專利名稱：復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬煙草下腳料制備乙醇的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法。
背景技術(shù)：
能源危機(jī)日益加劇，許多國(guó)家開(kāi)始致力于開(kāi)發(fā)各種可再生能源。生物質(zhì)乙醇以其清潔性以及生物質(zhì)能源在地球上存在的廣泛性而引起了人們的特別關(guān)注。大部分的生物質(zhì)乙醇發(fā)酵的原料是以甘蔗，甜菜和陳化糧為主，但僅限于不危害國(guó)家安全的前提下。利用廢棄物發(fā)酵制取乙醇可以"一舉兩得"不僅能夠帶來(lái)環(huán)境的效益，還能夠達(dá)到廢棄物資源利用化的目的。
中國(guó)煙葉種植面積和年產(chǎn)量均居世界首位。在煙草種植和生產(chǎn)過(guò)程中，有大量的低次
煙葉和煙梗被廢棄，大約占煙葉總產(chǎn)量的25%。如2002年全國(guó)有6.116X105t的廢棄煙葉。由于煙葉中含有許多有用的成分，廢棄煙葉的資源化利用研究日益受到人們的重視。國(guó)內(nèi)外學(xué)者偏重于廢棄煙葉中煙堿、茄尼醇、氨基酸、有機(jī)酸等的分析提取研究。但是，煙葉中含量最豐富的化合物是糖類。據(jù)測(cè)定，煙葉總糖平均占29.85%，最大值達(dá)到41.96%，還原糖占26.50% (以葡萄糖計(jì)，還原糖占16% 22%)，最大值達(dá)到38.99%。
現(xiàn)有的研究表明多種酵母菌的混合發(fā)酵有利于改善發(fā)酵結(jié)果，并且在一步中實(shí)現(xiàn)2種或者2種以上的轉(zhuǎn)換。多種酵母菌的混合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了不同的微生物的協(xié)同作用。而固定化微生物可以進(jìn)行高密度增殖培養(yǎng)，提高反應(yīng)器單位體積的生物轉(zhuǎn)化速率，延長(zhǎng)發(fā)酵細(xì)胞的壽命，增加穩(wěn)定性，利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，利于產(chǎn)物分離等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法，該制備方法簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)率高達(dá)49.3g/kg，適合于大規(guī)模生產(chǎn)；比單一酵母菌固定化發(fā)酵產(chǎn)率具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法，包括
(1) 種子液的培養(yǎng)
將拉斯12號(hào)，1346， 1578酵母(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究所)分別接種于酵母種子培養(yǎng)基中,在30'C， 150r/min條件下培養(yǎng)24h-36h;
(2) 復(fù)合載體的制備
取10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸鈉和5g硅藻土,加入60ml蒸餾水浸泡24h-36h,之后在ll(TC
3下滅菌10min ,冷卻至40'C;
(3) 固定化小球的制備
將步驟(1)三種酵母菌種子液與步驟(2)復(fù)合載體混合均勻，注射到含有P/。CaCl2飽和的硼酸溶液(300 mL)進(jìn)行交聯(lián)20h-22h,使用生理鹽水和無(wú)菌水洗漆，得到固定化小球；
(4) 增殖培養(yǎng)
將上述固定化小球接入增殖培養(yǎng)基中，3(TC活化24小時(shí)，進(jìn)行固定化酵母的增值培
養(yǎng)；
(5) 將增殖培養(yǎng)后的固定化小球以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25'C-35'C、 150r/min條件下發(fā)酵，即得。
所述步驟(3)三種酵母菌種子液的體積比l: 1: 1。
所述步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)基中煙草下腳料與雙蒸水的固液比為1: 10，蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L。
所述步驟(5)發(fā)酵溫度為35'C，時(shí)間為72h，固定化小球的填充率為15%，發(fā)酵液的pH值為3.5。
有益效果
(1) 本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)率高達(dá)49.3g/kg，適合于大規(guī)模生產(chǎn)；
(2) 本發(fā)明的復(fù)合載體固定化小球中添加聚乙烯醇與海藻酸鈉小球相比彈性明顯增加，加入硅藻土使其內(nèi)部小孔明顯增加，增加了固定化小球的比表面積，硼酸飽和溶液的交聯(lián)作用使其機(jī)械強(qiáng)度性能得到改善，利用煙草下腳料發(fā)酵制取乙醇達(dá)到了固廢資源化目的。


圖1固定化小球的表面在50倍下的電鏡照片
圖2固定化小球的表面在5000倍下的電鏡照片
圖3共固定酵母菌發(fā)酵圖4酵母菌共固定化發(fā)酵的條件優(yōu)化。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人
4員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1
混合酵母菌株固定化小球的制備
(1) 挑選拉斯12號(hào)，1346， 1578酵母菌落，接種于種子培養(yǎng)基中，在3(TC、 150r/min條件下培養(yǎng)24h;
(2) 稱取10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸鈉和5g硅藻土放入100mL燒杯內(nèi),加入60mL蒸餾水浸泡過(guò)夜，次日IIO 'C下滅菌10mhi，冷卻至40 °C;
(3) 將上述三種酵母菌種子液按體積比l: 1: l混合后與復(fù)合載體混合均勻，用注射器注射到含有in/。CaCl2飽和的硼酸溶液(300mL)進(jìn)行交聯(lián)20-22小時(shí)，生理鹽水和無(wú)菌水洗滌，得到固定化小球；
(4) 將上述固定化小球接入增殖培養(yǎng)基中，3(TC活化24小時(shí)，進(jìn)行固定化酵母的增值培養(yǎng)；其表面電鏡照片如圖l，圖2。
(5) 煙草下腳料用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目，以固液比為l: 10將過(guò)40目的煙草下腳料和雙蒸水混合，煙草下腳料浸濕，吸水膨脹，體積增大，然后加入65FPU的纖維素酶作為發(fā)酵料；
將上述增殖后的固定化小球，以10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行燃料乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為3(TC，發(fā)酵周期為36小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，在20h后三種酵母菌以1: 1: 1的比例共固定粒子發(fā)酵具有比任兩種菌共固定化和單酵母菌固定發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)明顯。發(fā)酵36小時(shí)候達(dá)到產(chǎn)量49.3g/kg。發(fā)酵條件優(yōu)化如圖4。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法，包括(1)將拉斯12號(hào)，1346，1578酵母分別接種于酵母種子培養(yǎng)基中，在30℃，150r/min條件下培養(yǎng)24h-36h，得到種子液；(2)取10g聚乙烯醇、0.5g海藻酸鈉和5g硅藻土，加入60ml蒸餾水浸泡24h-36h，之后在110℃下滅菌10min，冷卻至40℃，制得復(fù)合載體；(3)將步驟(1)三種酵母菌種子液與步驟(2)復(fù)合載體混合均勻，注射到含有1％CaCl2飽和的硼酸溶液進(jìn)行交聯(lián)20h-22h，使用生理鹽水和無(wú)菌水洗滌，得到固定化小球；(4)將上述固定化小球接入增殖培養(yǎng)基中，30℃活化24小時(shí)，進(jìn)行固定化酵母的增值培養(yǎng)；(5)將上述增殖培養(yǎng)后的固定化小球以10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25℃-35℃、150r/min條件下發(fā)酵，即得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法，其特征在于所述步驟(3)三種酵母菌種子液的體積比l: 1: 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法， 其特征在于所述步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)基中煙草下腳料與雙蒸水的固液比為1: 10，蛋白胨 10g/L，酵母膏5g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法， 其特征在于所述步驟(5)發(fā)酵溫度為35'C，時(shí)間為72h，固定化小球的填充率為15%， 發(fā)酵液的pH值為3.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合載體混合固定酵母菌發(fā)酵煙草下腳料制備乙醇的方法，包括(1)將拉斯12號(hào)，1346，1578酵母分別接種于酵母種子培養(yǎng)基中，在30℃，150r/min條件下培養(yǎng)；(2)聚乙烯醇、海藻酸鈉和硅藻土，加入60ml蒸餾水浸泡24h-36h，滅菌；(3)三種酵母菌種子液與復(fù)合載體混合均勻，注射到含有1％CaCl₂飽和的硼酸溶液進(jìn)行交聯(lián)20h-22h，洗滌；(4)將固定化小球接入增殖培養(yǎng)基中；(5)以10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25℃-35℃、150r/min條件下發(fā)酵。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)率高達(dá)49.3g/kg，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/00GK101671699SQ200910197400
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者謝麗萍, 趙曉祥 申請(qǐng)人:東華大學(xué)