專利名稱：用于計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物的方法和組合物的制作方法
用于計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物的方法和組合物相關(guān)專利申請的交叉引用本申請要求2008年8月21日提交的美國專利申請No. 61/090，761的優(yōu)先權(quán)，該 專利申請以引用方式全文并入本文。
背景技術(shù)：
有大量文獻(xiàn)證明凝固酶陽性菌種金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是人 類機(jī)會性病原體(Murray 等人編輯，1999，Manual of Clinical Microbiology，第 7 版，ASM Press, Washington, D. C.)。由金黃色葡萄球菌引起的醫(yī)院感染是發(fā)病和死亡的主要原因。 由金黃色葡萄球菌引起的一些最普通的感染涉及皮膚，這些感染包括發(fā)生在各個(gè)部位的癤 子或疔瘡、蜂窩織炎、膿皰病以及手術(shù)后和慢性傷口感染。由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的一些更 嚴(yán)重的感染是菌血癥、肺炎、骨髓炎、急性心內(nèi)膜炎、心肌炎、心包炎、大腦炎、腦膜炎、燙傷 樣皮膚綜合征和各種膿腫。由葡萄球菌腸毒素介導(dǎo)的食物中毒是另一種與金黃色葡萄球菌相關(guān)的重要綜合 征。中毒性休克綜合征是一種社區(qū)獲得性疾病，它也已被歸因于產(chǎn)毒素的金黃色葡萄球菌 的感染或定植。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)出現(xiàn)在二十世紀(jì)80年代，成為醫(yī)院中 的重大臨床和流行病學(xué)問題(Oliveira 等人，2002，Lancet Infect Dis. 2 :180-189)。MRSA 能耐受所有的內(nèi)酰胺，包括青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類和單環(huán)內(nèi)酰胺類，它們是治 療金黃色葡萄球菌感染的最常用抗生素。MRSA感染只能用毒性更高且更昂貴的抗生素治 療，這些抗生素通常作為最后一道防線來使用。由于MRSA能容易地通過醫(yī)護(hù)人員在患者間 傳播，全世界的醫(yī)院都面臨控制MRSA的問題。因此，需要開發(fā)出用于檢測和/或鑒定MRSA 的快速簡便的篩選或診斷試驗(yàn)法，以減少它的擴(kuò)散和改善對受感染患者的診斷和治療。金黃色葡萄球菌中的甲氧西林耐受性之所以獨(dú)特，是因?yàn)閺钠渌堂戈幮云咸?球菌(CNS)獲得了編碼耐β-內(nèi)酰胺的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的DNA，該蛋白在細(xì)胞暴露于 β -內(nèi)酰胺抗生素時(shí)會接管正常PBP的生物合成功能。金黃色葡萄球菌通常含有四種ΡΒΡ， 其中PBP 1、2和3是必需的。MRSA中的低親和力PBP被稱為PBP 2a(或ΡΒΡ2')，是由染 色體mecA基因編碼，起到耐β -內(nèi)酰胺的轉(zhuǎn)肽酶的作用。mecA基因在甲氧西林敏感性金黃 色葡萄球菌中不存在，但廣泛分布于其他的葡萄球菌種類中，且高度保守⑴bukata等人， 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34 :170-172)?；跈z測mecA基因和金黃色葡萄球菌特異性染色體序列來檢測和鑒定MRSA的 方法已有描述。(Saito 等人，1995，J. Clin. Microbiol. 33 :2498-2500 ；Ubukata 等人， 1992，J. Clin. Microbiol. 30 :1728-1733 ；Murakami 等人，1991，J. Clin. Microbiol. 29 2240-2244 ；Hiramatsu等人，1992,Microbiol. Immunol. 36 :445-453)。但是，由于mecA基因 在金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中都廣泛存在，這些方法并不總是能夠區(qū)別MRSA 與耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)(參見Suzuki等人，1992，Antimicrob. Agents. Chemother. 36 :429-434)。為解決這個(gè)問題，Hiramatsu等人開發(fā)了對MRSA具有特異性的 基于PCR的測定法，該測定法利用能與3種類型的葡萄球菌染色體盒mec DNA(SCCmec DNA)的右末端雜交的引物，以及對金黃色葡萄球菌的對應(yīng)于SCCmec整合位點(diǎn)的右側(cè)上的核苷 酸序列具有特異性的引物。(美國專利No. 6，156，507)。其他葡萄球菌種類(例如表皮葡 萄球菌(S^pidermidis)和溶血葡萄球菌(S. haemolyticus))中的SCCmec整合位點(diǎn)周圍 的核苷酸序列與金黃色葡萄球菌中存在的那些核苷酸序列不同，因此，這個(gè)PCR測定法能 特異性檢測MRSA。用于檢測MRSA和區(qū)分MRSA與MRCNS的遺傳測定法相對較昂貴。另外，這類試驗(yàn) 法需要復(fù)雜的儀器和熟練的實(shí)驗(yàn)人員才能進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于當(dāng)前的試驗(yàn)法要求復(fù)雜的儀器、不穩(wěn)定的培養(yǎng)基和/或高度熟練的實(shí)驗(yàn)人 員，因此需要更簡單的基于培養(yǎng)的試驗(yàn)法來檢測和區(qū)分樣本中的MRSA和/或MRCNS微生 物。此外，目前的MRSA和MRCNS微生物的試驗(yàn)法是定性的或者半定量的。本發(fā)明涉及用于 檢測和區(qū)分樣本中的抗生素抗性微生物的簡單物品和方法。有利地，本發(fā)明的某些實(shí)施例 提供抗生素抗性微生物的定量計(jì)數(shù)。本發(fā)明方法還提供對含有MRSA和MRCNS的樣本中的 這兩種微生物的差分計(jì)數(shù)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測或計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物的物品。該物品可包 括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素，前提條件是 該內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南。該物品還可包括營養(yǎng)培養(yǎng)基、用于指示微生物的存在的 指示劑系統(tǒng)和包含膠凝劑的干燥、可再水化的薄膜培養(yǎng)裝置。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于對抗生素抗性微生物進(jìn)行差分計(jì)數(shù)的物品。該物 品可包括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的β-內(nèi)酰胺抗生素，前提 條件是該β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南。該物品還可包括營養(yǎng)培養(yǎng)基、用于指示微生物的 存在的第一指示劑系統(tǒng)、用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)和包含膠凝劑 的干燥、可再水化的薄膜培養(yǎng)裝置。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測抗生素抗性微生物的方法。該方法可包括提 供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；提供干燥的薄膜培養(yǎng)裝置；用該液體樣本接種 該培養(yǎng)裝置；將該接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間；和分析該培養(yǎng)裝置存在抗生素抗性微生 物。該培養(yǎng)裝置可包括營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的β-內(nèi) 酰胺抗生素(前提條件是該β -內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的存在的指示 劑系統(tǒng)和膠凝劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測和區(qū)分抗生素抗性微生物的方法。該方法可 包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；提供干燥的薄膜培養(yǎng)裝置；用該液體樣 本接種該培養(yǎng)裝置；將該接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間；和分析該培養(yǎng)裝置存在抗生素抗 性微生物。該培養(yǎng)裝置可包括營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的 β-內(nèi)酰胺抗生素(前提條件是該β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的存在 的指示劑系統(tǒng)、用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)和膠凝劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測和區(qū)分抗生素抗性微生物的方法。該方法可 包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本和包含膠凝劑的干燥的薄膜培養(yǎng)裝置以 及以下成分中的任何一種或多種營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素(前提條件是該內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南)和用于指示微生 物的存在的指示劑系統(tǒng)。該方法還可包括向該培養(yǎng)裝置加入如果不是已經(jīng)存在的營養(yǎng)培 養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素(前提條件是該 內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南)和用于指示微生物的存在的指示劑系統(tǒng)。該方法還可包括 用該液體樣本接種該培養(yǎng)裝置，將該接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間，和分析該培養(yǎng)裝置存 在抗生素抗性微生物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測和區(qū)分抗生素抗性微生物的方法。該方法可 包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本和包含膠凝劑的干燥的薄膜培養(yǎng)裝置以 及以下成分中的任何一種或多種營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生 長的β -內(nèi)酰胺抗生素(前提條件是該β -內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的 存在的第一指示劑系統(tǒng)和用于檢測金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)。該方法還可 包括向該培養(yǎng)裝置加入如果不是已經(jīng)存在的營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微 生物的生長的β-內(nèi)酰胺抗生素(前提條件是該β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示 微生物的存在的第一指示劑系統(tǒng)和用于檢測金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)。該 方法還可包括用該液體樣本接種該培養(yǎng)裝置，將該接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間，和分析 該培養(yǎng)裝置存在抗生素抗性微生物。定義出于本發(fā)明的目的，“液體樣本”指其中可能含有各種微生物的含水混合物，包括食物樣本和臨床樣本 在內(nèi)，包括那些均化、稀釋和/或懸浮在含水混合物中的樣本在內(nèi)；“ β -內(nèi)酰胺抗生素”指任何在其分子結(jié)構(gòu)中包含β -內(nèi)酰胺核心的抗生素。β -內(nèi) 酰胺抗生素的非限制性例子包括青霉素、頭孢菌素、單菌胺環(huán)、卡巴培南和前述任一者的含 β-內(nèi)酰胺的衍生物；“粉末”指具有適用于本發(fā)明薄膜培養(yǎng)板裝置的平均直徑的一種或多種膠凝劑的 顆粒狀材料，優(yōu)選地直徑為約10-400微米，更優(yōu)選地直徑為約30-90微米；“冷水可溶性粉末”指當(dāng)與含水試驗(yàn)樣本進(jìn)行組合時(shí)在室溫水(例如約18°C至 24°C )中形成凝膠的粉末； “非抑制性乳化劑，，指適用于將水不溶性粘合劑分散在含水環(huán)境中，但不會實(shí)質(zhì)上 抑制想要培養(yǎng)的微生物的生長的乳化劑，優(yōu)選地為非離子型乳化劑；“復(fù)水的培養(yǎng)基”指用水或含水試驗(yàn)樣本對冷水可溶性粉末進(jìn)行復(fù)水所形成的溶 液和/或凝膠；“透氣的”指這樣的材料，它當(dāng)在它的邊緣實(shí)質(zhì)上暴露于空氣時(shí)，可在水平方向上 (即平行于它的上表面和下表面)充分地可透過空氣，以給上方的復(fù)水培養(yǎng)基提供充足的 空氣供應(yīng)，從而支持復(fù)水培養(yǎng)基中的好氧微生物的生長；“水基粘合劑組合物”指水不溶性粘合劑分散于含水環(huán)境中所得的粘合劑組合物； 和“選擇劑”指任何起到抑制生長于本發(fā)明培養(yǎng)基裝置上的微生物的生長和/或促進(jìn) 所述微生物的鑒定的作用的元素、化合物或組合物。詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”指在某些情況下，可提供某些有益效果的本發(fā)明實(shí)施例。然而，在相同的情況或其它情況下，也可優(yōu)選其它實(shí)施例。此外，對一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選實(shí) 施例的敘及并不暗示其它實(shí)施例是不可用的，且并無意于將其它實(shí)施例排除在本發(fā)明范圍 之外。當(dāng)術(shù)語“包含”及其變型出現(xiàn)在具體實(shí)施方式
和權(quán)利要求中時(shí)不具有限制的意思。本文所用的“一種(個(gè))”、“所述(該)”、“至少一種(個(gè))”以及“一種或多種(一 個(gè)或多個(gè))”可互換使用。因此，例如，懷疑含有“一種”微生物的樣本可被解釋為意指該液 體可包含“一種或多種”微生物。術(shù)語“和/或”意指所列要素的一個(gè)或全部，或所列要素的任何兩個(gè)或更多個(gè)的組合。本文以端點(diǎn)值敘及的數(shù)字范圍包括該范圍內(nèi)的所有數(shù)字(比如，1到5包含1、 1. 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容并非意圖描述本發(fā)明每一個(gè)公開的實(shí)施例或每種實(shí)施方 式。以下“具體實(shí)施方式
”更具體地舉例說明了示例性實(shí)施例。在本專利申請全文的幾處， 通過實(shí)例列表提供指導(dǎo)，可以不同組合使用這些實(shí)例。在每一種情況下，被引用的列表均僅 用作一個(gè)代表性的組，不應(yīng)被理解為是排他性列表。


本發(fā)明將結(jié)合下面所列的附圖進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，其中在幾個(gè)視圖中相同的結(jié)構(gòu) 由相同的數(shù)字指代。圖1是包括隔片的薄膜培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖2是包括網(wǎng)格圖案的自支撐基材的一個(gè)實(shí)施例的頂視圖。圖3是薄膜培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖4是包括隔片和捕獲元件的表面菌落計(jì)數(shù)薄膜培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)施例的頂部 透視圖(局部剖視)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及用于檢測樣本中的耐抗生素(例如耐β -內(nèi)酰胺抗生素)微生物的物 品和方法。本發(fā)明還提供用于區(qū)分樣本中的抗生素抗性微生物的物品和方法。具體地講， 本發(fā)明涉及抗生素抗性葡萄球菌的檢測。在一些實(shí)施例中，可將耐抗生素金黃色葡萄球菌 與耐抗生素凝固酶陰性葡萄球菌區(qū)分開來。與常規(guī)的測試抗生素抗性微生物存在與否的試 驗(yàn)法形成對照的是，本發(fā)明方法提供對樣本中活的抗生素抗性微生物的定量。本發(fā)明方法 還提供對樣本中不同種類和/或類群的抗生素抗性微生物的定量。常規(guī)的基于瓊脂的抗生素抗性微生物檢測試驗(yàn)法需要費(fèi)力地制備瓊脂平板，且通 常平板必須在相對較短的時(shí)間內(nèi)使用，以避免脫水和/或抗生素功效的損失。相比之下，本 發(fā)明的干的薄膜培養(yǎng)裝置現(xiàn)成可用于樣本，能保藏相對較長時(shí)間，且任選地可在使用過程 中加入抗生素，從而確保抗生素選擇的完全功效。常規(guī)的檢測抗生素抗性微生物的方法通常涉及純化微生物菌落并將菌落轉(zhuǎn)移到 含抗生素的瓊脂平板，以確定它們是否能在抗生素存在下生長。在這些方法中，首先對抗生 素抗性微生物的存在進(jìn)行定性檢測(即在劃線平板上的菌落或者在用于對存在與否進(jìn)行定性的肉湯培養(yǎng)中的生長)，隨后對檢測到的微生物的耐抗生素純菌落進(jìn)行表征(即通過 產(chǎn)生抗菌譜或者通過進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)或最小殺菌濃度(MBC)測定來表征)。常規(guī) 方法可包括區(qū)分性試驗(yàn)(例如凝集測定)，以使得能夠?qū)股乜剐晕⑸镞M(jìn)行推測性鑒 定。但是，常規(guī)的方法不能提供對原始樣本中的抗生素抗性微生物的直接、定量的計(jì)數(shù)。此 外，常規(guī)的方法不能提供對原始樣本中存在的微生物混合群體的區(qū)分性定量。本發(fā)明方法 可提供對原始樣本中或原始樣本的稀釋部分中的抗生素抗性微生物的計(jì)數(shù)。本發(fā)明方法還 可提供對樣本中的抗生素抗性微生物的混合群體的差分計(jì)數(shù)。
薄膜培養(yǎng)裝置 本發(fā)明的物品包括薄膜培養(yǎng)裝置，如美國專利No. 4，476，226、5，089，413和 5，232，838中公開的那些薄膜培養(yǎng)裝置，這些專利以引用方式全文并入本文。圖1示出根據(jù) 本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)施例。培養(yǎng)裝置110包括主體構(gòu)件，該主體構(gòu)件包括具有 上下表面(分別為11 和112b)的自支撐防水基材112?；?12可為相對堅(jiān)硬的膜(例 如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)，該膜不會吸水或者以別的方式被水影響?；?12可為透明 的或不透明的，這取決于是否想要通過該基材觀察細(xì)菌菌落。為促進(jìn)細(xì)菌菌落的計(jì)數(shù)，基材 212可在其上印刷有網(wǎng)格圖案(例如方格)，如圖2中所示。再參見圖1，基材112可在其上表面11 上涂覆有一層粘合劑114，該層粘合劑起 到將干燥的膠凝劑和/或營養(yǎng)物保持在均勻的單層中以便水化的作用。粘合劑114應(yīng)以優(yōu) 選地小于粉末化膠凝劑和/或營養(yǎng)物的顆粒直徑的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足 夠的粘合劑以將顆粒粘附到基材，但又不太多而造成顆粒完全嵌在粘合劑中。冷水可溶性 粉末的均勻單層116是所期望的，其表面積充分暴露以便水化。圖1中還示出在覆蓋片122 上的任選的粘合劑層114’和冷水可溶性粉末層116’。在一些實(shí)施例中，粘合劑114可包含水基粘合劑組合物。優(yōu)選地，水基粘合劑層 114當(dāng)被含水試驗(yàn)樣本濕潤時(shí)充分透明，以使得能夠觀察微生物菌落。水基粘合劑組合物可 摻入一種或多種親水劑，包括營養(yǎng)物，選擇劑、指示劑(例如酶底物、染料)或它們的組合。 本領(lǐng)域技術(shù)人員參考本說明書，根據(jù)所要生長和/或選擇性檢測(例如染色)或抑制的具 體微生物，將顯而易見地知道水基粘合劑組合物中使用的具體營養(yǎng)物和/或選擇劑。示例性的一類有用的親水性選擇劑包括這樣的染料，其被生長中的微生物代謝或 者以別的方式與生長中的微生物反應(yīng)，由此造成微生物菌落被染色或者發(fā)熒光，以便技術(shù) 人員或自動讀數(shù)器進(jìn)行檢測和/或定量。這種染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、 對甲苯基四唑紅、四唑紫、藜蘆基四唑藍(lán)、中性紅、酚紅、氯酚紅和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷 酸二鈉鹽。本發(fā)明的特別優(yōu)選的染料包括中性紅和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二鈉鹽。但 是應(yīng)認(rèn)識到，取決于所要鑒定的具體微生物，也可使用其他合適的染料。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，粉末116可包含營養(yǎng)物但無膠凝劑。如果想要顯現(xiàn) 和/或分離分立的細(xì)菌菌落，則膠凝劑可以是合乎需要的。在許多微生物學(xué)試驗(yàn)中，如用于 細(xì)菌鑒定或抗生素易感性的試驗(yàn)中，使用到肉湯培養(yǎng)基，可不需要粘稠的凝膠。在進(jìn)行這種 試驗(yàn)的裝置中，可省去膠凝劑?？刹捎镁彌_試劑如碳酸鈉來提供顯示中性pH的培養(yǎng)基，并可采用“Cab-0-Sil M-5”作為加工助劑，如美國專利No. 4，565，783中所描述，該專利以引用方式全文并入本 文。當(dāng)然，可根據(jù)所要生長的微生物的類型，對用于粉末116的具體的包覆混合物(例如營養(yǎng)物、指示劑和/或膠凝劑)加以調(diào)整。用于支持各種葡萄球菌的生長的非限制性示例性粉末混合物如下15克膠(M150瓜爾豆膠和黃原膠(Rhodia，Cranbury, NJ)的1 1混合物)5克蛋白胨2. 5克酵母膏1克右旋糖0. 06克碳酸鈉0. 12 克“Cab-0-Sil M-5”(熱解法二氧化硅，可從 Cabot Corporation 市售獲得)設(shè)想到，本發(fā)明的物品可包括區(qū)分性指示劑。本文所用的“區(qū)分性指示劑”指添加 到培養(yǎng)基中的、會指示某些微生物的存在而不會指示其他微生物的存在的試劑。區(qū)分性指 示劑的非限制性例子包括染料(例如著色劑、PH指示劑、氧化還原指示劑)、酶底物(例如 磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的發(fā)色底物或熒光底物)以及當(dāng)被某些微生物代 謝時(shí)會產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)(例如與菌落相關(guān)的PH變化)的特定營養(yǎng)物(例如可發(fā)酵碳水 化合物、氨基酸)。在一些實(shí)施例中，可將一種或多種區(qū)分性指示劑加在涂覆到基材上的水基組合物 中以加到薄膜培養(yǎng)裝置。在一些實(shí)施例中，可將一種或多種區(qū)分性指示劑加到液體樣本，然 后液體樣本加到培養(yǎng)裝置。在一些實(shí)施例中，可在培養(yǎng)裝置進(jìn)行水化后，將一種或多種區(qū)分 性指示劑加到培養(yǎng)裝置。涉及到使用加到水化后的培養(yǎng)裝置的區(qū)分性指示劑的方法的一 個(gè)例子，是其中將用于檢測耐熱核酸酶的物品加到溫育后的培養(yǎng)裝置的方法，如美國專利 No. 6，022，682中所述，該專利以引用方式全文并入本文。在本發(fā)明范圍內(nèi)還設(shè)想到，粉末116可任選包括為執(zhí)行某些用于微生物鑒定的生 化試驗(yàn)所必需的試劑。這種在特定類型的微生物存在下發(fā)生顏色變化的試劑(例如酶底 物)可包括在粉末116或粘合劑114中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，粉末116可包含這樣的涂層，其包括膠凝劑和營養(yǎng) 物的混合物、選擇劑和/或指示劑，且已被溶解或懸浮于溶液中涂覆并干燥到基材112上。 在這個(gè)實(shí)施例中，涂層實(shí)質(zhì)上是無水的(即涂層一旦被允許與周圍環(huán)境平衡，其水分含量 不超過大約脫水涂層的水分含量)。如圖1所示，主體構(gòu)件可包括施加到基材112的上表面的隔片118，該隔片118包 括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圓形孔120?？?20的壁提供預(yù)定大小和形 狀的槽以限定水化后的培養(yǎng)基。隔片118應(yīng)足夠厚以形成所需體積的槽，例如1、2或3毫 升。聚乙烯閉孔泡沫塑料是隔片118的優(yōu)選材料，但也可使用任何疏水性(非濕潤性)、對 微生物惰性且能夠承受滅菌的材料。在一些實(shí)施例中(未顯示)，隔片118可包括多個(gè)孔 20(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20個(gè)孔)，每個(gè)孔可接種上不同的液體樣本。隔片118可包括相對較厚的設(shè)計(jì)，如美國專利No. 5，681，712中所述的那些設(shè)計(jì)， 該專利以引用方式全文并入本文。較厚的帶孔隔片118的一個(gè)目的是對放置在隔片118的 孔120中的膜進(jìn)行定位和保護(hù)(例如微孔過濾膜)(未顯示)。較厚的隔片118的另一個(gè)目 的是減少或防止覆蓋片122與生長中的微生物菌落的接觸(即提供生長表面和覆蓋片122 之間的“頂部空間”，這還可使得對生長中的微生物菌落的通氣增加)。隔片118的厚度應(yīng)足以圍住當(dāng)對培養(yǎng)裝置接種時(shí)加到裝置的液體體積。取決于膜(當(dāng)使用時(shí))的厚度，隔片可為至少約0.5mm厚、約Imm厚、約1. 5mm厚和約2mm厚。圖3顯示薄膜培養(yǎng)裝置310的另一個(gè)實(shí)施例。這個(gè)實(shí)施例包括基材312、粘合劑 314、冷水可溶性粉末316和覆蓋片322，如圖1所示。與圖1的培養(yǎng)裝置110相反，圖3的 裝置310不包括用于在接種過程中限定樣本的隔片?？蓪⒛０謇缂又丨h(huán)(未顯示)臨時(shí) 施加到覆蓋片322的外面，該模板在閉合后用以在冷水可溶性粉末316形成凝膠的時(shí)候?qū)?樣本限定到特定區(qū)域。在一些實(shí)施例中，裝置310可接種上多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、12、15或20個(gè))不同的液體樣本，采用適當(dāng)?shù)母羝湍０鍋韺⒏鱾€(gè)樣本限定于培養(yǎng)裝置 310的粉末316的不同部分。圖4示出根據(jù)本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置的另一個(gè)實(shí)施例410。培養(yǎng)裝置410包括主 體構(gòu)件411，該主體構(gòu)件包括具有上下表面41 和412b的自支撐基材412?；?12在其 上表面41 上包覆有一層粘合劑414。包含一種或多種膠凝劑的冷水可溶性粉末416以薄 的、相對均勻的層粘附到粘合劑414。一旦接種上含水試驗(yàn)樣本(未顯示)，冷水可溶性粉 末層416立即水化而形成復(fù)水的培養(yǎng)基(未顯示)，該培養(yǎng)基進(jìn)而能夠培育存在于液體接種 物中或存在于膜(如試驗(yàn)樣本微生物過濾膜)(未顯示)的表面上的微生物。隔片418部 分地覆蓋基材412和覆蓋粉末416的表面，具有孔420。另外，薄膜培養(yǎng)裝置410任選包括 覆蓋片422，以覆蓋在加入含水試驗(yàn)樣本后形成的復(fù)水培養(yǎng)基。圖4還顯示捕獲元件似6和 在其上生長的微生物菌落428。在該圖示的實(shí)施例中，捕獲元件似6是微孔濾膜，已將液體 樣本過濾通過該膜，以在其上截留樣本中可能存在的任何細(xì)菌。雖然圖1-4所示的實(shí)施例具有連接到裝置的覆蓋片，但在本發(fā)明范圍內(nèi)還設(shè)想 到，含粉末的實(shí)施例可以在保藏和溫育過程中不進(jìn)行覆蓋，而是僅僅放在無菌環(huán)境中。還可以在本發(fā)明的裝置中使用透氣的膜層，如美國專利No. 5，232，838中所描述。 可將透氣的層“夾”在基材和冷水可溶性粉末之間，在該透氣的膜層的兩側(cè)上具有粘合劑涂 層(未顯示)?？股乇景l(fā)明包括利用抗生素來選擇抗生素抗性微生物的生長的物品和方法。對某些 從臨床感染分離到的微生物(例如金黃色葡萄球菌)日常篩選它們對某些抗生素(例如
內(nèi)酰胺抗生素)的耐藥性。用于篩選過程的抗生素的選擇可取決于操作者想要進(jìn)行抗 生素耐藥性測試的微生物。在一些實(shí)施例中，可在薄膜培養(yǎng)裝置的制造過程中將抗生素?fù)饺氲皆撗b置 中。在一些實(shí)施例中，可將抗生素?fù)饺氲奖∧づ囵B(yǎng)裝置的粘合劑涂層中，如美國專利 No. 5，089，413的實(shí)例1中所描述。除此之外，或者作為另外一種選擇，可在薄膜培養(yǎng)裝置的 制備過程中將抗生素?fù)饺氲酵扛苍诨纳系幕旌衔镏?如美國專利No. 7，087，401的實(shí)例 1和2中所描述)。美國專利No. 7，087，401 (其以引用方式全文并入本文)描述了將抗生 素?fù)饺氲胶旌衔镏校S后將混合物涂覆并干燥到基材上。在一些實(shí)施例中，可將抗生素 加到粉末(例如粉末化營養(yǎng)物和/或膠凝劑)的混合物，然后可用粉末涂覆方法將該混合 物涂覆到基材上的粘合劑層上。在一些實(shí)施例中，可在薄膜培養(yǎng)裝置的使用過程中將抗生素加到該裝置。例如，可 在將樣本接種到培養(yǎng)裝置中之前將抗生素加到樣本。或者，可在將樣本接種到培養(yǎng)裝置中 之前將含抗生素的溶液加到培養(yǎng)裝置。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，用含抗生素的溶液水化該裝置的膠凝劑，并通過例如將含有樣本的過濾器放在水化凝膠的表面上來將樣本接種到水化 凝膠上。在一些實(shí)施例中，在就要將樣本加到薄膜培養(yǎng)裝置之前將先抗生素的濃縮溶液加 到該裝置，然后在接種過程中將兩種溶液混合。設(shè)想到，可使用任何與薄膜培養(yǎng)裝置材料相容的抗生素來檢測和/或計(jì)數(shù)根據(jù)本 發(fā)明的抗生素抗性微生物。本文所用的“相容的”意指該抗生素與薄膜培養(yǎng)裝置中的其他 材料發(fā)生相互作用，不至于實(shí)質(zhì)上改變抗生素的功效或者會不利地影響培育和檢測耐該抗 生素的微生物的能力。優(yōu)選的一組用于檢測抗生素抗性微生物的抗生素是內(nèi)酰胺抗生 素組別，它們常常是用于治療臨床感染的主要類型的抗生素。在一些實(shí)施例中，可將內(nèi) 酰胺抗生素用于培養(yǎng)裝置中以檢測抗生素抗性微生物。在某些實(shí)施例中，內(nèi)酰胺抗生 素屬于內(nèi)酰胺抗生素中的頭孢菌素組別?？股氐念^孢菌素組別包括“第一代頭孢菌 素”(例如頭孢唑林)。抗生素的頭孢菌素組別還包括“第二代頭孢菌素”(例如頭孢西丁 和頭孢呋辛)。在一些實(shí)施例中，頭孢唑林可用于根據(jù)本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置中。可將頭孢唑林 以會在水化的培養(yǎng)基中產(chǎn)生約1 μ g/mL至約5 μ g/mL濃度的量加到上述的裝置。在一些實(shí) 施例中，頭孢唑林在接種的樣本中的最終濃度可為約1 μ g/mL、約3 μ g/mL、約4 μ g/mL或約 5 μ g/mL。在一些實(shí)施例中，頭孢呋辛可用于根據(jù)本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置中?？蓪㈩^孢呋辛 以會在水化的培養(yǎng)基中產(chǎn)生約3 μ g/mL至約5 μ g/mL濃度的量加到上述的裝置。在一些實(shí) 施例中，頭孢呋辛在接種的樣本中的最終濃度可為約3 μ g/mL、約4 μ g/mL或約5 μ g/mL。在一些實(shí)施例中，頭孢西丁可用于根據(jù)本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置中。可將頭孢西丁 以會在水化的培養(yǎng)基中產(chǎn)生約3 μ g/mL至約5 μ g/mL濃度的量加到上述的裝置。在一些實(shí) 施例中，頭孢西丁在接種的樣本中的最終濃度可為約3 μ g/mL、約4 μ g/mL或約5 μ g/mL。在本發(fā)明范圍內(nèi)設(shè)想到，物品或方法可包括使用兩種或更多種抗生素以檢測和/ 或計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物。捕獲元件本發(fā)明的培養(yǎng)裝置可與捕獲元件一起使用以檢測液體懸浮液中或者表面上的抗 生素抗性微生物。本文所用的“捕獲元件”指用于捕集和保持樣本中存在的微生物的物品。 優(yōu)選地，將捕獲元件的尺寸確定成能讓它們放入本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置中并在溫育期間保 持在薄膜培養(yǎng)裝置中，保持的時(shí)間足以讓靶標(biāo)微生物進(jìn)行至少一次細(xì)胞分裂。將捕獲元件 放入培養(yǎng)裝置中可使捕獲元件與培養(yǎng)裝置中的膠凝劑和/或營養(yǎng)培養(yǎng)基(如果存在的話)， 從而讓微生物生長和/或增殖。在一些實(shí)施例中，在將捕獲元件放入培養(yǎng)裝置中之前將培 養(yǎng)裝置水化(例如用無菌液體或未知的液體樣本接種)。在一些實(shí)施例中，在將捕獲元件放 入培養(yǎng)裝置中之后將培養(yǎng)裝置水化?？蓪Σ都b置加以選擇非，確定它們與某些類型的樣本的適合性。例如，可將微 孔過濾器用作捕獲元件以截留液體樣本中存在的微生物?？墒挂后w樣本通過過濾器，從而 微生物可被截留在其上。微生物可通過例如物理俘獲或者特異性(例如抗原-抗體或受 體-配體相互作用)或非特異性(疏水吸附)化學(xué)相互作用進(jìn)行截留。參考圖4所示的實(shí)施例，試驗(yàn)樣本可包含液體接種物和/或捕獲元件4 如微孔 過濾器(例如過濾膜)或擦拭裝置。捕獲元件4 可從各種膜(membrane)和薄膜(film)構(gòu)造而成，且可用于捕集微生物。在一些實(shí)施例中，捕獲元件似6可提供表面，微生物菌落 可在該表面上通過本發(fā)明的方法和裝置進(jìn)行培育、檢測和/或計(jì)數(shù)。特別合適的是已通常 用于從大的流體樣本分離小的微生物群體(如細(xì)菌)的已知微孔過濾器。已知這種過濾 器被放在瓊脂培養(yǎng)基的表面上并進(jìn)行溫育，以便對被過濾的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)和評估。合適 的過濾器包括可獲自Millipore公司(Marlborough，ΜΑ)的HAWG系列過濾器，例如HAWG 04750型的HA過濾器，和可獲自Gelman公司(Ann Arbor, MI)的Metricel型的膜，例如 GN-6 Metricel膜。其他合適的膜包括通過在各種由乙烯醇的均聚物或共聚物構(gòu)成的聚合 物上提供涂層而制備的親水性膜，如PCT國際公開文本W(wǎng)O 92/07899中所描述。由該國際 公開文本的實(shí)例5中所述的方法制備的乙烯醇涂層微孔聚丙烯，是本發(fā)明中優(yōu)選的微生物 過濾器ο上述的微生物過濾器的薄膜通常相對較薄，厚度約為0.01_2mm，優(yōu)選 0.05-1. 0mm，且可以任何所需的二維形狀提供，例如以矩形、盤形(包括部分的盤形)等提{共。取決于膜中的孔隙的大小，這種過濾器以不同的效率分離微生物。細(xì)菌容易分離， 而酵母和霉菌也會被這種過濾器分離。過濾是用合適大小的漏斗和隔膜(disc)按常規(guī)方 法進(jìn)行。隔膜優(yōu)選用鑷子在無菌條件下操作。隔膜可由使用者從可市售獲得的材料制作， 或者在無菌包裝中作為單獨(dú)的實(shí)體或作為本發(fā)明的套件的部件提供。擦拭裝置可作為捕獲元件用于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置。本文所用的“擦拭裝置”是被 構(gòu)造成用于接觸表面以獲取分布在該表面上的微生物樣本的物品。擦拭裝置可包括多孔無 紡材料。擦拭材料的非限制性例子包括紙(例如濾紙、纖維素膜過濾器)、合成的無紡材料 (例如尼龍或聚酯無紡材料)、聚合物膜或陶瓷膜(例如聚碳酸酯膜、氧化鋯膜)、微結(jié)構(gòu)化 薄膜(例如含微通道的薄膜，如美國專利No. 7，223，364中描述的那些，該專利以引用方式 全文并入本文)。在一些實(shí)施例中，含微通道的薄膜具有讓流體(和溶質(zhì)或小顆粒)從薄膜 的一個(gè)主表面通向另一個(gè)主表面的通孔。擦拭裝置可包括用于改善濕潤性的化學(xué)物質(zhì)(例 如表面活性劑)或者試劑(例如區(qū)分性著色劑)。擦拭裝置所包含的化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量一般 而言不會實(shí)質(zhì)上抑制抗生素抗性微生物在本文所述的接種和溫育條件下的生長。在一些實(shí) 施例中，捕獲元件實(shí)質(zhì)上是透明的，或者當(dāng)濕潤時(shí)變得實(shí)質(zhì)上是透明度，從而使得區(qū)分性反 應(yīng)(如溶血)可以透過捕獲元件顯現(xiàn)出來。 合適的捕獲元件包括一個(gè)顆粒或多個(gè)顆粒。捕獲元件包括用于將捕獲元件結(jié)合到 微生物的手段。顆粒的非限制性例子包括微球體、微珠等。這種顆?？蔀闃渲w粒，例如瓊 脂糖、乳膠、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、纖維素、多糖或它們的組合，或者為無機(jī)顆粒，例 如二氧化硅、氧化鋁或它們的組合。這種顆?？梢允谴判缘摹㈨槾判缘?、超順磁性或非磁性 的。這種顆?？蔀槟z體大小，例如約IOOnm至約10微米(μ m)。這種顆粒的非限制性例子 包括以商品名 DYNABEADS(Invitrogen，Inc.，Carlsbad, CA)和 BIO-ADEMBEADS(Ademtech， Pessac，法國)出售的超順磁性聚合物顆粒?？蓪㈩w粒捕獲元件摻入到其他結(jié)構(gòu)如微孔膜 中。 有多種手段用于將捕獲元件(例如顆粒)結(jié)合到微生物。在一些實(shí)施例中，用于 將捕獲元件結(jié)合到微生物的手段可包括表面分子或者能促進(jìn)非特異性吸附的性質(zhì)。例如， 捕獲元件的至少一部分在其表面上可具有這樣的分子，它們在適當(dāng)?shù)臈l件(例如高PH或低PH)下變得帶正電荷或帶負(fù)電荷，且非特異性地吸附到與微生物表面締合的帶互補(bǔ)電荷的 分子。除此之外，或者作為另外一種選擇，捕獲元件(例如聚苯乙烯顆粒)的至少一部分 可具有非特異性吸附到與微生物表面締合的疏水分子的疏水表面。在一些實(shí)施例中，用于 將捕獲元件結(jié)合到微生物的手段可包括能通過受體-配體相互作用特異性結(jié)合微生物的 分子。這種特異性的受體-配體相互作用是本領(lǐng)域公知的，包括例如抗體和它們的相應(yīng)抗 原之間的相互作用、凝集素和它們的相應(yīng)碳水化合物結(jié)合伴侶之間的相互作用、噬菌體蛋 白和它們的相應(yīng)噬菌體受體之間的相互作用，等等。應(yīng)理解，用于將顆粒結(jié)合到微生物的手 段也可與薄膜或非織造物(例如過濾器)以及顆粒狀捕獲元件捕獲元件聯(lián)用。樣本可在可衍自任何來源的試驗(yàn)樣本中分析所關(guān)注的耐抗生素種類，所述來源例如生 理流體，如血液、唾液、眼晶狀體液、滑液、腦脊髓液、膿液、汗液、滲出液、尿液、黏液、糞便、 乳液等。此外，試驗(yàn)樣本可衍自身體部位，例如傷口、皮膚、鼻孔、頭皮、指甲等。特別值得關(guān)注的樣本包括含黏液的樣本，如鼻樣本(來自例如前鼻孔、鼻咽腔、鼻 腔、鼻前庭等)以及來自外耳、中耳、口、直腸、陰道或其他類似組織的樣本。具體的粘膜組 織的例子包括口腔、齒齦、鼻、眼、氣管、支氣管、胃腸、直腸、尿道、輸尿管、陰道、子宮頸和子 宮的粘膜。除了生理流體外，其他試驗(yàn)樣品可包括其他液體以及溶于液體介質(zhì)的固體。所關(guān) 注的樣本可包括工藝流、水、土壤、莊稼或其他植物、空氣、表面(例如受污染的表面、地面、 墻壁、儀器、被褥)等。樣本還可包括經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。各種用于檢測表面上的微生物如金黃色葡萄球菌的患者采樣技術(shù)是已知的。這些 取樣技術(shù)也適用于本發(fā)明方法。例如，常常擦拭患者的鼻孔以獲取樣本。特別優(yōu)選的采樣 技術(shù)包括用無菌拭子或采樣裝置拭抹受試者(例如患者)的前鼻孔。例如，一個(gè)拭子用于 對一名受試者取樣，即一個(gè)拭子用于兩個(gè)鼻孔。例如可這樣進(jìn)行采樣將干燥的或用適當(dāng)?shù)?溶液預(yù)濕潤的拭子插入到受試者鼻孔的前末端，并將拭子沿著鼻孔的粘膜表面完整地旋轉(zhuǎn) 一圈或多圈。有多種拭子或其他樣本收集裝置可市售獲得，例如以商品名PURE-WRAPS獲自 Puritan Medical Products Co. LLC (Guilford, ME)，或者以商品名 ESWAB 獲自 Copan Diagnostics, Inc. (Corona, CA)，或者以商品名 FL0CKEDSWAB 獲自 microRheologics， S. r. 1.(意大利布雷西亞)。如果需要也可使用例如美國專利No. 5，879，635 (Nason)中公 開的樣品采集裝置。拭子可為包括棉花、人造絲、藻酸鈣、滌綸、聚酯、尼龍、聚氨酯等在內(nèi)的 各種材料。然后可將樣品采集裝置(例如拭子)直接培養(yǎng)、直接分析或用適當(dāng)?shù)娜芤禾崛?(例如，通過洗滌，經(jīng)渦旋洗脫)。這些提取(即洗脫)溶液通常包括水并可任選包括緩沖 液和至少一種表面活性劑。洗脫緩沖液的例子包括例如磷酸緩沖鹽水(PBS)，其可例如與 TffEEN 20或PLUR0NIC L64組合使用。試驗(yàn)樣本(例如液體)可先進(jìn)行處理再作進(jìn)一步的 分析。這可包括濃縮、沉淀、過濾、離心、透析、稀釋、天然成分的滅活、試劑的加入、化學(xué)處理寸。其他的樣本收集裝置(也稱“捕獲元件”)可用來從表面或者從液體流收集樣本。在一些實(shí)施例中，捕獲元件可用于擦拭表面以從表面收集微生物的代表性樣本。隨后，可將 捕獲元件轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)裝置中，并在微生物的溫育和生長過程中保留在該裝置中。在一些實(shí) 施例中，捕獲元件可用于將微生物過濾出液體樣本。在過濾步驟后，可將捕獲元件轉(zhuǎn)移到培 養(yǎng)裝置中，并在微生物的溫育和生長過程中保留在該裝置中。檢測和區(qū)分耐甲氧西林微牛物的方法薄膜裝置可用于檢測和區(qū)分耐抗生素(例如耐甲氧西林)微生物的方法中。裝置 可進(jìn)行接種，干燥的營養(yǎng)物和/或膠凝劑可通過幾種不同的程序進(jìn)行水化。在一些實(shí)施例 中，可將液體樣本接種到薄膜裝置中，從而基本上形成“傾注板”。在一些實(shí)施例中，可將不 含目標(biāo)菌群和可為無菌的含水液體(例如水、緩沖液、營養(yǎng)培養(yǎng)基)加到薄膜裝置，并讓凝 膠固化。凝膠固化后，可打開覆蓋片，并可使凝膠接觸表面(例如墻壁、地面、儀器、皮膚、粘 膜)以使裝置接種。隨后可將覆蓋片關(guān)閉以進(jìn)行溫育。在一些實(shí)施例中，如上所述將含水 溶液加到裝置，隨后可將捕集裝置(例如膜過濾器或擦拭物)放到薄膜裝置中，從而使裝置 接種?；蛘?，可用捕獲元件所具有的水分溶解薄膜中的營養(yǎng)物和膠凝劑。在一些實(shí)施例中， 可在捕獲元件已放在裝置中之后，將含水溶液加到裝置以溶解營養(yǎng)物和膠凝劑。在一些實(shí) 施例中，可將樣本溶液分布(例如沉積、涂布或劃線)到裝置中，然后再加入含水溶液以溶 解營養(yǎng)物和膠凝劑?？蓪⒓又氐陌寤蛘邔ｉT設(shè)計(jì)的涂布器放在覆蓋片的頂部上，以完全涂 布樣本。薄膜裝置還可用于計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物的方法中。在接種后，接著將培養(yǎng)裝置 溫育預(yù)定的一段時(shí)間?？赏高^覆蓋片計(jì)數(shù)在培養(yǎng)基或捕獲元件中或者在培養(yǎng)基或捕獲元件 上生長的細(xì)菌菌落?？蓪⒅辽僖环N親水劑如營養(yǎng)物、指示劑或選擇劑(例如抗生素)在接種時(shí)隨樣本 一起加到培養(yǎng)裝置。可將該至少一種親水劑(優(yōu)選為無菌的)溶解、懸浮或稀釋到液體樣本 中，然后再將樣本加到培養(yǎng)裝置。在一些實(shí)施例中，可將該至少一種親水劑緊接在液體樣本 之前或之后單獨(dú)加到培養(yǎng)裝置(例如作為粉末、干燥薄膜、基材上的涂層或者溶液加入)， 并任選可在關(guān)閉和/或溫育培養(yǎng)裝置之前在培養(yǎng)裝置中與樣本一起混合(例如用移液管頭 混合)?？赏ㄟ^在培養(yǎng)裝置已接種后使液體、半固體溶液或脫水物品(例如經(jīng)涂覆的干燥 的基材)與培養(yǎng)裝置中的水化營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸，來將親水劑(例如營養(yǎng)物、抗生素和指示 劑)加到接種的/水化的培養(yǎng)裝置。該脫水物品可為部分脫水的物品。基材可包括塑料薄 膜、微孔膜、纖維素材料或無紡材料。區(qū)分性指示劑(如果存在的話)可用于區(qū)分不同類群或種類的微生物并提供差分 計(jì)數(shù)。例如，酶底物可用于區(qū)分含葡萄球菌的菌落和含芽孢桿菌屬種類或其他微生物的菌 落。美國專利No. 5，837，482(其以引用方式全文并入本文)描述了使用“吲哚基_吡喃葡 萄糖苷”酶底物以檢測非葡萄球菌微生物和Baird-Parker區(qū)分性試劑(例如蛋黃_亞碲酸 鹽懸浮液)以檢測葡萄球菌微生物的指示劑系統(tǒng)。美國專利No. 5，635，367(其以引用方式 全文并入本文)描述了使用“吲哚基-吡喃葡萄糖苷”酶底物以檢測非葡萄球菌微生物和 “吲哚基-磷酸鹽”酶底物以檢測葡萄球菌微生物的指示劑系統(tǒng)。可從培養(yǎng)裝置挑取菌落以進(jìn)行區(qū)分性試驗(yàn)?？蓪⒏鱾€(gè)菌落分別進(jìn)行試驗(yàn)，或者可 將它們進(jìn)行集合或“匯集”以進(jìn)行區(qū)分性試驗(yàn)。可例如通過從裝置挑取兩個(gè)或多個(gè)菌落來“匯集”菌落，將它們混合在一起，然后對來自該兩個(gè)或多個(gè)菌落的微生物同時(shí)進(jìn)行區(qū)分性 試驗(yàn)。區(qū)分性試驗(yàn)可包括例如染色試驗(yàn)(例如革蘭氏染色、孢子染色、免疫化學(xué)染色)、酶 促試驗(yàn)(例如DNA酶試驗(yàn)、TNA酶試驗(yàn))、表面受體識別試驗(yàn)(例如凝固酶試驗(yàn)或聚集因子 試驗(yàn))、遺傳試驗(yàn)(例如擴(kuò)增試驗(yàn)，如PCR和rtPCR ；核酸測序；或雜交測定(例如FISH測 定))、免疫測定試驗(yàn)(例如ELISA、免疫擴(kuò)散、免疫層析)或生化試驗(yàn)(例如凝固酶試驗(yàn)、過 氧化氫酶試驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵(例如甘露糖醇發(fā)酵)、脂質(zhì)分析)。本發(fā)明的套件本發(fā)明提供的套件包括兩個(gè)或多個(gè)部件。一個(gè)部件包括本文所述的薄膜培養(yǎng)板裝 置。每個(gè)套件的第二個(gè)部件可選自如下附件膜過濾器、移液管、涂布器、手套、樣本獲取裝 置、捕獲元件、樣品懸浮介質(zhì)、試劑和前述附件中的任何兩者或多者。膜過濾器的形狀和大小應(yīng)適合于裝配到套件的培養(yǎng)板裝置的隔片的孔中。不同種 類的過濾器可與套件一起提供，或者多個(gè)套件可包含各種過濾器。過濾器是任選的，且優(yōu)選 地在無菌條件中提供，如已通過Y輻射、環(huán)氧乙烷或其他滅菌方式滅菌的涂聚乙烯的紙包 裝?；蛘?，過濾器可為將由使用者進(jìn)行滅菌的非無菌組件。合適的移液管和涂布器可由例如塑料或玻璃制作。移液管和涂布器可在預(yù)滅菌條 件中提供，或者可在非無菌條件中提供。移液管和涂布器可在單次使用后丟棄，或者可再滅 菌以供多次使用。本文所用的“移液管”包括具有至少一個(gè)對應(yīng)于已知體積的刻度標(biāo)志和 具有移液管頭的容量移液管，其可用于容量移液裝置。套件可包含親水劑的包裝。親水劑 優(yōu)選地包含在無菌包裝中，例如箔包裝，如制藥行業(yè)常規(guī)使用的那些包裝。這種包裝的一個(gè) 例子是用于 NITR0-BID 軟膏劑(Marlon Laboratories, Inc.，Kansas City, Mo.)。套件中所包括的營養(yǎng)物和/或選擇劑可如上所述摻入到粘合劑和/或粉末組合物 中。套件中有用和必需的親水劑的選擇取決于所要評估的微生物。選擇套件組分的另一個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)將是親水劑的短期和長期化學(xué)相容性?，F(xiàn)將參考以下非限制性實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。所有的份數(shù)和百分?jǐn)?shù)均以 重量份表示，除非另有指明。除非另有說明，否則所有的試劑均獲自Sigma Chemical公司 (St. Louis) ο^M實(shí)例1.在含有頭孢西丁或苯嗶西林的薄膜培養(yǎng)裝置中檢測和計(jì)數(shù)葡萄球菌試劑和培養(yǎng)基的制備PETRIFILM好氧微生物計(jì)數(shù)板獲自3M公司(St. Paul, MN)。DIFCO脫水胰酶大豆 瓊月旨(TSA)獲自 BD Diagnostics (Sparks，MD)。除纖維蛋白羊血獲自 RemelJnc. (Lenexa, KS)。磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH 7. 5)從10X濃縮液(OmniPur 6505緩沖鹽水；EMD Chemicals, Inc. ；Gibbstown,NJ)制備，并進(jìn)行高壓滅菌?？股貎淙芤涸谌ルx子水中制 備，并通過使其經(jīng)過0. 22 μ m過濾器進(jìn)行除菌。制備含有頭孢西丁(SBA-Cf)的羊血瓊脂，以將抗生素抗性微生物在瓊脂培養(yǎng)基 上的回收率與抗生素抗性微生物在薄膜培養(yǎng)裝置中的回收率進(jìn)行比較。將20克的脫水TSA 與475mL的去離子水混合并進(jìn)行高壓滅菌。將熔融的瓊脂在50°C下回火(temper)。將25 毫升的除纖維蛋白羊血加到瓊脂(以產(chǎn)生5%羊血終濃度)并漩渦攪拌以混合。將頭孢西丁儲備溶液(0. 5mL,4mg/mL)加到瓊脂并漩渦攪拌以混合。將瓊脂倒入無菌培養(yǎng)皿中，讓瓊 脂在室溫下固化。將板倒置并在4°C下保藏。制備PBS稀釋溶液以稀釋細(xì)菌培養(yǎng)物。這些稀釋溶液分別含有3 μ g/mL、4 μ g/mL 和5 μ g/mL的頭孢西丁，或者4 μ g/mL,5 μ g/mL和6 μ g/mL的苯唑西林。稀釋溶液在制備 后八小時(shí)內(nèi)使用。不含抗生素的PBS用作PETRIFILM和SBA對照板的稀釋液。細(xì)菌懸浮液的制備試驗(yàn)了八個(gè)葡萄球菌微生物菌株。甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌(96號菌株)、耐 甲氧西林表皮葡萄球菌G71號和472號菌株)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(560號和907 號菌株)獲自人臨床分離物。甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(ATCC25923和ATCC27664 菌株)和甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌ATCC122^獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所(Manassas， VA)。接種、溫育和菌落計(jì)數(shù)將各個(gè)細(xì)菌菌株接種到胰酶大豆肉湯并在37°C下溫育過夜。將細(xì)菌懸浮液在上述 的每個(gè)PBS稀釋液中稀釋。取1毫升樣本按照廠商說明書接種到PETRIFILM板上。通過用 無菌涂布器將0. 1毫升的細(xì)菌懸浮液涂布在含有頭孢西丁的血液瓊脂板的表面上，對板進(jìn) 行接種。所有的板都在35°C下溫育，并在對士2小時(shí)和48士4小時(shí)計(jì)數(shù)每個(gè)板上的菌落。 菌落計(jì)數(shù)(CFU)在表1和2中顯示。數(shù)據(jù)表明，在溫育后M小時(shí)和48小時(shí)，在兩種類型的 平板培養(yǎng)基(瓊脂和PETRIFILM板)中都可檢測到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄 球菌。數(shù)據(jù)顯示，第560號菌株對頭孢西丁敏感卻耐苯唑西林。表1.在M小時(shí)時(shí)在含有頭孢西丁或苯唑西林的PETRIFILM板和血液瓊脂板上觀 察到的菌落形成單位(CFU)。表中所示的稀釋系數(shù)是最終稀釋系數(shù)，其計(jì)入了接種到各個(gè) 板類型中的樣本的體積的差異。PF-C = PETRIFILM板對照，PF-Cf(n)=具有指定微克數(shù)/ mL的頭孢西丁的Petrifilm板，PF-Ox (n)=具有指定微克數(shù)/mL的苯唑西林的Petrif ilm， SBA-Cf =含有頭孢西丁的羊血瓊脂，SBA-C =羊血瓊脂對照
權(quán)利要求
1.一種用于檢測或計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物的物品，所述物品包括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素，前提條件 是β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南；營養(yǎng)培養(yǎng)基；用于指示微生物的存在的指示劑系統(tǒng)；和 包含膠凝劑的干燥、可再水化的薄膜培養(yǎng)裝置。
2.一種用于對抗生素抗性微生物進(jìn)行差分計(jì)數(shù)的物品，所述物品包括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素，前提條件 是β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南； 營養(yǎng)培養(yǎng)基；用于指示微生物的存在的第一指示劑系統(tǒng)； 用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)；和 包含膠凝劑的干燥、可再水化的薄膜培養(yǎng)裝置。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的物品，其中所述抗生素包含甲氧西林。
4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的物品，其中所述抗生素包含苯唑西林。
5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的物品，其中所述β-內(nèi)酰胺抗生素包含頭孢菌素抗生素。
6.權(quán)利要求5的物品，其中所述頭孢菌素抗生素包含頭孢西丁。
7.權(quán)利要求6的物品，其中頭孢西丁在所述培養(yǎng)裝置的再水化營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為 約 0. 5 μ g/mL 至約 4 μ g/mL0
8.權(quán)利要求7的物品，其中頭孢西丁在所述培養(yǎng)裝置的再水化營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為 約 1 μ g/mL 至約 4 μ g/mL ο
9.權(quán)利要求8的物品，其中頭孢西丁在所述培養(yǎng)裝置的再水化營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為 約 2 μ g/mL 至約 4 μ g/mL ο
10.權(quán)利要求9的物品，其中頭孢西丁在所述培養(yǎng)裝置的再水化營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度 為約 3 μ g/mL 至約 4 μ g/mL ο
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的物品，其還包含亞碲酸鉀。
12.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的物品，其還包含氯化鋰。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的物品，其還包含第二抗生素。
14.權(quán)利要求13的物品，其中所述第二抗生素不是內(nèi)酰胺抗生素。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的物品，其中所述薄膜培養(yǎng)裝置包括表面菌落計(jì)數(shù)薄膜培 養(yǎng)裝置。
16.一種檢測抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養(yǎng)裝置，所述干燥的薄 膜培養(yǎng)裝置包含營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內(nèi)酰胺抗 生素、用于指示微生物的存在的指示劑系統(tǒng)和膠凝劑，前提條件是所述內(nèi)酰胺抗生素 不是氨曲南；用所述液體樣本接種所述培養(yǎng)裝置； 將所述接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間；和 分析所述培養(yǎng)裝置存在抗生素抗性微生物。
17.一種檢測和區(qū)分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養(yǎng)裝置，所述干燥的薄 膜培養(yǎng)裝置包含營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內(nèi)酰胺抗 生素、用于指示微生物的存在的第一指示劑系統(tǒng)、用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二 指示劑系統(tǒng)和膠凝劑，前提條件是所述內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南； 用所述液體樣本接種所述培養(yǎng)裝置； 將所述接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間；和 分析所述培養(yǎng)裝置存在抗生素抗性微生物。
18.一種檢測和區(qū)分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養(yǎng)裝置，所述干燥的薄 膜培養(yǎng)裝置包含膠凝劑和以下成分中的任一種或多種營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗 生素抗性微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素、或者用于指示微生物的存在的指示劑系統(tǒng)， 前提條件是所述β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南；向所述培養(yǎng)裝置加入如果不是已經(jīng)存在的營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性 微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素和用于指示微生物的存在的指示劑系統(tǒng)，前提條件是所 述β-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南；用所述液體樣本接種所述培養(yǎng)裝置； 將所述接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間；和 分析所述培養(yǎng)裝置存在抗生素抗性微生物。
19.一種檢測和區(qū)分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養(yǎng)裝置，所述干燥的薄 膜培養(yǎng)裝置包含膠凝劑和以下成分中的任一種或多種營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗 生素抗性微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素、用于指示微生物的存在的第一指示劑系統(tǒng)、 或者用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)，前提條件是所述內(nèi)酰胺抗生 素不是氨曲南；向所述培養(yǎng)裝置加入如果不是已經(jīng)存在的營養(yǎng)培養(yǎng)基、有效量的用于選擇抗生素抗性 微生物的生長的內(nèi)酰胺抗生素、用于指示微生物的存在的第一指示劑系統(tǒng)和用于指示 金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統(tǒng)，前提條件是所述-內(nèi)酰胺抗生素不是氨曲南； 用所述液體樣本接種所述培養(yǎng)裝置； 將所述接種的培養(yǎng)裝置溫育一段時(shí)間；和 分析所述培養(yǎng)裝置存在抗生素抗性微生物。
20.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述液體樣本進(jìn)行稀釋且所述培養(yǎng)裝置接 種上所述稀釋的液體樣本。
21.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的方法，其還包括以下步驟i)稀釋所述液體樣本以產(chǎn)生 兩個(gè)或更多個(gè)不同濃度的液體樣本，和ii)將兩個(gè)或更多個(gè)不同濃度的樣本接種到分別的培養(yǎng)裝置中。
22.權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的方法，其還包括以下步驟i)提供捕獲元件，和ii)使 所述膠凝劑與所述捕獲元件接觸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中在將所述捕獲元件與所述膠凝劑接觸之前使所述膠凝劑水化。
24.權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述β-內(nèi)酰胺抗生素包含頭孢西丁。
25.權(quán)利要求16-24中任一項(xiàng)的方法，其中分析培養(yǎng)基存在抗生素抗性微生物包括對 菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
26.權(quán)利要求16-25中任一項(xiàng)的方法，其還包括對來自一個(gè)或多個(gè)菌落的微生物進(jìn)行 差分試驗(yàn)的步驟。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中從所述培養(yǎng)裝置移取來自一個(gè)或多個(gè)菌落的微生物以進(jìn) 行差分試驗(yàn)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中從所述培養(yǎng)裝置移取來自兩個(gè)或更多個(gè)菌落的微生物并 混合一起以進(jìn)行差分試驗(yàn)。
29.權(quán)利要求沈-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述差分試驗(yàn)包括生化試驗(yàn)。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述生化試驗(yàn)包括對過氧化氫酶活性的試驗(yàn)。
31.權(quán)利要求四的方法，其中所述生化試驗(yàn)包括對凝固酶活性的試驗(yàn)。
32.權(quán)利要求四的方法，其中所述生化試驗(yàn)包括革蘭氏染色。
33.權(quán)利要求四的方法，其中所述差分試驗(yàn)包括免疫測定。
34.權(quán)利要求四的方法，其中所述菌落差分試驗(yàn)包括遺傳試驗(yàn)。
35.權(quán)利要求16-34中任一項(xiàng)的方法，其中在所述培養(yǎng)裝置接種之后使親水劑與所述 培養(yǎng)裝置中的水化營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述親水劑包含基材。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述親水劑涂覆在基材上。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述基材包括塑料膜、微孔膜、纖維素材料或無紡材料。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測抗生素抗性微生物的薄膜培養(yǎng)裝置。該裝置可包括用于區(qū)分葡萄球菌微生物與非葡萄球菌微生物的指示劑。使用方法包括檢測或計(jì)數(shù)抗生素抗性微生物。所述方法還包括獲得葡萄球菌微生物與非葡萄球菌微生物的差分計(jì)數(shù)。
文檔編號C12N1/00GK102131915SQ200980132608
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月21日
發(fā)明者帕特里克·A·馬赫, 米歇爾·L·羅索爾 申請人:3M創(chuàng)新有限公司