專利名稱：人胚胎干細胞向胰腺內分泌譜系的分化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了促進多能干細胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供一種提高表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中的MAFA的表達的方法。
背景技術：
用于I型糖尿病的細胞替代療法的進展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細胞或β細胞的來源上。一種方法是從多能干細胞，例如胚胎干細胞產生功能性β細胞。在脊椎動物的胚胎發(fā)育中，多能細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內胚層)的一組細胞。諸如例如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內胚層經由中間階段發(fā)育而來。該過程中的中間階段是形成定形內胚層。定形內胚層細胞可表達多種標記物，例如HNF-3 β、GATA4、MIXLl、CXCR4和S0X17。定形內胚層分化成胰腺內胚層導致形成胰腺。胰腺內胚層細胞表達胰-十二指腸同源盒基因PDX1。在不存在PDXl時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因而，PDXl表達標志著胰腺器官發(fā)生中的一個關鍵步驟。除了其他細胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內分泌組織。外分泌和內分泌組織來自胰腺內胚層的分化。據報道，從小鼠的胚胎細胞衍生了帶有胰島細胞特征的細胞。例如，Lumelsky等人 (Science 292 =1389,2001)報道了小鼠胚胎干細胞向類似胰島的胰島素分泌結構的分化。 Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)報道，衍生自小鼠胚胎干細胞的胰島素分泌細胞使鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中的血糖變正常。在一個例子中，Hori等人(PNAS 99 =16105,2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶 (LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細胞，產生了類似β細胞的細胞。在另一例子中，Blyszczuk等人(PNAS 100 =998,2003)報道，從組成型表達1^x4 的小鼠胚胎干細胞產生了胰島素生成細胞。Micallef等人報道說，視黃酸可調節(jié)胚胎干細胞定向形成Pdxl陽性胰腺內胚層。 在對應于胚胎的原腸胚形成末的期間，加入胚胎干細胞分化第4天的培養(yǎng)物中時視黃酸是誘導 Pdxl 最有效的(Diabetes54 :301,2005)。Miyazaki等人報道了過表達Pdxl的小鼠胚胎干細胞系。他們的結果顯示，外源Pdxl表達在所得的分化細胞中明顯增強了胰島素、生長抑素、葡萄糖激酶、神經元素3、 P48、Pax6 和 HNF6 基因的表達(Diabetes 53:1030,2004)。Skoudy等人報道說，激活素A(TGF-β超級族的成員)能上調小鼠胚胎干細胞中的胰腺外分泌基因(Ρ48和淀粉酶)和內分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達。 使用InM激活素A時觀察到最大的效果。他們還觀察到，胰島素和Pdxl mRNA的表達水平不受視黃酸的影響；然而，3nM FGF7處理導致Pdxl的轉錄水平升高(Biochem. J. 379 :749，2004)。Shiraki等人研究了能特征性增強胚胎干細胞分化成Pdxl陽性細胞的生長因子的效果。他們觀察到，TGF-β 2可再現(xiàn)地產生更高比例的Pdxl陽性細胞(Genes Cells. 2005 年 6 月；10 (6) =503-16)。Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同fet信號轉導抑制劑的情況下從小鼠胚胎干細胞誘導brachyUry+/HNF-3 β +內胚層細胞(US 2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 頁，2006 年)聲稱“Wnt 禾口 TGF-β /nodal/ 激活素信號轉導同時為前原條的產生所必需”。然而，胚胎干細胞發(fā)育的小鼠模型可能不會完全模擬高等哺乳動物(例如人)中的發(fā)育程序。Thomson等人從人胚泡分離了胚胎干細胞(Science 282 :114，1998)。同時， Gearhart和其同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細胞系(Shamblott等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡單通過與白血病抑制因子(LIF) — 起培養(yǎng)來防止分化的小鼠胚胎干細胞不一樣，人胚胎干細胞必須維持在非常特殊的條件下 (美國專利 No. 6，2OO,洲6、WO 99/20741, WO ΟΙ/δΙΘΙ6)。D’Amour等人描述了在高濃度激活素和低血清的存在下產生人胚胎干細胞衍生的定形內胚層的富集培養(yǎng)物(Nature Biotechnology2005) 0將這些細胞移植到小鼠的腎囊下，導致分化成具有某些內胚層器官的特性的更成熟細胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干細胞衍生的定形內胚層細胞可進一步分化成Pdxl陽性細胞(US2005/0266554A1)。D，Amour 等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401 (2006))聲稱“我們已開發(fā)出一種將人胚胎干(hEQ細胞轉化成能夠合成胰腺激素即胰島素、胰高血糖素、生長抑素、 胰多肽和生長素釋放素(ghrelin)的內分泌細胞的分化方法。該方法通過引導細胞經過通向能表達內分泌激素的細胞的類似定形內胚層、腸管內胚層、胰腺內胚層和內分泌前體的各階段，來模擬體內胰腺器官發(fā)生。，，在另一個例子中，F(xiàn)isk等人報道了用于從人胚胎干細胞產生胰島細胞的系統(tǒng) (US2006/0040387A1)。在這個情況中，分化途徑分成三個階段。首先用丁酸鈉和激活素 A的組合使人胚胎干細胞分化成內胚層。然后將細胞與TGF-β拮抗劑(例如成頭蛋白 (Noggin))結合EGF或β細胞素一起進行培養(yǎng)，以產生Pdxl陽性細胞。通過煙酰胺誘導終末分化。在一個例子中，Benvenistry等人聲稱“我們得出結論認為，Pdxl的過表達增強了胰腺富集基因(pancreatic enriched genes)的表達，胰島素表達的誘導可能需要另外的僅存在于體內的信號(Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 1923-1930)?！奔毎芷诘鞍缀挺录毎δ苡嘘P系。例如，Lilja等人報道Cdk5存在于胰島素分泌胰腺 β -細胞中(J. Biol. Chem.，276 卷，36 期，34199-34205，2001 年 9 月 7 日)。Lilja 等人稱“Cdk5存在于β-細胞中并充當胰島素胞外分泌的正調節(jié)因子。”在另一實例中，Marzo等人聲稱“Cdk4基因敲入小鼠具有顯著增加的β-細胞群并具有生理功能，從而表明Cdk4是1型糖尿病中胰腺β細胞群再生的潛在靶點”(Diabetalogia，47 卷第 4 期，686-694 頁，2004 年 4 月 1 日)。
在另一個實施例中，WDeda等人報道抑制細胞周期蛋白依賴性激酶5活性可保護胰腺β細胞不受糖毒性的影響(J. Biol. Chem.，281卷，39期，28858-28864頁，2006年9月
四日)。在另一個實例中，Wei等人報道了葡萄糖刺激的胰島素分泌的Cdk5依賴性調控 (Nature Medicine 11，第 1104-1108 頁，(2005 年 10 月 1 日))。在另一個實例中，Vanderford等人聲稱“MafA”是在胰腺的β細胞內表達的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，并因其涉及β細胞生物學的多個方面而需要其來維持正常葡萄糖內穩(wěn)態(tài)。已知MafA蛋白水平通過尚未完全表征的機制響應高葡萄糖而增加。我們調查了分立的細胞內信號轉導事件是否會控制mafA表達。我們發(fā)現(xiàn)通用激酶抑制劑星孢菌素在不會改變蛋白質穩(wěn)定性的情況下誘導mafA表達。MAP激酶JNK的抑制模擬了星孢菌素對mafA表達的影響。鈣調蛋白激酶和鈣信號轉導在高葡萄糖刺激mafA表達方面也是重要的。然而，星孢菌素、JNK和鈣調蛋白激酶對胰島素表達的誘導具有不同影響。這些數據反映MafA水平由多條激酶通路的協(xié)同作用緊密控制(Archives of Biochemistry and Biophysics(2008)，doi 10.1016/j.abb. 2008. 10. 001)。因此，仍非常需要研究出用于使多能干細胞分化為胰腺內分泌細胞、胰腺激素表達細胞或胰腺激素分泌細胞的方法。本發(fā)明提供增加表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達的方法。

發(fā)明內容
在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于增加表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達的方法，所述方法包括在含有足以引起MAFA表達增加的量的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞的步驟。


圖1中分圖a示出來自EMD Calbiochem激酶抑制劑庫的化合物對由實時PCR確定的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中胰島素與胰高血糖素表達之比的影響。數字字母混合標記對應于表1所示的化合物種類。分圖b示出來自EMD Calbiochem激酶抑制劑庫的化合物對由實時PCR確定的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA與 ARX4比的影響。數字字母混合標記對應于表1所示的化合物種類。圖2A)示出在第6階段處理的第4天，根據實例1所述的方法處理的細胞的4倍顯微圖。B)示出在處理的第4天，用0. 5μΜ的化合物PubChemID#5330812處理的細胞的4 倍顯微圖。C)示出在處理的第4天用1 μ M的化合物PubChemID#5330812處理的細胞的4 倍顯微圖。D)示出在第6階段處理的第6天，根據實例1所述的方法處理的細胞的20倍顯微圖。E)示出在處理的第6天，用0. 5μΜ的化合物PubChemID#5330812處理的細胞的20 倍顯微圖。F)示出在處理的第6天，用ΙμΜ的化合物PubChemID#5330812處理的細胞的 20顯微圖。圖3示出在0·5μΜ(暗色柱條)或Ι.ΟμΜ(淺色柱條)的化合物PubChem ID#5330812的五天處理之后表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中所標示的23種基因的表達。在第0天、第2天和第5天確定表達水平。
圖4示出⑶K抑制劑III處理對用實例4所述分化方案的第7階段處理的細胞中胰腺內分泌譜系特征性標記物的表達的影響。圖5示出⑶K抑制劑III處理對胰島樣細胞簇的雙硫腙染色的影響。圖6示出根據實例5所述的方法產生的產胰島素細胞中胰島素、突觸素和胰高血糖素的表達。通過FACS來確定所示蛋白質的表達。圖7示出根據實例5所述的方法產生的產胰島素細胞中胰島素、突觸素和胰高血糖素的表達。通過FACS來確定所標示的蛋白質的表達。圖8示出由本發(fā)明的方法產生的產胰島素細胞中MAFA的表達(分圖a)和胰島素的表達(分圖b)。在第1天、第2天、第3天和第4天獲取用于PCR分析的細胞樣本。在用 ⑶K抑制劑處理4天之后，從培養(yǎng)基去除⑶K抑制劑，并且細胞在DMEM-F12+1 % B27+20ng/ ml的激活素A中培養(yǎng)額外的4天。在四天結束時，收集三份用于PCR分析的樣本。圖9示出來自EMD Calbiochem激酶抑制劑庫I的化合物對由實時PCR確定的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達的影響。圖10示出染料木素對由實時PCR確定的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中胰島素、胰高血糖素、生長抑素和MAFA的mRNA表達的影響。
具體實施例方式將本發(fā)明的具體實施方式
部分分成以下幾個分部分，來描述或說明本發(fā)明的某些特征、實施例或應用，這是為了使公開內容清楚起見，并非限制本發(fā)明。^X干細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和末端分化細胞。干細胞的特征還在于它們能夠在體外分化成多種胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的多種細胞譜系的功能細胞， 以及在移植后產生多種胚層組織，并在注射進囊胚后形成基本上大部分(如果不是全部) 組織。干細胞根據其發(fā)育潛能分為(1)全能，指能夠產生所有的胚胎和胚胎外細胞類型；( 多能，指能夠產生所有的胚胎細胞類型；C3)專能，指能夠產生細胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內能產生所有的細胞(例如造血干細胞(HSC)可產生的后代細胞包括HSC(自我更新)、局限于血細胞的寡能祖細胞以及作為血液正常組分的所有細胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產生比多能干細胞更有限的細胞譜系亞群； 以及(5)單能，指能夠產生單一細胞譜系(如生精干細胞)。分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細胞獲得特化細胞(如神經細胞或肌肉細胞)的特征的過程。分化的或分化誘導的細胞是在細胞的譜系當中具有較為特化的 (“定向的”)地位的細胞。術語“定向的”當應用到分化的過程時，指在分化途徑中已經進行到這么一種程度的細胞在正常環(huán)境下，它會繼續(xù)分化成特定的細胞類型或細胞類型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細胞類型或回復到分化不足的細胞類型。去分化指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)不足的地位的過程。本文所用的“細胞的譜系”限定細胞的遺傳關系，即它來自哪些細胞和它能產生什么細胞。細胞的譜系將該細胞置于發(fā)育和分化的遺傳安排(hereditary scheme)當中。譜系特征性標志指與目的譜系的細胞的表型明確相關的特征，可用來評估未定向細胞向目的譜系的分化。“ β -細胞譜系”是指對于轉錄因子PDX-I和下列轉錄因子中的至少一種具有陽性基因表達的細胞NGN3、NKX2. 2、NKX6. U NEUROD, ISL1、HNF3 β、MAFA, ΡΑΧ4 或 ΡΑΧ6。表達 β細胞譜系特征性標記物的細胞包括β細胞。本文所用的“表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞”指表達至少一種如下標記物的細胞SOX17、GATA4、HNF3 β、GSC、CER1、No da 1、FGF8、Brachyury、Mix 樣同源盒蛋白、 FGF4 CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、C)(CR4、C-Kit、CD99 或 0TX2。表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內胚層細胞和定形內胚層細胞。本文所用的“表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞”是指表達至少一種下列標記物的細胞PDX1、HNF-I β ,PTFl α ,HNF-或ΗΒ9。表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞包括胰腺內胚層細胞、原腸管細胞和后前腸細胞。本文所用的“表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞”指表達至少一種下列標記物的細胞NGN3、NEUR0D、ISL1、PDX1、NKX6. 1、PAX4或PTFl α。表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞包括胰腺內分泌細胞、胰腺激素表達細胞和胰腺激素分泌細胞以及β -細胞譜系的細胞。本文所用的“定形內胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產生的細胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內胚層細胞表達下列標記物HNF3i3、GATA4、 S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C_Kit、CD99 或 MIXLl。本文所用的“胚胎外內胚層”指表達至少一種下列標記物的細胞群體S0X7、AFP 或 SPARC。本文所用的“標記物”是在所關注細胞中差異表達的核酸或多肽分子。在這個情形中，差異表達意思是陽性標記物的水平增加，而陰性標記物的水平降低。標記物核酸或多肽的可檢測水平，在目的細胞中充分地高于或低于在其他細胞中，使得可使用多種本領域公知的方法中的任何一種將目的細胞與其他細胞鑒別和區(qū)分開來。本文所用的“中內胚層細胞”指表達至少一種下列標記物的細胞⑶48、脫中胚蛋白(EOMES)、SOXl7、DKK4、HNF3 β、GSC、FGF17 或 GATA6。本文所用的“胰腺內分泌細胞”或“胰腺激素表達細胞”指能夠表達至少一種下列激素的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。本文所用的“胰腺內胚層細胞”指能夠表達至少一種下列標記物的細胞NGN3、 NEUROD、ISL1、PDX1、ΡΑΧ4 或 ΝΚΧ2 · 2。本文所用的“產胰腺激素細胞”指能夠分泌至少一種下列激素的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素或胰多肽。本文所用的“胰腺激素分泌細胞”指能夠分泌至少一種下列激素的細胞胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。本文所用的“后前腸細胞”指能夠分泌至少一種下列標記物的細胞PDX1、HNFl、 PTFl α、HNF6、ΗΒ9 或 PR0X1。本文所用的“前原條細胞”指表達至少一種下列標記物的細胞=Nodal或FGF8。本文所用的“原腸管細胞”指能夠分泌至少一種下列標記物的細胞HNFl或HNF4A。本文所用的“原條細胞”指表達至少一種下列標記物的細胞=Brachyury、Mix樣同源盒蛋白或FGF4。多能干細胞的分離、擴增和培養(yǎng)多能干細胞的表征多能干細胞可表達階段特征性胚胎抗原(SSEA) 3和4以及可用稱為Tra-1_60和 Tra-1-81的抗體檢測的標記物中的一種或多種(Thomson等人，Science 282 =1145,1998) 多能干細胞體外分化導致喪失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-l_81的表達(如果存在的話)， 并增加SSEA-I的表達。未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4% 多聚甲醛固定細胞，然后用Vector Red作為底物顯影來檢測，如生產商所描述的(Vector Laboratories,Burlingame Calif)。未分化的多能干細胞還通常表達0ct_4和TERT，這可通過RT-PCR檢測。增殖的多能干細胞的另一理想表型是分化成所有三個胚層即內胚層、中胚層和外胚層組織的細胞的潛能。多能干細胞的多能性可例如通過這樣來證實將細胞注射進重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后對它們進行組織學檢驗以確定是否存在來自三個胚層的細胞類型。作為另一種選擇，多能性可通過這樣來確定產生胚狀體并評價該胚狀體是否存在與三個胚層相關的標記物。增殖的多能干細胞系可以用標準G-顯帶技術進行核型分析并與所公開的相應靈長類物種的核型相比較。理想的是獲得具有“正常核型”的細胞，“正常核型”的細胞意指該細胞是整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有顯著改變。多能干細胞的來源可使用的多能干細胞的類型包括從妊娠后形成的組織衍生而來的確立了的多能細胞系，包括在妊娠期間任何時間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時間通常是但不必須是在大約10-12周妊娠前。非限制性例子是確立了的人胚胎干細胞系或人胚胎生殖細胞系，例如人胚胎干細胞系H1、H7和H9 (WiCell)。還考慮的是在這類細胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本發(fā)明的組合物，在這種情形中，源細胞將會是直接取自源組織的原代多能細胞。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)的多能干細胞群體的細胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens, GA)。在一個實施例中，人胚胎干細胞是如Thomson等人所述制備(美國專利 No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 133 ff. ，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)。多能干細胞的培養(yǎng)在一個實施例中，通常在飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)多能干細胞，飼養(yǎng)細胞可以多種方式支持多能干細胞?；蛘?，在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多能干細胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)基本上不含飼養(yǎng)細胞，但同樣支持多能干細胞的增殖而不會進行顯著的分化。使用通過此前培養(yǎng)另一細胞類型而調理過的培養(yǎng)基來支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學成分確定的培養(yǎng)基來支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。例如，Reubinoff 等人(Nature Biotechnology 18:399—404(2000))禾口 Thompson等人(Science，1998年11月6日第282卷，第5391期，第1145-1147頁)公開了用小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)細胞層來培養(yǎng)來自人胚泡的多能干細胞系。Richards 等人(Stem Cells 21 :546-556,2003)對一組 11 種不同的成人、胎兒和新生兒飼養(yǎng)細胞層支持人多能干細胞培養(yǎng)的能力進行了評價。Richards等人聲稱“在成人皮膚成纖維細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細胞系保持了人胚胎干細胞形態(tài)并保持了多能性”。US20020072117公開了可產生支持靈長類多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長的培養(yǎng)基的細胞系。所采用的細胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了所述細胞系作為原代飼養(yǎng)細胞層的用途。又如，Wang等人(Stem Cells 23 1221-1227，2005)公開了用于人多能干細胞在衍生自人胚胎干細胞的飼養(yǎng)細胞層上長期生長的方法。又如，Stojkovic等人(Stem Cells 200523 :306-314,2005)公開了一種衍生自人胚胎干細胞的自發(fā)分化的飼養(yǎng)細胞系統(tǒng)。在另一例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22 =433-440,2004)公開了從人胎盤獲得的飼養(yǎng)細胞的來源。Amit等人(Biol. R印rod 68 :2150_2156，2003)公開了衍生自人包皮的飼養(yǎng)細胞層。又如，Inzunza等人(Stem Cells 23 =544-549,2005)公開了來自人出生后包皮成纖維細胞的飼養(yǎng)細胞層。US6642048公開了可支持靈長類多能干(pPQ細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長的培養(yǎng)基以及可用于產生這種培養(yǎng)基的細胞系。US6642048聲稱“本發(fā)明包括從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述并闡明了用于衍生這種細胞系、處理培養(yǎng)基以及用該調理培養(yǎng)基培育干細胞的方法”。又如，W02005014799公開了一種用于哺乳動物細胞的維持、增殖和分化的調理培養(yǎng)基。W02005014799聲稱“通過鼠細胞(特別是分化并永生化的轉基因肝細胞，稱為 MMH(Met鼠肝細胞))的細胞分泌活性對根據本發(fā)明制備的培養(yǎng)基進行調理”。又如，Xu等人(Stem Cells 22 =972-980,2004)公開了一種從人胚胎干細胞衍生物獲得的調理培養(yǎng)基，所述干細胞衍生物已經過遺傳修飾而過表達人端粒酶逆轉錄酶。又如，US20070010011公開了一種用于維持多能干細胞的化學成分確定的培養(yǎng)基。一種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)采用補充有能促進胚胎干細胞增殖的生長因子的無血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioReprodDOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870，2005 年 10 月19日)公開了一種無飼養(yǎng)細胞的無血清培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細胞維持在補充有能引發(fā)胚胎干細胞自我更新的不同生長因子的未經調理的血清替代(SR)培養(yǎng)基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006)公開了使用補充有 bFGF 的培養(yǎng)基，在不存在成纖維細胞或調理培養(yǎng)基的情況下長期培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法。又如，US20050148070公開了一種在無血清且無成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質、至少一種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白替代品、至少一種胰島素或胰島素替代品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，該培養(yǎng)基基本上無哺乳動物胎兒血清且含有至少約lOOng/ml能激活成纖維細胞生長因子信號轉導受體的成纖維細胞生長因子，其中該生長因子的供給來源不是僅為成纖細胞飼養(yǎng)層，該培養(yǎng)基支持干細胞在無飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。又如，US20050233446公開了一種可用于培養(yǎng)干細胞的化學成分確定的培養(yǎng)基，所述干細胞包括未分化的靈長類原始干細胞。在溶液中，該培養(yǎng)基與被培養(yǎng)的干細胞基本上等滲。在給定的培養(yǎng)物中，特定的培養(yǎng)基包含基礎培養(yǎng)基和各為一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸，所述bFGF、胰島素和抗壞血酸為支持原始干細胞進行基本上非分化性生長所必需。又如，US6800480聲稱“在一個實施例中，提供了用于培養(yǎng)處于基本上未分化狀態(tài)的衍生自靈長類的原始干細胞的細胞培養(yǎng)基，其包括可有效支持衍生自靈長類的原始干細胞生長的低滲透壓、低內毒素的基礎培養(yǎng)基。該基礎培養(yǎng)基與可有效支持衍生自靈長類的原始干細胞生長的營養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細胞和衍生自飼養(yǎng)細胞的胞外基質組分的基質物質相混合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子”。又如，US20050244962聲稱“在一個方面，本發(fā)明提供了培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法。可在基本上無哺乳動物胎兒血清(優(yōu)選還基本上無任何動物血清)的培養(yǎng)物中且在存在成纖維細胞生長因子的情況下培養(yǎng)所述干細胞，該成纖維細胞生長因子的供給來源不是僅為成纖維細胞飼養(yǎng)層。在優(yōu)選的形式中，通過添加足量的成纖維細胞生長因子，使得之前為維持干細胞培養(yǎng)物所需的成纖維細胞飼養(yǎng)層變得非必需”。在又一個例子中，W020050653M公開了一種基本上無飼養(yǎng)細胞和無血清的成分確定的等滲培養(yǎng)基，包含a.基礎培養(yǎng)基；b.bFGF，其量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長；c.胰島素，其量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長；和d.抗壞血酸， 其量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長。又如，W02005086845公開了一種維持未分化的干細胞的方法，所述方法包括使干細胞暴露于轉化生長因子-β (TGF-β)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(FGF)蛋白家族的成員或煙酰胺(NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持細胞處于未分化狀態(tài)達足以實現(xiàn)所需結果的一段時間?？蓪⒍嗄芨杉毎臃N至合適的培養(yǎng)基質上。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)基質是胞外基質成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)基質是MATRIGEL (Becton Dickenson)。MATRIGEL 是得自Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細胞的可溶性制品，其在室溫下膠凝而形成重構的基底膜。其他的胞外基質組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴增的細胞類型， 這可包括單獨的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合。可在存在可促進細胞存活、增殖和保持理想特性的培養(yǎng)基存在的情況下，以合適的分布將多能干細胞接種于所述基質上。所有這些特性可得益于對接種分布的認真考慮并可容易地由本領域技術人員確定。合適的培養(yǎng)基可用如下組分制備，例如達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，Gibco#l 1965-092 ；Knockout 達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(K0 DMEM)，Gibco#10829-018 ； Ham' s F12/50% DMEM基礎培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027 ；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β -巰基乙醇，Sigma#M7522 ；人重組堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)，Gibco#13256-029。帕鮮成產·在一個實施例中，本發(fā)明提供一種從多能干細胞產生產胰腺激素細胞的方法，該方法包括如下步驟a.培養(yǎng)多能干細胞，b.使所述多能干細胞分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞，c.使所述表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞，以及d.使所述表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。適用于本發(fā)明的多能干細胞包括例如人胚胎干細胞系H9(NIH編碼WA09)、人胚胎干細胞系Hl (NIH編碼WA01)、人胚胎干細胞系H7(NIH編碼WA07)和人胚胎干細胞系 SA002 (Cellartisj^W )。同樣適用于本發(fā)明的是表達至少一種下列多能細胞特征性標記物的細胞ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、連接蛋白 43、連接蛋白 45、0CT4、S0X2、NANOG、hTERT、 UTF1、ZFP42、SSEA3、SSEA4、Tra 1 -60 或 Tra 1-81。定形內胚層譜系特征性標記物選自S0X17、GATA4、HNF3 3、GSC、CER1、N0DAL、FGF8、 Brachyury、Mix 樣同源盒蛋白、FGF4CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、 C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達至少一種定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞是原條前體細胞。在另一方面，表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞是中內胚層細胞。在另一方面，表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞是定形內胚層細胞。胰腺內胚層譜系特征性標記物選自PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、HB9和PR0X1。適用于本發(fā)明的是表達至少一種胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞是胰腺內胚層細胞。胰腺內分泌譜系特征性標記物選自NGN3、NEUR0D、ISLl、PDXl、NKX6. 1、PAX4、NGN3 和PTFl α。在一個實施例中，胰腺內分泌細胞能夠表達以下激素中的至少一種胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的是表達至少一種胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞是胰腺內分泌細胞。胰腺內分泌細胞可以是胰腺激素表達細胞?；蛘?，胰腺內分泌細胞可以是胰腺激素分泌細胞。在本發(fā)明的一個方面，胰腺內分泌細胞是表達β細胞譜系特征性標記物的細胞。表達β細胞譜系特征性標記物的細胞可表達Pdxl和至少一種下列轉錄因子NGN3、 ΝΚΧ2. 2、NKX6. 1、NEUR0D、ISL1、HNF3 β、MAFA、ΡΑΧ4 或 ΡΑΧ6。在本發(fā)明的一個方面，表達 β 細胞譜系特征性標記物的細胞是β細胞。^^M^mmmw^m^mmm^m^可通過本領域的任何方法或通過本發(fā)明提出的任何方法，使多能干細胞分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人在 Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據Shinozaki 等人，在 Development 131,1651-1662(2004)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據McLean等人，在Mem Cells 25,29-38(2007)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，在 Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過將多能干細胞在含有激活素A的培養(yǎng)基中在血清不存在下進行培養(yǎng)，然后將所述細胞與激活素A和血清一起培養(yǎng)，再然后將所述細胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在 Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開。例如，可通過將多能干細胞在含有激活素A的培養(yǎng)基中在血清不存在下進行培養(yǎng)，然后將所述細胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2005 中公開。例如，可通過將多能干細胞在含有激活素A和Wnt配體的培養(yǎng)基中在血清不存在下進行培養(yǎng)，然后去除Wnt配體并將所述細胞與激活素A和血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個實例在Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開。例如，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號No. 11/736，908中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號No. 11/779，311中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，根據美國專利申請系列號No. 60/990, 529中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，根據美國專利申請系列號No. 61/076, 889中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，根據美國專利申請系列號No. 61/076, 900中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，根據美國專利申請系列號No. 61/076, 908中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，根據美國專利申請系列號No. 61/076，915中公開的方法，通過處理多能干細胞來使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞。表達.定形^lKIii普系特te牛fei戰(zhàn)勿的細朐,的分化表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞的形成可通過在進行特定方案之前或之后檢測該標記物的存在來確定。多能干細胞通常不表達這類標記物。因而，當細胞開始表達它們時即檢測到多能干細胞的分化。可通過將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質標記物和核酸標記物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些包括定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Northern印跡、原位雜交(參見(M^n)Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人(編輯)，2001增刊))，以及免疫測定法，例如切開材料的免疫組織化學分析、Western印跡、 易在完整細胞中觸及的標記物的流式細胞分析(FACS)(參見(例如)HarloW和Lane， Using Antibodies:A Laboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))ο多能干細胞的特征是本領域技術人員熟知的，并且其他特征有待繼續(xù)辨別。多能干細胞標記物包括(例如)一種或多種如下物質的表達ABCG2、cripto、F0XD3、連結素43、 連結素 45、0CT4、S0X2、NANOG, hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA3、SSEA4、Tral-60 或 Tral-81。在用本發(fā)明方法處理多能干細胞后，可通過將處理過的細胞群體暴露于特異性識別由表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質標記物(例如CXCR4)的試劑 (例如抗體)來進行純化。表汰胰腺內胚層譜系特征件標記物的細胞的形成可通過本領域的任何方法或通過本發(fā)明提出的任何方法，使表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，在 Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞?？赏ㄟ^用成纖維細胞生長因子和hedgehog信號轉導途徑抑制劑KAAD-環(huán)巴胺處理表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞，然后去除含有纖維細胞生長因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，并隨后將所述細胞在含有視黃酸、成纖維細胞生長因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在Nature Biotechnology 24， 1392-1401(2006)中公開。在本發(fā)明的一個方面，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號 No. 11/736,908中公開的方法，通過用視黃酸和至少一種成纖維細胞生長因子處理表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞一段時間，來使表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號 No. 11/779,311中公開的方法，通過用視黃酸和至少一種成纖維細胞生長因子處理表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞一段時間，來使表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據序列號為No. 60/990, 529的美國專利申請中公開的方法，通過處理表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞。表汰胰腺內胚層譜系特征件標記物的細胞的檢測胰腺內胚層譜系特征性標記物是本領域技術人員所熟知的，并且其他胰腺內胚層譜系特征性標記物不斷被鑒別。這些標記物可用于確定根據本發(fā)明處理過的細胞是否已分化而獲得胰腺內胚層譜系特征性特性。胰腺內胚層譜系的特異性標記物包括一種或多種轉錄因子，例如HLXB9、PTFla、PDX1、HNF6 或 HNFl β 的表達?？赏ㄟ^將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質標記物和核酸標記物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些包括定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Northern印跡、原位雜交(參見(M^n)Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人(編輯)，2001增刊))，以及免疫測定法，例如切開材料的免疫組織化學分析、Western印跡、 易在完整細胞中觸及的標記物的流式細胞分析(FACS)(參見，例如，Harlow和Lane， Using Antibodies :A Laboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))ο徹4普胃紐龍適_胞』_成,可通過本領域的任何方法或通過本發(fā)明公開的任何方法，使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，在 Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過將表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后去除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個實例在 Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開。例如，可通過將表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后去除該含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。該方法的一個例子在 D' Amour 等人，Nature Biotechnology, 2006 中公開。例如，可通過將表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。該方法的一個例子在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2006 中公開。例如，可通過將表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。該方法的一個例子在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2006 中公開。
在本發(fā)明的一個方面，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號 11/736，908中公開的方法，通過用抑制Notch信號轉導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號 11/779,311中公開的方法，通過用抑制Notch信號轉導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據轉讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請系列號 60/953，178中公開的方法，通過用抑制Notch信號轉導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，通過根據序列號為60/990，5 的美國專利申請中公開的方法處理表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了用于增加與胰腺內分泌譜系相關的標記物的表達的方法，所述方法包括根據美國專利申請序列號61/110，278中公開的方法，用包含足量的TGF-β受體激動劑的培養(yǎng)基處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞，以引起與胰腺內分泌譜系相關的標記物的表達增加。表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞的檢測胰腺內分泌譜系特征性標記物是本領域技術人員所熟知的，并且其他胰腺內分泌譜系特征性標記物不斷被鑒別。這些標記物可用于確定根據本發(fā)明處理過的細胞是否已分化而獲得胰腺內分泌譜系特征性特性。胰腺內分泌譜系特異性標記物包括一種或多種轉錄因子例如NGN3、NEUROD或ISLl的表達。這些標記物可用于確認根據本發(fā)明處理的細胞已分化而獲得β -細胞譜系特征性的性質。除了別的以外，β細胞譜系特異性特征包括一種或多種轉錄因子的表達，這些因子例如為 PDX1、ΝΚΧ2. 2、ΝΚΧ6. 1、ISL1、ΡΑΧ6、ΡΑΧ4、NEUROD, HNFl β、HNF6、HNF3 β 或 MAFA。 這些轉錄因子在內分泌細胞鑒別領域中已得到公認。參見例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3 :524-632(2002)) 可通過將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。作為另一種選擇， 可通過將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達β細胞譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質標記物和核酸標記物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些包括定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Northern印跡、 原位雜交(參見(例如)Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel 等人(編輯)，2001增刊))，以及免疫測定法，例如切開材料的免疫組織化學分析、Western印跡、 易在完整細胞中觸及的標記物的流式細胞分析(FACS)(參見(例如)HarloW和Lane， Using Antibodies :A Laboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1998))ο在本發(fā)明的一個方面，通過在處理后測定給定細胞培養(yǎng)物中胰島素陽性細胞的百分比來確定分化的效率。在一個實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約100%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約90%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約80%的胰島素陽性細胞。 在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約70%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約60%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約50%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中， 本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約40%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約30%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約20%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約10%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產生約5%的胰島素陽性細胞。在本發(fā)明的一個方面，通過測定葡萄糖刺激的胰島素分泌來確定分化的效率，胰島素分泌可通過測量由細胞釋放的C-肽的量測定。在一個實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約IOOOng C-肽/pgDNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約900ngC-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約800ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約700ng C-肽/ Pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約600ng C-肽/pg DNA0 在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約500ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約400ng C-肽/pgDNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約500ngC-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約400ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約300ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約200ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約 IOOng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約90ng C-肽 /pgDNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約SOngC-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約70ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約60ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約50ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約40ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約30ng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約 20ng C-肽/pgDNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產生的細胞可產生約IOngC-肽/ pg DNA0增加表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于增加表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達的方法，所述方法包括在含有足以引起MAFA表達增加的量的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞的步驟。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶1?；蛘?，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶2?；蛘?，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4。或者，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶5?；蛘?，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶9?；蛘?，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可以其任意組合抑制周期素依賴性激酶的多種同種型。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可以是蛋白質?；蛘?，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑可以是肽。或者，細胞周期蛋白激酶抑制劑可以是小分子。在一個實施例中，小分子細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑選自7-正丁基-6-(4-羥苯基)[5H]吡咯并[2，3-b] 吡嗪、9-硝基-7，12- 二氫吲哚并[3，2-d] [1]苯并氮雜卓-6 (5!1)-酮、3-(6-氧代-9-硝基_5，6，7，12-四氫吲哚并[3，2-d][l]苯并氮雜卓_2_基)丙腈、QR)-2-((6-((3-氨基-5-氯苯基)氨基)-9-(1-甲基乙基)-9H-嘌呤-2-基)氨基)-3-甲基-1- 丁醇、團網菌黃素AMrcyriaflavin A)、[6-芐基氨-2-(3-羥基丙氨基)_9_異丙基嘌呤、丁內酯I、 (Z)-1-(3-乙基-5-甲氧基-2，3-二氫苯并噻唑-2-亞基)丙-2-酮、2-(3-羥基丙基氨基)-6-(鄰羥芐基氨)-9-異丙基嘌呤、1- (2,6- 二氯苯基)-1，5- 二氫-6- ((4- (2-羥基乙氧基)苯基)甲基)-3-(1-甲基乙基)-4H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮、Cdk/細胞周期蛋白抑制肽III、3_ (2-氯代-3-吲哚亞甲基)_1，3- 二氫吲哚-2-酮、(6-羥基-4-苯基苯并 [4,5]呋喃并[2,3-b])吡啶-3-羧酸乙酯、R0-3306、N-(順式-2-氨基環(huán)己基)-N-(3-氯苯基)-9-乙基-9H-嘌呤-2，6- 二胺、6-環(huán)己基甲氧基-2- (4，-氨磺酰苯胺基)嘌呤、5-氨基-3-( (氨基磺?；?苯基)氨基)-N-(2，6-二氟苯基)-1Η-1，2，4-三唑-1-硫代甲酰胺、3-氨基-IH-吡唑并[3,4-b]喹喔啉、Cdk2抑制劑I、Cdk2抑制劑11、2(雙-(羥乙基)氨基)-6- (4-甲氧基芐氨基)-9-異丙基嘌呤、4- (6-環(huán)己基甲氧基-9H-嘌呤-2-基氨基)-N，N- 二乙基苯甲酰胺、N4-(6-氨基嘧啶-4-基)_對氨基苯磺胺、(4-(2-氨基-4-甲基噻唑-5-基)嘧啶-2-基)-(3-硝基苯基)胺、2-溴代-12，13- 二氫-5H-吲哚并[2， 3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5，7(6H)_ 二酮、1，4-二甲氧基吖啶-9(10H)_ 硫酮、5-(N44-甲苯基)氨基)-2-甲基-4，7- 二氧代苯并噻唑、4- (3，5- 二氨基-IH吡唑-4-基偶氮)-酚、 2-(2-羥基乙氨基)-6-(3-氯苯胺基)-9-異丙基嘌呤、Fascaplysin、靛玉紅_3’_單肟、靛玉紅-3，-單肟、5-碘代_，靛玉紅-3，-單肟-5-磺酸、Isogranulatimide、2-(2-羥基乙氨基)-6-芐氨基-9-甲基嘌呤、6- (2-羥基芐氨基)-2- ((I -(羥甲基)丙基)氨基)-9-異丙基嘌呤、5-溴代-3-(2-(4-氟苯基)-2-氧代乙叉基)-1，3- 二氫吲哚-2-酮、N6，N6- 二甲基腺嘌呤、2-(lR_異丙基-2-羥基乙氨基)-6-(3-氯苯胺基)-9-異丙基-嘌呤、雷帕霉素、2-(R)-(l-乙基-2-羥基乙氨基)-6-芐氨基-9-異丙基嘌呤、偽枝藻素、3-[1-(3Η-咪唑-4-基)-甲-(Z)-亞基]-5-甲氧基-1，3-二氫吲哚-2-酮和4-(3'羥苯基)氨基_6， 7-二甲氧基喹唑啉。在一個實施例中，細胞周期蛋白依賴性激酶是(6-羥基-4-苯基苯并[4，5]呋喃并[2,3-b])吡啶-3-羧酸乙酯。在一個實施例中，將(6-羥基-4-苯基苯并[4,5]呋喃并 [2，3-b])吡啶-3-羧酸乙酯以約0. 1 μ M至約10 μ M的濃度添加至表達內分泌譜系特征性標記物的細胞，保持約一至七天。在一個實施例中，將表達內分泌譜系特征性標記物的細胞用(6-羥基-4-苯基苯并[4,5]呋喃并[2,3-b])吡啶-3-羧酸甲酯處理約一至約七天。
本發(fā)明進一步通過如下實例舉例說明，但不受限于如下實例。實例實例1細胞系Hl的人胚胎干細胞在不存在胎牛血清的情況下向胰腺內分泌細胞的分化將第52代人胚胎干細胞系Hl的細胞在涂覆有MATRIGEL 的培養(yǎng)皿(1 30稀釋物)上培養(yǎng)，并暴露于下面的分化方案，以便使細胞向表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞分化。a.暴露于補充有 2% BSA(目錄號 152401，MP Biomedical, Ohio)禾Π 100ng/ml 激活素 A (R&D Systems, MN)力Π 20ng/ml WNT-3a (目錄號 1324-WN-002，R&D Systems, MN)加 8ng/ml bFGF(目錄號100-18B，P印roTech，NJ)的RPMI培養(yǎng)基一天，然后用補充有2% BSA 和lOOng/ml激活素A加8ng/ml bFGF的RPMI培養(yǎng)基另外處理兩天(第1階段)，然后b.暴露于 DMEM/F12+2 % BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD (#239804, Calbiochem, CA)兩天(第2階段)，然后c.暴露于 DMEM/F12+1 % B27 (Invitrogen, CA)+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD+2 μ M 視黃酸(RA) (Sigma，M0)+100ng/ml 成頭蛋白(R&D Systems, MN)四天(第 3 階段)，然后d.暴露于01^] /^12+1%827(11^行1~08611，〇八)+100叫/1111成頭蛋白+14]\1 DAPT ( — 種Y-分泌酶抑制劑)(目錄號565784，Calbiochem, CA)+lyM ALK5抑制劑II (目錄號 616452，Calbiochem，Ca)+100ng/ml 導蛋白-4(R&D Systems, MN)三天(第 4 階段)，然后e.暴露于 DMEM/F12+1%B27 (Invitrogen，CA)+1 μ M ALK5 抑制劑 II (Calbiochem， Ca)七天(第5階段)。每天更換培養(yǎng)基。在每個階段，用血球計計算細胞數目并收集RNA用于PCR分析。 所有樣品均一式三份進行收集。實例2篩詵來自EMD激酶抑制劑庫II的化合物對已根據實例1所沭分化方案處理的細胞的影響將第44代的人胚胎干細胞系Hl細胞接種至涂覆有MATRIGEL 的M板孔培養(yǎng)皿中(1 30稀釋物)并根據實例1所述的方法(最多至第5階段)使其分化。在此之后， 將細胞在含有1 μ M最終濃度的來自EMD Calbiochem化合物庫的化合物(目錄號539745， Calbiochem, San Diego, Ca)的DMEM/F12+1 % B27中處理四天。將含有溶媒的板孔包括在內作為對照。在整個方案中每天更換培養(yǎng)基。將所有樣本一式兩份進行處理。在此處理完成時，收集用于PCR分析的RNA。通過實時PCR分析樣本的胰島素、胰高血糖素、MAFA和 Arx4的表達。將結果表示為由實時PCR測得的相對于未處理對照處理樣本的胰島素/胰高血糖素比(圖1，分圖a)或MAFA/ARX4比(圖1，分圖b)。各個板孔號的對應PubChem化合物識別號列于表1中。用1 μ M濃度的化合物Α6、Β7、Β8或C2處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞得到大約3. 0或更高的胰島素/胰高血糖素表達比(參見圖1，分圖a)。我們然后檢查這些化合物對MAFA/ARX4比的影響，我們發(fā)現(xiàn)用若干化合物處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞導致MAFA與ARX4之比的變化比庫中所測試的其他化合物大得多用化合物C2處理的細胞顯示出大約1000的MAFA/ARX4比。用化合物C2處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞得到大約100的MAFA/ARX4比(參見圖1，分圖 b)。實例3細胞周期蛋白依賴件激酶抑制劑處理對已根據實例1所沭分化方案處理的細胞中胰島素和MAFA表汰的影響增加實例2中胰島素與胰高血糖素表達或MAFA與ARX4表達比的若干化合物是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。一種這類化合物是PubChem化合物識別號為5330797的 (5-氨基-3-((氨基磺?；?苯基)氨基)-N-(2，6-二氟苯基)-1Η-1，2，4-三唑-1-硫代酰胺)(目錄號217714 ;Calbi0Chem，San Diego, Ca)。為了證實這些觀察結果，根據實例1所述的方法(最多至第5階段)，將第42代人胚胎干細胞系Hl的細胞在IOcm2涂覆有 MATRIGEL 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在第5階段之后，將細胞用包含1 μ M PubChem化合物識別號
為5330797的化合物的含Β27的DMEM/F12處理六天。每隔一天更換培養(yǎng)基。在用化合物處理之前以及在化合物處理的第二天和第五天，取細胞的樣本用于實時PCR。在化合物處理的第4天或第6天的細胞與未處理對照相比的特征性顯微圖示于圖2。未處理細胞是高度堆積的(圖3，分圖a和b)，并且難以辨別個體細胞。然而，在用 0. 5 μ M或1 μ M的PubChem化合物識別號5330797處理六天之后，與未處理對照(圖2，分圖d)相比，個體細胞核開始可見(圖2，分圖e和f)，表明在細胞群體中發(fā)生分化。這也伴隨一些細胞死亡，這可通過圖2的分圖b和c所示的細胞層中的間隙看到。用PubChem化合物識別號為5330797的化合物處理引起胰島素、胰高血糖素、 MAFA、MAFB和抑生長素的表達不同程度增加。圖3的分圖a_v示出了與第0天(處理前)培養(yǎng)物相比較的每種處理的基因表達的相對誘導。用1 μ M PubChem化合物識別號為5330797 的化合物處理的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞在48小時處理時引起胰高血糖素表達增加大約1. 5倍。這種表達在5天處理后下降至處理前水平之下。用0. 5μ M PubChem 化合物識別號為5330797的化合物處理沒有觀察到胰高血糖素表達增加(參見圖3，分圖 a) ο用1 μ M PubChem化合物識別號為5330797的化合物處理五天的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞導致胰島素表達增加大約1. 5倍(參見圖3，分圖b)。用1 μ M PubChem化合物識別號為5330797的化合物處理五天的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞導致MAFA表達增加大約200倍(參見圖3，分圖d)。用0. 5 μ MPubChem化合物識別號為5330797的化合物處理五天的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞導致MAFB表達增加大約1.5倍(參見圖3，分圖C)。觀察到抑生長素表達的劑量依賴性增加(圖3，分圖e)。在用PubChem化合物識別號5330797處理五天的表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中沒有觀察到淀粉酶表達的變化(參見圖3，分圖f)。然而，觀察到PAX4(圖3，分圖 h)、NKX6. 1 (圖 3，分圖 k)、PDXl (圖 3，分圖 1)、NEUROD (圖 3，分圖 ο)和 BRN4 (圖 3，分圖q)表達水平降低。實例4細胞周期蛋白依賴件激酶抑制劑處理增加了胰島樣細胞簇中MAFA的表汰。
將第52代的人胚胎干細胞系Hl細胞在涂覆有MATRIGEL 的培養(yǎng)皿上(1 30稀
釋物)培養(yǎng)并根據實例1所述的方法使其分化。增加額外的階段(第6階段)，以便使表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞進一步成熟。在此實例中第6階段由在DMEM/F12+1% B27(Invitrogen,CA)中的處理七天組成。每天更換培養(yǎng)基。在第6階段之后，將細胞用IX accutase (Sigma, M0)在室溫下處理5分鐘。去除 accutase，并將DMEM/12+1% B27加至細胞。將附著細胞用細胞刮刀移出并輕輕地再懸浮， 并通過40 μ m細胞過濾網。將留在過濾網上的細胞通過在基礎培養(yǎng)基中沖洗而移出，并在 Ultra-Low培養(yǎng)平板(目錄號3471，Corning, Ma)上的懸浮液中進行培養(yǎng)。將細胞進行如下處理將細胞在含有20ng/ml的激活素A(AA)、1 μ m的⑶K抑制劑III (目錄號217714， Calbiochem, Ca)的DMEM/F12+1% B27中培養(yǎng)10天(第7階段)。將用溶媒處理的細胞包括在內作為對照。在第7天至第10天收集用于PCR分析和雙硫腙染色的樣本。根據此實例所述的方法在懸浮液中培養(yǎng)的細胞呈現(xiàn)類似于胰腺胰島細胞簇的形態(tài)。用CDK抑制劑III 處理看起來不會影響胰島樣細胞簇的形態(tài)。圖4(分圖a-i)示出了⑶K抑制劑III處理對細胞簇的基因表達譜的影響。用⑶K 抑制劑III處理增加了與胰腺內分泌譜系相關的標記物的表達，尤其增加了胰島素原轉錄因子MAFA的表達。圖5(分圖a-分圖b)示出了 CDK抑制劑III對細胞簇的雙硫腙(DTZ)染色的影響。與未用⑶K抑制劑III處理的細胞簇相比，用⑶K抑制劑處理并用DTZ染色的細胞簇表現(xiàn)出更紅艷的染色圖案。實例5由本發(fā)明的方法產牛的產fl夷島素細胞,的FACS分析。
將第42代人胚胎干細胞系Hl的細胞在涂覆有MATRIGEL 的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，并用下面的方案使其分化為產胰島素細胞a.補充有 2% BSA(目錄號 152401，MP Biomedical, Ohio)和 100ng/ml 激活素 A (R&D Systems, MN)力卩 20ng/ml WNT-3a (目錄號 1324-WN-002，R&D Systems, MN)力卩 8ng/ml 的bFGF(目錄號100-18B，P印roTech，NJ)的RPMI培養(yǎng)基處理一天，然后用補充有2% BSA 和lOOng/ml激活素A加8ng/ml的bFGF的RPMI培養(yǎng)基另外處理兩天(第1階段)，然后b. DMEM/F12+2 % BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD(#239804， Calbiochem, CA)處理兩天(第2階段)，然后c. DMEM/F12 + 1 % Β27 (Invitrogen, CA)+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD+2 μ M視黃酸(RA) (Sigma,Μ0)+100ng/ml 的成頭蛋白(R&D Systems,MN)處理四天 (第3階段)，然后d. DMEM/F12+1 % B27 (Invitrogen, CA)+100ng/ml 成頭蛋白 +1 μ M DAPT ( 一種 Y-分泌酶抑制劑)(目錄號565784，Calbiochem, CA)+lyM ALK5抑制劑II (目錄號 616452, Calbiochem, Ca) +100ng/ml 的導蛋白-4 (R&D Systems,MN)處理三天(第 4 階段)， 然后e. DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+1 μ M ALK5 抑制劑 II (Calbiochem, Ca)處理七天(第5階段)，然后f. DMEM/F12+1 % B27處理七天(第6階段)，然后
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g.用Accutase處理5分鐘，然后刮擦以移出任何剩余的附著細胞。然后使細胞懸浮液穿過40 μ m細胞過濾網。將留在過濾網上的細胞通過在基礎培養(yǎng)基中沖洗而移出，并在有高糖 DMEM(目錄號 11995-073，Invitrogen, Ca)+1 % B27+20ng/ml 的激活素 A(AA)+1 μ m 的 CDK 抑制劑 III (目錄號 217714, Calbiochem, Ca)的 Ultra-Low 培養(yǎng)平板上的懸浮液中培養(yǎng)5天(第7階段)。將胰島樣細胞簇用iTrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, CA)分散為單細胞并在冷PBS中洗滌。為了固定，將細胞再懸浮于200-300 μ ICytofix/Cytoperm緩沖液 (BD 554722，BD，Ca)中并在4°C下溫育30分鐘。將細胞在Iml Perm/Wash緩沖溶液(BD 554723)中洗滌兩次并再懸浮于100 μ 1含有Perm/Wash緩沖液中的2%正常山羊血清的染色/封閉溶液中。為了進行流式細胞分析，將細胞用下面的一抗體染色抗胰島素(兔單抗， Cell Signaling No. C27C9 ； 1 100 稀釋)；抗胰高血糖素(小鼠單抗，Sigma No. G2654, 1 100)；抗突觸素(兔多克隆抗體，DakoCytomation No A0010,1 50)。將細胞在4°C 下溫育30分鐘，然后在Perm/Wash緩沖液洗滌兩次，在如下適當的二抗中溫育30分鐘山 Ψ^ ^ Alexa 647 (Invitrogen No. A21246) ^Lij^^i/Ml 647 (Invitrogen No. A21235)； 山羊抗兔R_PE(BioSource No. ALI4407)。所有的二抗均以1 200稀釋度使用。將細胞在 Perm/Wash緩沖液中至少洗滌一次并用BD FACSArray進行分析。獲取至少10，000個事件用于分析。對照包括未分化Hl細胞和i3-TC(CRL-11506 ATCC，VA)細胞系。圖6(分圖a-c)示出了在含有溶媒的培養(yǎng)基中按照第7階段處理的細胞中胰島素陽性、突觸素陽性和胰高血糖素陽性細胞的百分比。圖7(分圖a-c)示出了在含有ΙμΜ CDK抑制劑II的培養(yǎng)基中按照第7階段處理5天的胰島素陽性、突觸素陽性和胰高血糖素陽性細胞的百分比。單激素胰島素陽性細胞的數量在用CDK抑制劑處理之后從3%增加到 8%。另外，多激素(胰島素和胰高血糖素陽性)細胞的百分比在用CDK抑制劑處理之后下降。實例6CDK抑制劑誘導的MAFA表達的動態(tài)。將第42代人胚胎干細胞系Hl的細胞在涂覆有MATRIGEL 的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，并用下面的方案使其分化為產胰島素細胞a.補充有 2% BSA(目錄號 152401，MP Biomedical, Ohio)和 100ng/ml 激活素 A (R&D Systems, MN)力卩 20ng/ml WNT-3a (目錄號 1324-WN-002，R&D Systems, MN)加 8ng/ ml的bFGF(目錄號100-18B，P印roTech，NJ)的RPMI培養(yǎng)基一天，然后用補充有2% BSA和 100ng/ml激活素A加8ng/ml的bFGF的RPMI培養(yǎng)基另外處理兩天(第1階段)，然后b. DMEM/F12+2 % BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD(#239804， Calbiochem, CA)處理兩天(第二階段)，然后c. DMEM/F12 + 1 % Β27 (Invitrogen, CA)+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD+2 μ M視黃酸(RA) (Sigma,Μ0)+100ng/ml 的成頭蛋白(R&D Systems,MN)處理四天 (第3階段)，然后d. DMEM/F12+1 % B27 (Invitrogen, CA)+100ng/ml 成頭蛋白 +1 μ M DAPT (—種 Y-分泌酶抑制劑)(目錄號565784，Calbiochem, CA)+lyM ALK5抑制劑II (目錄號 616452, Calbiochem, Ca) +100ng/ml 的導蛋白-4 (R&D Systems,MN)處理三天(第 4 階段)，然后e. DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+1 μ M ALK5 抑制劑 II (Calbiochem, Ca)處理七天(第5階段)，然后f. DMEM/F12+1 % B27處理七天(第6階段)，然后g.用Accutase處理5分鐘，然后刮擦以移出任何剩余的附著細胞。然后使細胞懸浮液通過40 μ m細胞過濾網。將留在過濾網上的細胞通過在基礎培養(yǎng)基中沖洗而移出，并在有高糖 DMEM(目錄號 11995-073，Invitrogen, Ca)+1 % B27+20ng/ml 的激活素 A(AA) +2 μ m 的 CDK 抑制劑 III (目錄號 217714, Calbiochem, Ca)的 Ultra-Low 培養(yǎng)平板上的懸浮液中培養(yǎng)1-8天(第7階段)。在第1天、第2天、第3天和第4天收集用于PCR分析的樣本。在用⑶K抑制劑處理4天之后，從培養(yǎng)基去除⑶K抑制劑，并且細胞在DMEM-F12+1 % B27+20ng/ml的激活素A 中培養(yǎng)額外的4天。在四天結束時，收集三份用于PCR分析的樣本。圖8(分圖a-b)示出在第7階段的不同時間點MAFA和胰島素的表達模式。⑶K抑制劑處理引起隨時間推移增加的MAFA和胰島素表達的顯著增加。然而，去除CDK抑制劑導致在去除化合物之后四天獲得的樣本中，MAFA和胰島素兩者表達顯著下降。實例7篩詵來自BIOMOLm激酶抑制劑庫的化合物對已根據實例1所沭分化方案處理的細胞的影響。將第51代的人胚胎干細胞系Hl細胞接種至涂覆有MATRIGEL 的M板孔培養(yǎng)皿
中(1 30稀釋物)并根據實例1所述的方法(最多至第5階段)使其分化。在此之后， 使細胞在DMEM/F12+1%B27中生長一天，然后在含有終濃度為4 μ M的來自BI0M0L 化合物庫的化合物(目錄號 ^32，BI0M0L，Plymouth Meeting,Pa)的 DMEM/F12+1 % B27 中處理六天。將含有溶媒的板孔包括在內作為對照。在整個處理中，每隔一天更換含有溶媒或化合物的處理方案所用的培養(yǎng)基。將所有樣本一式兩份進行處理。在此處理完成時，收集用于 PCR分析的RNA。通過實時PCR分析樣本的胰島素、胰高血糖素、MAFA和ARX4的表達。將結果表示為由實時PCR測得的相對于未處理對照處理樣本的胰島素/胰高血糖素比(圖2) 或MAFA/Arx4比(表幻。各個字母數字板孔號的對應產品目錄號、CAS號和化合物名或識別號在表3中列出。用4 μ M濃度的化合物C8或Fl處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞得到大約10. 0或更高的胰島素/胰高血糖素表達比。用D9處理的細胞具有大約1840. 0的胰島素/胰高血糖素比(表2)。我們然后檢查這些化合物對MAFA/ARX4比的影響，并且我們發(fā)現(xiàn)用若干化合物處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞引起比庫中測試的其他化合物大得多的MAFA/ ARX4比的變化用化合物Β6或Fl處理的細胞顯示出大約大于10的MAFA/ARX4比。用化合物C8處理胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞得到大約84的MAFA/ARX4比，而用D9處理的細胞具有大約212的MAFA/ARX4比(表2)。實例8細胞周期蛋白依賴件激酶抑制劑對已根據實例1所沭分化方案處理的細胞中胰島素和MAFA表達的影響。
將第51代的人胚胎干細胞系Hl細胞接種至涂覆有MATRIGEL 的M板孔培養(yǎng)皿中(1 30稀釋物)并根據實例1所述的方法(最多至第5階段)使其分化。在此之后， 使細胞在DMEM/F12+1 % B27中生長八天，然后在含有0. 6125、1. 25或終濃度為5. 0 μ M的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的DMEM/F12+1% B27中處理四天。我們測試了 6種抑制劑 PubChem 識別號 5330812 (EMD 目錄號 217714)、PubChem 識別號 4566 (EMD 目錄號 217713)、 PubChem 識別號 5330797 (EMD 目錄號 219476)、PubChem 識別號 73四2 (EMD 目錄號 341251)、 PubChem 識別號 4592 (EMD 目錄號 495620)和 PubChem 識別號 160355 (EMD 目錄號 557360)。 將含有溶媒的板孔包括在內作為對照。在整個處理中，每隔一天更換含有溶媒或化合物的處理方案所用的培養(yǎng)基。將所有樣本一式兩份進行處理。在此處理完成時，收集用于PCR 分析的RNA。通過實時PCR分析樣本的胰島素、胰高血糖素、MAFA和ARX4的表達。將結果表示為由實時PCR測得的相對于溶媒處理對照的倍數變化。我們觀察到化合物PubChem識別號5330812、PubChem識別號4566、PubChem識別號5330797和PubChem識別號73292在所測試的濃度下均刺激MAFA表達(表4)。PubChem 識別號4592和PubChem識別號160355在所測試的濃度下不刺激MAFA(表4)?；衔?PubChem 識別號 5330812、PubChem 識別號 4566、PubChem 識別號 5330797、PubChem 識別號 4592和PubChem識別號160355看起來都刺激胰島素表達(表4)?；衔颬ubChem識別號 5330797減少了胰高血糖素和Arx4兩者的表達(表4)，但刺激MAFA表達。實例9俥用缺臺牛血清的含WmM葡萄糖的DMEM(DMEM-HG)細朐系Hl的人胚胎干細朐向胰腺內分泌細胞分化將人胚胎干細胞細胞系Hl的細胞在涂覆有MATRIGEL 的培養(yǎng)皿(1 30稀釋物)， 并使用下面的方案讓其分化為表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞a.補充有 2% BSA(目錄號 152401，MP Biomedical, Ohio)和 100ng/ml 激活素 A (R&D Systems, MN)力卩 20ng/ml WNT-3a (目錄號 1324-WN-002，R&D Systems, MN)加 8ng/ml 的bFGF(目錄號100-18B，P印roTech，NJ)的RPMI培養(yǎng)基處理一天，然后用補充有2% BSA 和lOOng/ml激活素A加8ng/ml的RPMI培養(yǎng)基另外處理兩天(第1階段)，然后b. RPMI 培養(yǎng)基用 2 % BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD (#239804， Calbiochem, CA)處理兩天(第二階段)，然后 c. DMEM-HG+1 % Β27 (Invitrogen, CA) +50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD+2 μ M 視黃酸(RA) (Sigma,Μ0)+100ng/ml的成頭蛋白(R&D Systems,MN)處理六天(第3階段)， 然后d. DMEM-HG+1 % B27 (Invitrogen, CA) +100ng/ml 成頭蛋白 +1 μ M ALK5 抑制劑 IK目錄號616452，Calbiochem，Ca)處理三天(第4階段)，然后e. DMEM-HG+1 % B27 (Invitrogen, CA) +1 μ M ALK5 抑制劑 II (Calbiochem, Ca)處理七天(第5階段)。每天更換培養(yǎng)基。在每個階段，用血球計計算細胞數目并收集RNA用于PCR分析。 所有樣品均一式三份進行收集。實例10篩詵來自EMD激酶抑制劑庫I的化合物對已根據實例9所沭分化方案處理的細胞的影響將第45代的人胚胎干細胞系Hl細胞接種于涂覆有MATRIGEL &M板孔的培養(yǎng)皿上(1 30稀釋物)，并根據實例9所述方法(最多至第5階段)使其分化。在此之后，飼養(yǎng)細胞，并在第5階段的第1天、第3天和第5天用培養(yǎng)基處理，該培養(yǎng)基包含DMEM-HG、1 % B27(Invitrogen,CA)UuM ALK5 抑制劑 II (Calbiochem，Ca)和溶于 DMSO (目錄號 539744， Calbiochem, San Diego, Ca)并以2. 5 μ M的最終濃度處理的來自EMD Calbiochem化合物庫I的化合物。將含有溶媒的板孔包括在內作為對照。在整個方案中，除了在第5階段每隔一天更換培養(yǎng)基，其它每天更換培養(yǎng)基。將所有樣本一式兩份進行處理。在此處理完成時，收集用于PCR分析的RNA。通過實時PCR分析樣本的MAFA的表達。將結果表示為由實時PCR測得的MAFA表達對未處理Hl人胚胎干細胞(表5)的倍數增加。用2. 5μΜ濃度的化合物A4(目錄號124001，Akt抑制劑IV)、E8 (目錄號527450， PKR抑制劑)和F9(目錄號539648，Staurosporine, N-苯甲酰-)處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞導致MAFA表達增加比溶媒處理對照高至少4倍(表5)。用2. 5 μ M 濃度的化合物Ε6(目錄號521233，PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑IV)處理導致MAFA表達增加比溶媒處理對照高至少2. 5倍(表5)。實例11篩詵來自EMD激酶抑制劑庫II的化合物對已根據實例9所沭分化方案處理的細胞的影響將第46代的人胚胎干細胞系Hl細胞接種于涂覆有MATRIGEL &M板孔的培養(yǎng)皿上(1 30稀釋物)，并根據實例9所述方法(最多至第5階段)使其分化。在此之后，飼養(yǎng)細胞，并在第5階段的第1天、第3天和第5天用培養(yǎng)基處理，該培養(yǎng)基包含DMEM-HG、1 % B27 (Invitrogen, CA) U μ M ALK5 抑制劑 II (Calbiochem, Ca)(第 5 階段)和溶于 DMSO (表 1 和表 6，Calbiochem，San Diego, Ca)并以 2. 5 μ M 的最終濃度處理的來自 EMD Calbiochem 化合物庫II的化合物。將含有溶媒的板孔包括在內作為對照。在整個方案中，除了在第5 階段每隔一天更換培養(yǎng)基，其它每天更換培養(yǎng)基。將所有樣本一式兩份進行處理。在此處理完成時，收集用于PCR分析的RNA。通過實時PCR分析樣本的MAFA的表達。刺激MAFA表達的化合物的結果示出并表達為由實時PCR測得的MAFA表達對對照樣本的倍數增加(圖9)。用2. 5 μ M 濃度的 2-氰乙基 Alsterpaullone、SU9516、Alsterpaullone、Cdkl/2 抑制劑III、酪蛋白激酶I抑制劑、D4476或MEK1/2抑制劑中的任一者處理表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞導致MAFA表達相對于未處理對照4. 5倍增加(表7)。實例12用小分子抑制劑抑制表汰胰腺內分泌譜系特征件標記物的細胞中的細胞周期講稈可促講表汰胰腺內分泌譜系特征件標記物的細胞中的MAFA表汰可通過用胞外生長因子刺激細胞來激活和維持由細胞周期進程引起的細胞生長。 生長因子結合至生長因子受體的胞外結構域，從而誘導受體胞內結構域的構象轉換。這種轉變引發(fā)了位于受體胞內結構域上的酪氨酸激酶的受體二聚化和活化，從而導致下游的多個絲氨酸/蘇氨酸激酶的磷酸化和活化，最終引起細胞周期進程和細胞增殖。
在正常生理狀況下，表征為胰島素和轉錄因子MAFA表達的成熟胰腺β細胞處于靜息狀態(tài)，并往往保持在細胞周期的GO中。然而，為了產生足夠的細胞來形成機能器官并滿足成熟動物的需要，表達本發(fā)明的胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞必須具有細胞周期。因此，在胚胎發(fā)育的某一點，表達本發(fā)明的胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞向β 細胞分化，并從活動細胞周期增殖細胞轉變?yōu)殪o息細胞。我們的數據表明，通過用小分子激酶抑制劑阻斷信號轉導級聯(lián)反應來抑制細胞周期進程，我們可誘導表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞來表達MAFA(—種成熟胰腺 β細胞的標記物)。靶向生長因子受體的激酶抑制劑(PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑IV) 或干擾酪氨酸激酶受體下游激酶的抑制劑(ΜΕΚ1Λ抑制劑、PKR抑制劑或Akt抑制劑IV) 會干擾基于增殖生長因子/激酶的信號轉導，從而引起細胞周期停止和MAFA表達的誘導。 使用像星孢菌素的廣譜抑制劑可有效地誘導MAFA，然而其在有效濃度下也具有細胞毒性。 像細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的更具針對性的化合物(2-氰乙基Alsterpaullone、 SU9516、Alsterpaullone或Cdkl/2抑制劑III)可誘導MAFA，具有比像星孢菌素的廣譜抑制劑更小的毒性。為了確定廣譜激酶抑制劑是否可以在表達本發(fā)明的胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中誘導MAFA表達和更成熟的顯型，我們根據實例9所述的方法來分化Hl人ES細胞，并在第5階段的第1天、第3天和第5天用已顯示可在人和鼠類細胞系中誘導G2階段停止并抑制多種激酶的蛋白質-酪氨酸激酶抑制劑染料木素(Genistein)來處理它們。在10 和30ng/ml的劑量下，與未處理對照相比，內分泌激素胰島素、生長抑素和轉錄因子MAFA均表現(xiàn)出表達增加，但在lOng/ml下，內分泌激素胰高血糖素具有增加表達(圖10)。我們在 100ng/ml劑量的高金雀花堿下觀察到與胰島素、胰高血糖素和生長抑素表達降低相關聯(lián)的顯著毒性。這些數據表明，通過用小分子激酶抑制劑阻斷信號轉導級聯(lián)反應來抑制細胞周期進程(所述小分子激酶抑制劑靶向抑制信號從生長因子受體酪氨酸激酶通過胞內信號轉導激酶傳導至核和細胞周期蛋白依賴性激酶)，我們可以誘導表達本發(fā)明的胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞來表達MAFA (—種成熟胰腺β細胞的標記物)。將本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。盡管已通過參考實例和優(yōu)選的實施例對本發(fā)明的多個方面進行了闡述，但應當理解，本發(fā)明的范圍不由前面的描述限定，而是由根據專利法的原理正確解釋的權利要求書所限定。
權利要求
1. 一種用于增加表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達的方法，所述方法包括以下步驟在含有足以引起MAFA表達增加的量的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于增加表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞中MAFA的表達的方法，所述方法包括在含有足以引起MAFA表達增加的量的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達胰腺內分泌譜系特征性標記物的細胞的步驟。
文檔編號C12N5/071GK102272291SQ200980153865
公開日2011年12月7日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權日2008年10月31日
發(fā)明者A·雷扎尼亞, B·弗賴爾 申請人:森托科爾奧索生物科技公司