專利名稱：長春花毛狀根再生植株的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的方法，特別是一種長春花毛狀根再生植株的方法。
背景技術：
長春花(Catharanthus roseus)是夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬植物，目前人們從長春花全草中分離了100多種萜類吲哚生物堿，如長春堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、阿嗎堿(Ajmalicine)、蛇根堿(Serpentine)、文多靈堿(Vindoline)、長春質堿(Catharanthine)等。大多數萜類吲哚生物堿由于具有生物學活性而被廣泛應用于現代醫(yī)藥中，如著名的抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿是目前應用最廣的天然植物抗腫瘤藥物，其硫酸鹽已廣泛應用于臨床。長春堿和長春新堿是目前長春花中藥用價值最大、應用最廣泛的抗癌萜類吲哚生物堿。它們主要從天然長春花植株中提取，但天然植物體內含量極其微少，使得長春花材料來源困難，僅從天然植物中提取萜類吲哚生物堿遠遠不能滿足市場需求。長春堿和長春新堿由于化學結構復雜，化學合成和半合成成本太高，也不具有商業(yè)前景。利用基因工程技術獲得萜類吲哚生物堿高產的長春花新品種是一種有效方法，但直接通過根癌農桿菌轉化獲得轉基因長春花植株目前還未見報道。通過發(fā)根農桿菌轉化很容易獲得萜類吲哚生物堿高產的長春花轉基因毛狀根，由于轉化毛狀根起源于一個單細胞，由毛狀根再生的植株是純合體，解決了Ti質粒轉化形成嵌合體問題。Ri質粒的T-DNA可按照孟德爾方式穩(wěn)定遺傳，再生的轉化植株經數代分化繁殖其克隆的性質不變，大多數轉化植株均表現出特異的可遺傳表型。
經檢索發(fā)現，現有文獻中目前已有100多種植物通過發(fā)根農桿菌感染獲得毛狀根并再生出完整的再生植株。由轉基因長春花毛狀根再生出完整植株，通過篩選鑒定具有高含量萜類吲哚生物堿的轉化長春花植株可為理論研究和生產實踐帶來巨大的動力和效益，將為最終解決抗腫瘤萜類吲哚生物堿藥物稀缺提供長春花優(yōu)質新品種，但尚未發(fā)現與本發(fā)明主題所提及的長春花毛狀根再生植株的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種長春花毛狀根再生植株的方法。本發(fā)明中涉及的長春花毛狀根不定芽誘導培養(yǎng)基、不定芽生根培養(yǎng)基、再生植株快速繁殖培養(yǎng)基和移栽基質用于本發(fā)明組織培養(yǎng)的方法，建立了長春花毛狀根再生植株的方法，為長春花品種改良和生物技術育種奠定堅實的基礎，促進了我國長春花藥物技術領域的發(fā)展。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的本發(fā)明將長春花毛狀根外植體切段，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，經光照培養(yǎng)，形成愈傷組織；通過接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成芽點；挑選芽點的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，經光照培養(yǎng)，形成不定芽。切取不定芽轉移到生根培養(yǎng)基上，產生出不定根，將再生出的完整植株轉移到快速繁殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，選取株系，移栽到盛有移栽基質的花盆中，通過馴化可獲得生長正常的長春花植株。
本發(fā)明包括如下步驟(1)長春花毛狀根愈傷組織的誘導和不定芽的分化將長春花毛狀根切成2-3cm長的節(jié)段，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。培養(yǎng)溫度為25±1℃，每天光照16小時，經過10-20天的光照培養(yǎng)，可在外植體周圍形成愈傷組織；將愈傷組織接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2代，每代20-25天，所述的不定芽誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。在愈傷組織上形成大量綠色芽點；挑選含綠色芽點的愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)，經過20天的培養(yǎng)，綠色芽點生長并分化形成不定芽。
(2)長春花不定芽的生根切取從長春花毛狀根分化的不定芽，置入生根培養(yǎng)基中，所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。培養(yǎng)溫度為25+1℃，每天光照16小時，經過20天的光照培養(yǎng)，可從不定芽基部分化出不定根，從而形成再生的完整植株。
(3)長春花再生植株的快速繁殖選取生長健壯的長春花再生植株，通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，形成長春花再生植株株系。所述的快速繁殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。
(4)長春花再生植株的移栽選取生長健壯、繁殖系數高的株系，移栽到裝有移栽基質的花盆中，所述的移栽基質成分為蛭石∶珍珠巖∶泥炭土(2∶1∶6)。通過馴化可獲得生長正常的長春花植株。
本發(fā)明采用組織培養(yǎng)的方法，篩選出適合長春花毛狀根不定芽分化和生根的培養(yǎng)基，長春花毛狀根的不定芽分化率達80％，不定芽生根率為100％，再生植株的移栽成活率為100％，長春花毛狀根再生技術的建立，為長春花品種改良和生物技術育種奠定了堅實的基礎。從各種轉基因長春花毛狀根再生出完整植株，能夠獲得萜類吲哚生物堿高產的轉基因長春花新品系，為解決萜類吲哚生物堿藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產需要具有重要意義。
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解為這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1長春花毛狀根愈傷組織的誘導和不定芽的分化將長春花毛狀根外植體切成2-3cm長的節(jié)段，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS(Murashige and Skoog，1962)+萘乙酸(NAA)0.3mg/L+6-芐基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。經過10-20天的光照培養(yǎng)，可在毛狀根上長滿瘤狀的愈傷組織，愈傷組織的誘導率達100％；將愈傷組織接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1-2代，每代20-25天，在愈傷組織表面產生大量淺綠色芽點，不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+萘乙酸(NAA)0.3mg/L+6-芐基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+3％蔗糖+0.26％植物凝膠；挑選含綠色芽點的愈傷組織繼續(xù)在上述培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，經過20天左右的培養(yǎng)，綠色芽點逐漸生長分化形成不定芽，不定芽的分化率達80％以上，再經過20天左右的培養(yǎng)不定芽可長高至2cm。
以上各類培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度均為25±1℃，每天光照16小時。
實施例2長春花不定芽的生根切取實施例1中分化的不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+3％蔗糖+0.26％植物凝膠，培養(yǎng)溫度均為25±1℃，每天光照16小時。經過8-10天的培養(yǎng)，在不定芽基部出現肉眼可見的白色根突，經過20天的光照培養(yǎng)，可分化出5-10條不定根，不定根的分化率為100％，30天后可長成5-6cm高、具有3-5對葉片的試管苗。
實施例3長春花再生植株的快速繁殖選取實施例2中生長健壯的長春花再生植株，通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可形成長春花再生植株株系?？焖俜敝撑囵B(yǎng)基為不添加任何植物生長調節(jié)物質的MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.26％植物凝膠，培養(yǎng)溫度均為25±1℃，每天光照16小時。
實施例4長春花再生植株的移栽選取生長健壯、繁殖系數高的再生株系，用鑷子小心取出無菌試管苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽到盛有基質的花盆中，基質中的成分為蛭石、珍珠巖和泥炭土，其配方比例為2∶1∶6。通過馴化2周后可移栽到大田中，可獲得生長正常的長春花植株，移栽成活率達100％。
通過研究，在本發(fā)明中提供了一種從長春花毛狀根再生植株的方法。應用本發(fā)明的方法，可以從各種轉基因長春花毛狀根再生出完整植株，從而獲得萜類吲哚生物堿高產的轉基因長春花新品系，為解決萜類吲哚生物堿藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產需要具有重要意義。
權利要求
1.一種長春花毛狀根再生植株的方法，其特征在于，將長春花毛狀根外植體切段，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，經光照培養(yǎng)，形成愈傷組織，通過接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成芽點，挑選芽點的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，經光照培養(yǎng)，形成不定芽，切取不定芽轉移到生根培養(yǎng)基上，產生出不定根，將再生出的完整植株轉移到快速繁殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，選取株系，移栽到盛有移栽基質的花盆中，通過馴化可獲得生長正常的長春花植株。
2.根據權利要求1所述的長春花毛狀根再生植株的方法，其特征是，包括如下具體步驟(1)長春花毛狀根愈傷組織的誘導和不定芽的分化，將長春花毛狀根切成2-3cm長的節(jié)段，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25±1℃，每天光照16小時，經過10-20天的光照培養(yǎng)，可在外植體周圍形成愈傷組織，將愈傷組織接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2代，每代20-25天，在愈傷組織上形成大量綠色芽點；挑選含綠色芽點的愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)，經過20天的培養(yǎng)，綠色芽點生長并分化形成不定芽；(2)長春花不定芽的生根，切取從長春花毛狀根分化的不定芽，置入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25±1℃，每天光照16小時，經過20天的光照培養(yǎng)，從不定芽基部分化出不定根，從而形成再生的完整植株；(3)長春花再生植株的快速繁殖，選取生長健壯的長春花再生植株，通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，形成長春花再生植株株系；(4)長春花再生植株的移栽，選取生長健壯、繁殖系數高的株系，移栽到裝有移栽基質的花盆中，通過馴化可獲得生長正常的長春花植株。
3.根據權利要求1或者2所述的長春花毛狀根再生植株的方法，其特征是，所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。
4.根據權利要求1所述的長春花毛狀根再生植株的方法，其特征是，所述的不定芽誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。
5.根據權利要求1所述的長春花毛狀根再生植株的方法，其特征是，所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。
6.根據權利要求1所述的長春花毛狀根再生植株的方法，其特征是，所述的快速繁殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.26％植物凝膠。
7.根據權利要求1所述的長春花毛狀根再生植株的方法，其特征是，所述的移栽基質成分為蛭石∶珍珠巖∶泥炭土為2∶1∶6。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術領域的長春花毛狀根再生植株的方法。本發(fā)明將長春花毛狀根外植體切段，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，經光照培養(yǎng)，形成愈傷組織，通過接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成芽點，挑選芽點的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，經光照培養(yǎng)，形成不定芽，切取不定芽轉移到生根培養(yǎng)基上，產生出不定根，將再生出的完整植株轉移到快速繁殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，選取株系，移栽到盛有移栽基質的花盆中，通過馴化可獲得生長正常的長春花植株。本發(fā)明篩選出適合長春花毛狀根不定芽分化和生根的培養(yǎng)基，長春花毛狀根的不定芽分化率達80％，不定芽生根率為100％，再生植株的移栽成活率為100％。
文檔編號A01H4/00GK1788551SQ20051011122
公開日2006年6月21日 申請日期2005年12月8日 優(yōu)先權日2005年12月8日
發(fā)明者唐克軒, 龔一富, 苗志奇, 孫小芬 申請人:上海交通大學