抗npt ii蛋白的單克隆抗體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了特異性識別轉(zhuǎn)基因植物中抗生素類安全篩選標記NPT II(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，neomycin phosphotransferase gene II)單克隆抗體及其制備方法和用途，目的是為免疫學方法檢測天然轉(zhuǎn)基因物種(玉米、水稻、棉花等)中是否存在篩選標記NPT II蛋白提供關鍵試劑材料。制備該抗體的抗原為由經(jīng)化學合成的特征性多肽片段經(jīng)半胱氨酸與KLH載體蛋白偶聯(lián)后免疫小鼠，最終獲得的抗體均屬于IgG1亞型，編碼其可變區(qū)的序列經(jīng)基因克隆的方式獲得。對天然轉(zhuǎn)基因水稻材料的免疫印跡(Western Blotting)檢測和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，該抗體具有很好的特異性，可以用于對轉(zhuǎn)基因材料的定性與定量檢測。
【專利說明】
抗NPT I I蛋白的單克隆抗體及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及識別轉(zhuǎn)基因植物的抗生素類篩選標記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (neomycin phosphotransferase gene II)的單克隆抗體制備方法以及采用兩種單克隆抗 體組裝為ELISA檢測試劑盒的方法，以及該試劑盒在水稻和棉花等轉(zhuǎn)基因植物檢測中的用 途，屬于生物檢測領域。
【背景技術】
[0002] 隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不斷涌現(xiàn)，隨之而來的問題就是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評價及測 定。在轉(zhuǎn)基因品種的培養(yǎng)和后期鑒定中，離不開針對轉(zhuǎn)化的篩選標記和報告基因，最常用的 篩選標記包括抗生素抗性類篩選標記基因和抗除草劑基因，這類抗性篩選標記基因有可能 會通過基因漂移造成基因污染，對環(huán)境產(chǎn)生不利影響（魏偉，馬克平.如何面對基因流和基 因污染[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2002,4(4): 10-15)。另外，含有該種標記基因的轉(zhuǎn)基因食 物有可能不會被人類的腸道系統(tǒng)吸收利用，還很有可能產(chǎn)生毒副作用。所以，為降低生物安 全風險，減少對環(huán)境和生物的潛在危害，目前對轉(zhuǎn)基因植物的篩選標記主要包括GUS報告 基因的生物化學染色方法，NPT II基因的G418抗生素抗性篩選以及CP4EPSPS -類抗除草 劑基因的抗性篩選方法，其中NPT II基因被用在眾多轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化用載體的構建中，該 基因的蛋白產(chǎn)物因此也會出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物的植株、葉片及籽粒中。為降低此類抗生素抗 性蛋白對環(huán)境和生態(tài)的不利影響，轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)逐漸向非抗生素抗性篩選過渡，比如以 PMI基因編碼的磷酸甘露糖異構酶（phosphomannose isomerase，PMI)替代抗生素抗性，最 終實現(xiàn)更安全的無標簽（Marker-free)篩選鑒定體系。
[0003] 對于包含NPT II蛋白轉(zhuǎn)基因植物的鑒定，通常都采用PCR的方法對植物進行檢 測，(Varsha et. al. , Development of a multiplex Polymerase Chain Reaction method for specific detection of Genetically Modified Cotton Events MON 531and MON 15985. International Journal of Basic and Applied Sciences，2012，Vol :45-52)，申 請?zhí)枮镃N200410023293的發(fā)明專利"含NPT-II標記基因轉(zhuǎn)基因水稻的快速檢測"方法公 開了一種利用不同G418抗生素濃度進行轉(zhuǎn)基因植物篩選的方法，該方法對于生長的植物 是有效的，但對于經(jīng)加工的糧食制品，因為加工過程的影響，很難檢測到完整的核酸分子， 因此，檢測轉(zhuǎn)基因目的蛋白也是一種重要的方法。
[0004] 制備特定蛋白的夾心檢測用抗體通常的方法為利用重組蛋白或選擇在空間和 序列組成上具有免疫原性和親水性的抗原肽經(jīng)與載體蛋白偶聯(lián)后進行動物免疫。重組 蛋白的方法簡單易行，但因優(yōu)勢抗原的存在，篩選過程較為繁瑣，且難以篩選到配對良好 的抗體，而以多肽作為抗原時，經(jīng)結(jié)構和序列分析后選擇恰當區(qū)域的多肽分別合成與免 疫則可提高實驗的成功率，并可能制得高靈敏度的檢測抗體。研究論文Development of a chemiluminometric immunosensor array for on-site monitoring of genetically modified organisms(Hye-Jee Jang，Il-Hoon Cho Hee-Soo Kim，Jin-Woo Jeon, Se-Young Hwang，Se-Hwan Paek，Sensors and Actuators B:Chemical，2011，155(2) :598 - 605)中 提供了利用重組蛋白制備NPT II抗體的方法，并將之用于免疫傳感器檢測。申請?zhí)枮?CN201310365343發(fā)明專利"轉(zhuǎn)基因作物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT II )雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法"公開了以重組蛋白為免疫原，分別免疫新西蘭大白兔和小鼠制備多克隆抗 體及單克隆抗體，并將其組裝為單抗-多抗夾心ELISA試劑盒的方法。眾所周知，因多克隆 抗體自身的非均一組成特征，其特異性要比單克隆抗體差，且不能連續(xù)生產(chǎn)，不同批次免疫 動物制備的多抗易產(chǎn)生批間差，造成測定結(jié)果不穩(wěn)定。因此，通過獨特的抗原設計，制備NPT II的高特異性和高親和力單克隆抗體是檢測和鑒定帶有NPT II標簽轉(zhuǎn)基因植物的得力工 具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種針對轉(zhuǎn)基因植物中常用篩選標記NPT II基因產(chǎn) 物NPT II蛋白的單克隆抗體雜交瘤的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供一對特異性好、親和力高，可用于雙抗夾心ELISA檢 測的抗NPT II單克隆抗體72450-3和72449-13,這兩個抗體能特異結(jié)合NPT II重組抗原 和轉(zhuǎn)基因植物材料中的NPT II蛋白成分。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種將本抗體用于以水稻為代表的轉(zhuǎn)基因生物的檢 測方法。
[0008] 解決技術問題所采用的技術手段
[0009] 本發(fā)明首先利用合成的多肽抗原制備了兩株分泌抗NPT II抗體的雜交瘤細胞株， 所述雜交瘤細胞株的制備方法包括以下步驟：
[0010] 1)按照序列表中Seq ID No:l所示的NPT II蛋白的氨基酸序列進行分析，依據(jù)在 細胞膜上的結(jié)構、抗原性、組成氨基酸的親疏水性以及二級結(jié)構，選擇了兩段在空間上互不 影響、具有良好免疫原性的多肽片段進行化學合成，合成的多肽其C端具有 Cys殘基，可通 過該Cys與載體蛋白KLH偶聯(lián)，免疫Balb/c小鼠。
[0011] 2)從免疫合格小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞，按常規(guī)方法，將B細胞 與骨髓瘤細胞SP2/0株融合，然后利用常規(guī)的融合細胞HAT篩選方法進行篩選，進而獲取融 合細胞生長克隆。
[0012] 3)以重組NPT II蛋白為抗原，應用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學技 術篩選和鑒定后，獲得高效分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞系。
[0013] 上述技術方案中，步驟3)中，制備重組NPT II蛋白的方法可以按照本領域技術人 員熟知的DNA和蛋白質(zhì)表達操作技術進行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和 表達載體的構建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，重組蛋白的純化。 具體地，可參考《分子克隆實驗指南（第三版）》（J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等 譯，2009年，科學出版社）。
[0014] 本發(fā)明同時要求保護采用上述技術方案制備得到的兩株雜交瘤細胞株及其抗體 72450-3和72449-13。其中72450-3的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No: 5和SEQ ID No :7所示，72449-13為SEQ ID No :9和SEQ ID No :11所示。兩株抗體均為 鼠源IgGl亞型單克隆抗體。
[0015] 本發(fā)明從上述雜交瘤細胞株制備了單克隆抗體，所述制備方法有以下兩種：
[0016] 1)在體外用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞，收獲培養(yǎng)上清經(jīng)免疫親和層析法分離 純化所需單克隆抗體；
[0017] 2)在動物腹腔內(nèi)接種上述雜交瘤細胞，收獲動物腹水后分離純化所需單克隆抗 體。本發(fā)明用腹水法制備的抗體經(jīng)Protein A/G柱親和層析純化得到的NPT II單抗，用 ELISA技術測定72450-3和72449-13分泌的抗體親和常數(shù)分別為1. 79 X 109和2. 27 X 10 9。
[0018] 本發(fā)明的這兩株抗體可以共同或單一地對生物樣品中的NPT II蛋白進行免疫學 檢測。可以應用的免疫學檢測方法包括但不限于利用抗體直接和抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸 附檢測（ELISA)、免疫印跡（Western Blot)、流式細胞術（FACS)、免疫組織化學（IHC)檢 測或者免疫PCR檢測方法。在免疫學檢測中，該抗體可單獨或與通過化學鍵偶聯(lián)，靜電吸 附或者親疏水性吸附，而連接綴合物包括辣根過氧化物酶（HRP)，堿性磷酸酶（AP)，生物 素（Biotin)，異硫氰酸熒光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖等綴合物連接。免疫印記 (Western blotting)實驗顯示這兩株抗體均能特異識別重組的NPT II蛋白以及天然水稻 葉片材料中的轉(zhuǎn)基因篩選標記基因 NPT II。
[0019] 本發(fā)明中的單克隆抗體，可以用作檢測試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測試劑盒的制備。 本發(fā)明的這兩株抗體還可以共同或單一地對含NPT II標簽的生物樣品進行基于免疫學的 生物分離中。該基于免疫學的分離方法包括但不限于利用瓊脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流 式細胞術完成生物分離方法或陽性細胞分選。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果
[0021] 本發(fā)明獲得的可由雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體72450-3和72449-13,能識別重 組和天然NPT II蛋白，具有極強特異性和敏感性。能用于轉(zhuǎn)基因植物的檢測與篩查。
[0022] 因兩種抗體的免疫原為特殊設計，位于NPT II蛋白不同空間位置，且其序列具備 適當?shù)摩?-轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構，因此不僅可單獨使用，也便于組合為雙抗夾心ELISA試劑盒。
【附圖說明】：
[0023] 圖1 :在大腸桿菌中表達和純化的NPT II重組蛋白。U :未誘導的對照；S:誘導菌 的超聲上清；Pe:誘導菌的沉淀；Pu:經(jīng)鎳柱純化后的NPT II蛋白；Marker為分子量蛋白， 表達產(chǎn)物的大小約為35kDa，使用12% SDS-PAGE凝膠。
[0024] 圖2.單克隆抗體72450-3以免疫印跡法檢測重組NPT II蛋白和水稻葉片蛋白的 結(jié)果。Re-NPT-II:純化的重組大腸桿菌NPT II蛋白，帶有His標簽；Rice-:非轉(zhuǎn)基因水 稻葉片蛋白；不含NPT II蛋白；Rice+:轉(zhuǎn)基因水稻葉片，含NPT II蛋白；HSP:以HSP蛋白 作為內(nèi)參蛋白用于確定非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻蛋白的載量一致。.
[0025] 圖3 :單克隆抗體72450-3對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢測結(jié) 果，樣本1-4為轉(zhuǎn)基因水稻材料，其中1 :根部蛋白提取物；2 :莖部蛋白提取物；3:葉片蛋白 提取物；4 :穗子蛋白提取物，Μ為分子量標記物；5-8為非轉(zhuǎn)基因水稻kasalath的蛋白樣 本，其中5 :根部蛋白提取物；6 :莖部蛋白提取物；7:葉片蛋白提取物；8 :穗子蛋白提取物。 一抗為lmg/ml的單克隆抗體，按1 :1000稀釋，二抗為HRP酶標羊抗鼠，稀釋比例1:5000。
[0026] 圖4 :單克隆抗體72449-13對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢測結(jié) 果，樣本1-4為轉(zhuǎn)基因水稻材料，其中1 :根部蛋白提取物；2 :莖部蛋白提取物；3:葉片蛋白 提取物；4 :穗子蛋白提取物，Μ為分子量標記物；5-8為非轉(zhuǎn)基因水稻kasalath的蛋白樣 本，其中5 :根部蛋白提取物；6 :莖部蛋白提取物；7:葉片蛋白提取物；8 :穗子蛋白提取物。 一抗為lmg/ml的單克隆抗體，按1 :1000稀釋，二抗為HRP酶標羊抗鼠，稀釋比例1:5000。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合圖表和具體實施的方式對本發(fā)明做進一步闡述，以使本領域技術人員可 以更清楚地得知本發(fā)明的技術方案，并非對本發(fā)明的限制。
[0028] 實施例1重組PMI蛋白的制備
[0029] 一、基因克隆和表達純化
[0030] 根據(jù)npt ii基因的序列設計PCR引物，以大腸桿菌基因組DNA為模板進行擴 增（圖1)，將擴增產(chǎn)物定向插入到pET30a(+)載體相應的酶切位點上，構建重組表達載 體pET30a-npt載體，雙酶切后得到約5. 4k的pET30a(+)線性片段和約790bp的插入片 段，根據(jù)測序結(jié)果選擇無堿基突變的質(zhì)粒，獲得npt II基因的原核表達載體。將重組載體 pET30a-npt II轉(zhuǎn)入表達菌中，挑取單菌落后培養(yǎng)放大，按1:100的比例將單菌落培養(yǎng)的過 夜菌轉(zhuǎn)接至l〇〇ml LB培養(yǎng)基，加入終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6。。 為0.6~0.8。加入0. lmol/L的IPTG，25°C震蕩培養(yǎng)8h，收菌后超聲破碎。該重組蛋白 帶有組氨酸標簽，細菌超聲破碎后離心分離上清和沉淀，用Ni 2+-NTA親和層析柱純化，進行 SDS-PAGE分析.由圖1可見，在大腸桿菌的上清和沉淀中均能清楚地觀測到目的條帶，純化 后獲得了分子質(zhì)量約為38kDa。
[0031 ] 實施例2雜交瘤細胞系的建立
[0032] -、免疫
[0033] 將按照序列表中Seq ID No :2及Seq ID No :3的氨基酸序列化學合成的兩條多 肽NPT II-p印1和ΝΡΤΠ -ρ印2分別與KLH載體蛋白（Thermo公司）偶聯(lián)。交聯(lián)后的多肽 用弗氏完全佐劑（Sigma公司）乳化，免疫4-6周齡雌性Balb/c小鼠（購自北京維通利華 實驗動物技術有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6點，劑量為60 μ g/只。每14天加強免 疫一次，抗原使用弗氏非完全佐劑（Sigma公司）乳化，劑量為30yg/只。第3次加強免疫 后7天以間接ELISA(波長450nm)檢測小鼠血清中抗免疫原的多抗效價，效價最高的小鼠 以尾靜脈注射沖擊免疫，抗原用生理鹽水混勻，劑量為50 μ g/只。
[0034] 二、細胞融合
[0035] 無菌制備免疫達標的小鼠脾細胞懸液，與小鼠骨髓瘤細胞sp2/0 (ATCC)以5:1比 例混合，離心1500rpm，5min。棄上清后離心管放入37°C水浴中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入lml的 PEG1500(Roche公司），并攪動細胞。在溫水中靜置lmin后，加入10ml無血清的頂DM(Sigma 公司），混勾，離心lOOOrpm，5min。棄上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的將細胞吹 打起來，并加入5ml混合10 X HAT (Sigma公司）的胸腺細胞，混勻。再加入25ml含有2. 1 % 硝基纖維素（Sigma公司）的半固體培養(yǎng)基充分混勻，然后均勻的倒入20個細胞培養(yǎng)皿中。 將細胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入37°C 5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0036] 三、陽性雜交瘤篩選及保存
[0037] 融合后7天克隆細胞團大小密度適中，在解剖鏡下，吸取圓、實、大的克隆團打入 事先準備好培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放入37 °C 5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038] 四、ELISA篩選陽性雜交瘤細胞
[0039] 3天后，細胞量大約占底面積2/3,取100 μ 1上清用免疫原和合成多肽分別進行 ELISA篩選。陽性克隆完全換液，加入200 μ 1含飼養(yǎng)細胞和1% HT (Sigma公司）的完全 培養(yǎng)基。兩天后進行第二次ELISA篩選，陽性克隆轉(zhuǎn)入事先準備好培養(yǎng)基（含飼養(yǎng)細胞和 HT)的24孔板培養(yǎng)。五天后取100 μ 1上清進行第三次ELISA篩選，陽性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔 板和細胞培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)并凍存。
[0040] 實施例3腹水誘生法制備單克隆抗體
[0041] 一、腹水制備
[0042] 對數(shù)生長期細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計數(shù)~5X 105,1ml。懸浮的細胞腹 腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水。取出的腹水于4°C離心4000rpm， lOmin。小心吸出中間的腹水收集于離心管中，4°C或-20°C保存。二、單克隆抗體的純化
[0043] 用HiTrap rProtein A FF(GE公司）親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。 SDS-PAGE膠鑒定純度，Bradford法測定濃度。純化的抗體保存于-20°C。
[0044] 實施例4單克隆抗體亞類鑒定及親和力測定
[0045] 一、亞類鑒定
[0046] 用lOOmM PBS(pH7. 4)稀釋包被羊抗鼠 IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司）至 0. 5 μ g/ml，每孔加 100 μ 1，4°C，過夜。傾空液體，用含 0. 05 % Tween 的 PBS (PBS-T)洗 3 次， 每孔加入200 μ 1封閉液（含2% BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T 清洗3次。每孔加入0. lml雜交瘤上清，37°C孵育lh。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封 閉液1 :1000稀釋HRP標記的羊抗鼠（κ，λ )抗體或1 :2000稀釋HRP標記的羊抗鼠（IgM， IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3, IgA)抗體（Southern Biotech 公司）0· lml 每孔分別加入適當?shù)?孔中，37°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含0· 15%ABTS(Southern Biotech公司）和0. 03%氏02的檸檬酸緩沖液（PH4. 0)進行顯色反應，10-20min內(nèi)測定 405nm波長下的0D值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體72450-3和72449-13均為IgGl型鼠 源單克隆抗體。
[0047] 二、親和常數(shù)測定
[0048] 包被重組NPT II蛋白，包被濃度為2μg/ml，100μ1/孔，4°C包被過夜，PBS-T洗3 次。每孔加200 μ 1封閉液37°C封閉2h，PBS-T洗3次。實施例4中純化的單克隆抗體，從 1 :200開始2倍梯度稀釋，最后1孔留空白對照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP標記的 羊抗鼠二抗1 :20000稀釋，每孔100 μ 1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100 μ 1含 0· 1 % TMB (Sigma公司）和0· 03% Η202的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色10min，加50 μ 1 0· 5Μ 硫酸溶液終止反應。用酶標儀測定波長450nm的吸光值。畫出0D值對應抗體稀釋倍數(shù)的曲 線，找出彡1/2"平臺0D值"對應的稀釋倍數(shù)A。利用下列公式計算出72450-3和72449-13 分泌的抗體親和常數(shù)分別為1. 79X 109和2. 27X 10 9。
[0049]
[0050] 實施例5本發(fā)明單克隆抗體的應用效果
[0051] 以純化的重組NPT II作為抗原，同時從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻kasalath葉片、 根、莖和穗中提取蛋白，用免疫印跡的方法檢測本發(fā)明的單克隆抗體識別特異性及在檢測 轉(zhuǎn)基因植物中的應用效果。免疫印跡實驗過程如下：每種蛋白上樣5-10ng，進行12%聚 丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上 (1^111?〇^公司）。將膜置于含5%脫脂奶粉的185-1'封閉液中4°(：過夜。加入單克隆抗 體70450-3及70449-13(1 :1000稀釋）4°C孵育過夜。用TBS-T洗膜后，加入1 :5000稀釋 的羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），室溫孵育1小時。再次TBST洗膜，加 入ECL超敏顯色液（北京普利萊基因技術有限公司），以ChemiDoc MP多色熒光成像系統(tǒng) (Bio-Rad)進行化學發(fā)光圖像數(shù)據(jù)的采集。
[0052] 實驗結(jié)果如圖2可見，72450-3可特異性識別重組NPT II蛋白和轉(zhuǎn)基因水稻中的 NPT II蛋白成分，而不識別非轉(zhuǎn)基因的水稻。圖3和圖4結(jié)果可見，72450-3和72449-13 均能特異性地識別轉(zhuǎn)基因水稻中的NPT II蛋白，在轉(zhuǎn)基因水稻的不同部位，NPT II分布的 情況也有不同，其中根部含量最低，幾乎不可檢出，莖部次之，而葉片和穗子中的蛋白含量 很高。
[0053] 實施例6抗體的可變區(qū)序列測定
[0054] 培養(yǎng)新鮮的雜交瘤細胞，取上清進行抗原結(jié)合特性驗證，證實用于克隆的細胞株 的確能分泌需要的抗體，結(jié)果確認后，離心收集1〇 6以上雜交瘤細胞。Trizol法提取雜交瘤 細胞總 RNA，取 9 μ L 總 RNA，加入 2. 5 μ L oligo (dT) 12 - 18primer (10mM)，及 5 μ L dNTPs， 混合均勻，70°C保溫5分鐘后置冰上5分鐘，或依照使用的逆轉(zhuǎn)錄酶進行變性操作。隨后加 入 5yL RT buffer(5X)，2.5yL DTT(O.IM)及 lyL 逆轉(zhuǎn)錄酶，42°C 反應 1 小時。70°C 孵 育15分鐘以終止反應，獲得的cDNA保存在-20°C。將獲得的第一鏈cDNA進行PCR擴增， 在50 yL反應體系中加入引物各25pmol，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)擴增用引物的序列按 照沈倍奮主編的《重組抗體》（科學出版社，2005年出版）一書中鼠單抗引物序列設計和合 成。用于擴增重鏈可變區(qū)的引物如下，其中MHV. B1直至MHV. B12的11條引物為上游引物， 可分別與重鏈下游引物MHC. F組合用于擴增重鏈可變區(qū)基因。
[0067] 用于擴增輕鏈可變區(qū)的引物如下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10條引物為上游 引物，可分別與輕鏈下游引物MKC. F組合用于擴增Kappa輕鏈的可變區(qū)基因。

[0079] 其余dNTPs及緩沖液均按照常規(guī)加入，最后加入cDNA模板1 μ L和1U熱啟動Taq DNA聚合酶。設置PCR擴增程序為94°C 40秒，52 °C 40秒，72 °C 40秒，進行20至25個循環(huán)， 最后72 °C延伸3分鐘，產(chǎn)物可置于4°C備用或直接電泳。取20 μ L PCR產(chǎn)物進行電泳分析， 在1. 5%瓊脂糖凝膠上分離切膠回收，克隆至Τ載體測序。
[0080] 實施例7 ΝΡΤ II的單克隆抗體用于ELISA的效果
[0081] 與CP4 EPSPS多克隆抗體配對，用重組的ΝΡΤ II蛋白為標準品，檢測兩種NPTII 單克隆抗體72450-3和72449-13用于雙抗夾心ELISA的效果。實驗步驟如下：
[0082] 將單克隆抗體72450-3,100 μ 1/孔，4°C包被過夜，包被的抗體濃度為1 μ g/ml至 5 48/1111均是有效的。用1%834在37°(：，封閉211。取純化后的即1'11蛋白用？831'稀釋 成 10 μ g/ml、1 μ g/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml、100pg/ml、10pg/ml 的蛋白稀釋液，以 100 μ 1/孔（2個重復）加入不同的孔作為標準曲線，同時加入轉(zhuǎn)基因水稻及非轉(zhuǎn)基因水稻 葉片中提取的蛋白質(zhì)，37°C孵育lh。每孔加入100 μ 1稀釋的經(jīng)HRP標記的72449-13單克 隆抗體作為檢測抗體，該抗體的原始濃度為lmg/ml，稀釋500-1000倍使用，此時其終濃度 為lμg/ml至2μg/ml，37°C孵育lh。以上每步完成后均用0.05% PBST清洗酶標板5-8 次，吸水紙徹底拍干。每孔加100 μ 1 TMB顯色液，反應3-5分鐘，加入50 μ 1終止液終止反 應。測定405nm波長下讀取各孔0D值。
【主權項】
1. 一種結(jié)合NPT II蛋白的免疫組合物，其特征在于包含由小鼠雜交瘤細胞系72450-3 和/或72449-13分泌的單克隆抗體。2. 權利要求1所述的兩種單克隆抗體，其免疫小鼠用的抗原分別具有SEQ ID No :2和 SEQ ID No :3所示的氨基酸序列，該多肽經(jīng)化學合成后與KLH載體蛋白偶聯(lián)，用于免疫小 ￡3 邱U3. 權利要求1所述的72450-3單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序 列分別為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5,其輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序列分別 為 SEQ ID No :6 和 SEQ ID No :7。4. 權利要求1所述的72449-13單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序 列分別為SEQ ID No:8和SEQ ID No:9,其輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序列分別 為 SEQ ID No :10 和 SEQ ID No :11。5. 權利要求1所述的單克隆抗體，其為小鼠 IgGl亞型單克隆抗體。6. 權利要求1所述的單克隆抗體，其可單獨或與其它綴合物連接完成含NPT II蛋白的 生物樣本的免疫學檢測和生物分離。7. 權利要求6所述連接綴合物包括辣根過氧化物酶（HRP)、堿性磷酸酶（AP)、生物素 (Biotin)、異硫氰酸熒光素（FITC)、Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖。8. 權利要求5所述的免疫學檢測方法包括利用抗體直接和抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附 檢測（ELISA)、免疫印跡（Western Blot)、流式細胞術（FACS)、免疫組織化學（IHC)檢測或 者免疫PCR檢測方法。9. 權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于可作為檢測試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測雙 抗夾心ELISA試劑盒的制備。10. 權利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物NPT II蛋白ELISA檢測試劑盒，其特征在于抗體的 包被濃度為1 μ g/ml到5 μ g/ml濃度范圍，檢測抗體的使用濃度為1 μ g/ml-2 μ g/ml濃度 范圍。
【文檔編號】C07K16/40GK105985438SQ201510097938
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月5日
【發(fā)明人】尹長城, 劉國振, 蘭金蘋, 武鵬程, 郭美岑, 史佳楠, 韋漢福, 榮瑞娟, 郝育杰, 李莉云, 吳 琳, 劉斯奇
【申請人】北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司