專利名稱：一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體是一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺 傳轉(zhuǎn)化高山紅景天建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法。
技術(shù)背景高山紅景天(Z / oc7o7a sac/ a2i/ e/ sis yl萬or)又名庫頁纟工景 天，為景天科紅景天屬(欣o力'o7a Z.)多年生雙子葉草本植物。 是珍稀藥用植物之一，中醫(yī)中具有"固本扶正"之功效，具有"適 應(yīng)原"的作用。還具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射等顯 著功能，而且具有延緩肌體衰老、防止老年疾病等功效。由于高山 紅景天在工業(yè)方面的開發(fā)，野生植物大量被采挖，資源日趨枯竭。 目前，當(dāng)?shù)卣簢?yán)禁采挖。自80年代初期，就開始人工引種栽培 的研究，由于高山紅景天適應(yīng)高寒、干燥、高海拔的生長環(huán)境，不 耐高溫、潮濕氣候以及易發(fā)病等原因，大面積栽培仍沒獲得成功。 高山紅景天主要藥用成分為紅景天甙。明海泉等報(bào)道利用其甙元醇 進(jìn)行糖基化反應(yīng)人工合成紅景天甙，但反應(yīng)過程復(fù)雜，收率低。高 山紅景天細(xì)胞培養(yǎng)為紅景天甙的生產(chǎn)提供了一條途徑，但產(chǎn)量很低， 培養(yǎng)細(xì)胞中的紅景天甙含量至多只能達(dá)到野生植株的水平。許建峰 等利用細(xì)胞培養(yǎng)，用于高山紅景天次生代謝物生產(chǎn)研究，通過外界 因子、前體物、誘導(dǎo)子以及細(xì)胞發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)研究，可使細(xì)胞培養(yǎng) 密度最大達(dá)到18 g DW/L，培養(yǎng)物中的紅景天甙產(chǎn)量最大達(dá)到1980 mg/L。相當(dāng)于野生高山紅景天中紅景天甙的含量，況且，由于激素 的添加不但增加成本，且影響紅景天甙的品質(zhì)。由于毛狀根具有生長速度快、分枝多、弱向地性，處于器官化 水平，激素自養(yǎng)，生理生化、遺傳特征穩(wěn)定，有穩(wěn)定的次生代謝物 合成能力。大量培養(yǎng)毛狀根替代野生資源，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化發(fā)展。 因此建立高山紅景天毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)大量培養(yǎng)具有重要意義。自1997年Ackermann首先用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高等植物以來，迄 今已有100多種植物建立了培養(yǎng)系統(tǒng)。并且利用其進(jìn)行次生代謝物 生產(chǎn)。中藥有效成分大多在根部。而Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根具有 根的特性，且具有生長速度快、激素自養(yǎng)、分化程度較高，以及遺 傳性狀相對(duì)地穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此，較細(xì)胞培養(yǎng)更有利于次生代謝物 的大量生產(chǎn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過生物技術(shù)手段大量生產(chǎn)高山紅景天毛狀 根，利用毛狀根大量培養(yǎng)生產(chǎn)高山紅景天甙，用以替代野生資源，填補(bǔ)中藥缺口；本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天獲得毛 狀根，利用發(fā)酵罐大量培養(yǎng)毛狀根用以生產(chǎn)紅景天甙。 本^明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的.-以高山紅景天(Wc^o/a sac/m/Zwew^ ASor)為夕卜植體，禾!j 用發(fā)根農(nóng)桿菌(Jgro6a"eWww r/z/zogew", ^r)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)產(chǎn) 生毛狀根(hairy root)，通過培養(yǎng)條件(pH值、溫度、侵染時(shí)間、 共培養(yǎng)時(shí)間和乙酰丁香酮添加)優(yōu)化提高毛狀根誘導(dǎo)率。毛狀根經(jīng) 發(fā)酵罐培養(yǎng)大量生產(chǎn)毛狀根，通過碳源、氮源、光照、溫度、pH值、 誘導(dǎo)子、前體物質(zhì)和培養(yǎng)液的優(yōu)化，提高高山紅景天毛狀根紅景天 甙的含量。通過毛狀根紅景天甙的分離提取過程，生產(chǎn)紅景天甙。
該方法的具體步驟如下1、 外植體的制備將高山紅景天的無菌種子置1/2MS培養(yǎng)基萌 發(fā)，取3天苗齡的綠色子葉(留2mm左右的子葉柄)置于MS+0.5mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA培養(yǎng)基上25。C繼代培養(yǎng)。以在MS+1.2mg/L 2， 4-D+ 2.4mg/L 6-BA培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2-4天的葉片、莖段和子葉節(jié)為 外植體；2、 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)將發(fā)根農(nóng)桿菌R1000或LBA9402或R1601 或ATCC15834或A4 (菌種均由法國園藝中心提供)在YEB固體培養(yǎng)基 上活化，挑取單菌落，接種在LB液體培養(yǎng)基中，在27°C， 4000r/min 黑暗下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，發(fā)根農(nóng)桿菌菌液A。。為0.45 0.60時(shí)用于感 染夕卜植體。3、 侵染、共培養(yǎng)、毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)、除菌及篩選將外植體分別侵入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，黑暗中侵染20 30min;將侵染過的外植體 置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基pH值為 5.0 6.0)，于18。C 2(TC共培養(yǎng)2 5天；移至1/2MS +卡那霉素 50 mg/L +頭孢霉素450 mg/L+50 100m mol/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基上， 光照培養(yǎng)2 5天，弱光培養(yǎng)誘導(dǎo)毛狀根；將誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根接入 抑菌、篩選培養(yǎng)基1/2MS+Cef (500mg/L) +Km (50mg/L)保持弱光 培養(yǎng)，每周轉(zhuǎn)接一次，反復(fù)轉(zhuǎn)接3 5次后；切下抗Km根系的2 5mm的根尖，接入液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
4 、株系篩選及液體擴(kuò)大培養(yǎng)選擇生長的迅速、分枝較多的 毛狀根株系，切取長2 4mm根尖部份，置于1/2MS液體培養(yǎng)基， 50ml培養(yǎng)液裝入150ml三角瓶中弱光或暗培養(yǎng)條件下，于搖床上 50 80rpm/min振蕩培養(yǎng)，25天繼代一次。優(yōu)化培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo) 子和前體物質(zhì)有利于高山紅景天次生代謝物積累。誘導(dǎo)子為靈芝或 云芝或黑曲霉或毛霉，濃度為50mg/L 100mg/L;前體物質(zhì)為酪 醇或酪氨酸或苯丙氨酸，濃度為0.8 1.8 mmol/L。其中誘導(dǎo)子以黑
曲霉為好，前體物以酪醇為好。5、毛狀根中紅景天甙含量測定采用高效液相色譜法測定。其 結(jié)果為通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)高山紅景天得到的毛狀根，在25天左 右能夠增值15 28倍。毛狀根干品中紅景天甙含量為3.58%，約是 野生長白山高山紅景天根的5倍，西藏高山紅景天的7倍。高山紅 景天毛狀根生長量最大可達(dá)到398.21g/L;紅景天甙積累量可達(dá)到 14.26 g/L。比野生長白山高山紅景天根的0.59%有顯著的提高。6、高山紅景天毛狀根中紅景天甙的分離提取工藝取高山紅景 天毛狀根培養(yǎng)物于空氣循環(huán)干燥器60'C烘干，干粉以粉碎機(jī)粉碎成 20目的粗粉，用70%乙醇提取，或直接用70%酒精浸泡新鮮的毛狀 根培養(yǎng)物，提取紅景天甙。本方法由毛狀根培養(yǎng)物中得到的紅景天 甙的含量為毛狀根干重的3.0°/。 3. 50%，總次生代謝物生產(chǎn)率為 14.06 g/L。本發(fā)明中涉及的縮寫術(shù)語、培養(yǎng)基1. 外植體一一高山紅景天的無菌苗切成的1.0cn^葉片、lcm長 莖段及子葉節(jié)。2. 發(fā)根農(nóng)桿菌菌種--RIOOO， R1601, ATCC15834, A4 ，LBA9402由法國園藝研究中心(Tepter博士惠贈(zèng))。3. 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基LB、 YEBLB液體培養(yǎng)基為10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，10g/L NaCl，調(diào)pH值至7.2后高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基在上述 的基礎(chǔ)上加15g/L瓊脂糖。 YEP培養(yǎng)基為10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L 牛肉浸膏，15g/L瓊脂糖，調(diào)pH值至7.0后高壓滅菌。4. 植物基本培養(yǎng)基MS (Murashige and Skoog， 1962)， 50ml MS大量元素(20*)， 5ml MS微量元素(200*), 5ml Fe鹽(200*)， 10ml V維生素(100"(V^1000mg，VB6l00mg，煙酸100mg， 甘氨酸200mg，肌醇10g，生物素5mg。定容至1000ml，配成母液)， 0.2g酪素，0.2g天冬素，0.5mg氨基苯甲酸，0.25mg核黃素。葉 酸50mg用少量NaOH溶解，定容至100ml，每升培養(yǎng)基取 lml(0.5mg/ml) 。 6.5g/L瓊月旨，pH 5.8 6.0。5. 抗生素卡那霉素Km (Kanamycin)、頭孢霉素Cef(cephamycin)6. 激素2 ， 4-D ( 2 ， 4-Dichlorophenoxyacetic acid ) 、 NAA(Naphthaleneacetic acid)、 6-BA ( benzyladenine)7. 其他試劑乙酰丁 香酮 AS( 3 ， 5-mcthoxy-4-hydroxyacetophenone)、月甫氣酸Pro ( proline )、 紅景天武(salidroside) 本發(fā)明有益的效果體現(xiàn)在1、 通過毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)技術(shù)解決高山紅景天資源短缺問題， 為中藥紅景天來源開辟出一條有效途徑。高山紅景天為國家保護(hù)植 物，具有重要的藥用價(jià)值，利用毛狀根大量培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紅景天甙， 可保護(hù)有限的野生資源，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，具有實(shí)用性。2、 應(yīng)用高山紅景天毛狀根大量培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙與栽培和野生 的植物相比，可獲得穩(wěn)定的質(zhì)量和產(chǎn)量，不受自然條件的限制，不 占用耕地面積，只需占用有限的廠房和培養(yǎng)室。3、 通過人工調(diào)控優(yōu)化培養(yǎng)條件，可提高毛狀根的生長和次生代 謝物的合成，極大的提高紅景天甙的產(chǎn)量。4、 該技術(shù)在毛狀根液體大量培養(yǎng)過程中不添加任何激素，在暗 培養(yǎng)環(huán)境中快速生長，因此，可以大大降低成本。


圖l是高山紅景天無菌苗示意圖。圖2是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根示意圖。圖3是毛狀根在固體培養(yǎng)基上快速生長示意圖。圖4是毛狀根ro/基因的PCR檢測示意圖。圖5是液體培養(yǎng)的高山紅景天毛狀根示意圖。圖6是毛狀根液體培養(yǎng)基生長曲線示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 無菌苗的獲得取采自長白山海拔1700 2500米的高山紅景天種子，用自來水 沖洗凈，在75%酒精中浸泡1 min后，再用15 % NaClO消毒12min。 然后用無菌水沖洗3 5次，將水空干接種在無激素的1/2MS+ Pro 700mg/L培養(yǎng)基(瓊脂0.6%)上萌發(fā)培養(yǎng)10 18天。25°C ，光強(qiáng) 20001ux， 16小時(shí)光照，8小時(shí)暗培養(yǎng)。待15天無菌苗長出，取3 天苗齡的綠色子葉(留2mm左右的子葉柄)置于MS+0.5mg/L NAA+3.0mg/L6-BA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)如圖1所示。2 預(yù)培養(yǎng)取繼代培養(yǎng)的無菌苗的子葉節(jié)、莖段和葉片，葉片和帶葉柄的 子葉背腹面用刀輕劃，莖段切成lcm長作外植體，接種在MS+1.2mg/L 2， 4-D+ 2.4mg/L 6-BA+ Pro 700mg/L培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 3天，待邊 緣略有愈傷現(xiàn)象時(shí)用于侵染。3 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)將發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834接種在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 于27X:下活化3次，挑取平板上單菌落，接種在25ml LB液體培養(yǎng) 基。在27'C， 4000r/min黑暗下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，繼代3次后，發(fā)根
農(nóng)桿菌菌液A。。為0. 45時(shí)用于感染外植體。4 發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染、共培養(yǎng)、除菌及篩選 將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入處于對(duì)數(shù)期菌液^)。為0.45的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌液中，黑暗中侵染24min，取出用無菌濾 紙吸干多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培養(yǎng) 基上共培養(yǎng)2天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +頭孢霉素450 mg/L+60mmol/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基上，于2(TC，散射弱光照除菌培 養(yǎng)。每5天轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基。并以未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的高山紅景天 子葉、莖段和子葉節(jié)為對(duì)照。15天左右產(chǎn)生毛狀根如圖2所示。把 感染后外植體上長出的毛狀根剪下移到新的培養(yǎng)基1/2MS+卡那霉素 50 mg/L +頭孢霉素450 mg/L上，每周轉(zhuǎn)接1次，直至除菌完成后， 移到不含抗生素的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)如圖3所示。5 毛狀根優(yōu)質(zhì)株系的篩選挑選除菌徹底、經(jīng)過PCR檢測的毛狀根，將分枝多、生長快的 毛狀根剪下長1 3 cm左右，移入1/2MS+Pro700mg/L培養(yǎng)液中。150ml 三角燒瓶中，每瓶裝液50ml接入一根毛狀根。25天后觀察生長情況， 挑選生長旺盛的用于繼代及大量培養(yǎng)。 6毛狀根的檢測基因組DNA微量提取1) 取0.5g 1.0g經(jīng)過篩選的毛狀根在液氮下研磨，裝入50ml 離心管加入20ml Extraction Buffer( 100mM Tris-HC1,PH 8.0; 0.35mM Sorbitol; 5mM EDTA,PH 8.0; 1% 2-Mercaptoethanol (使用之前加入)) 并置于冰上。2) 4°C， 10000r/min離心IO分鐘，去上清，用20ml Extraction Buffer溶解沉淀兩次并離心。3) 去上清并用5ml Extraction Buffer懸浮沉淀，加入3.5ml High-Salt CTAB Buffer (50mM Tris-HCl,PH 8.0; 4M NaCl; 1.8% CTAB;25mM EDTA,PH8.0)和0.3mlSarkosyl(濃度為30%的水溶液)， 55'C溫育60 90分鐘。4) 加入等體積的氯仿異戊醇(24: 1)， 10000r/min離心10分鐘。5) 去上清加入2/3體積預(yù)冷的混合有1/10體積乙酸鈉的異丙 醇。4°C， 10000r/min離心20分鐘。6) 去上清，用冷的75%的乙醇洗滌沉淀。去乙醇，在空氣中干 燥DNA，并用200jalTE Buffer (10mM Tris,PH 8.0; lmMEDTA， PH 8.0) 溶解。7)加入10plRnase(lmg/ml)在37。C下溫育40分鐘，加入等體積 的酚氯仿，抽提去除蛋白質(zhì)。室溫下高速離心10分鐘(最好13000r/min以上)。8) 取上清加入等體積預(yù)冷的100%的氯仿，沉淀去除蛋白質(zhì)。室 溫下高速離心10分鐘。9) 取上清加入兩倍體積的冷的無水乙醇(混合1/10體積的乙 酸鈉)，沉淀DNA然后將其放于-2(TC下30分鐘。10) 用最大轉(zhuǎn)速沉淀DNA15分鐘。用75%的冷的乙醇洗滌DNA 沉淀，并在空氣中干燥。用50 00plTE Buffer溶解DNA。毛狀根的PCR檢測 取經(jīng)過篩選的毛狀根100 ng的基因組DNA為模板，以試管苗正 常根作為陰性對(duì)照，Ri質(zhì)粒為陽性對(duì)照。rolC基因的引物序列(寶 生物合成)引物I序列5、一GATATATGCCAAATTTACACTAG—3、 引物II序列5、一GTTAACAAAGTAGGAAACAGG—3、PCR反應(yīng)總體系為 50ul Taq Mix (購自寶生物) 25ul引物I 2 (20pmo1) ul引物II 2 (20pmo1) ul模板 5 (100ng) ul 去離子無菌水 16ul在PCR儀(UNOII，Biometra)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4°C， 45s; 45°C， 30s; 72°C， 45s共30個(gè)循環(huán)，72。C延長10min，如圖4所示。 7 毛狀根生長曲線的測定挑選生長旺盛的毛狀根株系，接入1/2MS培養(yǎng)液中。150ml三 角燒瓶中，每瓶裝液50ml接入毛狀根鮮重0.390g(干重0.041g)，共30瓶。每5天測定一次鮮重和干重，以平均重量為指標(biāo)繪制生長曲 線。鮮重系用布氏漏斗抽濾至無水滴下時(shí)測定，干重系60'C烘干后 測得如圖6所示。8毛狀根的液體培養(yǎng)基大量培養(yǎng)挑選生長旺盛的毛狀根株系，接入150ml三角培養(yǎng)瓶裝液50ml 的1/2MS+Pro700mg/L液體培養(yǎng)基中如圖5所示。其中碳源為蔗糖或 果糖或葡萄糖(30 g/L);NH4+禾卩N(V為氮源，總氮濃度為80 mmol/L; 光照為2000x1散射光；溫度為18°C 20°C; pH值為6.5 7.2;誘導(dǎo) 子為靈芝或云芝或黑曲霉或毛霉，濃度為50mg/L 100mg/L;前 體物質(zhì)為酪醇或酪氨酸或苯丙氨酸，濃度為0.8 1.8 mmol/L。其中 誘導(dǎo)子以黑曲霉為好，前體物以酪醇為好。 9毛狀根紅景天甙的分離提取色譜條件Ci8色譜柱(250mmx4.6mm， 5|im)，流動(dòng)相為甲醇- 水(20: 80)，流速1 ml/min，檢測波長274nm用于紅景天甙的測定。 對(duì)照品及供試品溶液的制備 紅景天甙標(biāo)準(zhǔn)品購自中國生物制品檢定所。精密稱取紅景天甙對(duì)照品5.08mg置10ml量瓶中，加甲醇至刻度， 搖勻，得紅景天甙對(duì)照品貯備液；精密量取此貯備液lml置10ml量 瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得紅景天甙對(duì)照品溶液(50.8)Lig/ml)。取 毛狀根樣品粗粉約0.4g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇90ml，浸 泡振搖60min后超聲提取30min，放冷，濾過，用少許甲醇洗滌容器， 濾過，濾液并入100ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45Lm微孔 濾膜濾過，作為供試品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密吸取紅景天甙對(duì)照品溶液0.5、 1、 2、 5、 10ml，用甲醇稀釋成含紅景天甙1.56、 4.68、 7.8、 10.92、 15.6pg/ml 5種溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y-34663.4X- 2445.1， r = 0.9997(n = 5)。紅景天甙在0.20 8.00pg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān) 系。經(jīng)計(jì)算分析紅景天甙含量為毛狀根干重的3.58%，約是野生長白 山高山紅景天根的5倍，西藏高山紅景天的7倍。高山紅景天毛狀 根生長量最大可達(dá)到398.21g/L;紅景天甙積累量可達(dá)到14.26 g/L。 10高山紅景天毛狀根中紅景天甙的分離提取工藝取高山紅景天毛狀根培養(yǎng)物于空氣循環(huán)干燥器6(TC烘干，干粉 以粉碎機(jī)粉碎成20目的粗粉，用70%乙醇提取，或直接用70%酒精 浸泡新鮮的毛狀根培養(yǎng)物，提取紅景天甙。本方法由毛狀根培養(yǎng)物 中得到的紅景天甙的含量為毛狀根干重的3.0% 3.50%，總次生代謝 物生產(chǎn)率為14.06 g/L。下面實(shí)施例2、 3、 4、 5中的1、 2、 5、 6、 7、 8、 9、 10步驟與 實(shí)施例1相同省略。 實(shí)施例23、 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)將5種發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402，接種在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 于27'C下活化3次，挑取平板上單菌落，接種在25ml LB液體培養(yǎng) 基。在27°C， 4000r/min黑暗下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，繼代3次后，發(fā)根 農(nóng)桿菌菌液A。。為0. 55時(shí)用于感染外植體。4、 發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染、共培養(yǎng)、除菌及篩選 將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入處于對(duì)數(shù)期菌液A。。為0.45 0. 60的發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402菌液中，黑暗中侵染25min，取出用無 菌濾紙吸干多余的菌液，置于MS+NAA (0. 05mg/L) + Pro 700mg/L 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2. 5天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +頭孢霉
素450 mg/L+80m mol/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基上，于20。C，散射弱光照 除菌培養(yǎng)。每5天轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基。并以未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的高山 紅景天子葉、莖段和子葉節(jié)為對(duì)照。把感染后外植體上長出的毛狀 根剪下移到新的培養(yǎng)基1/2MS+卡那霉素50 mg/L +頭孢霉素450 mg/L 上，每周轉(zhuǎn)接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培 養(yǎng)基上培養(yǎng)。 實(shí)施例33、 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)將5種發(fā)根農(nóng)桿菌A4接種在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于 27。C下活化3次，挑取平板上單菌落，接種在25ml LB液體培養(yǎng)基。 在27°C， 4000r/min黑暗下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，繼代3次后，發(fā)根農(nóng)桿 菌菌液A。。為0.50時(shí)用于感染外植體。4、 發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染、共培養(yǎng)、除菌及篩選 將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入處于對(duì)數(shù)期菌液A。。為0. 50的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液中，黑暗中侵染24min，取出用無菌濾紙 吸干多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培養(yǎng)基 上共培養(yǎng)2天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +頭孢霉素450 mg /L+90m mol/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基上，于25°C，散射弱光照除菌培養(yǎng)。 每5天轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基。并以未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的高山紅景天子葉、 莖段和子葉節(jié)為對(duì)照。把感染后外植體上長出的毛狀根剪下移到新 的培養(yǎng)基1/2MS+卡那霉素50 mg/L+頭孢霉素450 mg/L上，每周轉(zhuǎn)接 l次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 實(shí)施例43、 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)將5種發(fā)根農(nóng)桿菌R1601接種在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 于27。C下活化3次，挑取平板上單菌落，接種在25ml LB液體培養(yǎng) 基。在27°C， 4000r/min黑暗下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，繼代3次后，發(fā)根 農(nóng)桿菌菌液A。。為0.60時(shí)用于感染外植體。4、 發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染、共培養(yǎng)、除菌及篩選 將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入處于對(duì)數(shù)期菌液A。。為0.60的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601菌液中，黑暗中侵染25min，取出用無菌濾紙吸干 多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培養(yǎng)基上共 培養(yǎng)3天后，移至1/2MS +卡那霉素50mg/L +頭孢霉素450mg/L+ 70m mol/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基上，于25°C，散射弱光照除菌培養(yǎng)。每5 天轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基。并以未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的高山紅景天子葉、莖 段和子葉節(jié)為對(duì)照。把感染后外植體上長出的毛狀根剪下移到新的 培養(yǎng)基1/2MS+卡那霉素50 mg/L+頭孢霉素450 mg/L上，每周轉(zhuǎn)接1 次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 實(shí)施例53、 發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)將5種發(fā)根農(nóng)桿菌RIOOO，接種在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 于27。C下活化3次，挑取平板上單菌落，接種在25ml LB液體培養(yǎng) 基。在27eC， 4000r/min黑暗下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，繼代3次后，發(fā)根 農(nóng)桿菌菌液A。。為0. 45 0. 60時(shí)用于感染外植體。4、 發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染、共培養(yǎng)、除菌及篩選 將上述預(yù)培養(yǎng)的外植體分別浸入處于對(duì)數(shù)期菌液A。。為0. 55的發(fā)根農(nóng)桿菌R1000菌液中，黑暗中侵染30min，取出用無菌濾紙吸干 多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培養(yǎng)基上共 培養(yǎng)3天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +頭孢霉素450 mg/L+ 90m mol/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基上，于25°C，散射弱光照除菌培養(yǎng)。每5 天轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基。并以未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的高山紅景天 子葉、莖段和子葉節(jié)為對(duì)照。把感染后外植體上長出的毛狀根剪下 移到新的培養(yǎng)基1/2MS+卡那霉素50 mg/L+頭孢霉素450 mg/L上，每 周轉(zhuǎn)接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上 培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1、 一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天建立毛狀根培養(yǎng)體 系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于其特點(diǎn)在于以高山紅景天(i /zoflf/o/a sac/za/z7 ews" A5or ) 為夕卜植體，禾'J用發(fā)根農(nóng)桿菌 (々ro6""eW謂Wn'zoge"es,爿r)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根(hairy root),通過培養(yǎng)條件(pH值、溫度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和乙酰 丁香酮添加)優(yōu)化提高毛狀根誘導(dǎo)率；毛狀根經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)大量生 產(chǎn)毛狀根，通過碳源、氮源、光照、溫度、pH值、誘導(dǎo)子、前體物 質(zhì)和培養(yǎng)液的優(yōu)化，提高高山紅景天毛狀根紅景天甙的含量；通過 毛狀根紅景天甙的分離提取過程，生產(chǎn)紅景天甙。
2、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于高山紅景 天為長白山高山紅景天或西藏高山紅景天。
3、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于發(fā)根農(nóng)桿 菌菌系為ATCC15834或A4或Ri1000或LBA9402或Ril601。
4、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值為5力 6.0;培養(yǎng)溫度為18°C 20°C。
5、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高山紅景天侵染時(shí)間為20 30 min;共培養(yǎng)時(shí)間為2 3天。
6、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于發(fā)根農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化高山紅景天的培養(yǎng)過程添加乙酰丁香酮為50 100u mol/L。
7、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于毛狀根培 養(yǎng)培養(yǎng)液碳源為蔗糖、果糖和葡萄糖，添加量為20 35g/L。
8、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于毛狀根培 養(yǎng)培養(yǎng)液中NH/和N03-為氮源，總氮濃度為65 85 mmol/L。
9、 如權(quán)利要求1所述一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天 建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法，其特征在于毛狀根培 養(yǎng)液為1/2MS培養(yǎng)液，培養(yǎng)光照為2000x1散射光，培養(yǎng)溫度為18 。C 2(TC，培養(yǎng)液pH值為6.5 7.2，誘導(dǎo)子為靈芝、云芝、黑曲霉 和毛霉，添加濃度為50mg/L 100mg/L，前體物質(zhì)為酪醇、酪氨 酸及苯丙氨酸，添加濃度為0.8 1.8 mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)遺傳轉(zhuǎn)化高山紅景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)建立毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法。通過外植體的制備，發(fā)根農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)，對(duì)高山紅景天進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，經(jīng)PCR檢測，證明毛狀根為轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，利用發(fā)酵罐培養(yǎng)大量生產(chǎn)毛狀根，通過添加前體物質(zhì)和誘導(dǎo)子提高紅景天甙含量，用以生產(chǎn)紅景天甙，替代瀕臨枯竭的高山紅景天資源。
文檔編號(hào)C12P19/44GK101121941SQ20071005546
公開日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2007年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者周曉馥, 徐洪偉 申請(qǐng)人:吉林師范大學(xué)