專利名稱：人胚胎干細胞的分化的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明提供促進多能干細胞分化為胰島素生成細胞的方法。具體而言，本發(fā)明提供一種方法，其產(chǎn)生表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞，所述細胞共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素。
背景技術(shù)：
用于I型糖尿病的細胞替代療法的進展以及可移植胰島的缺乏，已使人們的注意力集中在開發(fā)適于移入的胰島素生成細胞或P細胞的來源上。一種方法是從多能干細胞例如胚胎干細胞產(chǎn)生功能性P細胞。
在脊椎動物的胚胎發(fā)育中，多能干細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細胞群體。諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內(nèi)胚層經(jīng)由中間階段發(fā)育而來。該過程中的中間階段是形成定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層細胞可表達多種標志物，如HNF3P、GATA4、MIXLl、CXCR4和S0X17。定形內(nèi)胚層分化成胰內(nèi)胚層導致形成胰腺。胰內(nèi)胚層細胞表達胰-十二指腸同源盒基因roxi。在不存在roxi時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因而，PDXi表達標志著胰腺器官發(fā)生中的一個關鍵步驟。除了含有其他細胞類型，成熟的胰腺還含有外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌組織來自胰內(nèi)胚層的分化。據(jù)報道，從小鼠的胚胎細胞衍生出了帶有胰島細胞特征的細胞。例如，Lumelsky等人(Science 292 =1389,2001)報道了小鼠胚胎干細胞向類似于胰島的胰島素分泌結(jié)構(gòu)的分化。Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)報道，小鼠胚胎干細胞衍生的胰島素分泌細胞使鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠血糖恢復正常。在一個實例中，Hori等人(PNAS 99 :16105，2002)公開了用磷酸肌醇3-激酶抑制劑(LY294002)處理小鼠胚胎干細胞產(chǎn)生了與P細胞相似的細胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 =998,2003)報道了從組成型表達Pax4的小鼠胚胎干細胞產(chǎn)生產(chǎn)胰島素的細胞。Micallef等人報道，視黃酸可以調(diào)控胚胎干細胞定向形成roXl陽性胰內(nèi)胚層。在對應于胚胎的原腸胚形成末期的期間，當將視黃酸加入胚胎干細胞分化第4天的培養(yǎng)物時，其最有效地誘導Pdxl表達(Diabetes 54:301,2005)。Miyazaki等人報道了過量表達Pdxl的小鼠胚胎干細胞系。他們的結(jié)果表明，外源Pdxl表達明顯增強了所得到的分化細胞中胰島素、促生長素抑制素、葡萄糖激酶、神經(jīng)元素(neurogenin) 3、p48、Pax6 和 Hnf6 基因的表達(Diabetes 53:1030,2004)。Skoudy等人報道，激活蛋白ACTGF-P超家族的成員)能上調(diào)小鼠胚胎干細胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和內(nèi)分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達。使用InM激活蛋白A時觀察到了最大的效果。他們還觀察到胰島素和PdxlmRNA的表達水平不受視黃酸影響；然而，3nM FGF7處理導致了 Pdxl轉(zhuǎn)錄物的水平增加(Biochem. J. 379 749，2004)。Shiraki等人研究了能特異性增強胚胎干細胞分化成Pdxl陽性細胞的生長因子的作用。他們觀察到，TGF-P 2可再現(xiàn)地產(chǎn)生了更高比例的Pdxl陽性細胞(GenesCells. 2005Jun ；10(6) :503-16.)。Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活蛋白連同Wnt信號轉(zhuǎn)導抑制劑的情況下從小鼠胚胎干細胞誘導brachyury [陽性]/HNF3 0 [陽性]內(nèi)胚層細胞(US2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 頁，2006 年)聲稱“Wnt 和 TGF-P /nodal/激活蛋白信號轉(zhuǎn)導同時為前原條的產(chǎn)生所必需”。然而，胚胎干細胞發(fā)育的小鼠模型可能不會完全模擬高等哺乳動物(例如人)中 的發(fā)育程序。Thomson等人從人胚泡分離出了胚胎干細胞(Science 282:114,1998)。同時，Gearhart及同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細胞系(Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡單通過與白血病抑制因子(LIF) —起培養(yǎng)來防止分化的小鼠胚胎干細胞不一樣，人胚胎干細胞必須在非常特殊的條件下維持(美國專利 No. 6，200，806 ；W099/20741 ；W0 01/51616)。D’Amour等人描述了在高濃度激活蛋白和低血清的存在下產(chǎn)生人胚胎干細胞衍生的定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)物(Nature Biotechnology 2005)。將這些細胞移植到小鼠的腎包膜下，導致分化成具有某些內(nèi)胚層器官的特性的更成熟細胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干細胞衍生的定形內(nèi)胚層細胞可進一步分化成Pdxl陽性細胞(US 2005/0266554A1)。D’ Amour 等人(Nature Biotechnology-24,1392-1401 (2006))聲稱“我們已經(jīng)開發(fā)了一種分化方法，其將人胚胎干(hES)細胞轉(zhuǎn)化成能夠合成胰激素胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和生長素釋放肽的內(nèi)分泌細胞。該方法通過引導細胞經(jīng)過通向表達內(nèi)分泌激素的細胞的類似定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體的各階段，來模擬體內(nèi)胰腺器官發(fā)生”。又如，F(xiàn)isk等人報道了用于從人胚胎干細胞產(chǎn)生胰島細胞的系統(tǒng)(US2006/0040387A1)。在這種情況下，分化途徑分成三個階段。首先用丁酸鈉和激活蛋白A的組合使人胚胎干細胞向內(nèi)胚層分化。然后將細胞與TGF-P拮抗劑(如成頭蛋白(Noggin))結(jié)合EGF或P細胞素一起進行培養(yǎng)，以產(chǎn)生Pdxl陽性細胞。通過煙酰胺誘導終末分化。在一個實例中，Benvenistry等人聲稱“我們得出結(jié)論PDX1的過量表達增強了胰腺豐富基因的表達，胰島素表達的誘導可能需要僅在體內(nèi)存在的額外信號” (Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 :1923-1930)。在另一個實例中,Grapin-Botton等人聲稱“Ngn3的早期活化幾乎專門誘導了胰高血糖素+細胞，同時耗盡胰腺祖細胞的庫。從Ell. 5開始，PDX-I祖細胞具備了分化成胰島素[陽性]和PP[陽性]細胞的能力” (Johansson KA等人，Developmental Cell 12,457-465,2007 年 3 月)。
例如，Diez等人聲稱；“在9和10周，大部分胰高血糖素陽性細胞共表達了胰島素，盡管在這些階段可清楚檢測到獨特的僅表達胰島素的細胞。在整個研究期間(9至21周)觀察到共表達胰島素和胰高血糖素的細胞，但是它們僅代表全部的表達胰島素和胰高血糖素的細胞的一小部分”(J Histochem Cytochem. 2009S??；57 (9) :811-24. 2009Apr13)。在一個實例中，Chen等人聲稱“(_) -indolactam V [ (ILV)]能活化蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導并且指導已經(jīng)定型成內(nèi)胚層譜系的hESC的胰特化ILV和視黃酸通過相關的機制發(fā)揮作用ILV顯示出比視黃酸更 強烈地誘導rox-i表達細胞(表達rox-i的細胞的百分數(shù))”(Nature Chemical Biology 5，195-196 (April 2009) doi 10. 1038/nchembio0409-195)。Lyttle等人聲稱“NKX6_1僅與胰島素細胞共定位，這表明NKX6-1專門參與人3細胞發(fā)育” (Diabetologia 2008Jul :51(7) :1169-80，2008)。因此，仍特別需要開發(fā)出用來產(chǎn)生與P細胞更密切相似的表達胰島素的功能細胞的體外方法。本發(fā)明另辟蹊徑，通過產(chǎn)生表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞群體，來改善使人胚胎干細胞分化成胰島素表達細胞的效率。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施例中，本發(fā)明提供表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞群體。在一個實施例中，本發(fā)明提供了使多能干細胞群體分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞群體的方法，所述方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細胞，b.使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，c.使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，并且d.通過用補充有蛋白激酶C激活劑的培養(yǎng)基處理表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，使表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞。


圖I示出TPB處理對本發(fā)明細胞中胰島素和胰高血糖素表達的影響。小圖a和b分別示出用TPB處理的細胞中胰島素和胰高血糖素的表達。對照細胞群體在小圖c和d中示出。圖2示出多個濃度的TPB對根據(jù)本發(fā)明方法處理的細胞中胰島素和胰高血糖素表達的影響。小圖a至d示出用TPB以所示劑量處理的細胞群體中胰島素和胰高血糖素的表達。圖3示出蛋白激酶C抑制劑對根據(jù)本發(fā)明方法處理的細胞中胰島素和胰高血糖素表達的影響。小圖a描繪用TPB處理的細胞中胰島素和胰高血糖素的表達，小圖c描繪相應的DAPI染色。小圖b描繪用TPB和GO 6976處理的細胞中胰島素和胰高血糖素的表達，小圖d描繪相應的DAPI染色。圖4示出多種蛋白激酶C激活劑對根據(jù)本發(fā)明方法處理的細胞中胰島素表達的影響。小圖a示出用TPB處理的細胞中胰島素的表達。小圖b示出用ILV處理的細胞中胰島素的表達。小圖c示出用PMA處理的細胞中胰島素的表達。圖5示出根據(jù)本發(fā)明方法處理的細胞中胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的表達。各小圖描繪胰島素和NKX6. I (小圖a)、胰島素和roXl (小圖b)、胰島素和NEUR0D1 (小圖c)、胰島素和促生長素抑制素(小圖d)以及胰島素和生長素釋放肽(小圖e)的表達。圖6示出根據(jù)本發(fā)明方法處理的細胞中胰島素和胰高血糖素的表達。小圖a至c 示出用 DMEM-高葡萄糖 +1 % B27+50ng/mL FGF7+0. 25 y M 環(huán)巴胺-KAAD+2 ii M 視黃酸(RA) +100ng/mL 成頭蛋白(Noggin) +20ng/mL 激活蛋白 A+p38 激酶抑制劑(在 US6，214, 830中公開，2.5UM)處理四天的細胞中的胰島素表達(小圖a)、胰高血糖素表達(小圖b)和 DAPI染色(小圖c)(階段3，處理8，實施例2)。小圖d至f示出用DMEM-高葡萄糖+1%B27+0. 25 y M環(huán)巴胺-KAAD+2 U麗視黃酸(RA)+100ng/mL成頭蛋白處理四天的細胞中的胰島素表達(小圖d)、胰高血糖素表達(小圖e)和DAPI染色(小圖f)(階段3，處理9，實例2)。圖7示出在葡萄糖攻擊后，在接受本發(fā)明細胞后4、8和12周的(SCID)-beige (Bg)小鼠中檢測到人C肽。圖8示出在多種蛋白激酶C抑制劑以所示濃度處理后獲得的共表達roxi和NKX6. I的細胞的百分比。圖9示出根據(jù)實例6中所述方法處理的細胞中NGN3、H)X1、NKX6. I和PTFl a的表達。
具體實施例方式為了以非限制的方式清晰說明本公開，將本發(fā)明的具體實施方式
分成下列各個描述或闡明本發(fā)明某些特征、實施例或應用的小節(jié)。定義干細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，所述子代細胞包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和終末分化細胞。干細胞還由它們的以下能力來表征從多個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)體外分化成多種細胞譜系的功能細胞的能力，以及在移植后產(chǎn)生多個胚層的組織的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多數(shù)的組織(如果不是所有的組織的話)的能力。干細胞根據(jù)其發(fā)育潛能分類為(I)全能，意指能夠產(chǎn)生全部胚胎細胞和胚外細胞類型；(2)多能，意指能夠產(chǎn)生全部胚胎細胞類型；(3)專能，意指能夠產(chǎn)生細胞譜系子類，但是均處于特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)(例如，造血干細胞(HSC)可以產(chǎn)生子代，其包括(自我更新性)HSC、血液細胞限制性寡能祖細胞和作為血液正常組分的全部細胞類型和要素(例如，血小板)；(4)寡能，意指能夠產(chǎn)生比多潛能干細胞更受限制的細胞譜系子類；和(5)單能，意指能夠產(chǎn)生單一細胞譜系(例如，精子發(fā)生干細胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細胞獲得特化細胞(如神經(jīng)細胞或肌肉細胞)的特征的過程。分化的細胞或分化誘導的細胞是已經(jīng)在細胞的譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細胞。術(shù)語“定向的”當應用到分化的過程時，指在分化途徑中已經(jīng)進行到這么一種程度的細胞在正常環(huán)境下，它會繼續(xù)分化成特定的細胞類型或細胞類型子類，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細胞類型或回復到分化不足的細胞類型。去分化指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)不足的位置的過程。本文所用的“細胞的譜系”限定細胞的遺傳關系，即它來自哪些細胞和它能產(chǎn)生什么細胞。細胞的譜系將該細胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計劃內(nèi)。譜系特異性標志物指與所關注譜系的細胞的表型明確相關的特征，可用來評估未定向細胞向所關注譜系的分化。如本文所用，“表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞”或“第I階段細胞”或“第I階段”是指表達下列標志物中的至少一種的細胞S0X17、GATA4、HNF3 P、GSC、CER1> Nodal、FGF8、Brachyury> Mix 樣同源盒蛋白、FGF4CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin,EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或0TX2。表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內(nèi)胚層細胞和定形內(nèi)胚層細胞。
如本文所用，“表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞”是指表達下列標志物中的至少一種的細胞PDX1、NKX6. I、HNFl ^、PTFl a、HNF6、HNF4 a、S0X9、HB9 或 PROXl。表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞包括胰內(nèi)胚層細胞、原腸管細胞和后前腸細胞。如本文所用，“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產(chǎn)生的細胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內(nèi)胚層細胞表達下列標志物HNF3P、GATA4、S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 MIXLl。如本文所用，“標志物”是在所關注細胞中差異表達的核酸或多肽分子。就此而論，差異表達意指陽性標志物的水平增加，而陰性標志物的水平降低。標志物核酸或多肽的可檢測水平在所關注細胞中充分地高于或低于在其他細胞中，使得可使用多種本領域公知的方法中的任何一種將所關注細胞與其他細胞鑒別和區(qū)分開來。本文所用的“胰內(nèi)分泌細胞”或“胰激素表達細胞”或“表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞”指能夠表達至少一種以下激素的細胞胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素和胰多肽。多能干細胞的分離、擴增和培養(yǎng)多能干細胞的表征多能干細胞可以表達一種或多種階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可使用稱為Tra-1-60和Tra-1-81的抗體檢測的標志物(Thomson等人，Science 282 :1145,1998)。多能干細胞體外分化導致SSEA-4、Tra 1-60和Tral_81的表達(如果存在的話)的喪失，并導致SSEA-I的表達增加。未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4%多聚甲醒固定細胞,然后用Vector Red作為底物按生產(chǎn)商所描述(VectorLaboratories,Burlingame Calif)進行顯影來檢測。未分化的多能干細胞通常也表達0CT4和TERT，這通過RT-PCR檢測到。增殖的多能干細胞的另一期望的表型，是分化成所有以下三種胚層的細胞的潛能內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織。多能干細胞的多能性可例如通過這樣來證實將細胞注射進重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后對它們進行組織學檢驗以確定是否存在來自所述三種胚層的細胞類型。作為另外一種選擇，可以通過產(chǎn)生胚狀體并評估胚狀體中是否存在所述三種胚層相關的標志物來確定多能性。可以使用標準的G帶(G-banding)技術(shù)并與已公布的相應靈長類物種的核型相比較，來分析增殖的多能干細胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細胞，其意指細胞為整倍體，其中所有的人染色體都存在并且沒有明顯被改變。多能干細胞的來源可使用的多能干細胞的類型包括從妊娠后形成的組織衍生而來的確立多能細胞系，包括在妊娠期間任何時間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時間通常是但不一定是在大約10至12周妊娠前。非限制性例子是確立的人胚胎干細胞系或人胚胎生殖細胞系，例如人胚胎干細胞系HI、H7和H9 (WiCell)。還設想的是，在此類細胞的初始建立或穩(wěn)定化期間使用本發(fā)明的組合物，在此情況下，源細胞將是直接取自源組織 的原代多能細胞。另外合適的是取自己經(jīng)在不存在飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)的多能干細胞群體的細胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細胞系，例如BGOlv (BresaGen, Athens, GA)。在一個實施例中，人胚胎干細胞是如Thomson等人所述制備(美國專利No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol.) 38 133 ff. , 1998 ；Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :7844,1995)。多能干細胞的培養(yǎng)在一個實施例中，通常在飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)多能干細胞，飼養(yǎng)細胞可以多種方式支持多能干細胞。作為另一種選擇，在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多能干細胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)基本上不含飼養(yǎng)細胞，但仍然支持多能干細胞的增殖而不使其發(fā)生實質(zhì)分化。使用通過此前培養(yǎng)另一細胞類型而調(diào)理過的培養(yǎng)基來支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學成分確定的培養(yǎng)基來支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18 :399-404(2000))和 Thompson等人(Science 6November 1998 :Vol. 282. no. 5391,第 1145-1147 頁)公開了使用小鼠胚成纖維細胞飼養(yǎng)細胞層從人胚泡培養(yǎng)多能干細胞系。Richards 等人(Stem Cells 21 :546-556, 2003)評價了一組 11 種不同的成人、胎兒和新生兒飼養(yǎng)細胞層支持人多能干細胞培養(yǎng)物的能力。Richards等人聲稱“在成人皮膚成纖維細胞飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)的人胚胎干細胞系保持了人胚胎干細胞形態(tài)并仍為多能性的”。US20020072117公開了能產(chǎn)生支持靈長類多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長的介質(zhì)的細胞系。所采用的細胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間充質(zhì)細胞系和成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了所述細胞系作為原代飼養(yǎng)細胞層的用途。在另一個實例中，Wang等人(Stem Cells 23 :1221-1227，2005)公開了用于在源自人胚胎干細胞的飼養(yǎng)細胞層上長期培育人多能干細胞的方法。在另一個實例中，Stojkovic等人(Stem Cells 200523 :306-314,2005)公開了一種源自人胚胎干細胞的自發(fā)分化的飼養(yǎng)細胞系統(tǒng)。在又一個實例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22 :433-440, 2004)公開了從人胎盤獲得的飼養(yǎng)細胞源。Amit等人(Biol. R印rod 68 =2150-2156,2003)公開了源自人包皮的飼養(yǎng)細胞層。在另一個實例中，Inzunza等人(Stem Cells 23:544-549,2005)公開了來自人出生后包皮成纖維細胞的飼養(yǎng)細胞層。US6642048公開了可支持靈長類多能干(pPS)細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長的介質(zhì)以及可用于產(chǎn)生這種介質(zhì)的細胞系。US6642048聲稱“本發(fā)明包括從胚胎組織獲得的或從胚胎干細胞分化的間充質(zhì)細胞系和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述并闡明了用于衍生這種細胞系、處理培養(yǎng)基以及用該調(diào)理培養(yǎng)基培養(yǎng)干細胞的方法”。又如，W02005014799公開了用于哺乳動物細胞的維持、增殖和分化的調(diào)理培養(yǎng)基。W02005014799聲稱“根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的培養(yǎng)基經(jīng)鼠細胞的、尤其是那些命名為MMH(Met鼠肝細胞)的分化和永生化轉(zhuǎn)基因肝細胞的細胞分泌活性調(diào)理”。在另一個實例中，Xu等人(Stem Cells 22 =972-980,2004)公開了從人胚胎干細 胞衍生物獲得的調(diào)理培養(yǎng)基，所述人胚胎干細胞衍生物已被遺傳修飾而過量表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。又如，US20070010011公開了用于維持多能干細胞的化學成分確定的培養(yǎng)基?！N另選的培養(yǎng)系統(tǒng)采用補充有能夠促進胚胎干細胞增殖的生長因子的無血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioReprod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870,2005 年 10月19日)公開了一種無飼養(yǎng)細胞的無血清培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細胞維持在補充有能夠引 發(fā)胚胎干細胞自我更新的不同生長因子的未經(jīng)調(diào)理的血清替代(SR)培養(yǎng)基中。在另一個實例中，Levenstein等人(Stem Cells 24:568-574,2006)公開了使用補充有bFGF的培養(yǎng)基，在不存在成纖維細胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下長期培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法。在另一個實例中，US20050148070公開了一種在無血清和無成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，所述方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，該培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎血清，并且含有至少約100ng/ml能夠激活成纖維細胞生長因子信號轉(zhuǎn)導受體的成纖維細胞生長因子，其中提供該生長因子的來源不只是成纖維細胞飼養(yǎng)層，該培養(yǎng)基支持干細胞在無飼養(yǎng)細胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。又如，US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細胞，包括未分化的靈長類原始干細胞的限定培養(yǎng)基。在溶液中，此培養(yǎng)基與培養(yǎng)中的干細胞相比基本上是等滲的。在給定的培養(yǎng)物中，特定的培養(yǎng)基包含基礎培養(yǎng)基和各為一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸,所述一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸為支持原始干細胞進行實質(zhì)上非分化性生長所必需的。又如，US6800480聲稱“在一個實施例中，提供了用于以基本上未分化狀態(tài)培養(yǎng)靈長類來源的原始干細胞的細胞培養(yǎng)基，其包括低滲透壓、低內(nèi)毒素基礎培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基對于支持靈長類來源的原始干細胞的生長是有效的。該基礎培養(yǎng)基混合了有效支持靈長類來源的原始干細胞生長的營養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細胞和衍生自飼養(yǎng)細胞的胞外基質(zhì)組分的底物(substrate)。該培養(yǎng)基還包含非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子”。
在另一個實例中，US20050244962聲稱“在一個方面，本發(fā)明提供培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法”。在基本上不含哺乳動物胎血清(優(yōu)選也基本上不含任何動物血清)的培養(yǎng)物中，并在存在由不只是成纖維細胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細胞生長因子情況下培養(yǎng)干細胞。在優(yōu)選的形式中，通過添加足量的成纖維細胞生長因子，使得之前為維持干細胞培養(yǎng)物所需的成纖維細胞飼養(yǎng)層變?yōu)榉潜匦璧摹?。在又一個實例中，W02005065354公開了一種基本上不含飼養(yǎng)細胞和血清的確定成分的等滲培養(yǎng)基，其包含a.基礎培養(yǎng)基；b. —定量的bFGF，該量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞的生長；c. 一定量的胰島素，該量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞的生長；和d. —定量的抗壞血酸，該量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞的生長。又如，W02005086845公開了一種維持未分化的干細胞的方法，所述方法包括使干細胞暴露于轉(zhuǎn)化生長因子-P (TGF-P)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(FGF)蛋白家族的成員或煙酰胺(NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持細胞處于未分化狀態(tài)達足以實現(xiàn)所需結(jié)果的一段時間。 可將多能干細胞接種至合適的培養(yǎng)底物上。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)底物是胞外基質(zhì)成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)底物是MATR丨GEL/ (Becton Dickenson)。MATRIGEL 是得自Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細胞的可溶性制品,其在室溫下膠凝而形成重構(gòu)的基底膜。其他的細胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴增的細胞類型，這可包括單獨的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合。可在存在可促進細胞存活、增殖和保持之理想特性的培養(yǎng)基的情況下，以合適的分布將多能干細胞接種于所述底物上。所有這些特性可得益于小心注意接種分布，并可容易地由本領域技術(shù)人員確定。合適的培養(yǎng)基可由下列組分制成，例如達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium, DMEM), Gibco 貨號 11965-092 ;敲除達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Knockout Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium, KODMEM)，Gibco 貨號 10829-018 ;Ham' s F12/50 % DMEM 基礎培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027 ;非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； ^ -巰基乙醇，Sigma#M7522 ;人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，Gibco#13256-029。從多能干細胞形成表汰胰內(nèi)分泌譜系特征件標志物的細胞在一個實施例中，本發(fā)明提供了由多能干細胞產(chǎn)生表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細胞，b.使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，c.使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，并且d.使表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素。多能干細胞向表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞的分化表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞的形成，可通過在進行特定方案之前或之后檢測所述標志物的存在來確定。多能干細胞一般表達極微量的此類標記物。因而，當多能細胞開始表達它們時即檢測到多能細胞的分化?？赏ㄟ^本領域的任何方法或通過本發(fā)明提出的任何方法，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，可根據(jù)D’Amour 等人，Nature Biotechnology 23,1534-1541 (2005)中公開的方法，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。 例如，可根據(jù)Shinozaki 等人，Development 131,1651-1662 (2004)中公開的方法，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，可根據(jù)McLean等人，Stem Cells 25,29-38(2007)中公開的方法，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，可根據(jù)D’Amour 等人，Nature Biotechnology 24,1392-1401 (2006)中公開的方法，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，可通過將多能干細胞在含有激活蛋白A但不存在血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所述細胞與激活蛋白A和血清一起培養(yǎng)，再然后將所述細胞與激活蛋白A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。此方法的一個例子在 Nature Biotechnology 23,1534-1541 (2005)中進行了公開。例如，可通過將多能干細胞在含有激活蛋白A但不存在血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所述細胞與激活蛋白A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。此方法的一個例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology, 2005 中進行了公開。例如，可通過將多能干細胞在含有激活蛋白A和Wnt配體但不存在血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后移除fct配體并將所述細胞與激活蛋白A和血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。此方法的一個例子在Nature Biotechnology24,1392-1401(2006)中進行了公開。例如,通過按照被轉(zhuǎn)讓給LifeScan, Inc.的美國專利申請系列號11/736，908中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如,通過按照被轉(zhuǎn)讓給LifeScan, Inc.的美國專利申請系列號11/779，311中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，通過按照美國專利申請系列號60/990，529中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，通過按照美國專利申請系列號61/076，889中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。
例如，通過按照美國專利申請系列號61/076，900中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，通過按照美國專利申請系列號61/076，908中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，通過按照美國專利申請系列號61/076，915中公開的方法處理多能干細胞，可將多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。表達定形內(nèi)胚層i普系特征性標志物的細胞向表達胰內(nèi)胚層i普系特征性標志物的細胞的分化可通過本領域的任何方法或通過本發(fā)明提出的任何方法，使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。 例如,表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞可以根據(jù)D’ Amour等人，NatureBiotechnol. 24 =1392-1401,2006中公開的方法分化成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞。在一個實施例中，表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞共表達H)X1、NKX6. 1，但是共表達極微量的⑶X2和NGN3。在一個實施例中，通過在補充有FGF7的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，然后將所述細胞在補充有FGF7、一種能夠抑制BMP的因子、TGF @受體激動劑、視黃酸和hedgehog信號轉(zhuǎn)導途徑抑制劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng),使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物并共表達H)X1、NKX6. I但共表達極微量的⑶X2和NGN3的細胞。在一個實施例中，F(xiàn)GF7可以按約50pg/ml至約50 y g/ml的濃度使用。在一個實施例中，F(xiàn)GF7按50ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，能夠抑制BMP的因子為成頭蛋白。成頭蛋白可以按約500ng/ml至約500 u g/ml的濃度使用。在一個實施例中，成頭蛋白以100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，TGFP受體激動劑選自激活蛋白A、激活蛋白B、TGFP-I、TGF HI、GDF-8 和 GDF-11。激活蛋白A可以按約2ng/ml至100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，激活蛋白A按20ng/ml的濃度使用。在一個另選的實施例中，激活蛋白A按50ng/ml的濃度使用。激活蛋白B可以按約2ng/ml至100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，激活蛋白B按20ng/ml的濃度使用。在一個另選的實施例中，激活蛋白B按50ng/ml的濃度使用。TGF ^ -I可以按約2ng/ml至100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，TGF P -I按20ng/ml的濃度使用。在一個另選的實施例中，TGFP -I按50ng/ml的濃度使用。TGFP-II可以按約2ng/ml至100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，TGFP -II以20ng/ml的濃度使用。在一個另選的實施例中，TGFP-II按50ng/ml的濃度使用。⑶F-8可以按約2ng/ml至100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中,⑶F-8按20ng/ml的濃度使用。在一個另選的實施例中，⑶F-8按50ng/ml的濃度使用。⑶F-II可以按約2ng/ml至100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，⑶F-II按20ng/ml的濃度使用。在一個另選的實施例中，⑶F-II按50ng/ml的濃度使用。視黃酸可以按約InM至約ImM的濃度使用。在一個實施例中，視黃酸按I U M的濃度使用。在一個實施例中，hedgehog信號轉(zhuǎn)導途徑抑制劑為環(huán)巴胺-KAAD。環(huán)巴胺-KAAD可以按約0. 025 u M至約2. 5 ii M的濃度使用。在一個實施例中，環(huán)巴胺-KAAD按0. 25 y M的濃度使用?？赏ㄟ^將處理過的細胞群體暴露于能特異性識別由表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞所表達的蛋白質(zhì)標志物的試劑(如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質(zhì)標志物和核酸標志物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些包括定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Northern印跡、原位雜交(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人,編輯,2001增刊))以及免疫測定(例如切片材料的免疫組織化學分析)、Western印跡，對于在完整細胞中可接近(accessible)的標志物來說，有流式細胞術(shù)分析(FACS)(參見，例如，Harlow和Lane,Using Antibodies A Laboratory Manual,New York :CoId Spring Harbor Laboratory Press (1998))。多能干細胞的特征是本領域技術(shù)人員熟知的，并且多能干細胞的另外的特征繼續(xù)得到鑒定。多能干細胞標志物包括(例如)一種或多種下列標志物的表達ABCG2、cripto、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、Nanog, hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4,Tra 1-60、Tra 1-81 在用本發(fā)明方法處理多能干細胞后，可通過使處理過的細胞群體暴露于能特異性識別由表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞所表達的蛋白質(zhì)標志物(如CXCR4)來純化分化的細胞。適用于本發(fā)明的多能干細胞包括(例如)人胚胎干細胞系H9 (NIH代碼WA09)、人胚胎干細胞系Hl (NIH代碼1々01)、人胚胎干細胞系117 0111代碼WA07)以及人胚胎干細胞系SA002(Cellartis,瑞典)。表達下列多能細胞特征性標志物中的至少一種的細胞也適用于本發(fā)明ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、Nanog, hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60 和 TraI-81。定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物選自S0X17、GATA4、HNF3 P、GSC、CERU Nodal、FGF8、Brachyury、MiX 樣同源盒蛋白、FGF4、CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit,⑶99和0TX2。表達至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個方面，表達定形內(nèi)胚層系特征性標志物的細胞為原條前體細胞。在另一方面，表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞是中內(nèi)胚層細胞。在另一方面，表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞是定形內(nèi)胚層細胞。胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物選自PDXl、NKX6. I、HNFl ^、PTFl a、HNF6、HNF4 a、S0X9、HB9和PR0X1。表達至少一種胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個方面，表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞為胰內(nèi)胚層細胞。表汰胰內(nèi)胚層譜系特征件標志物的細胞向表汰胰內(nèi)分泌譜系標志物的細胞的分it在一個實施例中，使表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞進一步分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞。在一個實施例中，表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞共表達H)X1、NKX6. 1，但是共表達極微量的⑶X2和NGN3。在一個實施例中，表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素。在一個實施例中，通過在補充有能夠抑制BMP的因子、TGFP受體信號轉(zhuǎn)導抑制劑和蛋白激酶C激活劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞,使表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞。在一個實施例中，能夠抑制BMP的因子為成頭蛋白。成頭蛋白可以按約500ng/ml至約500 u g/ml的濃度使用。在一個實施例中，成頭蛋白以100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，TGFP受體信號轉(zhuǎn)導抑制劑是ALK5的抑制劑。在一個實施例中，ALK5的抑制劑是ALK5抑制劑II。ALK5抑制劑II可以按約0. I y M至約10 y M的濃度使用。在一個實施例中，ALK5抑制劑II按I ii M的濃度使用。 在一個實施例中，蛋白激酶C激活劑選自(2S，5S)_(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戍二烯酰氨基)苯并內(nèi)酰胺、Indolactam V和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯。在一個實施例中，蛋白激酶C激活劑是(2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)_2，4-戍二烯酰氨基)苯并內(nèi)酰胺。(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-( 二氟甲基)苯基)-2,4-戍二烯酰氨基)苯并內(nèi)酰胺可以按約20nM至約500nM的濃度使用。(2S，5S) - (E，E) -8- (5- (4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戍二烯酰氨基)苯并內(nèi)酰胺、Indolactam V和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯在本文中稱作“TPB”。胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物選自NEUROD、ISLU PDXU NKX6. I、NKX2. 2、PAX4和PAX6。在一個實施例中，表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素癥法在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有I型糖尿病或有發(fā)展I型糖尿病風險的患者的方法。在一個實施例中，該方法包括培養(yǎng)多能干細胞，使多能干細胞在體外分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞，并且將表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞植入患者中。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有2型糖尿病或有發(fā)展2型糖尿病風險的患者的方法。在一個實施例中，該方法包括培養(yǎng)多能干細胞，使多能干細胞在體外分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞，并且將表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞植入患者體內(nèi)。如果合適，可用有利于植入的細胞的存活和功能的藥劑或生物活性劑對患者進行進一步處理。這些試劑可包括(例如)胰島素、TGF-P家族的成員(包括TGF-P 1、2和3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-IU BMP-12 和 BMP-13)、成纖維細胞生長因子-I和_2、血小板衍生生長因子-AA和-BB、富血小板血漿、胰島素生長因子(IGF-I、II)、生長分化因子(⑶F-5、⑶F-6、⑶F-7、⑶F-8、⑶F-10、⑶F-15)、血管內(nèi)皮細胞衍生生長因子(VEGF)、多營養(yǎng)因子、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)和高血糖素樣肽-II、GLP-1和2模擬體(mimetibody)、毒蜥外泌肽_4、視黃酸、甲狀旁腺激素、MAPK抑制劑，例如美國已公布的專利申請2004/0209901和美國已公布的專利申請2004/0132729中所公開的化合物。可使多能干細胞在移植進接受者之前分化成胰島素生成細胞。在一個具體的實施例中，在移植進接受者之前，使多能干細胞完全分化成￠-細胞。作為另一種選擇，可將多能干細胞以未分化狀態(tài)或部分分化的狀態(tài)移植進接受者中?？稍谠摻邮苷咧邪l(fā)生進一步分化?？蓪⒍ㄐ蝺?nèi)胚層細胞，或作為另一選擇，胰內(nèi)胚層細胞，或作為另一種選擇，e細胞作為分散細胞進行移植，或可使這些細胞形成簇，而這些細胞簇可輸注進肝門靜脈內(nèi)。作為另一種選擇，可將細胞設置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性裝置中或可進行封裝以保護其免受宿主免疫應答的作用?？蓪⒓毎浦策M接受者中的合適部位內(nèi)。植入部位包括(例如)肝臟、天然的胰腺、腎包膜下空間、網(wǎng)膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮下袋。為了增強植入的細胞的進一步分化、存活或活性，可在給予細胞之前、之同時或之后給予額外的因子，例如生長因子、抗氧化劑或抗炎劑。在某些實施例中，利用生長因子使所給予的細胞在體內(nèi)分化。這些因子可由內(nèi)源性細胞分泌并原位暴露于所給予的細胞?？?通過本領域已知的內(nèi)源生長因子或外源給予的生長因子的任何組合來誘導植入的細胞進行分化。移植中所用的細胞的量取決于多種因素，包括患者的狀況和對該療法的響應，并且可由本領域技術(shù)人員確定。在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有糖尿病或有發(fā)展糖尿病風險的患者的方法。該方法涉及培養(yǎng)多能干細胞、使培養(yǎng)的細胞體外分化成￠-細胞譜系，以及將細胞摻入三維支持物中。在移植進患者前，可使細胞在該支持物上體外維持。作為另一種選擇，可將容納有細胞的支持物直接移植進患者中而無需進行額外的體外培養(yǎng)?？扇芜x將至少一種有利于植入的細胞的存活和功能的藥劑摻入該支持物中。適用于本發(fā)明目的的支持材料包括可用于組織修復的組織模板、導管、屏障物和貯器。具體地講，已經(jīng)在體外和體內(nèi)用于生物組織重建或再生以及用于遞送趨化劑來誘導組織生長的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織物和非織造結(jié)構(gòu)的形式的合成材料和天然材料，適用于實施本發(fā)明的方法。參見，例如在美國專利5，770，417、美國專利6，022，743、美國專利5，567，612、美國專利5，759，830、美國專利6，626，950、美國專利6，534，084、美國專利6，306，424、美國專利6，365，149、美國專利6，599，323、美國專利6，656，488、美國已公布的專利申請2004/0062753A1、美國專利4，557，264和美國專利6，333，029中所公開的材料。為了形成摻有藥劑的支持物，可在形成支持物前將藥劑與聚合物溶液混合。作為另一種選擇，可將藥劑涂覆于制好的支持物上，優(yōu)選在存在藥物載體的情況下進行。藥劑可以液體、微細固體或任何其他合適的物理形式存在。作為另一種選擇，可將賦形劑添加至支持物以改變藥劑的釋放速率。在一個另選的實施例中，將至少一種為抗炎化合物的藥物化合物(例如在美國專利6，509，369中所公開的化合物)摻入支持物中。可將至少一種為抗凋亡化合物的藥物化合物(例如在美國專利6，793，945中所公開的化合物)摻入支持物中?？蓪⒅辽僖环N為纖維變性抑制劑的藥物化合物(例如在美國專利6，331，298中所公開的化合物)摻入支持物中。
支持物還可摻有至少一種能夠增強血管生成的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請2004/0220393和美國已公布的專利申請2004/0209901中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種為免疫抑制化合物的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請2004/0171623中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種為生長因子的藥物化合物，例如TGF-P家族的成員(包括 TGF-P I、TGF-P 2 和 TGF-P 3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7.BMP-1UBMP-12和BMP-13)、成纖維細胞生長因子_1和_2、血小板衍生生長因子-AA和-BB、富血小板血漿、胰島素生長因子(IGF-I、IGF-II)、生長分化因子(⑶F-5、⑶F-6、⑶F-8、⑶F-10、⑶F-15)、血管內(nèi)皮細胞衍生生長因子(VEGF)、多營養(yǎng)因子、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、缺氧誘導因子l_a、胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)、GLP-I和GLP-2模擬體、毒蜥外泌肽-4、nodal、成頭蛋白、NGF、視黃酸、甲狀旁腺激素、生腱蛋白-C、彈性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凱薩林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、層粘連蛋白、含有粘附性胞外基質(zhì)蛋白(例如纖連蛋白和玻連蛋白)的細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物肽、MAPK抑制劑(例如在美國已公布的專利申請2004/0209901和 美國已公布的專利申請2004/0132729中所公開的化合物)?？赏ㄟ^簡單地將細胞沉積在支架上來實現(xiàn)將本發(fā)明細胞摻入該支架中。細胞可通過簡單擴散進入支架中(J. Pediatr. Surg. 23 (IPt 2) :3-9(1988)) 0已經(jīng)開發(fā)了若干其他方法來增強細胞接種的效率。例如，已經(jīng)將轉(zhuǎn)瓶(spinner flask)用于將軟骨細胞接種于聚乙醇酸支架上(Biotechnol. Prog. 14(2) : 193-202 (1998))。另一種用于細胞接種的方法是利用離心，這對接種的細胞產(chǎn)生的應力極小并增強接種效率。例如，Yang等人開發(fā)了一種細胞接種方法(J. Biomed. Mater. Res. 55(3) :379-86 (2001))，稱作離心細胞固定法(CCI)。本發(fā)明通過(但不限于)以下實例進一步說明。SM實例I表汰胰內(nèi)分泌譜系特征件標志物并共表汰胰島素和NKX6. I以及極微量的胰高血糖素的細胞群體的形成將人胚胎干細胞系Hl的細胞在MATRIGEL (I : 30稀釋度)(BDBiosciences ；目錄號356231)包被的平皿上，用RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen ;目錄號22400) +0. 2 %FBS+100ng/ml 激活蛋白 A (PeproTech ；目錄號 120-14)+20ng/ml WNT-3a (R&D Systems ；目錄號1324-WN/CF)培養(yǎng)I日，隨后用RPMI培養(yǎng)基+0. 5% FBS+100ng/mL激活蛋白A再處理兩日(階段1)，隨后，a.用 DMEM/F12 (Invitrogen ;目錄號 11330-032)+2 % FBS+50ng/mlFGF7 (PeproTech ；目錄號100-19)處理三日(階段2)，隨后b. DMEM-高葡萄糖(Invitrogen ；目錄號 10569)+1 % B27+50ng/mlFGF7+0. 25 u M環(huán)巴胺-KAAD(Calbiochem ;目錄號 239804)+100ng/ml 成頭蛋白(R&D Systems ;目錄號3344-NG)處理四日(階段3)，隨后c.用 DMEM-高葡萄糖 +1 % B27 (Invitrogen ;目錄號 0791)+100ng/ml 成頭蛋白 +IiiM ALK5 抑制劑 IKAxxora ;目錄號 ALX-270-445)+500nM TBP ((2S, 5S) - (E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戍二烯酰氨基)苯并內(nèi)酰胺)(Calbiochem ;目錄號565740)處理6日(階段4)。作為對照，將另外的細胞群體用DMEM-高葡萄糖+1 % B27+100ng/ml成頭蛋白+IuM ALK5抑制劑II處理六日(階段4，對照組)。如圖I所示，在階段4的TBP處理導致了表達胰島素的細胞增加(圖I小圖a)。應當指出，約60%的這些表達胰島素的細胞是單一表達內(nèi)分泌激素的細胞，其中所述細胞表達胰島素并且不表達胰高血糖素、促生長素抑制素和生長素釋放肽(圖I小圖a和b ;圖5小圖d和e)。還在接受TBP處理的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)表達胰高血糖素的細胞。大多數(shù)表達胰高血糖素的細胞也共表達胰島素(圖I小圖a和b)。對于對照組，大部分細胞共表達胰島素和膜聞血糖素(圖I小圖c和d)。在一個單獨實驗中，將人胚胎干細胞系Hl的細胞在MATRlGELli (I : 30稀釋)包被的平皿上用RPMI培養(yǎng)基+0. 2% FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT_3a培養(yǎng)I日，隨后用RPMI培養(yǎng)基+0. 5% FBS+100ng/mL激活蛋白A再處理兩日(階段I)，隨后，
a.用 DMEM/F12+2% FBS+50ng/ml FGF7 處理三日(階段 2)，隨后b.用 DMEM-高葡萄糖 +1 % B27+0. 25 y M 環(huán)巴胺-KAAD+2 u M 視黃酸(RA) +IOOng/ml成頭蛋白處理四日(階段3)，隨后c.進行處理I :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制劑II+500nM TBP處理六日(階段4，處理I)，或d.進行處理2 :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制劑II+100nM TBP處理六日(階段4，處理2)，或e.進行處理3 :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制劑II+20nM TBP處理六日(階段4，處理3)，或f.進行處理4 :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制劑II處理六日(階段4，處理4)。用免疫細胞化學分析來評估不同濃度的TPB對本發(fā)明細胞的形成的影響。在500nM和IOOnM TPB處理組中都觀察到單一表達胰島素的細胞的數(shù)目顯著增加(圖2小圖a和b)。FACS分析證實兩種處理均在體外產(chǎn)生12%單一表達胰島素的細胞，并且該細胞群體的15%還表達NKX6. I (表I-表達NKX6. 1/INS的細胞占總細胞群體的2. 4% )。在20nMTPB情況下，與對照組相似，大部分細胞共表達胰島素和胰高血糖素(圖2小圖c和d)。表I :胰內(nèi)分泌譜系特征件標志物的表汰，以占總細胞群體的百分比示出
^突觸小泡蛋白~^INS ^NKX6.1 NKX6.1/INS
TPB(SOOnM)383%94%45.7%24%
TPB
,,二,、47.6%14.4% 34.8%3.1%
(IOOnM)_____為了進一步證實對表達內(nèi)分泌激素的細胞的形成的影響是由蛋白激酶C的活化介導，將人胚胎干細胞系Hl的單獨細胞群體在MATRIGEL (I : 30稀釋)包被的平皿上用RPMI培養(yǎng)基+0. 2% FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT_3a培養(yǎng)I日，隨后用RPMI培養(yǎng)基+0. 5% FBS+100ng/mL激活蛋白A在處理兩日(階段I)，隨后，a.用 DMEM/F12+2% FBS+50ng/ml FGF7 處理三日(階段 2)，隨后
b.用 DMEM-高葡萄糖 +1 % B27+0. 25 y M 環(huán)巴胺-KAAD+2 u M 視黃酸(RA) +IOOng/ml成頭蛋白處理四日(階段3)，隨后c.進行處理5 :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制劑II+500nM TBP處理六日(階段4，處理5)，或d.進行處理6 :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制齊IJII + 500nM TPB + 5uM GO 69766處理六日(階段4，處理6)，或e.進行處理7 :用DMEM-高葡萄糖+1% B27+100ng/ml成頭蛋白+IyM ALK5抑制劑II處理(階段4，處理7)，隨后f.用DMEM-高葡萄糖+1 % B27處理四日(階段5)。GO 6976已知能選擇性抑制Ca2+依賴性蛋白激酶C同工型。在單獨接受TPB (圖3，小圖a)和接受TPB和GO 6976 (圖3，小圖b)的培養(yǎng)物中表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標 志物的細胞的數(shù)目顯著減少。FACS分析證實TPB處理(處理6)產(chǎn)生了 30. 6%表達突觸小泡蛋白的細胞，12%單一表達胰島素的細胞和4. 6%表達胰高血糖素的細胞。另一方面，TBP和GO 6976處理(處理7)產(chǎn)生了 10. 6%的表達突觸小泡蛋白但沒有表達可檢測水平的單一胰島素的細胞(表2)。在處理6和處理7之間觀察到的細胞總數(shù)不存在差異。(參見圖3，小圖c和d，其示出DAPI染色，反映處理6和處理7中的總細胞數(shù)目)。這些結(jié)果表明，蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導對于形成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞可能是重要的。還試驗了其他蛋白激酶C激活劑。它們是Indolactam V(ILV) (Axxora ;目錄號ALX-420-011-C300)和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA) (Calbiochem ；目錄號524400)。然而，僅TPB顯示出形成單一表達胰島素的細胞(圖4，小圖a)。500nM的ILV(圖
4,小圖b)和PMA(圖4,小圖c)在TK日后均廣生了共表達膜島素和膜聞血糖素的細胞。FACS分析證實TPB處理產(chǎn)生了 12%單一表達胰島素的細胞和4. 6%表達胰高血糖素的細胞，以及7. I %共表達胰島素和胰高血糖素的細胞。另一方面，ILV處理產(chǎn)生了 3%單一表達胰島素的細胞和12%表達胰高血糖素的細胞以及12%共表達胰島素和胰高血糖素的細胞(表2)。免疫細胞化學分析顯示，在用TPB處理的培養(yǎng)物中，20%表達胰島素的細胞共表達NKX6. I (圖5小圖a)和PDXl (圖5的小圖b)。大部分表達胰島素的細胞共表達NEUROD,后者是一種內(nèi)分泌標志物(圖5小圖c)非常少的表達胰島素的細胞共表達促生長素抑制素或生長素釋放肽(GHRL)(圖5小圖d和e)。表2 :胰內(nèi)分泌譜系特征件標志物的表汰，以占總細胞群體的百分比示出
TPBILVTPB
____+Go6976_
突觸小泡蛋白 30.6%56.8%10.6%
INS12%— 3%-
GCG_ 4.6%_ 12.6%3.1%—
"INS/GCG7.1%12.9%丨 4%實例2用于形成表汰胰內(nèi)分泌譜系特征件標志物并共表汰胰島素和NKX6. I以及極微量的胰高血■糖素的細胞群體的一種另選方法在一個獨立實驗中，將人胚胎干細胞系Hl的細胞在MATR丨GEL (I : 30稀釋)包被的平皿上用RPMI培養(yǎng)基+0. 2% FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT_3a培養(yǎng)I日，隨后用RPMI培養(yǎng)基+0. 5% FBS+100ng/mL激活蛋白A再處理兩日(階段I)，隨后，a.用 DMEM/F12+2% FBS+50ng/ml FGF7 處理三日(階段 2)，隨后b.進行處理 8 :用 DMEM-高葡萄糖 +1 % B27+50ng/mL FGF7+0. 25 y M 環(huán)巴胺-KAAD+2 u M視黃酸(RA) +100ng/ml成頭蛋白+20ng/ml激活蛋白A+p38激酶抑制劑(在US6, 214,830中公開，2.5iiM)處理四日(階段3，處理8)，或c.進行處理9 :用DMEM-高葡萄糖+1 % B27+0. 25 y M環(huán)巴胺-KAAD+2 u M視黃酸(RA)+100ng/ml成頭蛋白處理四日(階段3，處理9)，隨后d.用 DMEM-高葡萄糖 +1% B27+100ng/ml 成頭蛋白 +IyM ALK5 抑制劑 II+500nMTPB處理六日(階段4)。階段3，處理8導致了形成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物并共表達roXl和 NKX6. I但不表達⑶X2和NGN3的細胞群體。另一方面，階段3，處理9導致了形成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物并共表達PDXl、NKX6. I和NGN3的細胞群體。檢查了蛋白激酶C激活劑處理對這些細胞群體的影響(上文的階段4)。進行了 FACS分析以確定胰島素單一陽性細胞、胰高血糖素單一陽性細胞、胰島素/胰高血糖素雙陽性細胞、表達NKX6. I陽性的細胞、胰島素/NKX6. I陽性細胞和突觸小泡蛋白(一種泛內(nèi)分泌標記物)陽性細胞的百分比。如表3中所示，處理8所形成的細胞群體產(chǎn)生了較大百分比的內(nèi)分泌細胞，如突觸小泡蛋白表達所表示總細胞群體的49. 7%表達了突觸小泡蛋白?？偧毎后w的27. 8%是胰島素單一陽性細胞。另一方面，處理9所形成的細胞群體僅產(chǎn)生了 25. 7%表達突觸小泡蛋白的細胞?？偧毎后w的7. 6%是單一表達胰島素的細胞。在兩種處理中沒有觀察到單一表達胰高血糖素的細胞的顯著差異，并且表達胰高血糖素的細胞的百分比顯著地低于表達胰島素的細胞的百分比。大量的表達胰島素的細胞也共表達NKX6. I。在接受處理8的細胞群體中，總細胞群體的11%表達了胰島素和NKX6. I。在接受處理9的細胞群體中，總細胞群體的2%表達了胰島素和NKX6. I。免疫熒光分析證實以上結(jié)果(圖6)。與處理9相比，處理8導致了表達胰島素的細胞增加(圖6小圖a和d)。大部分表達胰高血糖素的細胞是多激素性細胞(圖6，小圖
8、13、(1和6)。這些結(jié)果提示，處理8所產(chǎn)生的細胞群體(表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物并共表達I3DXl和NKX6. I但不表達⑶X2和NGN3的細胞)可以通過本發(fā)明的方法更有效地誘導，以變?yōu)槌墒旌陀泄δ艿谋磉_胰島素的細胞。表3 :胰內(nèi)分泌譜系特征件標志物的表汰，以占總細胞群體的百分比示出
權(quán)利要求
1.表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞的群體，所述細胞共表達NKX6.I和胰島素并且其中所述群體中小于10%的所述細胞表達胰高血糖素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細胞群體，其中至少30%的所述細胞表達NKX6.I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細胞群體,其中至少40%的所述細胞表達NKX6.I。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細胞群體，其中至少50%的所述細胞表達NKX6.I。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細胞群體，其中至少60%的所述細胞表達NKX6.I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細胞群體，其中至少5%的所述細胞表達胰島素。
7.—種產(chǎn)生表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物的細胞的群體的方法，所述細胞共表達NKX6. I和胰島素并且其中所述群體中小于10%的所述細胞表達胰高血糖素，所述方法包括以下步驟 a.培養(yǎng)多能干細胞， b.使所述多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞， c.使所述表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，并且 d.通過在補充有能夠抑制BMP的因子、TGFP受體信號轉(zhuǎn)導抑制劑和蛋白激酶C激活劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述表達胰內(nèi)胚層譜系特征性標志物的細胞，使所述表達胰內(nèi)胚層譜系 特征性標志物的細胞分化成表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6. I和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種促進多能干細胞分化為胰島素生成細胞的方法。具體而言，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生表達胰內(nèi)分泌譜系特征性標志物并共表達NKX6.1和胰島素以及極微量的胰高血糖素的細胞的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102741395SQ201080059059
公開日2012年10月17日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者J.徐 申請人:森托科爾奧索生物科技公司