專利名稱：控制端粒長度的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及控制端粒長度的方法，其中真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性經過修飾，以在真核細胞中修飾內源Mrell蛋白的生理學活性的物質為活性組分的端粒長度控制劑，和與端粒長度相關的疾病的基因治療劑，所述的基因治療劑包含作為活性成分的能在真核細胞中修飾內源Mrell蛋白的生理學活性物質。
背景技術：
端粒是位于組成真核細胞的絲狀染色體的雙鏈DNA末端的功能性結構。已知這一結構通常包含簡單重復序列，并且在阻止由于染色體融合造成的染色體畸變，在有絲分裂過程中的染色體配對，控制基因表達，和決定在核中染色體的形成中起著重要的作用。
一般來說，雙鏈DNA的復制是通過由引物酶合成RNA引物，在其末端由DNA聚合酶使DNA鏈的延長-合成而進行的。上述RNA引物通過DNA聚合酶的5′-3′內切酶活性去除，同時所去除的部分通過DNA聚合酶的作用由DNA鏈所替代。但是對于絲狀染色體，沒有DNA鏈替換大多數新生DNA鏈5′-端的RNA引物，因此當復制完成后所得的染色體短了RNA引物大小的一段。由此每次細胞分裂所得的子細胞中都累積性地由染色體的末端縮短其長度，最終染色體變得不穩(wěn)定并導致細胞死亡。另一方面，已表明在無限增殖的細胞中，可使端粒延長的端粒酶高度表達，從而使端粒的長度不能縮短。由此我們對有關細胞壽命的調節(jié)劑或在其機制中涉及端粒酶活性的抗癌劑進行了詳細地研究。
然而，最近有報道在酵母和小鼠等生物中，即使其端粒酶基因被破壞，其端粒的縮短仍然要耗費一定的時間[Blasco，M.A.，et al.Cell，9125-34(1997)；Rudolph，K.L.，et al.Cell，96701-12(1999)；Herrera，E.，etal.Embo 3，182950-60(1999)]，另外并不與端粒酶活性直接相關的基因的變異體也導致端粒的縮短或延長[Boulton，S.3.，et al.Embo 3，171819-28(1998)；Furuse，M.，et al.Embo 3，176412-25(1998)；Wilson，S.et al.Nucleic Acids Res，272655-61(1999)]。因此，說明存在維持端粒的非端粒酶的潛在機制[Nakamura，T.M.，et al.Science，282493-6(1998)；Reddel，R.R.，et al.A review.Biochemistry(Mosc)，621254-62(1997)]。具體說來，已有報道，用于修復雙鏈DNA斷裂等的Mrell-Rad5O-Xrs2復合物也與控制端粒酶長度相關[Boulton，5.3.，et al.Embo 3，171819-28(1998)；Puruse，M.，et al.Embo 1，176412-25(1998)；Le，S.，et al.Genetics，152143-52(1999)]。Mrell-Rad5O-Xrs2(Nbsl)復合物[Ajimura，M.，et al.Genetics，13351-66(1993)；Johzuka，K.，et al.Genetics，1391521-32(1995)]是以具有強DNA結合活性且起雙鏈DNA外切酶和單鏈內切酶作用的Mrell作為核心所形成的的蛋白復合物[Furuse，M.，et al.Embo 3，176412-25(1998)；Paull，T.T.，et al.Mol Cell，1969-79(1998)；Usui，T.，et al.Cell，95705-16(1998)；Trujillo，K.M.，et al.3 Biol Chem，27321447-50(1998)]。所述的復合物作為核心酶起始修復DNA雙鏈斷裂或染色體重組的反應。在出芽酵母中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，即使組成這種酶-復合物的蛋白之一缺失，也可觀察到端粒的明顯縮短[Boulton，S.J.，et al.Embo 3，171819-28(1998)]。在人體中存在Mrell-Rad5O-Xrs2(Nbsl)復合物中所有組成型蛋白的同系物[Dolganov，G.M.，et al.Mol Cell Biol，164832-41(1996)；Petrini，J.H.，et al.Genomics，2980-6(1995)]，據認為它們在從酵母到人的所有真核生物中具有共同的功能。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供控制端粒長度的方法，該方法包括修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性。
對上述內容進行詳細研究的結果的基礎上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性可以控制端粒的長度，進而完成了本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明是一種控制端粒長度的方法，該方法包括修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性。此處，所述的修飾內源Mrell蛋白的生理學活性是通過在下述DNA能夠表達的狀態(tài)下向細胞中引入編碼外源Mrell蛋白的DNA或編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA而進行的。
而且，本發(fā)明是包含以在真核細胞中修飾內源Mrell蛋白的生理學活性的物質作為活性組分的端粒長度控制劑和與端粒長度相關的疾病的基因治療劑。此處，在真核細胞中修飾內源Mrell蛋白的生理學活性的物質可以包括含有處于能夠表達狀態(tài)下的下述DNA的DNA構建體即編碼外源Mrell蛋白的DNA或編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA。
在本發(fā)明中提供下述的蛋白(a)或(b)，其作為外源Mrell蛋白(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含從、在或對如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白。
而且，在本發(fā)明中提供下述DNA(c)或(d)，其作為編碼外源Mrell蛋白的DNA(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在嚴謹條件下與(c)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白的DNA。
本發(fā)明還提供下述蛋白(e)或(f)，作為其中的外源Mrell蛋白核酸酶結構域經過修飾的蛋白(e)包含如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含從、在或對如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
而且在本發(fā)明中提供下述DNA(g)或(h)，作為編碼其中的外源Mrell蛋白核酸酶結構域經過修飾的蛋白的DNA(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在嚴謹條件下與(g)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
而且本發(fā)明還提供下述蛋白(i)或(j)，作為其中的外源Mrell蛋白C-末端結構域經修飾的蛋白(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含從、在或對如SEQ ID NO8所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白。
再一方面，本發(fā)明提供下述DNA(k)或(l)，作為編碼其中的外源Mrell蛋白C-末端結構域經修飾的蛋白的DNA(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可與(k)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白的DNA。
通過下述內容對本發(fā)明進行詳細介紹。
依照本發(fā)明控制端粒長度的方法是基于對真核細胞中的內源Mrell蛋白的生理學活性進行修飾而進行的。此處所用的術語“控制端粒的長度”是指縮短，保持或延長細胞中端粒的長度。術語“內源Mrell蛋白”是指天然存在于細胞內并具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白。術語“Mrell蛋白生理學活性”是指至少下列活性之一與Rad50蛋白和Xrs2(Nbsl)蛋白形成復合物的能力，雙鏈DNA結合活性，雙鏈DNA外切酶活性和單鏈DNA內切酶活性。所述的雙鏈DNA外切酶活生和單鏈DNA內切酶活性作為一個整體指核酸酶活性。另外“修飾”是指提高，降低或缺失，部分或全部內源Mrell蛋白的生理學活性。例如，端粒的縮短可以通過在下述DNA可以表達的狀態(tài)下向細胞中引入編碼全長外源Mrell蛋白的DNA或編碼其中的外源Mrell蛋白核酸酶結構域經過修飾的蛋白的DNA。此處“DNA可以表達的狀態(tài)”是指一種狀態(tài)，其中所述的DNA包含在帶有與所述表達有關的DNA區(qū)域，如啟動子，的載體中，以使由所述的DNA編碼的蛋白能在引入了所述DNA的細胞中表達。相反，端粒長度的維持或增加是通過在下述DNA可以表達的狀態(tài)下將編碼其中的外源Mrell蛋白C末端結構域經修飾的蛋白的DNA引入細胞而進行的。此處術語“外源Mrell蛋白”是指由靶細胞外衍生的Mrell蛋白。術語“修飾”是指從、在或對功能結構域進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加。
1.編碼外源Mrell蛋白的DNA的制備(1)編碼外源Mrell蛋白的DNA的來源任何生物來源的細胞，只要具有編碼Mrell蛋白的DNA的均可作為編碼可用于控制端粒長度的外源Mrell蛋白的DNA的來源，沒有特別地限定。其實例包括來源于多種真核生物如人(Homo sapiens)，小鼠(Musmusculus)，南非爪蛙(Xenopus laevis)，蠅(Drosophila melanoaster)，擬南芥(Arabidopsis thaliana)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiac)，Coprinuscinereus，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。優(yōu)選地，編碼用于控制端粒長度的外源Mrell蛋白的DNA可以來源于與端粒長度控制靶細胞相同的種。對于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)與Mrell蛋白相應的蛋白稱作Rad32。例如，控制人細胞端粒長度，優(yōu)選使用編碼人Mrell蛋白的DNA，控制釀酒酵母細胞的端粒長度優(yōu)選使用編碼釀酒酵母的Mrell蛋白的DNA。
(2)編碼外源Mrell蛋白的DNA的制備編碼外源Mrell蛋白的DNA可以通過篩選由上述(1)中所述生物體的細胞制備的DNA基因組文庫或cDNA文庫獲得，或用基因組DNA文庫或cDNA文庫作為模板直接由PCR擴增獲得。
例如，通過篩選cDNA文庫獲得編碼Mrell蛋白的DNA，開始通過例如硫氰酸胍法從上述(1)中所述的生物體的細胞制備mRNAs。接下來，與含寡-dT序列的合成DNA引物雜交，然后通過反轉錄酶合成單鏈cDNA。然后利用大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA連接酶和RnaseH通過常規(guī)的方法合成雙鏈cDNA，然后由T4DNA聚合酶將cDNA的末端補平，由T4DNA連接酶將DNA接頭如EcoRI接頭連接到cDNA鏈的兩端。再通過常規(guī)的方法將添加了DNA接頭的cDNA鏈插入到可商購的λ噬菌體載體(如可購自Stratagene的λZAP)或質粒載體(如在購自PromegaBiotech的pGEM2)上。這樣即可獲得一組重組的噬菌體DNA或質粒DNA。
接下來，用可商購的體外包裝試劑盒(如購自PromegaBiotech的Gigapack Gold)對上述組的重組λ噬菌體DNA組進行體外包裝，以產生包含重組λ噬菌體DNAs的噬菌體顆粒。將所得的重組λ噬菌體顆粒通過常規(guī)方法轉化宿主細胞，如大腸桿菌[Maniatis，T.，et al.Molecular Cloning.ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989]。擴增所得的轉化子，由此獲得噬菌體cDNA文庫。
另一方面，對于重組質粒DNAs的組，例如，通過常規(guī)方法將質粒DNAs轉化宿主細胞，如大腸桿菌。擴增所得的轉化子，由此獲得質粒cDNA文庫。
接下來，將上述的轉化子擴增，轉移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，如購自DuPont的Gene Screening Plus，在堿性條件下去除蛋白膜上的λ噬菌體DNAs或質粒DNAs與用放射性標記的來自編碼Mrell蛋白的DNA的部分片段的探針雜交，選擇陽性克隆。此處所用的探針可由根據編碼Mrell蛋白部分氨基酸序列的DNA序列設計的引物通過PCR制備。例如用于篩選包含編碼酵母Mrell蛋白的陽性克隆的探針可用5′-gtgccattattatttcagaa-3′(SEQ ID NO9)和5′-gggatcaagtacaactattttc-3′(SEQ ID NO10)為引物由PCR-制備。培養(yǎng)所得的陽性克隆并由此培養(yǎng)物獲得λ噬菌體DNAs或質粒DNAs。
另外，通過直接PCR-擴增編碼Mrell蛋白的DNA，首先由如上述(1)中所述的生物體細胞中制備基因組DNA或cDNA。然后，用所獲得的基因組DNA或cDNA為模板，以編碼Mrell蛋白N末端氨基酸序列的DNA和編碼Mrell蛋白C末端氨基酸序列的DNA為引物進行PCR。然后將PCR-擴增片段連接到合適的載體上。用于擴增編碼酵母Mrell蛋白的DNA的引物的例子包括5′-atggactatcctgatccaga-3′(SEQ ID NO11)和5′-gggatcaagtacaactattttc-3′(SEQ ID NO12)。對于通過直接PCR擴增的方法獲得編碼Mrell蛋白的DNA的情況，優(yōu)選使用pfu聚合酶作為DNA合成酶，因為該酶的錯讀率低。
由任何已知的方法，如雙脫氧法，確定核酸序列，以證明依照上述方法獲得的DNA是編碼Mrell蛋白的DNA。通常確定核苷酸序列可以通過自動核酸測序儀(如PERKIN-ELMER制造的373ADNA測序儀)進行。
SEQ ID NOS1和3分別是編碼釀酒酵母和人的Mrell蛋白的DNAs的核酸序列，SEQ ID NOS2和4分別是所述蛋白氨基酸序列的示例。但是只要所述蛋白具有Mrell蛋白的生理學活性，所述蛋白也可以是由這些氨基酸序列缺失，取代和添加一個或多個氨基酸而形成的變異體。
例如可由如SEQ ID NOS2或4所示的氨基酸序列中缺失一個或多個，優(yōu)選約20到30個，更優(yōu)選10到20個氨基酸。也可以向如SEQ ID NOS2或4所示的氨基酸序列中添加一個或多個，優(yōu)選約20到30個，更優(yōu)選10到20個氨基酸?；蛘哂闷渌被崛〈鏢EQ ID NOS2或4所示的氨基酸序列中的一個或多個，優(yōu)選約20到30個，更優(yōu)選10到20個氨基酸。
而且可以在嚴謹條件下與上述基因雜交的DNA，只要其編碼具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白均可用于本發(fā)明。術語“嚴謹條件”是指例如，鈉濃度在33到70mM，優(yōu)選50到66mM溫度為40到70℃，優(yōu)選55到68℃。
所述的Mrell蛋白的生理學活性如上所述是指雙鏈DNA結合活性，雙鏈DNA內切酶活性和單鏈DNA內切酶活性，這些活性均可依照Furuse等所述的方法確定[Furuse et al.EMBO J 176412-25(1998)]。
2.向編碼外源Mrell蛋白的DNA中引入變異在以下述DNA能夠表達的狀態(tài)下，與將編碼野生型Mrell蛋白的DNA引入細胞的情況相比，將編碼核酸酶結構域經過修飾的外源Mrell蛋白變異體的DNA引入細胞使端粒變得更短。與將編碼野生型Mrell蛋白的DNA引入細胞的情況不同，將編碼C-末端結構域經過修飾的外源Mrell蛋白變異體的DNA以下述DNA能夠表達的狀態(tài)引入細胞時，端粒長度保持不變或加長。此處，術語“核酸酶結構域”是指在組成Mrell蛋白的氨基酸序列中負責所述蛋白的雙鏈DNA內切酶活性和單鏈DNA內切酶活性的氨基酸序列。具體說來，例如對于酵母Mrell蛋白，所述的核酸酶結構域對應于自N-末端起算第225到450位的氨基酸。術語“C末端結構域”是指在組成Mrell蛋白的氨基酸序列中處于羧基端負責所述蛋白雙鏈DNA結合活性的氨基酸序列。具體說來，例如對于酵母Mrell蛋白，所述的C末端結構域對應于從N末端起算從第600個氨基酸向前的區(qū)域。
編碼Mrell蛋白變異體的DNA可如下述制備。例如，制備編碼在Mrell蛋白的核酸酶結構域具有一個或多個氨基酸被不同氨基酸取代的蛋白的DNA，可以用例如基于PCR的定點誘變的方法[Saigo Kaoru et al.″BUNSHISEIBUTSU-GAKU JIKKEN PROTOCOL I(Experiment Protocol Ifor Molecular Biology)，p.263-270，Maruzen，1997]，其在本發(fā)明所屬領域中是已知的。
3.編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA引入細胞可以通過下述方法將編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA引入細胞。即，在如上述1或2中所述制備了包含編碼Mrell蛋白或其變異體的DNA的載體后，將所得的重組載體引入宿主細胞。
(1)重組載體的制備可以通過將編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA連接(插入)到合適的載體中而獲得重組載體。此處所用的載體沒有特別的限定，只要其能在宿主細胞中復制即可。所述載體的實例包括質粒載體和病毒載體。
用于酵母細胞的質粒載體可以是pMAC56laur，YEp13，YEp24，YCp50等，用于動物宿主細胞的病毒載體可以是反轉錄病毒，痘病毒等。
將編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA連接到載體上可以應用下述方法，其中，先用合適的限制性內切酶切割包含上述DNA的DNA片段，再將其連接到載體DNA的限制性內切酶位點或多克隆位點。
必須將所述的編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA以其在所述宿主細胞中可表達的方式整合到所述載體中。因此除啟動子和編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA之外，需要時還可連接上順式元件如增強子，剪接信號，polyA附加信號和選擇標記。此處選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因，殺稻瘟菌素抗性基因，aureobasidin抗性基因，和G418抗性基因。
順便提到的是，包含編碼Mrell蛋白的DNA重組載體pMACMrellD16A，其中用丙氨酸取代從Mrell蛋白N-末端起第16位的精氨酸，和包含帶有C-末端結構域缺失的編碼Mrell蛋白的DNA的重組載體pMACMrellΔC49分別引入大腸桿菌DH5α菌株(ERKNMREllD16AYOPAUR和ERKNMREllDC49YOPAUR)并在1999年12月22日保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NIBH)，(Higashi 1-1-3，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏號為Nos.FERMBP-7421和FERM BP-7422。
(2)轉化細胞的制備可以將重組載體引入宿主細胞來制備轉化細胞，從而使所需基因得以表達。此處宿主細胞可以是任何真核細胞，沒有特別的限定，只要其絲狀染色體包含端粒即可。這樣的實例包括酵母，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，動物細胞如COS細胞和CHO細胞，或昆蟲細胞如Sf9，Sf21。
當用酵母作為宿主時，可使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)等。這種情況下可以用能在酵母中表達的任何啟動子，而沒有特別的限定。這樣的實例包括gal1啟動子，gal10啟動子，熱激蛋白啟動子，MFαl啟動子，PH05啟動子，PGK啟動子，GAP12啟動子，ADH啟動子，AOX1啟動子。向酵母細胞中引入重組載體的方法可以是能將DNA引入酵母的任何方法，而沒有特別的限定，例如電穿孔[Becker，D.M.etal.Methods.Enzymol.，194182(1990)]，原生質體法[Hinnen，A.等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，751929(1978)]，和醋酸鋰法[Itoh，H.3.Bacteriol.，153163(1983)]。
當用動物細胞作為宿主細胞時，可以使用猴COS-7細胞，Vero，中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)，小鼠L細胞，大鼠GH3，或人FL細胞。作為啟動子可以使用SRα啟動子，SV40啟動子，LTR啟動子，CMV啟動子等，也可以用人巨細胞早期基因啟動子。將重組載體導入動物細胞的方法的例子包括電穿孔法，醋酸鋰法和脂質轉染法。
當用昆蟲細胞作為宿主時可以使用Sf9細胞，Sf21細胞等。將重組載體導入昆蟲細胞的方法的例子包括磷酸鈣法，脂質轉染法，電穿孔法等。
4.端粒長度分析可以利用能與端粒序列特異性雜交的探針進行雜交分析端粒長度。例如為分析酵母細胞中的端粒長度，可以先從作為對照的酵母細胞和試驗用酵母細胞中抽提基因組DNAs。接下來用合適的限制性內切酶(如XhoI)消化所得的基因組DNA，再通過瓊脂糖凝膠電泳分離所得的片段。此后在堿性條件下將其轉移到尼龍膜上，在合適的條件下和能與端粒序列特異性雜交的標記探針雜交。此處所用的探針可以是包含序列5′-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt-3′(SEQ ID NO13)的寡核苷酸。洗膜后，通過放射自顯影或imaging plate(如由Fuji Photo Film有限公司制造的BAS2000)觀察。比較作為對照的酵母細胞的泳道和試驗酵母細胞的泳道，清楚地表明它們端粒長度的不同。
5.作為控制端粒長度的試劑和對治療與端粒長度-相關的疾病進行基因治療的試劑的用途通過修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性可以在細胞中控制端粒的長度。因此，包含以修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性的物質作為活性組分的試劑，作為控制端粒長度的試劑和對治療與端粒長度-相關的疾病進行基因治療的試劑價值巨大。上述修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性的物質的例子包括，含有以能夠表達的狀態(tài)存在的下述DNA的DNA構建體，所述DNA為編碼Mrell蛋白DNA或編碼其中的Mrell蛋白核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA。
(1)控制端粒長度的試劑含有以能夠表達的狀態(tài)存在的編碼Mrell蛋白DNA的DNA構建體，所述的Mrell蛋白是一種其中的Mrell蛋白核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白，上述DNA構建體作為端粒長度控制劑(如控制端粒長度的試劑)是有用的。在具有含端粒的染色體的任何生物的任何細胞中控制端粒長度都是可能的。為促進端?？s短可向細胞中引入下述DNA構建體，其含有以能夠表達的狀態(tài)存在的編碼Mrell蛋白或含有經修飾的Mrell蛋白核酸酶結構域的核酸酶結構域的蛋白的DNA。相反，為了維持或延長端粒長度可向細胞中引入下述DNA構建體，其含有以能夠表達的狀態(tài)存在的編碼其中的Mrell蛋白C末端結構域經修飾的蛋白的DNA。
將基因引入酵母細胞的方法可以是能將DNA引入酵母的任何方法，沒有特別的限定，例如電穿孔[Becker，D.M.et al.Methods.Enzymol.，194182(1990)]，原生質體法[Hinnen，A.等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，751929(1978)]，和醋酸鋰法[Itoh，H.3.Bacteriol.，153163(1983)]。將基因引入動物細胞的方法的例子包括電穿孔法，磷酸鈣法和脂質轉染法。
(2)與端粒長度-相關的疾病的基因治療試劑術語“端粒長度-相關疾病”是指任何初起涉及端粒長度的疾病。所述疾病的例子包括惡性腫瘤(如黑素瘤，肝細胞瘤，乳腺癌，胃癌，腦瘤)其中，因為其中提高的端粒酶活性，在其染色體上并不出現(xiàn)端粒縮短；老年性疾病，其與正常細胞相比端?？s短加劇。當將一種DNA構建體作為與端粒長度-相關疾病的基因治療劑時，所述的DNA構建體含有以下述DNA能夠表達的狀態(tài)存在的編碼Mrell蛋白的DNA或編碼其中的Mrell蛋白的核酸酶結構域或C末端結構域經修飾的蛋白的DNA，可以通過諸如注射，基因槍等方法將所述DNA構建體直接施用于受治療者。用于DNA構建體的載體的例子包括腺病毒載體，腺病毒伴隨病毒載體，皰疹病毒載體，痘病毒載體，反轉錄病毒載體等。這些病毒載體能使DNA更有效地導入細胞。而且，可以使用將DNA構建體導入磷酸脂質載體，如脂質體再將脂質體施用于受試者的方法。在這一方法中，由于脂質體是一種包括生物可降解材料的封閉載體，將本發(fā)明的基因與所述脂質體混合可以使所述基因鎖定在脂質體(脂質-基因復合物)的脂雙層或含水層內。接下來在所述復合物存在下培養(yǎng)，所述的基因即可整合到所述細胞中(脂質轉染法)。然后再由下述方法將所獲得的細胞施用于受試者。
作為本發(fā)明的基因治療試劑的施用形式除全身施用如動脈內或靜脈內施用等外也可以局部施用于上皮組織(表皮)或其它任何多種器官或組織。而且所述施用方式還可以與導管技術和外科手術結合使用。
本發(fā)明的基因治療試劑的劑量依病人的年齡、性別和所患疾病的不同，施用途徑和頻率或劑型而易，但通常對于成人可使用0.1到100mg本發(fā)明的基因/人/天的劑量。
附圖的簡要說明

圖1是重組載體的結構圖。
圖2是酵母染色體臂的示意圖。
圖3是引入了重組載體的酵母細胞中端粒長度的凝膠電泳照片。
本發(fā)明的最佳實施方式參考下述實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明的范圍并不因此受到限制。
制備編碼酵母Mrell蛋白和變異的Mrell蛋白的DNA重組載體(1)制備編碼Mrell蛋白的DNA將含有用YEp24酵母-大腸桿菌穿梭載體構建的(由M.Carlson構建)酵母菌株DBY939基因組DNA文庫的大腸桿菌細胞涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，將所得的克隆轉移到尼龍膜，然后用常規(guī)的方法使來自這些克隆的DNA結合到膜上。用分別具有相應于編碼Mrell蛋白N末端和C末端區(qū)域的DNA序列的寡核苷酸作為引物，用野生型酵母母細胞菌株ORD149的基因組DNA作為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)。將所得的DNA片段克隆到大腸桿菌的載體中，再將上述片段從所述載體上切割下來用[32P]-dCTP標記。這一探針與上述制備好的尼龍膜接觸在嚴謹條件下進行雜交，以確定含Mrell基因片段的克隆。分離這一克隆，與上述類似重復進行亞克隆(scolony)雜交，以獲得含有Mrell基因片段的單克隆。用內切酶將Mrell片段從這一質粒DNA上切下來，克隆到另一適合于大腸桿菌的載體上，即獲得了質粒pMRElltr。
(2)制備編碼變異的Mrell蛋白的DNA用由(1)中獲得的編碼Mrell蛋白的DNA依照Hashimoto-Gotoh等[Hashimoto-Gotoh，T.，et al.Gene，152271-275(1995)]所述的方法制備編碼下述蛋白的DNAsMrell蛋白C-末端結構域缺失的蛋白(也指DI6A型Mrell蛋白)，距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的蛋白(也指DC49型MreIl蛋白)，Mrell蛋白C-末端結構域缺失的距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的蛋白。即為形成DI6A型變異體，進行第16位的密碼子從gat到gct的單核苷酸取代，而且第643和第644位的密碼子由gct agt變?yōu)間cc tag以引入終止密碼子，形成DC49型變異體。
(3)含編碼Mrell蛋白或Mrell蛋白變異體的DNA重組載體的構建由上述(1)和(2)獲得的編碼Mrell蛋白和Mrell蛋白變異體的DNA片段，如圖1所示，插入到含aureobasidin抗性基因的酵母-大腸桿菌穿梭載體的ADH1啟動子和CYCl終止子之間的EcoRI位點構建了能在酵母中高表達的載體，含有編碼野生型Mrell蛋白的DNA的重組載體命名為pMACMreIlWT，含編碼距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的Mrell蛋白的DNA的重組載體命名為pMACMrellD16A，含編碼C-末端結構域缺失的Mrell蛋白的DNA的重組載體命名為pMACMrelIΔC49；含編碼包括Mrell蛋白C-末端結構域缺失的，且距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的蛋白DNA的重組載體命名為pMACMreIlD16AΔC49。
用重組載體轉化酵母細胞用如實施例1中獲得的重組載體轉化由Dr.Alain Nicolas(InstitutCurie，F(xiàn)rance)惠贈的釀酒酵母菌株ORD149(Saccharomyces cerevisiae)(具有arg4rv/arg4bg and trpl-289/trpl-289等位基因的二倍體)，如下。將上述酵母細胞用1M的山梨醇洗，再與所述載體混合。通過電穿孔使所述DNA導入酵母細胞(所述酵母菌株帶有trp1基因突變，所述載體帶有TRP1基因選擇標記)，使所述細胞在含有1M山梨醇不含色氨酸的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長，即選擇出帶有所述質粒的克隆。這些酵母克隆繼續(xù)在含有0.2μg/ml aureobasidin的培養(yǎng)基上生長。
端粒長度分析對由實施例2所得的每一轉化子的端粒長度進行如下分析。即將僅含有pMAC56laur載體的酵母細胞和由實施例2獲得的分別含有重組載體pMACMrellWT，pMACMreIlD16A，pMACMrellΔC49，和PMACMreIlDl6AΔC49的轉化酵母細胞在含有0.2μg/ml aureobasidin的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-16小時后，收獲細胞。接下來依照常規(guī)的方法從所述細胞中抽提基因組DNA，用內切酶XhoI消化，用凝膠瓊脂糖電泳分離所得的DNA片段。瓊脂糖凝膠上的DNA片段在堿性條件下真空轉移到尼龍膜上，然后依照Church等[Church，G.M.et.al.Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.，811991-1995(1984)]所述的方法用通過Southern雜交分析。用放射性同位素32P于5′-末端標記的含20個核苷酸5′-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt～3′(SEQID NO13)作為探針，于50℃下雜交20小時。洗膜后用放射自顯影和FujiPhoto Film有限公司制造的imaging plate觀察放射性信號。
所得酵母的染色體具有如圖2所示的結構。探針可以雜交的區(qū)域除存在于染色體末端的端粒(Y′型)還存在于中間點(X型)。與僅帶有不含編碼Mrell蛋白的DNA的載體的酵母細胞相比，當野生型Mrell蛋白或帶有核酸酶結構域的DI6A型Mrell蛋白高表達時，在X和Y型中均可觀察到端粒區(qū)域中端粒的縮短(圖3)。具體地說，帶有核酸酶結構域突變的D16A型Mrell蛋白高表達的酵母中端?？s短顯著。相反，對于帶有C-末端區(qū)域缺失的DC49型Mrell蛋白高表達的細胞系，所有X和Y型的端粒均出現(xiàn)端粒延長。前述內容表明可以通過向細胞中引入編碼帶有Mrell蛋白C-末端結構域缺失的蛋白的DNA可以延長端粒長度，引入編碼Mrell蛋白的DNA可以使端粒長度縮短。
工業(yè)實用性依照本發(fā)明，提供控制端粒長度的方法，控制端粒長度的控制劑，端粒長度-相關疾病的基因治療劑。
序列表<110>理化學研究所(RIKEN)科學技術振興事業(yè)團(Japan Science and TechnologyCorporation)<120>控制端粒長度的方法<130>PH-1136-PCT<150>JP 2000-41929<151>2000-2-18<160>13<210>1<211>2079<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220><221>CDS<222>(1)..(2076)<400>1atg gac tat cct gat cca gac aca ata agg att tta att act aca gat 48Met Asp Tyr Pro Asp Pro Asp Thr Ile Arg Ile Leu Ile Thr Thr Asp1 5 10 15aat cat gtg ggt tac aac gaa aat gat ccc att act ggc gat gat tct 96Asn His Val Gly Tyr Asn Glu Asn Asp Pro Ile Thr Gly Asp Asp Ser20 25 30tgg aaa act ttc cat gaa gtc atg atg ctg gcc aaa aat aac aac gta 144Trp Lys Thr Phe His Glu Val Met Met Leu Ala Lys Asn Asn Asn Val35 40 45gac atg gtt gta cag tcc ggt gat ctt ttt cac gtg aat aag cct tcc 192Asp Met Val Val Gln Ser Gly Asp Leu Phe His Val Asn Lys Pro Ser50 55 60aag aag tca ctc tac caa gta ctg aaa act ttg aga tta tgt tgc atg 240Lys Lys Ser Leu Tyr Gln Val Leu Lys Thr Leu Arg Leu Cys Cys Met65 70 75 80ggt gac aag cct tgc gag tta gaa tta ttg agc gat ccc tca caa gtt 288Gly 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565 570 575att agt caa gcg gaa agc agt aag cca acg agc aaa ccc aaa cga gtg 1776Ile Ser Gln Ala Glu Ser Ser Lys Pro Thr Ser Lys Pro Lys Arg Val580 585 590cga act gca acg aaa aag aaa att cct gct ttt tca gac tca act gtc 1824Arg Thr Ala Thr Lys Lys Lys Ile Pro Ala Phe Ser Asp Ser Thr Val595 600 605ata tcc gat gca gaa aat gaa ctc ggt gat aat aac gat gct caa gat 1872Ile Ser Asp Ala Glu Asn Glu Leu Gly Asp Asn Asn Asp Ala Gln Asp610 615 620gat gtt gat att gat gag aat gac ata att atg gtc agt act gac gaa 1920Asp Val Asp Ile Asp Glu Asn Asp Ile Ile Met Val Ser Thr Asp Glu625 630 635 640gag gac gct agt tat ggt tta ctt aat ggt cga aaa aca aaa aca aag 1968Glu Asp Ala Ser Tyr Gly Leu Leu Asn Gly Arg Lys Thr Lys Thr Lys645 650 655act cgt tct gct gcg agc acc aaa acc gct tcc aga agg gga aaa gga 2016Thr Arg Ser Ala Ala Ser Thr Lys Thr Ala Ser Arg Arg Gly Lys Gly660 665 670aga gca tca agg acg cca aag acg gat att ctt gga agt ctc ctt gct 2064Arg Ala Ser Arg Thr Pro Lys Thr Asp Ile Leu Gly Ser Leu Leu 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權利要求
1.一種控制端粒長度的方法，該方法包括修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性。
2.如權利要求1所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的內源Mrell蛋白的生理學活性的修飾是通過以下述DNA能夠表達的方式向細胞中引入編碼外源Mrell蛋白的DNA或編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA。
3.如權利要求2所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的外源Mrell蛋白是下述蛋白(a)或(b)(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含從、在或對如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白。
4.如權利要求2所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的編碼外源Mrell蛋白的DNA是下述的DNA(c)或(d)(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在嚴謹條件下與(c)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白的DNA。
5.如權利要求2所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域經過修飾的蛋白是下述蛋白(e)或(f)(e)包含如SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含從、在或對如SEQ ID NO6所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
6.如權利要求2所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域經過修飾的蛋白的DNA是下述的DNA(g)或(h)(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在嚴謹條件下與(g)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
7.如權利要求2所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的C-末端結構域經過修飾的蛋白是下述的蛋白(i)或(j)(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含從、在或對如SEQ ID NO8所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白。
8.如權利要求2所述的控制端粒長度的方法，其中，所述的編碼其中的外源Mrell蛋白的C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA是下述的DNA(k)或(l)(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可與(k)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白的DNA。
9.一種控制端粒長度的試劑，其包含作為活性成分的修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性的物質。
10.如權利要求9所述的控制端粒長度的試劑，其中所述的物質是含有處于能夠表達狀態(tài)下的下述DNA的DNA構建體，即編碼外源Mrell蛋白的DNA或編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA。
11.如權利要求10所示的控制端粒長度的試劑，其中，所述的外源Mrell蛋白是下述蛋白(a)或(b)(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含從、在或對如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白。
12.如權利要求10所示的控制端粒長度的試劑，其中，所述的編碼外源Mrell蛋白的DNA是下述的DNA(c)或(d)(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在嚴謹條件下與(c)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白的DNA。
13.如權利要求10所示的控制端粒長度的試劑，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域經過修飾的蛋白是下述蛋白(e)或(f)(e)包含如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含從、在或對如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
14.如權利要求10所示的控制端粒長度的試劑，其中，所述的編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域經過修飾的蛋白的DNA是下述的DNA(g)或(h)(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在嚴謹條件下與(g)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
15.如權利要求10所示的控制端粒長度的試劑，其中，所述其中的外源Mrell蛋白的C-末端結構域經過修飾的蛋白是下述的蛋白(i)或(j)(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含從、在或對如SEQ ID NO8所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白。
16.如權利要求10所示的控制端粒長度的試劑，其中，所述編碼其中的外源Mrell蛋白的C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA是下述的DNA(k)或(l)(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可與(k)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白的DNA。
17.一種治療端粒長度-相關疾病的基因治療劑，其包含作為活性組分的修飾真核細胞中內源Mrell蛋白的生理學活性的物質。
18.如權利要求17所述的基因治療劑，其中所述的物質是含有處于能夠表達狀態(tài)下的下述DNA的DNA構建體即編碼外源Mrell蛋白的DNA或編碼其中的Mrell蛋白的核酸酶結構域或C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA。
19.如權利要求17所述的基因治療劑，其中，與端粒長度-相關的疾病是惡性腫瘤或細胞衰老性疾病。
20.如權利要求19所述的基因治療劑，其中，所述的惡性腫瘤至少選自下述之一黑素瘤，肝細胞瘤，乳腺癌，胃癌，腦瘤。
21.如權利要求18所述的基因治療劑，其中，所述的外源Mrell蛋白是下述蛋白(a)或(b)(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含從、在或對如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白。
22.如權利要求18所述的基因治療劑，其中，所述的編碼外源Mrell蛋白的DNA是下述的DNA(c)或(d)(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在嚴謹條件下與(c)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性的蛋白的DNA。
23.如權利要求18所述的基因治療劑，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域經過修飾的蛋白是下述蛋白(e)或(f)(e)包含如SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含從、在或對如SEQ ID NO6所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
24.如權利要求18所述的基因治療劑，其中，所述的編碼其中的外源Mrell蛋白的核酸酶結構域經過修飾的蛋白的DNA是下述的DNA(g)或(h)(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在嚴謹條件下與(g)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
25.如權利要求18所述的基因治療劑，其中，所述其中的外源Mrell蛋白的C-末端結構域經過修飾的蛋白是下述的蛋白(i)或(j)(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含從、在或對如SEQ ID NO8所示氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，取代或添加后所獲得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白。
26.如權利要求18所述的基因治療劑，其中，所述編碼其中的外源Mrell蛋白的C-末端結構域經過修飾的蛋白的DNA可以是下述的DNA(k)或(l)(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可在嚴謹條件下與(k)中DNA雜交的且編碼具有Mrell蛋白生理學活性(除雙鏈DNA結合活性之外)的蛋白的DNA。
全文摘要
一種控制端粒長度的方法，該方法包括向細胞中引入編碼Mrell蛋白的DNA或編碼含部分或全部核酸酶結構域，C－末端結構域經修飾或缺失的Mrell蛋白的蛋白的DNA。
文檔編號A61K48/00GK1425065SQ01808230
公開日2003年6月18日 申請日期2001年2月14日 優(yōu)先權日2000年2月18日
發(fā)明者太田邦史, 柴田武彥 申請人:理化學研究所, 科學技術振興事業(yè)團