本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及miR-34c在體外誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞分化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼的單鏈小RNA，其長度約為20～25nt，在物種進(jìn)化中非常保守，它們在特定發(fā)育階段或特定組織中表達(dá)。miR-34c是mir-34家族的一員，miR-34家族有3個成員(miR-34a，miR-34b，miR-34c)。其中，miR-34a由一個單獨(dú)的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄生成，而miR-34b和miR-34c共用一個初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在人類基因組中，miR-34a位于1號染色體上，miR-34b和miR-34c位于11號染色體上。60％以上的人類編碼蛋白的基因都有miRNA的保守靶位點(diǎn)，因此，miRNA有多種多樣的生物學(xué)功能，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織分化、機(jī)體的發(fā)育等。

骨骼肌由中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育而來，是胚胎發(fā)育過程中最早形成的組織之一。骨骼肌的發(fā)育受到一系列調(diào)控因子的精確調(diào)控，其中肌肉生成調(diào)控因子(MRFs)發(fā)揮了核心作用，此外，Wnt、Notch、TGF-β等信號通路也起到了主要的作用。除了上述調(diào)控因子外，miRNA在骨骼肌的損傷修復(fù)、衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化、成肌細(xì)胞的增殖與分化等骨骼肌的發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。

自1993年發(fā)現(xiàn)第一個miRNA后，隨后20年中已有10000多個miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。它們在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。MiRNA調(diào)控的多樣性，使它們與很多人類疾病相關(guān)。因此了解miRNA在肌肉發(fā)育過程的作用，對預(yù)防和治療骨骼肌相關(guān)的疾病具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供miR-34c在體外誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞分化中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種新的促骨骼肌分化因子—miR-34c。

本發(fā)明還提供miR-34c在體外誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞分化中的應(yīng)用，其是利用脂質(zhì)體(例如脂質(zhì)體2000)在成肌細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染miR-34c mimics，待細(xì)胞匯合度達(dá)到85％-95％(優(yōu)選90％)時，將細(xì)胞用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

本發(fā)明中涉及的miR-34c mimics是指miR-34c擬似物，購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。所述miR-34c mimics的序列為：

正義鏈：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’(SEQ ID No.1)

反義鏈：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’(SEQ ID No.2)

本發(fā)明中涉及的成肌細(xì)胞為小鼠成肌細(xì)胞C2C12。

所述分化培養(yǎng)基培養(yǎng)為含有2％馬血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。

用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件為：37℃，5％CO₂。

在細(xì)胞分化第3天時，提取蛋白質(zhì)，用Western blot技術(shù)檢測肌球蛋白重鏈(MYHC)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-34c mimics的細(xì)胞MYHC的表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染Negative Control(NC)mimics(SEQ ID No.3和4)的細(xì)胞；另外，在細(xì)胞分化第3天時，取細(xì)胞樣品，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-34c mimics的細(xì)胞中MYHC陽性細(xì)胞數(shù)多于轉(zhuǎn)染NC mimics的細(xì)胞。以上結(jié)果說明過表達(dá)miR-34c能促進(jìn)C2C12細(xì)胞的分化。

本發(fā)明還提供含有miR-34c mimics的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、工程菌。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一種新的促骨骼肌細(xì)胞分化因子—miR-34c，通過Western blot和免疫熒光染色技術(shù)檢測miR-34c對成肌細(xì)胞(C2C12 細(xì)胞)分化的影響，從而確定miR-34c在骨骼肌發(fā)育中的作用，對預(yù)防和治療骨骼肌相關(guān)疾病具有重要的意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中Western blot檢測miR-34c對C2C12細(xì)胞分化的影響。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中免疫熒光檢測miR-34c對C2C12細(xì)胞分化的影響。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

以下實(shí)施例中涉及的miR-34c mimics的序列為：

正義鏈：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’

反義鏈：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’

NC mimics的序列為：

正義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’

實(shí)施例1 miR-34c在體外誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞分化中的應(yīng)用

待C2C12細(xì)胞的匯合度為60％-70％時，利用脂質(zhì)體2000(11668-019，Invitrogen)在C2C12細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染miR-34c mimics，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90％時，將細(xì)胞用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

所述分化培養(yǎng)基為含有2％馬血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。

用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件為：37℃，5％CO₂。

1、Western blot檢測miR-34c對C2C12分化的影響

蛋白樣品收集：將轉(zhuǎn)染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12細(xì)胞倒掉培養(yǎng)基后，用PBS洗3遍細(xì)胞，棄去PBS，加 入含有1％PMSF的IP裂解液，冰上放置5min，用細(xì)胞刮刀將樣品刮至1.5ml EP管中，12000g，4℃，離心5min，取上清，按照BCA蛋白定量試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)研究所)說明書對提取的蛋白進(jìn)行定量。

Western blot檢測：

1)將蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，于99℃變性10min，每個樣品上樣50ug。

2)電泳：濃縮膠時電壓恒定在60V左右，電泳45min。當(dāng)進(jìn)入分離膠時，電壓恒定在100V左右電泳1-2h，直到25KD marker跑至凝膠底部時，停止電泳；

3)轉(zhuǎn)膜：350mA恒流，4℃轉(zhuǎn)膜，蛋白MYHC(肌球蛋白重鏈)轉(zhuǎn)1小時40分鐘，蛋白GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，內(nèi)參蛋白)轉(zhuǎn)膜1小時。

4)封閉：將膜放入5％脫脂奶粉中，室溫封閉1小時。

5)一抗：GAPDH(1：10000，購自CST公司，貨號2118L)；MYHC(1：3000,購自Sigma公司，貨號M4276)，4℃，過夜。

6)洗一抗：TBST在搖床上洗3次，每次10分鐘。

7)二抗：山羊抗小鼠(貨號ZB-2305)和(貨號ZB-2301)山羊抗兔，1:10000(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫1小時。

8)洗二抗：TBST在搖床上洗3次，每次10分鐘。

9)顯影：將曝光過的膠片馬上放入顯影液中，顯影時間根據(jù)觀察而定。

10)停影：將顯影過的膠片放入水中停影。

11)定影：停影后的膠片放入定影液中定影至少5min。

圖1結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34c mimics的細(xì)胞MYHC的表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染NC mimics的細(xì)胞。

2、細(xì)胞免疫熒光檢測miR-34c對C2C12分化的影響

1)細(xì)胞固定：將轉(zhuǎn)染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12細(xì)胞倒掉培養(yǎng)基后，用PBS洗3遍細(xì)胞，棄去PBS，加入 4％多聚甲醛，室溫固定30分鐘。

2)細(xì)胞通透：倒掉固定液，PBS洗3遍，加入0.1％TritonX-100，室溫10分鐘。

3)細(xì)胞封閉：倒掉通透液，PBS洗3遍，加入免疫熒光封閉液(購自碧云天生物技術(shù)研究所)，室溫封閉1小時。

4)一抗：倒掉封閉液，加入MYHC一抗(1:500，Sigma公司)，4℃過夜。

5)洗一抗：PBS洗3次，每次10分鐘。

6)二抗：Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594(1:400，A-11034，購自Life公司)，室溫1小時，避光。

7)染DAPI：倒掉二抗，PBS洗一次，加入濃度為1μg/ml的DAPI，室溫避光染核5分鐘。

8)洗DAPI：PBS洗3次，每次10分鐘。

9)封片：加少量抗熒光淬滅機(jī)，放上蓋玻片，封片，鏡檢。

圖2結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34c mimics的細(xì)胞中MYHC陽性細(xì)胞數(shù)多于轉(zhuǎn)染NC mimics的細(xì)胞。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。