專利名稱：誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及誘導人胚胎干細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及一種誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
干細胞(stem cell)是具有自我更新能力并具有多向分化潛能的一類細胞。這類細胞可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小或者擴增，也可以進一步分化為更加成熟的細胞類型。根據(jù)干細胞的分化潛能，可以將其分為全能干細胞(如胚胎干細胞，它可以分化形成所有的成體組織細胞，甚至發(fā)育成為完整的個體)、多能干細胞(具有多向分化潛能，可以分化形成除自身組織細胞外的其它類型的組織細胞，如造血干細胞、神經(jīng)干細胞、間充質(zhì)干細胞、皮膚干細胞等)和專能干細胞(維持某一特定組織細胞的自我更新，如腸上皮干細胞)。胚胎干細胞的分化和增殖能力是動物發(fā)育的基礎，即由單個受精卵發(fā)育成為具有各種組織器官的個體；成體干細胞的進一步分化則是成年動物體內(nèi)組織和器官修復再生的基礎，即維持組織和器官的大小，并在受損時分化為成體細胞，以修復組織和器官。
胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell，ES)是由受精卵發(fā)育成囊胚的內(nèi)細胞團中分離得到的，具有分化上的全能性(totipotency)，可以演變成各種構(gòu)成人體任何器官或組織的組成細胞，并最終發(fā)育成完整的個體。第一株哺乳動物的胚胎干細胞系是從小鼠中分離出來的(Evans MJ，Kaufman MH.Nature，292(5819)154-156.1981；Martin GR.Proc Natl Acad Sci USA，78(12)7634-7638.1981)。經(jīng)證明，這些細胞能夠整合入胚泡，參與正常的胚胎發(fā)育和組織器官的形成(Robertson E.Nature323，445-448.1986；Stewart CL.Dev Biol 161，626-628.1994)，而且在特定的條件下還能形成正常的鼠胎(Nagy A.Proc Natl Acad Sci USA 90，8421-8428.1993；Eggan K.Nat Biotechnol 20，455-459.2002)。1998年，Thomson教授成功建立了人的胚胎干細胞系(Thomson JA.Science，282(5391)1145-1147)。到目前為止，由不同國家和地區(qū)建立的人胚胎干細胞株已達40多株，其中20多株已經(jīng)商品化。
由于胚胎干細胞可以在體外無限擴增，并維持向多個方向分化的潛能，這樣，通過胚胎干細胞的定向分化，就可以獲得足夠數(shù)量的細胞，用于細胞移植治療和基因治療?，F(xiàn)在備受矚目的“治療性克隆”策略，就是將病人的體細胞核，移植到去核的成熟受體卵母細胞中，在早期胚胎形成后，從中分離獲得人ES細胞，從而建立與患者具有相同遺傳背景的胚胎干細胞系，誘導使其分化出病人所需的細胞類型，最后再植回患者體內(nèi)進行治療。這種方法可以避免由外源移植導致的免疫排斥，它的實現(xiàn)將為許多目前難以治愈的疾病，如糖尿病、白血病以及心血管疾病等提供一條新的治療途徑。另外，人胚胎干細胞的研究將有助于揭示人胚胎的發(fā)育過程，并為藥物篩選、藥理分析及毒性評估等提供動物模型無法比擬的實驗平臺。
盡管人胚胎干細胞具有廣闊的應用前景，但要實現(xiàn)這些應用，尤其是臨床上的應用，仍需要解決一系列重要問題，例如安全性與有效性。安全性指的是移植到病人體內(nèi)的胚胎干細胞的分化產(chǎn)物必須滿足以下條件(1)不含有任何動物來源的、可能污染了動物病原體的成分；(2)不會在病人體內(nèi)形成腫瘤，即要解決致瘤性的問題，對動物模型的研究結(jié)果表明，目前在移植動物體內(nèi)致瘤的細胞主要是一些具有干性的細胞，且干性越強越容易致瘤(Hochedlinger K.Hematol J，Suppl3s114-117)；(3)不會在病人體內(nèi)引發(fā)免疫排斥反應，對于這一點，治療性克隆是一個很好的解決辦法。有效性是指由人胚胎干細胞分化出來的細胞必須有著和正常人體細胞一樣的性狀和生理功能，例如體外誘導出來的心肌細胞要能夠有節(jié)律地進行收縮。只有達到了這些標準，移植到病人體內(nèi)的細胞才能真正發(fā)揮治療的功效。而這些問題的解決都將有賴于在人胚胎干細胞培養(yǎng)體系的進一步完善、自我更新及定向分化的分子機制研究。
目前，人類胚胎干細胞的建系及培養(yǎng)均取得了重大的進展，已經(jīng)可以在化學成分確定的培養(yǎng)基中進行，從而可以滿足臨床應用的需要。1998年，Thomson建立人胚胎干細胞系時所用的培養(yǎng)基成分為80％Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，20％胎牛血清，1mM谷氨酰胺，0.1mM β-巰基乙醇，1％非必需氨基酸，并以MEF作為飼養(yǎng)層(Thomson JA.Science，282(5391)1145-1147)。然而血清是一種復雜的蛋白質(zhì)混合物，并且不同批次血清的質(zhì)量難以控制，以后的實驗發(fā)現(xiàn)在最初建系所用的含有胎牛血清的培養(yǎng)基中，人胚胎干細胞形成克隆的能力非常低，將培養(yǎng)基中的胎牛血清換成血清替代物(Knockout Serum Replacement，KSR)，胚胎干細胞的克隆形成率能提高好幾倍；再加入4ng/mL的重組人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，則能夠進一步提高胚胎干細胞的克隆形成效率。這種在培養(yǎng)基中使用血清替代物替代胎牛血清，同時添加bFGF，并使用小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)細胞作為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)條件，成為了目前常規(guī)的人胚胎干細胞的培養(yǎng)方法。
如何有效地將胚胎干細胞分化為特定組織的細胞，是實現(xiàn)治療性克隆的重要環(huán)節(jié)。小鼠胚胎干細胞的分化已經(jīng)積累了大量的經(jīng)驗，目前的研究主要集中于向外胚層(神經(jīng))和中胚層(造血細胞)分化上。向內(nèi)胚層的分化一直以來進展緩慢，其中一個主要的原因是在內(nèi)胚層組織里表達的基因大多在胚外內(nèi)胚層中也有表達，從而難以衡量分化過程是否有效。因此，在對分化細胞進行驗證時，除需檢測基因的表達情況，還需要對分化細胞的功能進行論證，包括體內(nèi)和體外兩個方面。盡管如此，小鼠胚胎干細胞向肝臟細胞的分化，仍然取得了一些進展。獲得了表達肝細胞特定蛋白的細胞，并且具有合成糖原、合成尿素等功能。此外，當分化細胞移植到體內(nèi)后，可以整合到受體鼠的肝臟中，并可在一定程度上恢復受損肝臟的功能(Takumi Teratani.Hepatology41836-846.2005)。
在小鼠胚胎干細胞中成功運用的方案運用到人類胚胎干細胞分化時，并不一定會有效。原因在于小鼠胚胎干細胞和人類胚胎干細胞的培養(yǎng)條件大相徑庭，在分化上存在多少差異仍是一個未知數(shù)。更為重要的是，小鼠胚胎干細胞的分化方案，并沒有遵循正常的小鼠胚胎發(fā)育的模式。開啟一個基因的表達只需要相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活化，執(zhí)行有關(guān)的功能也只是相關(guān)酶的表達。因此，這樣得到的分化細胞，盡管表達了肝細胞的標記蛋白并具備了某些功能，但究竟在多大程度上和正常肝細胞相似仍然存在疑問。如果分化過程遵循體內(nèi)的發(fā)育模式，分化過程中的細胞將會和體內(nèi)發(fā)育過程中出現(xiàn)的細胞類似，并對所加的誘導條件作出類似的應答，那么，在這種條件下，肝細胞標記蛋白的出現(xiàn)，則可以作為一個比較有效的證據(jù)，證明這群細胞是肝細胞(或肝樣細胞)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的用于誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的培養(yǎng)基，由以下2種培養(yǎng)基組成其中，分化養(yǎng)基I是在RPMI 1640培養(yǎng)基的基礎上添加了80-120ng/L活化素A，pH 7.2-7.6，分化培養(yǎng)基II是在HCM培養(yǎng)基的基礎上添加了20-60ng/mL成纖維細胞生長因子(FGF)和15-25ng/mL骨形態(tài)形成蛋白(BMP)，pH 7.2-7.6。
所述分化培養(yǎng)基II中的成纖維細胞生長因子優(yōu)選為aFGF、bFGF或FGF4，骨形態(tài)形成蛋白優(yōu)選為BMP2或BMP4。
優(yōu)選的分化培養(yǎng)基配方為分化培養(yǎng)基I是在RPMI 1640培養(yǎng)基的基礎上添加了100ng/L活化素A，pH 7.2-7.6；分化培養(yǎng)基II是在HCM培養(yǎng)基的基礎上添加了50ng/mLaFGF或20ng/mL bFGF或25ng/mL FGF4，以及20ng/mL BMP2或BMP4，pH 7.2-7.6。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法。
本發(fā)明所提供的誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法，包括以下步驟1)向定形內(nèi)胚層細胞(definitive endoderm)的誘導取培養(yǎng)在MEF飼養(yǎng)層上的人胚胎干細胞，棄去培養(yǎng)基，加入分化培養(yǎng)基I，在37℃下培養(yǎng)24-48小時，然后棄去培養(yǎng)基，更換為添加0.15-0.25％(體積百分濃度，V/V)胎牛血清(FBS)的分化培養(yǎng)基I，在相同條件下培養(yǎng)24-48小時，再棄去培養(yǎng)基，更換為添加1.5-2.5％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；2)棄去培養(yǎng)基，加入分化培養(yǎng)基II，在37℃下培養(yǎng)3-6天，每天更換一次培養(yǎng)基。
在上述誘導方法中，步驟1)中將人胚胎干細胞置于分化培養(yǎng)基I中的培養(yǎng)時間優(yōu)選為24小時，然后棄去培養(yǎng)基，更換為添加0.2％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，培養(yǎng)24小時，再棄去培養(yǎng)基，更換為添加2％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；步驟2)中的培養(yǎng)時間優(yōu)選為5天。
為獲得更好的分化效果，步驟1)-2)中每次更換培養(yǎng)基前將細胞用PBS洗1-3遍。
本發(fā)明提供了一種誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。除了分化培養(yǎng)基I含少量血清外，其余培養(yǎng)基成分確定，使用安全性高。分化培養(yǎng)基I中添加的Activin A可誘導人胚胎干細胞向定形內(nèi)胚層細胞高效分化，再在分化培養(yǎng)基II中FGF和BMP的共同作用下可進一步分化為表達白蛋白的早期肝細胞。所獲得的分化細胞具有典型的肝臟細胞的形態(tài)，并表達有早期肝細胞的標記蛋白CK8、Alb、CK18和AFP。整個分化過程非常高效，約占70％的細胞均表達這些早期標記蛋白。整個分化過程與肝臟的早期發(fā)育十分相似，因而是一種比較合理的分化方案。用本發(fā)明的方法及其專用培養(yǎng)基誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化具有周期短、分化率高、安全穩(wěn)定的優(yōu)點，分化獲得的肝細胞可用于細胞移植治療肝病、人工肝臟和藥物的毒性測試等，此外整個分化過程也可用于人類早期胚胎發(fā)育的研究中，應用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為由定形內(nèi)胚層向肝細胞分化過程中細胞形態(tài)的變化圖2為對分化細胞進行肝細胞標記分子AFP，Alb，CK8和CK18檢測的結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化一、人胚胎干細胞的常規(guī)培養(yǎng)試劑PBS稱取8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，加ddH2O定容至1000mL，用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.4。
200mM谷氨酰胺儲存液(200×)稱取0.292g谷氨酰胺，溶解于10mL PBS中，過濾除菌，分裝凍存于-70℃冰箱。
2M β-巰基乙醇(20000×)取1mL 14.3M的β-巰基乙醇，加6.15mL PBS稀釋，過濾除菌。
人胚胎干細胞培養(yǎng)基(HESM)20％血清替代物(Knock-out SerumReplacement，KSR)，1mM谷氨酰胺，0.1mM β-巰基乙醇，1％非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids)(美國Gibco公司)，4ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，用ddH2O定容至1000mL。
0.5mg/mL Dispase稱取Dispase 10mg粉末，溶解于20mL DMEM/F12(美國Invitrogen公司)中，過濾除菌。
1mg/mL膠原酶IV稱取膠原酶IV粉末20mg，溶解于20mL DMEM/F12(美國Invitrogen公司)中，過濾除菌。
MEF培養(yǎng)基含10％胎牛血清的DMEM(美國Gibco公司)。
絲裂霉素C工作液將2mg絲裂霉素C溶于200mL含10％胎牛血清的DMEM中，使其終濃度為10ug/mL，過濾除菌。
0.1％明膠稱取0.1g明膠粉末，溶解于100mL雙蒸水中，高壓滅菌。
1、飼養(yǎng)層(feeder)的獲得用下述方法對小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)進行處理，以作為培養(yǎng)人胚胎干細胞的飼養(yǎng)層1)取生長狀態(tài)良好的貼壁MEF細胞，棄去MEF培養(yǎng)基，加入含10ug/mL絲裂霉素C的絲裂霉素C工作液；2)在37℃下培養(yǎng)3個小時，培養(yǎng)期間用0.1％明膠處理將要接種MEF細胞的培養(yǎng)皿，室溫放置2小時以上(或37℃放置30分鐘以上)，用前吸掉明膠溶液即可；3)取出MEF細胞，棄去含絲裂霉素C工作液，用PBS洗5遍，以便徹底洗掉殘存的絲裂霉素(因為絲裂霉素是有絲分裂抑制劑，可能對胚胎干細胞有毒性)；4)加入胰酶-EDTA(美國Gibco公司)進行消化，然后用MEF培養(yǎng)基終止反應；5)1000rpm離心5分鐘，棄上清，用MEF培養(yǎng)基重懸細胞沉淀并計數(shù)；6)按照1.6×105個細胞/3.5cm培養(yǎng)皿的密度將經(jīng)上述步驟處理的MEF細胞接種至包被有0.1％明膠的培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時，得到用于培養(yǎng)人胚胎干細胞的飼養(yǎng)層。
2、人胚胎干細胞的常規(guī)培養(yǎng)在步驟1獲得的MEF飼養(yǎng)層上用人胚胎干細胞培養(yǎng)基(HESM)對人胚胎干細胞H1細胞系進行培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法包括以下步驟1)從4℃冰箱中取出培養(yǎng)所需試劑及培養(yǎng)基，室溫預熱15分鐘左右；2)取出人胚胎干細胞，吸去HESM，將細胞用PBS洗一遍；3)加入0.5mg/mL Dispase(或1mg/mL膠原酶IV)進行消化(1mL/3.5cm培養(yǎng)皿)，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育10-15分鐘，然后取出細胞在相差顯微鏡下觀察，若克隆邊緣出現(xiàn)卷邊，則可終止消化；否則放回培養(yǎng)箱，延長消化時間，但要隨時取出觀察，以防止因消化過度導致克隆脫落；4)消化結(jié)束后，吸掉Dispase或膠原酶IV，用PBS和DMEM/F12分別洗一遍后，加入適量DMEM/F12(2mL/3.5cm培養(yǎng)皿)；5)用無菌直頭或彎頭玻璃滴管輕柔地將所有人胚胎干細胞克隆從培養(yǎng)皿底部刮下，并轉(zhuǎn)移至無菌的15mL錐形底離心管中，用滴管溫和地吹吸若干次，使人胚胎干細胞克隆變成大小較為均一小的細胞團；6)1000rpm離心3-4分鐘，小心吸掉上清，用玻璃滴管吸新鮮的HESM培養(yǎng)基重懸沉淀；7)取出步驟1獲得的MEF飼養(yǎng)層，用PBS洗三遍，將人胚胎干細胞的小團塊接種于MEF飼養(yǎng)層上，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時，人胚胎干細胞貼壁后可更換新鮮的HESM培養(yǎng)基。每天更換一次培養(yǎng)基，通常5-7天傳代一次。若出現(xiàn)以下情況之一時則需及時進行傳代(1)MEF飼養(yǎng)層的放置時間達到兩周；(2)胚胎干細胞克隆過于致密或面積過大；(3)胚胎干細胞出現(xiàn)明顯的自發(fā)分化。
二、人胚胎干細胞向肝臟細胞的誘導分化分化培養(yǎng)基I添加100ng/L活化素A(Activin A)的RPMI 1640培養(yǎng)基(購自Hyclone公司)，pH 7.2-7.6。
分化培養(yǎng)基II添加50ng/mL酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)(或20ng/ml成纖維細胞生長因子2(FGF2)，或25ng/ml成纖維細胞生長因子4(FGF4))和20ng/mL骨形態(tài)形成蛋白2(BMP2)(或20ng/mL骨形態(tài)形成蛋白4(BMP4))的HCM培養(yǎng)基(購自Cambrex公司)，pH 7.2-7.6。所述不同的成纖維細胞生長因子和骨形態(tài)形成蛋白作用效果相同，可任意選擇。
用本發(fā)明的方法誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化，包括以下步驟1)向定形內(nèi)胚層細胞的誘導取步驟一培養(yǎng)在MEF飼養(yǎng)層上的人胚胎干細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，加入分化培養(yǎng)基I，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天(24小時)，棄去培養(yǎng)基，更換為添加0.2％胎牛血清(FBS，GIB-CO公司)的分化培養(yǎng)基I，在相同條件下培養(yǎng)1天，棄去培養(yǎng)基，更換為添加2％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，在相同條件下培養(yǎng)1天；2)棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入分化培養(yǎng)基II，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，每天換液1次。
實施例2、分化細胞的檢測試劑PBST含0.2％(體積百分比)Triton X100的PBS溶液。
封閉液含2-3％山羊血清(或馬血清)的PBST溶液。
二抗稀釋液(0.1％BSA溶液)稱取0.1g牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，溶于100mLPBS中。
一、由定形內(nèi)胚層細胞向肝細胞初始分化的檢測在誘導分化過程中，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)榈湫偷母渭毎男螒B(tài)，見圖1中的圖A-圖D(圖A、B、C、D分別為分化培養(yǎng)3、4、6、8天后的細胞形態(tài))，而在不加因子自發(fā)分化的對照組細胞，形態(tài)則完全不同，見圖1中的圖E。
用免疫熒光染色的方法對實施例1步驟二中經(jīng)過3天分化培養(yǎng)基I和5天分化培養(yǎng)基II誘導的人胚胎干細胞的分化狀態(tài)進行檢測，以在相同條件下用未添加FGF和BMP的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的自發(fā)分化的人胚胎干細胞為對照，檢測方法包括以下步驟1)取出細胞，棄培養(yǎng)基，用PBS洗2遍；2)加入4％多聚甲醛室溫固定15分鐘(或加入無水甲醇室溫固定5-10分鐘)；3)用PBS洗3遍，每遍5分鐘；4)用PBST溶液進行透化，室溫10分鐘；4)用PBS洗1遍，5分鐘；6)加入封閉液，室溫封閉30-60分鐘；7)棄封閉液，加入一抗(monoclonal anti-α-Fetoprotein(AFP)Clone C3，購自Sigma公司；Polyclonal Rabbit Anti-Human Alb，購自DAKO公司；Mab toCytokeratin 8(CK8)，購自Progen Biotechnik公司；鼠抗人細胞角蛋白18(CK18)單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)(按1∶50-200的比例對上述抗體用封閉液進行稀釋)，4℃放置12-24小時(或37℃孵育2小時)；8)用PBS洗3遍，每遍5分鐘；9)加入二抗(FITC標記羊抗小鼠IgG，TRITC標記羊抗兔IgG，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)(用前先將二抗按1∶50-150比例稀釋于二抗稀釋液中)，37℃避光放置1小時；
10)用PBS洗3遍，每遍5分鐘；11)加入終濃度為1mg/mL的DAPI溶液(美國Roche公司)，室溫放置5分鐘；12)用PBS洗3遍，每遍5分鐘；13)加入500ul PBS(或PBS∶甘油(1∶1))，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。
結(jié)果如圖2所示(左AFP，Alb，CK8，CK18的免疫組化染色結(jié)果，右與DAPI重疊的結(jié)果，比例尺50微米)，經(jīng)分化培養(yǎng)基I和分化培養(yǎng)基II誘導8天的人胚胎干細胞表達有肝細胞的標記分子AFP、Alb、CK8和CK18，其中，Alb陽性細胞約占分化細胞的70％，而對照組中，Alb陽性細胞所占比例小于10％(未顯示)，表明人胚胎干細胞的體外分化過程跟體內(nèi)發(fā)育過程所需的因子十分相似，即Activin A誘導出定形內(nèi)胚層細胞，F(xiàn)GF和BMP起始了由定形內(nèi)胚層細胞向肝細胞的分化。
上述檢測結(jié)果表明可用本發(fā)明的方法及添加有不同成纖維細胞生長因子和骨形態(tài)形成蛋白的專用培養(yǎng)基可將人胚胎干細胞誘導分化為成熟的肝臟細胞，且不同配方分化培養(yǎng)基的分化效果相同。
權(quán)利要求
1.用于誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的培養(yǎng)基，由以下2種培養(yǎng)基組成其中，分化培養(yǎng)基I是在RPMI 1640培養(yǎng)基的基礎上添加了80-120ng/L活化素A，pH7.2-7.6；分化培養(yǎng)基II是在HCM培養(yǎng)基的基礎上添加了40-60ng/mL成纖維細胞生長因子和15-25ng/mL骨形態(tài)形成蛋白，pH7.2-7.6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述分化培養(yǎng)基II中的成纖維細胞生長因子為aFGF、bFGF或FGF4，骨形態(tài)形成蛋白為BMP2或BMP4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述分化培養(yǎng)基I的配方是在RPMI 1640培養(yǎng)基的基礎上添加了100ng/L活化素A，pH7.2-7.6；分化培養(yǎng)基II的配方是在HCM培養(yǎng)基的基礎上添加了50ng/mL aFGF或20ng/mL bFGF或25ng/mL FGF4，以及20ng/mL BMP2或BMP4，pH7.2-7.6。
4.一種誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法，包括以下步驟1)取培養(yǎng)在MEF飼養(yǎng)層上的人胚胎干細胞，棄去培養(yǎng)基，加入權(quán)利要求1-3任一項所述的分化培養(yǎng)基I，在37℃下培養(yǎng)24-48小時，然后棄去培養(yǎng)基，更換為添加0.15-0.25％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，在相同條件下培養(yǎng)24-48小時，再棄去培養(yǎng)基，更換為添加1.5-2.5％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；2)棄去培養(yǎng)基，加入權(quán)利要求1-3任一項所述的分化培養(yǎng)基II，在37℃下培養(yǎng)3-6天，每天更換一次培養(yǎng)基，得到肝樣細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中先將人胚胎干細胞置于分化培養(yǎng)基I中培養(yǎng)24小時，然后棄去培養(yǎng)基，更換為添加0.2％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，培養(yǎng)24小時，再棄去培養(yǎng)基，更換為添加2％胎牛血清的分化培養(yǎng)基I，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的培養(yǎng)時間為5天。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟1)和步驟2)中每次更換培養(yǎng)基前均將細胞用PBS洗1-3遍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導人胚胎干細胞向肝臟細胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基由以下2種培養(yǎng)基組成分化養(yǎng)基I是在RPMI 1640培養(yǎng)基的基礎上添加了80－120ng/L活化素A；分化培養(yǎng)基II是在HCM培養(yǎng)基的基礎上添加了20－60ng/mL成纖維細胞生長因子和15－25ng/mL骨形態(tài)形成蛋白。本發(fā)明的培養(yǎng)基成分確定，使用安全性高；誘導方法具有周期短、分化率高、安全穩(wěn)定的優(yōu)點，應用前景廣闊。
文檔編號C12N5/08GK1884494SQ20061008930
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者鄧宏魁, 丁明孝, 蔡軍, 張晶 申請人:北京大學