的植物選自擬南芥(Arabidopsis thaliana)、蕓苔屬(Brassicus sp.)、大豆(Glycine max)、漠藜苜猜(Medicago truncatula)、葡萄 (Vitis vinifera)、楊屬(Populus sp.)、爺屬(Solanum sp·)、舌甘菜(Beta vulgaris)、 陸地棉(Gossypium hirsutum)、燕麥(Avena sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、普通小麥(Triticum aestivum)、禾 S (Oryza sativa)> 毛竹(Phyllostachys edulis)、芒屬(Miscanthus sp.)、小米(Panicum virgatum)、玉米(Zea mays)、甘蔴(Saccharum officinarum)、高梁(Sorghum bicolor)禾口蓖麻(Ricinus communis)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是作物植物，優(yōu)選是單子葉植物或者谷物，更優(yōu)選是選自稻、玉米、大麥、小米、 黑麥、高粱和燕麥的谷物。本發(fā)明另一方面涉及轉(zhuǎn)基因植物，其包含針對(duì)編碼SAMBA (SEQ ID NO :2)或者其變體的核酸的RNAi。在此使用的轉(zhuǎn)基因植物是包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA 構(gòu)建體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入，或者通過(guò)近交間接導(dǎo)入。針對(duì)編碼SAMBA的核酸的RNAi是指能負(fù)調(diào)節(jié)SAMBA的野生型表達(dá)的RNAi。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物選自擬南芥、蕓苔屬、大豆、蒺藜苜猜、葡萄、楊屬、茄屬、甜菜、陸地棉、燕麥、大麥、普通小麥、稻、毛竹、芒屬、小米、 玉米、甘蔗、高粱和蓖麻。更優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物是作物植物，優(yōu)選單子葉植物或者谷物，更優(yōu)選是選自稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱和燕麥。附圖簡(jiǎn)述圖1 :APC10表達(dá)。在三周齡植物的全部幼苗(seedling)中APClO表達(dá)的Q-PCR 分析。圖2 =APCIOoe品系的表型分析。兩周齡在體外(in vitro)生長(zhǎng)的野生型(左側(cè)) 和APCIOoe植物(右側(cè))。圖3 野生型(Col-O)和APClO高產(chǎn)(overproducing)植物的第一對(duì)葉的葉生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析。(A)葉片面積。(B)葉的遠(yuǎn)軸側(cè)表皮細(xì)胞數(shù)。(C)葉的遠(yuǎn)軸側(cè)表皮細(xì)胞大小。圖4 在土壤中生長(zhǎng)的三周齡野生型哥倫比亞和APC10°E植物的葉測(cè)量。A-品系 5. 3的葉面積和葉長(zhǎng)度；B-品系2. 3的葉面積和葉長(zhǎng)度。野生型植物的葉面積和葉長(zhǎng)度以黃線示出。圖5 三周齡植物的鮮重和干重測(cè)量。A-22天齡APC10°E和野生型植物苗(shoot) 的鮮重。B-22天齡APC10°e和野生型植物苗的干重。圖6 最初葉的倍性水平分布:A-14天，B-18天。C-野生型、APC10OE5. 3和 APC10oe2. 3植物通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)量。圖7 =Samba敲除植物的分子分析。A-Samba的外顯子(方框)和內(nèi)含子(線)結(jié)構(gòu)示意圖。白色三角形表示T-DNA插入位點(diǎn)。B-SAMBA表達(dá)。對(duì)兩周齡植物的兩最初葉中的SAMBA表達(dá)進(jìn)行Q-PCR分析。圖8 =SAMBA敲除品系的表型分析。兩周齡在體外生長(zhǎng)的SAMBA敲除植物(左側(cè)) 和野生型植物(右側(cè))。A-SAMBA敲除植物(SALK_018488)和野生型植物。B-SAMBA敲除植物(SALK_04883;3)和野生型植物。圖9 在體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)生長(zhǎng)的三周齡植物的葉測(cè)量。A-22天齡在體外生長(zhǎng)的哥倫比亞(線)和SAMBA敲除植物(方塊)中的葉系列測(cè)量。B-得自測(cè)量 A的代表性圖片。C-22天齡在體內(nèi)生長(zhǎng)的哥倫比亞(明線)和SAMBA敲除植物(暗線)中的葉系列測(cè)量。圖10 三周齡植物的鮮重和干重測(cè)量。A-Samki和野生型對(duì)照植物的苗鮮重。 B-Samba和野生型對(duì)照植物的苗干重。圖11 野生型和Samba敲除植物的12和15天齡植物葉1和2的測(cè)量，以及14天齡野生型和Samki敲除植物的最初葉的倍性水平分布。黑色長(zhǎng)方形(野生型植物)，灰色長(zhǎng)方形(Samba敲除植物)。(A)葉片面積(mm2)。
(B)葉遠(yuǎn)軸側(cè)表皮細(xì)胞數(shù)。(C)野生型和Samba敲除植物的倍性水平(％ )。圖12 兩周齡植物的根測(cè)量。A-野生型和Samba敲除植物的初生根測(cè)量。B-得自測(cè)量A的代表性圖片。C-根鮮重測(cè)量。D-根干重測(cè)量。圖13 野生型和Samba敲除植物的種子大小測(cè)量。圖14 甘露醇實(shí)驗(yàn)。野生型和Samba敲除植物在25mM甘露醇條件下生長(zhǎng)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)植物在無(wú)甘露醇條件下生長(zhǎng)。圖15 =SAMBA變體的比對(duì)，示出保守基序。Arath 擬南芥(Arabidopsis thaliana) ；Brana 甘藍(lán)型油菜(Brassicus napus) ；Glyma 大豆(Glycine max)； Medtr — _ 胃 H (Medicago truncatula) ；Vitvi ^ ^ (Vitis vinifera) ；Poptr
沙Il 山楊(Populus tremula) ；Solly # ^jp (Solanum lycopersicon) ；Betvu:舌甘菜(Beta vulgaris) ；Avesa 燕麥(Avena sativa) ；Horvu 大麥(Hordeum vulgare) ；Triae 普通小麥(Triticum aestivum) ；Orysa M (Oryza sativa) ；Phyed 毛竹(Phyllostachys edulis) ；Panvi /J、(Panicum virgatum) ；Zeama ΞΕ (Zea mays) ；Sacof 1ξ["胃 (Saccharum officinarum) ；Sorbi :1 (Sorghum bicolor)。
實(shí)施例材料和方法克隆如述進(jìn)行在組成型花椰菜煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子控制下的編碼標(biāo)簽融合體的轉(zhuǎn)基因克隆、擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)提取物制備、TAP純化、蛋白質(zhì)沉淀和分離(Van Leene et al. ，2007 & 2008)。使用BLAST程序在擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組版本(www, arabidopsis. org)搜索APClO基因同系物。在TA^數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒別一個(gè)579bp及大約21KDa 的序列。APClO (AT2G18290)的編碼區(qū)用于設(shè)計(jì)特異性引物(AttblAPClO ggggacaagtttg tacaaaaaagcaggcttcacaatggcgacagagtcatcggaat 禾口 Attb2APC10 ggggaccactttgtacaag aaagctgggtatgttcttcaaacttctcctgctc),以分離各自的 cDNA,并從擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型的組織中通過(guò)PCR直接擴(kuò)增。使用Pfx試劑盒(Invitrogen)，根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用Gateway系統(tǒng) (Invitrogen)通過(guò)attBfcittP重組位點(diǎn)將來(lái)自APClO基因的完整cDNA的PCR片段導(dǎo)入 PDONr 201中，隨后通過(guò)attL XattR位點(diǎn)重組重組進(jìn)pK7WG2載體中。所述序列通過(guò)測(cè)序證實(shí)。APC10_pK7WG2構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana)，通過(guò)浸花 (flower-dip)方法(Clough and Bent, 1998)進(jìn)行。植物材料SAMBA 敲除植物(種子編碼SALK_048833 和 SALK_018488)得自 Salk 收藏(http://simal.salk. edu/)。每個(gè)品系的20株植物基因型通過(guò)PCR確定， 使用T-DNA插入元件的特異性引物和SAMBA的特異性引物進(jìn)行(salk 018488， LP_atgacgaaacaccgaaaacacand, RP_agttttatggtcggtcacacg ；Salk 048833, LP_ccattgggatcattactgctg, RP_aaaggaaacgtgacgattgtg ；T-DNA iJl^l^1), LBb 1_3
attttgccgatttcggaac)。在20株植物中，我們發(fā)現(xiàn)每個(gè)品系的2個(gè)單獨(dú)的純合子。T-DNA插入的存在及野生型基因的不存在通過(guò)對(duì)15天齡植物葉進(jìn)行基因組PCR證實(shí)。選擇這些植物產(chǎn)生更多的種子并用于隨后的分析。使用SAMBA的特異性引物(SAMBA_Fwd gctggtctagacgatttcca和 SAMBA_Rev-gcttcacttcacctcctttc)進(jìn)行 Q-PCR 以證實(shí)不存在 SAMBA 的 mRNA。擬南芥植物(生態(tài)型Col-O)用APC10_pK7WG2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，通過(guò)浸花(floral dip)方法(10)進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因品系(APC10°e)通過(guò)在萌發(fā)培養(yǎng)基中50mg/l卡那霉素中選擇鑒別，隨后移至土壤中以優(yōu)化種子生產(chǎn)，及選擇T3純合植物。過(guò)表達(dá)品系通過(guò)Q-PCR證實(shí)，使用特異性弓 I物(APC10_Fwd tcatatccgccagatcaaagttt 和 APC10_Rev aaggttggtgcggaatagga)進(jìn)行， 以證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物的mRNA水平。RNA提取和cDNA制備使用TRIzol試劑(Invitrogen)從冷凍材料中提取總RNA。為了消除制備物中存在的剩余基因組DNA，將RNA通過(guò)無(wú)RNAse的DNAse I根據(jù)廠商指導(dǎo)(Amersham Biosciences) 進(jìn)行處理，及使用來(lái)自Qiagen的RNeasy Mini試劑盒進(jìn)行純化。然后使用分光光度計(jì)對(duì)總 RNA進(jìn)行定量，并加樣于瓊脂糖凝膠上以檢測(cè)其完整性。使用“superscript III第一鏈合成系統(tǒng)”(Invitrogen)及oligo(dT)引物溶液在2ug RNA模板上根據(jù)廠商指導(dǎo)制備cDNA。蛋白酶解和肽分離在脫色后，將凝膠平板在H2O中洗滌1小時(shí)，在25mL的6. 66mM DTT(在50mM NH4HCO3中)中40分鐘使多肽二硫鍵還原，隨后在25mL的55mM IAM(在50mM NH4HCO3 中)中30分鐘使硫醇基團(tuán)烷化。在用水將該凝膠平板洗滌3次后，將蛋白質(zhì)凝膠的完整條帶切成薄片，收集于微滴定平板中，并基本如前所述略加改變進(jìn)行處理(Van Leene et al.，2007)。在每個(gè)微滴定平板孔中，使脫水的凝膠顆粒在20 μ L消化緩沖液中在4°C再水合30分鐘，所述消化緩沖液含有250ng胰蛋白酶(MS Gold ；Promega, Madison, WI)、 50mM NH4HCO3 禾Π 10 % CH3CN(ν/ν)。在加入 10 μ L 含有 50mM NH4HCO3 禾Π 10 % CH3CN(ν/ν) 的緩沖液之后，將蛋白質(zhì)在37°C消化3小時(shí)。濃縮所得肽，并用微型柱固相吸管尖(tip) (PerfectPureTM C18 tip, 200nL bed volume ；Eppendorf, Hamburg, Germany)脫鹽，并使用1.2yL的用α -氰基-4-羥基肉桂酸飽和的并摻加20fmole/y L Glul Fibrinop印tide B(Sigma Aldrich)、20fmole/μ L des-Pro2-Bradykinin(Sigma Aldrich)禾口 20fmole/ μ L Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18-39 human(Sigma Aldrich)的 50 % CH3CN 0. 1 % CF3COOH 溶液直接洗脫在 MALDI 靶平板(0pti_T0FTM384 Well Insert ； Applied Biosystems, Foster City, CA)上。獲得質(zhì)譜使用MALDI 串聯(lián) MS 儀 0700 和 4800 Proteomics Analyzer ；Applied Biosystems)獲得所選擇的肽的肽質(zhì)量指紋及隨后的IkV CID片段化譜。肽質(zhì)譜和肽序列譜通過(guò)使用基本如前所述設(shè)置獲得(Van Leene et al.，2007)。根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)校準(zhǔn)每個(gè)MALDI平板。所有肽質(zhì)量指紋(PMF)譜均使用三種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)部校準(zhǔn)，即 m/z 963. 516(des-Pro2_Bradykinin)、m/z 1570. 677(Glul—Fibrinopeptide B)禾口 m/z
82465, 198 (Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18—39)，獲得在分析的 MALDI 革巴上的每個(gè)分析的肽點(diǎn)的平均質(zhì)量精確度為5ppm士 lOppm。使用單獨(dú)的PMF質(zhì)譜，對(duì)通過(guò)質(zhì)量排阻濾膜的信號(hào)-噪音比超過(guò)20的多達(dá)16個(gè)肽進(jìn)行片段化分析?；贛S的蛋白質(zhì)同源性鑒別處理每個(gè)樣品的PMF譜和肽序列譜，使用附帶的軟件套件(GPS Explorer 3. 6， Applied Biosystems)和基本如先前所述的參數(shù)設(shè)置(Van Leene et al.，2007)進(jìn)行處理。產(chǎn)生數(shù)據(jù)搜索文件，根據(jù)TA^ 8.0進(jìn)行蛋白質(zhì)同源鑒別，使用本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎 (Mascot 2. LMatrix Science) 0保留相對(duì)分值超過(guò)95%可能性的最高命中的蛋白質(zhì)同源鑒別(第一級(jí))。當(dāng)分值超過(guò)98%可能性閾值時(shí)，保持另外的陽(yáng)性鑒別(第二級(jí)或更多級(jí))。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析。將葉組織用剃須刀片在200-400 μ 1緩沖液(45mM MgCl2, 30mM檸檬酸鈉，20mM 3-[N-嗎啉代]-丙烷-磺酸pH 7和Triton X-100)中剁碎，經(jīng)過(guò) 30 μ m濾網(wǎng)過(guò)濾，加入1μ 1的lyg/mL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。使用Cyflow ML流式細(xì)胞計(jì)(Partec)分析核DNA含量分布。葉測(cè)量和細(xì)胞數(shù)分析如先前所述(De Veylder et al. 2001)，在第12天和15天收獲的葉片1和2的遠(yuǎn)軸表皮上進(jìn)行Samba敲除植物和野生型植物的葉測(cè)量及隨后的細(xì)胞數(shù)分析。將植物播種在圓形12-cm培養(yǎng)皿的四分之一分區(qū)上，所述培養(yǎng)皿中填充了 IOOmL的0. 5XMurashige和 Skoog培養(yǎng)基(Duchefa，Haarlem，The Netherlands)以及0. 9%植物組織培養(yǎng)瓊脂。將所有健康植物置于乙醇中過(guò)夜以除去葉綠素，隨后澄清并貯存在乳酸中以進(jìn)行顯微鏡檢。如先前所述(De Veylder et al. ,2001)對(duì)從APC10°E和對(duì)照植物中從第4天至第25天每日收獲的葉片1和2的遠(yuǎn)軸表皮進(jìn)行完整動(dòng)態(tài)分析。表型分析對(duì)于生物量測(cè)量，收獲20天齡植物的營(yíng)養(yǎng)(vegetative)部分，通過(guò)對(duì)每個(gè)品系的大約20株植物進(jìn)行稱重測(cè)量鮮重，將同一植物置于皮氏平板上干燥1周并再次稱重而獲得干重。對(duì)于葉面積測(cè)量，從在體外生長(zhǎng)22天的植物中制備葉片系列。葉從蓮座切下，在左側(cè)從兩子葉開(kāi)始，接著從左至右為第一，第二，第三以及隨后的葉。對(duì)于根分析，在15天期間使植物在具有1. 2%瓊脂的MS培養(yǎng)基的平板上以垂直狀態(tài)生長(zhǎng)。15天后，掃描該平板，使用圖像J 1.37程序分析圖片。對(duì)于鮮重測(cè)量，從25株植物的苗切下全部根，單獨(dú)稱重；對(duì)于干重測(cè)量，將同一植物置于皮氏平板上干燥1周，再次稱重。通過(guò)將種子置于透明塑料紙上進(jìn)行種子大小測(cè)量，每個(gè)品系單獨(dú)掃描。使用圖像 J 1.37程序分析全部種子面積的圖像。動(dòng)態(tài)分析如先前所述(De Veylder et al.，2001)對(duì)從第4-25天每日收獲的葉片1和2的遠(yuǎn)軸表皮進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。甘露醇實(shí)驗(yàn)將Samba敲除和野生型的生態(tài)型哥倫比亞-O(Col-O)的幼苗在補(bǔ)加蔗糖的半強(qiáng)度Murashige和 Skoog培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)中以 16 小時(shí)白天(110 μ molm-2s-l)和8小時(shí)黑夜的方案在體外生長(zhǎng)。在高壓滅菌之前，在瓊脂培養(yǎng)基中加入25mM甘露醇(Sigma)。使處理的植物在25mM甘露醇平板上生長(zhǎng)，對(duì)照植物在無(wú)甘露醇的相同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。使植物生長(zhǎng)20天并照相，使用Image J 1.37程序分析圖像。實(shí)施例1 :APC10對(duì)于植物生長(zhǎng)的影響為了評(píng)定APClO在發(fā)育期間的功能，產(chǎn)生在花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S組成型啟動(dòng)子控制下表達(dá)更高水平的APClO mRNA的擬南芥植物。選擇11個(gè)獨(dú)立純合的單一基因座植物，其中APClO表達(dá)水平增加通過(guò)QPCR證實(shí)(圖1)。APClO過(guò)表達(dá)品系(APC10°e)與對(duì)照品系之間對(duì)比性表型分析示出具有較高水平 APClO的植物導(dǎo)致在發(fā)育期間和葉生長(zhǎng)增加(圖2)。為了解哪些葉受影響，我們確定了來(lái)自APC10°E和野生型對(duì)照植物的2個(gè)獨(dú)立品系的所有葉的面積。在土壤中生長(zhǎng)三周齡，與野生型對(duì)照植物相比轉(zhuǎn)基因植物中所有葉的面積均明顯增加(圖4)。為了研究觀測(cè)的表型的細(xì)胞基礎(chǔ)，我們對(duì)發(fā)育中的葉進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。圖3示出當(dāng)與野生型植物對(duì)比時(shí)，物中葉面積和細(xì)胞數(shù)從發(fā)育開(kāi)始時(shí)(第4天和第5天)即明顯增加。主要結(jié)論是當(dāng)與野生型對(duì)照植物相比時(shí)，物在早期葉發(fā)育期間細(xì)胞分裂速率較高。盡管葉細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)(organization)和細(xì)胞大小與對(duì)照植物相似，但是在 APCIOoe植物的成熟葉中細(xì)胞數(shù)明顯增加。為了證實(shí)與野生型植物相比轉(zhuǎn)基因植物的生物量是否存在顯著差異，在APC10°E 和野生型植物中測(cè)量苗的鮮重和干重。觀測(cè)到當(dāng)與野生型對(duì)照植物相比時(shí)轉(zhuǎn)基因植物中生物量增加(圖5A和B)，這些植物的鮮重和干重比野生型植物大約高15%。我們分析了 APC10°e植物的葉細(xì)胞在不同發(fā)育階段的DNA含量增殖(d8、dlO和 dl2)，擴(kuò)展(dl4、dl6和dl8)以及成熟組織(d20 ；d22 ；d24)。觀測(cè)到與野生型植物相比較高比例的細(xì)胞具有2C和4C DNA含量，及相反較低比例的細(xì)胞具有8C和16C DNA含量，示出在植物中核內(nèi)復(fù)制降低(圖6)。實(shí)施例2 =APClO相互作用蛋白的TAP分離及MS鑒別為了鑒別APClO在體內(nèi)的相互作用配偶體，對(duì)在35kaMV啟動(dòng)子控制下表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行串聯(lián)親和性(TAP)純化，APClO在其N末端融合針對(duì)酵母開(kāi)發(fā)的傳統(tǒng) TAP 標(biāo)簽(Rigaut et al.，1999)及 GS 標(biāo)簽(Burckstummer et al.，2006)。對(duì)具有Van Leene et al. O007)所述傳統(tǒng)標(biāo)簽的培養(yǎng)物進(jìn)行四次獨(dú)立的TAP純化，及對(duì)具有 Van Leene et al. (2008)所述GS標(biāo)簽的培養(yǎng)物進(jìn)行兩次純化。在新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng) 2天后，收獲蛋白質(zhì)提取物。將親和性純化的蛋白質(zhì)在4-12% NuPAGE凝膠上分離，用考馬斯亮藍(lán)染色。切取蛋白質(zhì)條帶，在凝膠中用胰蛋白酶消化并進(jìn)行MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜分析以進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒別。在減去通過(guò)對(duì)照純化(Van Leene et al. ,2007 & 2008)鑒別的背景蛋白質(zhì)之后，我們鑒別了 18種APClO相互作用蛋白(表2)。這些蛋白質(zhì)可以分為兩組14 種蛋白質(zhì)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，4種蛋白質(zhì)僅在6個(gè)TAP實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中鑒別，其可代表很微弱或者瞬時(shí)的相互作用。實(shí)施例3 通過(guò)新的APC相互作用(SAMBA)蛋白敲除刺激植物生長(zhǎng)在相互作用蛋白中，鑒別一種新的100個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(AT1G32310)。選擇這種蛋白質(zhì)進(jìn)行更詳細(xì)的分析，因?yàn)槠涫境鰳O其特異性結(jié)合APClO亞基。表達(dá)的蛋白質(zhì)是與來(lái)自O(shè)ryza sativa(GB :AAL67597. 1)的未知蛋白質(zhì)相似的一種未知蛋白質(zhì)。為了更好地理解這個(gè)基因的功能，從SALK收藏中選擇敲除植物并加以分析。在 Samki基因第一個(gè)外顯子上T-DNA插入的代表性圖解在圖7A中示出。通過(guò)Q-PCR分析在 samba突變植物中未檢測(cè)出SAMBA轉(zhuǎn)錄物(圖7B)，證實(shí)所述基因功能的喪失。與APCIOqe 植物表型相似，SAMBA敲除的突變體植物(純合SALK品系)當(dāng)和野生型對(duì)照(圖8)相比時(shí)，示出蓮座和葉生長(zhǎng)增加。對(duì)在體外生長(zhǎng)的samki突變體的全部葉面積的測(cè)量與野生型植物相比也示出葉面積顯著增加(圖9)。對(duì)苗的鮮重和干重(圖10)、葉面積(圖11)、根長(zhǎng)度和重量(圖12)以及種子大小(圖1 的測(cè)量均示出SAMBA敲除植物的顯著增加，證實(shí)SAMBA是新的控制植物生長(zhǎng)的基因。Samba敲除植物的表型通過(guò)測(cè)量在體外生長(zhǎng)的22天齡植物的全部葉面積進(jìn)行詳細(xì)分析。結(jié)果示出與野生型植物相比，葉面積明顯增加(圖9A)。使用在土壤中生長(zhǎng)的22 天齡植物進(jìn)行相同分析，可觀測(cè)到與在體外生長(zhǎng)的植物相同的表型，與野生型植物相比在 samki敲除植物中顯著增加的葉面積(圖9C)。為了證實(shí)與野生型植物相比samki敲除植物的生物量是否存在明顯差異，我們測(cè)量了 20天齡植物的營(yíng)養(yǎng)部分的鮮重和干重。鮮重(圖 10A)和干重(圖10B)的測(cè)量結(jié)果示出SAMBA敲除植物的生物量明顯增加，證實(shí)了控制植物生長(zhǎng)的新的候選基因的假說(shuō)。為了研究觀測(cè)的表型的細(xì)胞基礎(chǔ)，我們測(cè)量和分析了第12天和15天的第一對(duì)葉的面積和細(xì)胞數(shù)。圖IlA和B示出與野生型植物相比在Samba敲除植物中顯著增加的葉面積和細(xì)胞數(shù)，表示在samki敲除植物中細(xì)胞分裂較高。進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)以分析降低的Samki基因表達(dá)對(duì)于植物DNA含量的影響。 Samba敲除植物與野生型植物相比示出略微增加的8C DNA含量水平(圖11C)。也評(píng)估了 Samba敲除對(duì)于根和種子產(chǎn)量的影響。測(cè)量在萌發(fā)15天后初生根的長(zhǎng)度。數(shù)據(jù)示出Samki敲除植物的根的長(zhǎng)度與野生型植物相比顯著增加(圖12A)。samki敲除植物的較長(zhǎng)的根的代表性圖片在圖12B中示出。測(cè)量根的鮮重和干重(圖12C和D)，可以證實(shí)在Samba敲除植物中根生物量顯著增加。種子分析還示出增加的種子大小。測(cè)量野生型植物和Samba突變植物的全部種子面積。我們可以觀測(cè)到Samba突變植物的種子明顯大于野生型植物的種子(圖13)。實(shí)施例4 SAMBA敲除在應(yīng)激條件下的作用使野生型和Samba敲除植物在補(bǔ)加25mM甘露醇的瓊脂平板上生長(zhǎng)，評(píng)估Samba突變植物在脅迫條件下生長(zhǎng)的能力。如圖14所示，samki突變植物在脅迫條件下保持其增加的生物量的表型。表1 進(jìn)行RNAi的靶序列的非限制性實(shí)例Arabidopsis thalianaTAAACAAAGCGTATATGACCATCATTTTCGAGTAATAGGCTCHordeum vuIgareTAAGTTATGACTTATGAGCATTTTAGATGAATGCAACTCCAT
Oryzae sativaTAGAATTCTACCAGGCGTCTTTTGAGTAATCCTTACATGCGABrassica napusTATAAAGTTCGTGATGGACATTACTAGATATCACCAAACCTASaccharum officinarumTTCTACACCCTAGAAGTTCTTTACTAGGCTTCTTACAAGCACGlycine maxTATCAAGCTTTAAGTGTGCTCTTAACATGACACGAACTTCGCVinis viniferaTCTTGTGGAGAACTCCCCCAGTCTTGTGGAGAACTCCAGCAGSolanaceum lycopersicumTATCTATACTCGTTATCGCACTATCTATACTCGTAATCGCTCTATCTCATATGGAATTCGCGCTricitum aestivumTTAACAGGTGAGTCGAATCAGTTAACAGGTGAGTCGAATCATZea maysTCAACTCTGAGAGTTTCGCATTTACCATGACATTAACGTCGC表2.經(jīng)MS鑒別的APClO-共純化蛋白質(zhì)的列表。第3列提到在6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中多少相互作用物被鑒別
權(quán)利要求
1.APClO或者其變體和/或APClO相互作用蛋白在增加植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述相互作用蛋白選自AT2G39090、AT2G20000、AT5G05560、 AT3G48150、AT1G06590、AT1G78770、AT4G21530、AT2G04660、AT1G32310、AT2G42260、 AT4GA19210、AT3G57860、AT3G16320、AT4G25550、AT5G13840、AT3G48750、AT3G56150 以及 AT2G06210。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述相互作用蛋白包含SAMBA(SEQID NO⑵或者其變體。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述變體包含保守基序K(D/E) EA和/或PRS (R/H/C) I。
5.權(quán)利要求3或4的應(yīng)用，其中所述變體包含保守基序K(D/E) EAXXXLXXXXMXXLXXXVXX LXXXXWXFXXPRSXI。
6.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中APClO或者其變體是過(guò)表達(dá)的。
7.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中SAMBA(SEQ ID NO 2)或者其變體的表達(dá)被抑制。
8.針對(duì)編碼SAMBA(SEQ ID NO 2)或者其變體的核酸的RNAi在增加植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述植物是作物植物。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述作物是谷物。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述谷物選自稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱和燕麥。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述植物生長(zhǎng)的增加是葉生物量增加、根生物量增加以及種子生物量增加中的任一或多項(xiàng)增加。
13.轉(zhuǎn)基因植物，其包含針對(duì)編碼SAMBA(SEQ ID NO 2)或者其變體的核酸的RNAi。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是谷物。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述谷物選自稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱和燕麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)植物生長(zhǎng)的蛋白復(fù)合物。更特別地，本發(fā)明涉及來(lái)自分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體的特定蛋白質(zhì)在增加苗生長(zhǎng)速率和/或增強(qiáng)細(xì)胞分裂速率中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102439030SQ200980153936
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者A·埃默里, D·G·因澤, G·德耶格爾, G·比姆斯特, J·范萊內(nèi), N·B·埃洛伊, P·C·G·費(fèi)雷拉 申請(qǐng)人:弗拉芒區(qū)生物技術(shù)研究所, 根特大學(xué), 里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學(xué)