專利名稱：一種金鐵鎖毛狀根系的誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用生物技術(shù)誘導(dǎo)與培養(yǎng)毛狀根系的方法，特別設(shè)計(jì)一種金鐵鎖 狀根系的誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
金鐵鎖是石竹科金鐵鎖屬單種屬植物(Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu)，為西南地區(qū)特有植物、民間常用草藥。其根入藥，常用于跌撲損傷、風(fēng)濕痹痛、胃寒 痛、瘡癤、創(chuàng)傷出血。是我國中成藥保密品種“云南白藥”的重要成分之一，也是多種知名中 成藥的主要成份，如云南白藥系列、云南紅藥膠囊、貴州金骨蓮膠囊、福建痛血康膠囊等。近 年來隨其藥用需求量的不斷增加，加上自然環(huán)境因素和人為作用，使金鐵鎖資源數(shù)量急劇 下降，目前已作為珍稀瀕危物種列入《中國植物紅皮書》中，屬于國家二級重點(diǎn)保護(hù)植物。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生毛狀根，并對毛狀 根進(jìn)行離體擴(kuò)增培養(yǎng)，可以快速大量的提取植物體中有效化學(xué)成分，也是進(jìn)行藥用植物資 源可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。由于毛狀根具有生長速度快、分枝多、弱向地性，處于器官 化水平，激素自養(yǎng)，生理生化、遺傳特征穩(wěn)定，有穩(wěn)定的次生代謝物質(zhì)合成能力，并且毛狀根 培養(yǎng)不受環(huán)境、生態(tài)、氣候等條件的限制。因此，利用毛狀根培養(yǎng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)金鐵鎖替 代野生資源，不但可以緩解日益增長的市場需求，而且有利于保護(hù)、搶救和挖掘民族藥，解 決日益嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)保問題，也將會(huì)大大促進(jìn)金鐵鎖等民族藥的現(xiàn)代化發(fā)展。因此，建立金 鐵鎖毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)大量生產(chǎn)金鐵鎖替代原材料具有重要意義目前，用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)形成的植物毛狀根涉及到31科100余種雙子葉植物，而 露水草(Cyanotis arachnoidea C. B. Clarke)是迄今單子葉植物中毛狀根誘導(dǎo)成功的唯 一例子。毛狀根培養(yǎng)與傳統(tǒng)栽培獲得中草藥原材料相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)毛狀根中染色 體和次生代謝產(chǎn)物的生物合成相對穩(wěn)定；(2)毛狀根不僅生長速度快，而且次生代謝產(chǎn)物 含量高，(3)不受病蟲害、地理和季節(jié)等各種環(huán)境因素的影響；(4)所獲得的產(chǎn)物可從培養(yǎng) 體系內(nèi)直接提取，并快速、高效的回收與利用，簡化了分離與純化的步驟；(5)有利于細(xì)胞 篩選、生物轉(zhuǎn)化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代謝途徑，還可以利用某些基 因工程手段探索與創(chuàng)造新的合成路線，得到價(jià)值更高的產(chǎn)品；(7)節(jié)省大量用于種植原料 的農(nóng)田。正是由于毛狀根的上述優(yōu)點(diǎn)，為其工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)中草藥原材料提供了基 礎(chǔ)，成為繼組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)之后當(dāng)代生物技術(shù)領(lǐng)域重要的研究和開發(fā)熱點(diǎn)。 利用植物毛狀根進(jìn)行天然產(chǎn)物的生產(chǎn)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展階段，植物細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物被人類廣泛應(yīng)用。通過毛狀根培養(yǎng)可以生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物有生 物堿類(如莨菪烷生物堿、喹啉生物堿)、甙類、黃酮類、醌類和一些重要的酶(如超氧化物 歧化酶)等。人參毛狀根的生長速度是常規(guī)激素誘導(dǎo)根生長速度的2倍(Yochikawa，1987)； 莨菪毛狀根無性系合成莨菪堿的效率是原植物的2倍以上(Mano 1986)；劉春超和劉本葉 等對青蒿毛狀根的培養(yǎng)條件和代謝組學(xué)進(jìn)行了研究；研究發(fā)現(xiàn)栝樓毛狀根生產(chǎn)天花粉蛋白 克鮮重含量到8. 16毫克。這些研究充分表明，毛狀根培養(yǎng)體系正在成為生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的重要生物技術(shù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是 公開一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法.本發(fā)明金鐵鎖毛狀根系誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法為取金鐵鎖幼嫩莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織，將愈傷組 織與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(ACCC10060，保藏單位縮寫和菌種編號)共培養(yǎng)，以無菌 紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在金鐵鎖愈傷組織處生長出金鐵鎖毛狀 根；抑菌培養(yǎng)后將具有毛狀根的外植體放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。所述金鐵鎖幼嫩莖脫分化處理時(shí)，是取1 2cm金鐵鎖幼嫩莖段置于MS+2， 4-Da5mgA+NAAa3mgA培養(yǎng)基中，25°C 士 1下暗培養(yǎng)20d。獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織；所述發(fā)根 農(nóng)桿菌與金鐵鎖愈傷組織共培養(yǎng)前，先在固體YEB培養(yǎng)基中25V 士 1下培養(yǎng)2 3d ；然后 選取單克隆到液體YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，菌液離心收集菌體；將菌體置于MS液體培養(yǎng)基 中混勻；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基。共培養(yǎng)時(shí)間為Id ； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有500mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基；所述介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體放入 抑菌培養(yǎng)基中于25°C 士 1暗黑培養(yǎng)，每3 6d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直 至將菌除凈；所述將抑菌處理后具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)是在25°C 士1暗 黑振蕩培養(yǎng)；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基為無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基；所述振蕩培養(yǎng)箱搖床轉(zhuǎn)速 為 110 120r · mirT1。本發(fā)明金鐵鎖毛狀根系誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法為(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成1 5cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理6 13分鐘， 酒精浸泡5 10秒，無菌水沖洗3 8遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基 中，25°C 士3下暗培養(yǎng)10 35d，獲得金鐵鎖愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌株用1 μ L無菌水稀釋后的菌液涂布在20mL YEB 固體培養(yǎng)基上，25°C 士 3下暗培養(yǎng)1 6d長出克隆菌體。(3)挑取1菌環(huán)單菌落接種于50mL液體YEB培養(yǎng)基中，25°C 士 3振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng) 12小時(shí)，OD值為0. 3 1. 2.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)8小 時(shí)，OD值為0. 3 0. 9.收集菌液，3500rpm下離心5 15分鐘收集菌體。(4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS固
體培養(yǎng)基中并混勻。(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織10 30分鐘，取出后用無菌紙 吸取多余的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂 的MS固體培養(yǎng)基中1 3天。(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將(5) 浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每2 9d繼代培養(yǎng)一次，至少 五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)用無激素V2MS液體培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后Ig的誘導(dǎo) 出來的毛狀根放入30mL的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為110 120r · min—lo
本發(fā)明金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)優(yōu)選方法為(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成2cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理7分鐘，酒精浸泡 6秒，無菌水沖洗4遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士 2下暗培養(yǎng) 12d，獲得金鐵鎖愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C 士3下暗培養(yǎng)4d長出單克
隆。 (3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C 士2振蕩培養(yǎng)，OD值為
0.5.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 5.收集菌液，3500rpm下 離心7分鐘收集菌體。(4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS固
體培養(yǎng)基中并混勻。(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織12分鐘，取出后用無菌紙吸取 多余的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS 固體培養(yǎng)基中2天。(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將(5) 浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每7d繼代培養(yǎng)一次，至少五 次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外 植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為Iio 120r · min-1。本發(fā)明金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)優(yōu)選方法為(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成4cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理11分鐘，酒精浸 泡8秒，無菌水沖洗7遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士2下暗 培養(yǎng)33d，獲得金鐵鎖愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C 士3下暗培養(yǎng)5d長出單克隆。(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C 士2振蕩培養(yǎng)，OD值為
1.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0.7.收集菌液，3500rpm下 離心12分鐘收集菌體。(4)將(3)收集的菌體置于100ml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS固
體培養(yǎng)基中并混勻。(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織25分鐘，取出后用無菌紙吸取 多余的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS 固體培養(yǎng)基中2天。(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將(5) 浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每4d繼代培養(yǎng)一次，至少五 次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外 植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為Iio 120r · min-1。


圖1發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化金鐵鎖愈傷組織產(chǎn)生發(fā)根的照片圖2金鐵鎖毛狀根擴(kuò)增后懸浮培養(yǎng)的照片下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1毛狀根系PCR檢測1、基因組DNA微量提取1. 1取1. Og經(jīng)過篩選的毛狀根在液氮下研磨，放入50ml離心管，加入20ml 提取緩沖液(IOOmM Tris-HCl，PH 8. 0 ；0.35mMSorbitol ；5mMEDTA, pH 8. 0 ；1 % 2-Mercaptoethanol),置于冰上。2. 240C，IOOOOg離心10分鐘，去上清液，用20ml提取緩沖液溶解沉淀兩次并離心。3. 3去上清液并用5ml提取緩沖液懸浮沉淀，加入3. 5ml高鹽CTAB緩沖液(50mM Tris-HCl, pH 8. 0 ；4M NaCl ；1. 8% CTAB ；25mM EDTA, pH 8. 0)和 0. 3ml Sarkosyl (濃度為 30 %的水溶液)，55 °C孵育70分鐘。4. 4加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)，IOOOOg離心10分鐘。去上清液加入2/3 體積預(yù)冷的混合有1/10體積乙酸鈉的異丙醇。4°C，IOOOOg離心20分鐘。去上清液，用冷 的75%的乙醇洗滌沉淀。去乙醇，在空氣中干燥DNA，并用200 μ L TE緩沖液(IOmM Tris, pH 8. 0 ； ImM EDTA，pH 8. 0)溶解。5. 5加入10 μ L Rnase (lmg/ml)在37°C下孵育40分鐘，加入等體積的酚氯仿，抽 提去除蛋白質(zhì)。室溫下，15000g離心10分鐘。5. 6取上清液加入等體積預(yù)冷的100%的氯仿，沉淀去除蛋白質(zhì)。室溫下高速離心 10分鐘。5. 7取上清加入兩倍體積的冷的無水乙醇(混合1/10體積的乙酸鈉)，沉淀DNA 然后將其放于-20°C下30分鐘。5. 818000rpm下離心沉淀DNA 15分鐘。用75%的冷的乙醇洗滌DNA沉淀，并在空 氣中干燥。用50-100 μ L TE緩沖液溶解DNA。2、毛狀根的PCR檢測取經(jīng)過篩選的毛狀根IOOng的基因組DNA為模板，以試管苗正常根作為陰 性對照，Ri質(zhì)粒為陽性對照。rolC基因的引物序列(寶生物合成)引物I序列 5:GATATATGCCAAATTTACACTAG-3、引物 II 序列 _GTTAACAAAGTAGGAAACAGG_3~。PCR反應(yīng)總體系為50ul
Taq Mix 25ul
引物 I2 (20pmol) ul
引物II2 (20pmol) ul
模板5 (IOOng) ul
去離子無菌水16ul在PCR儀(UN0II，Biometra)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C，45s ；45°C,30s ；72°C, 45s共30個(gè)循環(huán)，72°C延長lOmin。
證明了 T-DNA整合到金鐵鎖基因組誘導(dǎo)形成毛狀根。3、PCR-Southern分子雜交 檢測目的基因3. 1 轉(zhuǎn)膜將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將電泳膠在變性液中浸泡1小時(shí)，中途換一次 液。用去離子水漂洗一次，然后轉(zhuǎn)入中和液中浸泡1小時(shí)。取一塊潔凈玻璃板，其上方鋪一 土夬 whatman3MM 濾紙，盤內(nèi)倒入適量轉(zhuǎn)移液 20XSSC(5M NaCl ；0. 3M Na3Citrate, pH 8.0)， 并使濾紙兩端下垂完全浸入轉(zhuǎn)移液。用轉(zhuǎn)移液濕潤濾紙，排除它與玻璃板之間的氣泡。剪 取一塊與凝膠大小相同的尼龍膜，漂浮于去離子水中使其完全濕潤，然后置于20XSSC中5 分鐘。將中和后的凝膠上下倒置后置于已浸潤的Whatman3MM濾紙上方。將浸濕的尼龍膜 覆蓋到凝膠上。以2XSSC浸濕兩張與凝膠大小等同的Whatman3MM濾紙，并覆蓋于已經(jīng)濕 潤的尼龍膜上方。剪裁一疊與凝膠大小相同的吸水紙，高5-8厘米，置于Whatman3MM濾紙 上，吸水紙上方置一塊玻璃板。利用虹吸作用使DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。3. 2用Alkphos DIRECT試劑盒制備探針用80 μ L Alkphos DIRECT試劑盒提供的水稀釋20 μ L交聯(lián)劑溶液，制成交聯(lián)劑工 作液。將含有rolC基因片段的質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增出大量的rolC基因片段。將PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用UNIQ-IO柱式DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增出來的rolC基因片 段。將該DNA片段稀釋到IOng/μ 1，置于沸水浴中加熱15分鐘使其變性，然后迅速置于冰 上5分鐘。依次向其中加入10μ IL反應(yīng)液和2μ L標(biāo)記試劑，輕輕混勻。最后加入10 μ L 交聯(lián)劑工作液，輕混后在37。C反應(yīng)30分鐘。3. 3預(yù)雜交與雜交轉(zhuǎn)膜后將膜放于雜交緩沖液(把NaCl加入雜交緩沖液中，使其終濃度為0. 5M，再 加入阻斷劑至終濃度為4% (w/v)，立即混合成阻斷液懸液，繼續(xù)室溫混合1-2小時(shí)，55°C下 在雜交爐中進(jìn)行10分鐘的預(yù)雜交，然后向以上雜交緩沖液中加入制備好的探針，55°C雜交 過夜。3. 4 洗膜取出雜交后的膜，分別用初次洗液(2M尿素，0. SDS，50mM磷酸二氫鈉，150mM NaCl，ImM MgC12，0. 2% 阻斷劑)和二次洗液(1M Tris base，0. 3M 檸檬酸鈉液，pH 7.0)洗 去膜上與DNA非特異性結(jié)合的探針。3. 5 顯影將洗好的尼龍膜用保鮮膜包好，上壓一張X光膠片，置于黑暗處曝光2-3個(gè)小時(shí)。 用顯影液和定影液沖洗X光膠片，以得到清晰的X光顯影膠片。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例所述的效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成2cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理7分鐘，酒精浸泡 6秒，無菌水沖洗4遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士 2下暗培養(yǎng) 12d，獲得金鐵鎖愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C 士3下暗培養(yǎng)4d長出單克隆。 (3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C 士2振蕩培養(yǎng)，OD值為
0.5.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 5.收集菌液，3500rpm下 離心7分鐘收集菌體。(4)菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中并混勻。(5)將金鐵鎖愈傷組織浸染于上述菌液中12分鐘，取出后用無菌紙吸取多余的菌 液，接入到共培養(yǎng)基中2天。(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將浸染 后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)。每7d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的 抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外 植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為Iio 120r · min-1。實(shí)施例2 (1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成4cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理11分鐘，酒精浸 泡8秒，無菌水沖洗7遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士2下暗 培養(yǎng)33d，獲得金鐵鎖愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C 士3下暗培養(yǎng)5d長出單克隆。(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C 士2振蕩培養(yǎng)，OD值為
1.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0.7.收集菌液，3500rpm下 離心12分鐘收集菌體。(4)菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中并混勻。(5)將金鐵鎖愈傷組織浸染于上述菌液中25分鐘，取出后用無菌紙吸取多余的菌 液，接入到共培養(yǎng)基中2天。(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將浸染 后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)。每4d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的 抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外 植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為Iio 120r · min-1。實(shí)施例3:(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成1 2cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理8 10分鐘， 酒精浸泡8秒，無菌水沖洗5遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士 1 下暗培養(yǎng)20d，獲得金鐵鎖愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C 士 1下暗培養(yǎng)2 3d長出
單克隆。(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C 士 1振蕩培養(yǎng)，OD值 為0. 6 0. 8.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 6.收集菌液， 3500rpm下離心10分鐘收集菌體。(4)菌體置于100ml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中并混勻。
(5)將金鐵鎖愈傷組織浸染于上述菌液中20分鐘，取出后用無菌紙吸取多余的菌 液，接入到共培養(yǎng)基中1天。 (6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將浸染 后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)。每3 6d繼代培養(yǎng)一次，至少五 次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外 植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為Iio 120r · min-1。
權(quán)利要求
1.一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法為取金鐵鎖幼嫩莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織，將愈傷組織與 含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培 養(yǎng)，在金鐵鎖愈傷組織處生長出金鐵鎖毛狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有毛狀根的外植體放入擴(kuò) 增培養(yǎng)基中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法中所 述金鐵鎖幼嫩莖脫分化處理時(shí)，是取1 2cm金鐵鎖幼嫩莖段置于1^+2，4-隊(duì).5 ^+織~3 ^ 培養(yǎng)基中，25°C 士 1下暗培養(yǎng)20d ；獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織。
3.如權(quán)利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法中所 述發(fā)根農(nóng)桿菌與金鐵鎖愈傷組織共培養(yǎng)，是先在固體YEB培養(yǎng)基中25°C 士 1下培養(yǎng)2 3d ； 然后選取單克隆到液體YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，菌液離心收集菌體；將菌體置于MS液體培 養(yǎng)基中混勻。
4.如權(quán)利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法中所 述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)時(shí)間為Id ；所述誘導(dǎo)培 養(yǎng)基為含有500mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法中所 述介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體放入抑菌培養(yǎng)基中于25°C 士 1暗黑培養(yǎng)，每3 6d繼代培養(yǎng)一次，至 少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。
6.如權(quán)利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法中 所述將抑菌處理后具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴(kuò)增培養(yǎng)是在25°C 士 1暗黑振蕩培 養(yǎng)；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基為無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基，所述振蕩培養(yǎng)箱搖床轉(zhuǎn)速為110 120r · mirT1。
7.一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法為(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成1 5cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理6 13分鐘，酒 精浸泡5 10秒，無菌水沖洗3 8遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中， 250C 士 3下暗培養(yǎng)10 35d，獲得金鐵鎖愈傷組織；(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌株用1μ L無菌水稀釋后的菌液涂布在20mL YEB固體 培養(yǎng)基上，25°C 士3下暗培養(yǎng)1 6d長出克隆菌體；(3)挑取1菌環(huán)單菌落接種于50mL液體YEB培養(yǎng)基中，25°C士 3振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)12小 時(shí)，OD值為0. 3 1. 2.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)8小時(shí)，OD 值為0. 3 0. 9.收集菌液，3500rpm下離心5 15分鐘收集菌體；(4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0.9%瓊脂的MS固體培 養(yǎng)基中并混勻；(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織10 30分鐘，取出后用無菌紙吸取 多余的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS 固體培養(yǎng)基中1 3天；(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將( 浸染 后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每2 9d繼代培養(yǎng)一次，至少五次 的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈；(7)用無激素1/2MS液體培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后Ig的誘導(dǎo)出來的毛狀 根放入30mL的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為110 120r · min-1。
8.如權(quán)利要求7所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法為(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成2cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理7分鐘，酒精浸泡6秒， 無菌水沖洗4遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士 2下暗培養(yǎng)12d， 獲得金鐵鎖愈傷組織；(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C士3下暗培養(yǎng)4d長出單克??；(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C士2振蕩培養(yǎng)，OD值為 0. 5.取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 5.收集菌液，3500rpm下 離心7分鐘收集菌體；(4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0.9%瓊脂的MS固體培 養(yǎng)基中并混勻；(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織12分鐘，取出后用無菌紙吸取多余 的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS固體 培養(yǎng)基中2天；(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將( 浸染 后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每7d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的 抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈；(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外植體 放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為110 120r · min-1。
9.如權(quán)利要求7所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，其特征在于該方法為(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成4cm的小段，無菌操作臺(tái)中用升汞處理11分鐘，酒精浸泡8 秒，無菌水沖洗7遍后轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C 士 2下暗培養(yǎng) 33d，獲得金鐵鎖愈傷組織；(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液涂于YEB固體培養(yǎng)基中，25°C士3下暗培養(yǎng)5d長出單克??；(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C士2振蕩培養(yǎng)，OD值為1.取 Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 7.收集菌液，3500rpm下離心12 分鐘收集菌體；(4)將(3)收集的菌體置于100ml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0.9%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻；(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織25分鐘，取出后用無菌紙吸取多余 的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%瓊脂的MS固體 培養(yǎng)基中2天；(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將( 浸染 后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每4d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的 抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈；(7)把無激素1/2MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的毛狀根外植體 放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為110 120r · min-1。
全文摘要
本發(fā)明公開一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法，該誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法為取金鐵鎖幼嫩莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織，將愈傷組織與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(ACCC10060，保藏單位縮寫和菌種編號)共培養(yǎng)，以無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在金鐵鎖愈傷組織處生長出金鐵鎖毛狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有毛狀根的外植體放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。
文檔編號C12Q1/68GK102057868SQ200910237579
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者劉同祥, 崔箭, 張宗申, 張繼永, 王偉, 韋瑋 申請人:劉同祥