專利名稱：一種解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效應的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及一種解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑 制效應的方法。
背景技術：
由于石油資源的有限性以及國際原油價格的波動性，利用可再生資源制造生物能 源已受到世界各國的普遍重視。丁醇由于其優(yōu)良的燃燒特性及較乙醇更優(yōu)的儲存運輸特 性，有望在將來成為新一代生物燃料。自二戰(zhàn)以來隨著石油工業(yè)的發(fā)展，生物丁醇發(fā)酵由于 其較高的原料成本，其大規(guī)模發(fā)酵一直處于停滯狀態(tài)，而且隨著近年來糧食價格的不斷上 漲及國家相關糧食安全戰(zhàn)略的制定，采用糧食發(fā)酵生產燃料丁醇已受到嚴格限制。丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum是能夠發(fā)酵產生丁醇的四種梭菌之 一 (Keis et al.，Int J Syst Evol Microbiol, Issue 6，Vol 51，2001)，在發(fā)酵過程中產 生丁醇、丙酮、乙醇、乙酸和丁酸。利用丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產丙酮、丁醇的歷史已經有上百 年。Clostridium acetobutylicum除了能夠利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，還能利用木糖、乳 糖、阿拉伯糖等多種碳源。纖維素和半纖維素水解后的主要成分就是葡萄糖、木糖及阿拉伯 糖，因而可以利用纖維素和半纖維素為原料進行生物丁醇發(fā)酵。纖維素和半纖維素在自然 界中占到植物界碳素的50%以上，利用纖維素和半纖維素水解液進行生物丁醇發(fā)酵，有望 大大降低原料成本。但丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum像很多其他細菌一樣 存在著糖代謝物阻遏效應(carboncatabolite repression, CCR)，即在葡萄糖存在條件下， 其代謝產物阻遏了其他糖類的利用。目前的丙酮丁醇梭菌只能將木質纖維素水解液中的葡 萄糖利用完全，而木糖、阿拉伯糖等五碳糖的利用受到抑制，因此解除CCR效應成為木質纖 維素原料應用于丙酮丁醇發(fā)酵的關鍵技術之一。C. acetobutylicum屬于革蘭氏陽性菌，GC含量30 %，2001年完成全基因組測序 (Nolling et al.，J Bacteriol, Issue 16, Vol 183，2001)，其中含有 ccpA 基因，該基因在 NCBI核酸數(shù)據(jù)庫查詢號為gi :1119220o CCR效應在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtitles)中 得到了較多的研究，而在丙酮丁醇梭菌中的研究很少。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供一種解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效應的方法，從而能 同步利用葡萄糖和木糖發(fā)酵生產丙酮、丁醇、乙醇。本發(fā)明提供的方法，通過抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，通過在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入DNA片段可 實現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達被抑制的 Clostridium acetobutylicum 重組菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明提供的重組菌株的基因組中丙酮丁醇梭菌ccpA基因中已插入DNA片段。本發(fā)明還有一個目的在于，提供該重組菌株用于同步利用葡萄糖-木糖混合糖發(fā) 酵生產丙酮、丁醇、乙醇的應用。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖 發(fā)酵生產丙酮、丁醇、乙醇能力的方法。本發(fā)明提供的方法通過抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達實現(xiàn)。本發(fā)明中所指的“抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達”，既可以是降低丙酮丁醇梭 菌ccpA基因表達量，也可以是使丙酮丁醇梭菌ccpA基因不表達或不能表達出正確的蛋白 質。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，中斷丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達，能解除丙酮丁 醇梭菌葡萄糖抑制效應。根據(jù)本發(fā)明，丙酮丁醇梭菌ccpA基因的中斷，可采用二類內含子插入技術在該基 因內部的任何位點插入DNA實現(xiàn)；也可通過同源重組中斷ccpA基因，用于中斷ccpA基因的 插入片段可在ccpA基因中的任意位點插入，只需要能使ccpA基因表達被中斷或抑制即可； 還可以通過同源重組敲除ccpA部分或全部序列實現(xiàn)，只要能使得ccpA基因的表達被中斷 或表達出不完整的ccpA蛋白即可。上述三種方法用于將ccpA基因失活，除此之外還可以 采用反義核酸技術抑制ccpA基因的表達，將ccpA表達量下調。實現(xiàn)上述目的的方法在本 領域中為一般技術人員所熟知，因此在此不具體描述。根據(jù)本發(fā)明，“重組質粒載體”指的是用于敲除ccpA基因的重組質粒載體，該載體 應理解為具有與ccpA基因的特定序列進行特異位點配對序列的重組質粒載體，在上述重 組質粒載體中包括用于對ccpA基因進行特異性敲除的片段。本發(fā)明提供的Clostridium acetobutylicum重組菌株的基因組中的ccpA基因表 達被抑制，不能表達出具有完整結構的CcpA蛋白。本發(fā)明提供的重組菌株，解除了葡萄糖抑制效應，能同步利用葡萄糖-木糖進行 發(fā)酵，但不限于僅能利用葡萄糖-木糖進行發(fā)酵，也可利用受葡萄糖代謝物抑制的其他糖 類進行發(fā)酵，其中，使用的葡萄糖-木糖既可以是直接使用葡萄糖和木糖配制獲得的葡萄 糖-木糖，也可以是發(fā)酵或水解高分子化合物，如水解纖維素或半纖維素等，獲得的葡萄 糖-木糖。根據(jù)本發(fā)明，使用的重組菌株，既可以是本發(fā)明提供的抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基 因表達的菌株，也可以是根據(jù)本發(fā)明的教導和現(xiàn)有技術，制備的其他的抑制丙酮丁醇梭菌 ccpA基因表達的菌株，如采用反義核酸技術降低ccpA表達量的菌株。本發(fā)明的實施例中，使用的重組質粒載體pSY6-ccpA指的是用于敲除ccpA基因的 重組質粒載體，其中，使用的ccpA-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBSld位點堿基經修 改后，用于敲除ccpA基因的片段，該片段屬于Li. LtrB內含子一部分，所述的Li. LtrB 二類 內含子為原核二類內含子，其中包含ItrA基因，但在重復本發(fā)明的試驗時，可以選取其他 插入位點進行試驗，甚至還可以不使用重組質粒載體進行試驗，只要能在ccpA基因中插入 核酸片段以中斷ccpA基因的表達即可。本發(fā)明提供的重組菌株能同步利用葡萄糖-木糖混合糖進行發(fā)酵，以用于生產丙 酮、丁醇、乙醇。
本發(fā)明提供的提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖發(fā)酵生產丙酮、丁醇、 乙醇能力的方法，通過抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達實現(xiàn)。本發(fā)明提供的方法，中斷了丙酮丁醇梭菌ccpA的表達，本發(fā)明提供的菌株中， ccpA經二類內含子插入失活后的菌株同步利用葡萄糖和木糖的能力顯著提高，同時轉化生 成的ABE濃度相應提高。本發(fā)明構建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效應，能同步利用葡萄 糖-木糖進行發(fā)酵，因此該菌株有利用木質纖維素水解液進行丙酮丁醇發(fā)酵的潛力。


圖1為ccpA中斷菌株的菌落PCR鑒定的凝膠電泳檢測結果，其中，NC表示未加模 板的陰性對照，WT所用的模板為C. acetobutylicum ATCC 824的基因組，ccpAmutant的模 板分別為轉化子 8 AccpA 1-3，marker 為 Ikb DNA ladder。圖 2 為發(fā)酵 0-72hr 的 Clostridium acetobutylicum Clostridiumacetobutylicum ATCC 824 的 0D600 的檢測結果。圖 3 為發(fā)酵 0-72hr 的 Clostridium acetobutylicum Clostridiumacetobutylicum ATCC 824 的殘?zhí)呛康臋z測結果。圖 4 為發(fā)酵 0-72hr 的 Clostridium acetobutylicum Clostridiumacetobutylicum ATCC 8 的 ABE 含量的檢測結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明的下述實施例中，使用的菌株Clostridium acetobutylicum ATCC 8 含 有的ccpA基因是現(xiàn)有技術已知的，其在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫查詢號為gi :1119220。本發(fā)明的下述實施例中，ABE為丙酮、丁醇、乙醇(Acetone-butanol-ethanol)的 簡稱，ABE濃度指的是溶液中丙酮、丁醇、乙醇的總濃度。本發(fā)明的下述實施例中，重組質粒載體pSY6-ccpA指的是用于敲除ccpA基因的重 組質粒載體，其中，使用的ccpA-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBSld位點堿基經修改 后，用于敲除ccpA基因的片段，該片段屬于Li. LtrB內含子一部分，所述的Li. LtrB 二類內 含子為原核二類內含子，其中包含ItrA基因。本發(fā)明使用的菌株和質粒分別為質粒pSY6(Shao L.，Hu S.，Yang Y.，Chen J.，Yang Y, Jiang W, Yang S, Cellresearch, 2007, doi :10. 1038/cr. 2007. 91)，為俄 Ε. coli 和 C. acetobutylicum 的穿梭 質粒，在C. acetobutylicum中表達紅霉素抗性基因，該質粒的序列見SEQ ID N0. :6。質粒pANSl，序列見SEQ ID N0. :7，含壯觀霉素抗性基因；菌株俄E. coli ER2275 購自 New England Biolabs 公司。本發(fā)明中使用的PCR純化和DNA凝膠回收純化試劑盒均購自華舜生物制品有限公ccpA-突變株和 ccpA-突變株和 ccpA-突變株和 Gene Knockout System(TAOlOO)Kit 購自 Sigma-Aldrich 公司，基因組抽 提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的培養(yǎng)基和緩沖液如下CGM 培養(yǎng)基配方如下(Joseph W. Roos et al, Biotechnology and Bioengineering, P681-694, Vol 557,1985) :2g (NH4) 2S04，Ig K2HPO4 · 3H20，0. 5g KH2PO4, 0. IgMgSO4 ·7Η20，0· 015g FeSO4 ·7Η20，0. Olg CaCl2,0. Olg MnSO4 ·Η20，0. 002g CoCl2,0. 002g ZnSO4, 2g Tryptone, Ig Yeast Extraction, 50g Glucose，2%瓊月旨溶于 lL/jC中。P2 培養(yǎng)基的配制方法如下(F. Monot et al, Appl Environ Microbiol, Issue 6， Vol44,1982)溶液1 :40g D-葡萄糖，20g D-木糖，加H2O定溶至850mL ；溶液2 =NH4Ac 2. 2g, K2HPO4 · 3H20 0. 5g, KH2PO4 0. 5g,加 H2O 定溶至 IOOmL ；溶液3 2. Og MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · H20,0. Ig NaCl,0. Ig FeSO4 · 7Η20 ；溶液 4 :100ml 蒸餾水中加入 IOOmg 氨基苯酸(p—aminobenzoic acid)，IOOmg 維生 素 Bl (thiamine)，Img 生物素(biotin)；溶液1和溶液2高溫濕熱滅菌，溶液3和溶液4過濾除菌，溶液1和溶液2冷卻后 混合均勻，再加入IOmL溶液3和ImL溶液4，混勻后分裝成95mL/瓶，配制培養(yǎng)基時在培養(yǎng) 體系中添加CaCO3,以過濾除菌隊排除瓶中的空氣。ETM 緩沖液配方如下270mM 蔗糖，0. 6mM Na2HPO4,4. 4mM NaH2PO4,10mMMgCl2。ET 緩沖液配方如下270mM 蔗糖，0. 6mM Na2HPO4,4. 4mM NaH2PO4。本發(fā)明使用的限制性內切酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA連接酶和小牛堿性磷酸酶 (CIAP)均購自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶購自iToyobo公司。其他常規(guī)試劑均為國產或進口分裝。本發(fā)明通過PCR擴增用于中斷ccpA基因的targetron片斷，然后經Xho I及BsrGI 雙酶切并與經同樣酶切的PSY6載體連接，得到中斷質粒pSY6-ccpA，電轉Clostridium acetobutylicumATCC 824，然后經菌落PCR鑒定出有內含子插入到基因組中的重組菌，并 經測序驗證在ccpA基因的816-817bp間插入了 Li. LtrB內含子片段，經發(fā)酵驗證確定ccpA 基因經插入失活后解除了葡萄糖抑制效應，能夠同步利用葡萄糖-木糖混合碳源進行ABE 發(fā)酵，具體如下述實施例所示。實施例1、構建pSY6_ccpA質粒載體通過PCR擴增ccpA targetron片斷，然后使用BioI和BsrG I進行雙酶切，并與 同樣經BioI和BsrG I酶切的pSY6載體連接，得到中斷質粒pSY6-ccpA，其中，PCR擴增 ccpA targetron的模板及引物設計方法來源于Sigma-Aldrich公司的Targetron Gene Knockout System(TAOlOO) Kit，具體步驟如下1.1、引物設計參考Targetron Gene Knockout System(TAOlOO)Kit 提供的方法，分別設計引 物 ccpA-IBS(如序列 SEQ ID N0. 1 所示)、ccpA-EBSld(如序列 SEQ ID NO. :2 所示)禾口 ccpA-EBS2 (如序列SEQ ID NO. :3所示)，用于構建pSY6_ccpA質粒載體。PCR 擴增需要的 raS universal 由 Targetron Gene Knockout System(TAOlOO) Kit自帶。6
1.2、PCR 擴增使用Sigma-Aldrich 的 Targetron Gene Knockout System(TAOlOO)Kit 進行PCR 擴增，擴增需要的模板和試劑由試劑盒提供，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用華 舜公司的膠回收試劑盒純化回收350bp處的條帶。1. 3、構建pSY6-ccpA重組質粒載體使用Bio I及BsrGI分別酶切載體pSY6和ccpA-targetron片段，然后使用華舜 公司的膠回收試劑盒純化回收酶切后產物。將酶切后的ccpA-targetron片段與酶切后的載體片段使用T4DNA連接酶連接， 該連接反應在16°C水浴鍋中進行10hr，將獲得的連接產物以CaCl2熱休克法轉化E. coli DH5 α感受態(tài)細胞42°C熱擊90sec，然后添加4°C LB液體培養(yǎng)基復蘇lhr，然后將細胞 以4500rpm離心5min，涂布到含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng) 16-18hr0對獲得的菌落進行菌落PCR，以檢測350bp的targetron片段是否連接入pSY6載 體中，PCR擴增引物為IBS和EBSld0PCR檢測結果顯示，菌落PCR可以擴增出350bp特異性條帶。隨即挑取PCR呈陽性 的菌落以LB液體培養(yǎng)基擴陪，提取質粒。然后，以pIMPl-seq-for (如SEQ ID NO :9所示)作為引物，提取的質粒pSY6_ccpA 作為模板進行測序，測序結果如SEQ ID NO :10所示，其中196-244bp為IBS序列，485-544bp 為EBSld序列，為IBS2序列。根據(jù)SEQ ID NO 10的結果，擴增得到的350bp序列含有目的突變位點，因此，連接 產物轉化E. coli DH5a感受態(tài)細胞后獲得的陽性轉化子含有重組質粒pSY6-ccpA。實施例 2、Clostridium acetobutylicum ccpA-突變株的構建與檢測將pSY6_ccpA質粒經E. coli ER2275/pANSl在Cac8I位點甲基化后，電轉 Clostridium acetobutylicum ATCC 824，復蘇過夜后，取200 μ 1 細胞液涂布于加有40 μ g/ mL紅霉素的CGM平板上，在厭氧箱內37°C培養(yǎng)48-96小時后，挑取單菌進行菌落PCR驗證， 具體過程如下2. l、pSY6_ccpA 質粒的甲基化為防止外源DNA進入c. acetobutylicum后被其限制系統(tǒng)切割降解，pSY6_ccpA質 粒需甲基化(MermeIstein, L. D and Papoutsakis, Ε. Τ. Appl Environ Microbiol. vol59. issue 4.page 1077-81)。將pANSl質粒以CaCl2熱休克法轉化入Ε. coli ER2275，獲得菌株Ε. coliER2275/ pANSl。將抽提獲得的pSY6-ccpA質粒轉化入Ε. coli ER2275/pANSl感受態(tài)細胞，由于 pANSl質粒具有壯觀霉素抗性，因此涂布于含有100 μ g/mL氨芐青霉素和50 μ g/mL壯觀 霉素的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接至4mL添加有100 μ g/mL氨芐青霉素 和50 μ g/mL壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，獲得含pANSl及pSY6-ccpA的E. coli ER2275，用質粒抽提試劑盒抽提質粒，將抽提獲得的質粒使用&itl酶切驗證(以未轉化入 E. coli ER2275/pANSl 的 pSY6_ccpA 為對照；satl 為 Cac824I 的同裂酶，與 Cac824I 具有相 同的識別位點)，酶切結果顯示，經上述處理的質粒pSY6-ccpA不能被MtI酶切，而對照可被MtI酶切，根據(jù)酶切結果，經上述處理的質粒pSY6-ccpA的Cac824I酶切位點被甲基化 而不被clostridiumacetobutylicum的限制系統(tǒng)所識別。2. 2、pSY6-ccpA 質粒電轉入 Clostridium acetobutylicum ATCC 824將C. acetobutylicum ATCC 824于CGM培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48hr后，挑取單菌 落接入5mL CGM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)l^ir，再按接種量接入50mL CGM液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，當培養(yǎng)菌體的0D600達到0. 6-0. 7之間時取出培養(yǎng)菌，用于制備電轉感受態(tài)細胞。取 30mL菌液，于4°C、4500rpm離心lOmin，棄上清，加入30mL4°C的ETM緩沖液懸浮，再于4°C、 4500rpm離心lOmin，棄上清，加入3mL 4°C的ET緩沖液，獲得懸浮菌液。取上述懸浮菌液180 μ L，加入20 μ L (約1 3 μ g) pSY6-ccpA甲基化質粒(冰上 操作)，混勻后轉入電轉杯中Omrn直徑)，使用Bio-Rad MicroPulser 電轉儀電轉，電壓 2. OkV，其余參考使用手冊，電擊后迅速加入常溫的CGM培養(yǎng)基lmL，于37°C培養(yǎng)8hr后，取 200 μ L細胞液涂布于加有40 μ g/mL紅霉素的CGM平板上，于厭氧箱內37°C培養(yǎng)約2_4天。2. 3、菌落 PCR 驗證pSY6_ccpA質粒轉化入C. acetobutylicum ATCC 8 中后，可能會將二類內含子 的部分序列插入到基因組的ccpA基因中，是否有內含子插入可以使用插入位點上下游的 引物，通過菌落PCR加以驗證(未插入內含子的野生型菌將擴增出219bp的條帶，插入有內 含子的重組菌株將擴增出的條帶為1133bp條帶)，因此，隨機挑取三個轉化子(分別命名 為8MACCpA 1-3)進行驗證，其中，以C. acetobutylicumATCC擬4基因組為負對照，具體 過程如下PCR反應使用的引物為CCPA (ID)-FW和CCPA (ID)-REV，其序列分別如SEQID No. 4 和 SEQ ID No. 5 所示；PCR反應體系與實施例1相同；PCR 反應條件95°C 5min ；95 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 1. 5min，30 個循環(huán)；72 °C 5min。將PCR反應獲得的產物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。根據(jù)圖1的結果，得到的三個轉化子均為插入了內含子的突變體。2. 4、測序驗證陽性轉化子隨機挑取步驟2. 3中對應于圖1中標記為4的陽性轉化子，以加有40 μ g/mL紅 霉素的CGM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，抽提基因組。以抽提的基因組為模板，以CCPA(ID)-FW和 CCPA(ID)-REv為引物對進行PCR擴增，回收擴增獲得的1. IkbDNA條帶并測序，結果如SEQ ID N0. 8所示，測序結果顯示，該序列的817-1731位點的DNA為插入的內含子序列，即內 含子序列精確地插入到預計的816 I 817位點之間。實施例 3、Clostridium acetobutylicum ccpA-突變株的發(fā)酵取步驟2. 2中獲得的中斷了 ccpA基因的Clostridium acetobutylicum菌株 Clostridium acetobutylicum ccpA_在P2培養(yǎng)基中發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液，具體過程如下從CGM平板上挑取單菌接入5mL CGM液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，以1 %接種量接入 50mL CGM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 IOhr菌濃0D600達到0. 4，以5%接入P2培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā) 酵，并于0，12，25，34，48，60，72時取發(fā)酵液，檢測0D600 (結果如圖2所示)，殘?zhí)呛?使 用WATERS公司的sugar-pak柱經Agela 1200HPLC測定，結果如圖3所示)以及丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela 7890A氣相色譜儀測定，結果如圖4所示)，并以Clostridium acetobutylicum ATCC 8 作為對照，其中，測定發(fā)酵液中的殘?zhí)呛亢捅?、丁醇和乙?含量前需進行如下預處理發(fā)酵液經離心后分別取上清液測定殘?zhí)呛捅?、丁醇、乙醇上清液以H2O經20倍 稀釋后用于殘?zhí)菧y定；400 μ L上清液與100 μ L內標混合均勻測定丙酮、丁醇和乙醇(內標 配方為25g異丁醇，5g異丁酸，50mL 37%濃鹽酸，加水定容至1L)。根據(jù)圖3的結果，ccpA基因經插入失活后，實現(xiàn)了葡萄糖和木糖的同步利用，發(fā)酵 60hr可以使20g/L的木糖利用81%，產率為0. ^g/L/hr，而野生型經60hr發(fā)酵僅能利用 12 %，產率為0. 04g/L/hr, ccpA突變后木糖利用能力提高6倍?？梢奵cpA經插入失活后解 除了葡萄糖抑制效應。根據(jù)圖4的結果，ccpA突變菌株發(fā)酵液中的丙酮、丁醇和乙醇的終濃度均高于野 生菌株。綜上所述，本發(fā)明提供的方法，中斷了丙酮丁醇梭菌中ccpA基因的表達，本發(fā)明 提供的菌株中，ccpA基因經二類內含子插入失活后的菌株同步利用葡萄糖和木糖的能力顯 著提高，同時轉化生成的ABE濃度相應提高。本發(fā)明構建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效 應，能同步利用葡萄糖-木糖進行發(fā)酵，因此該菌株有利用木質纖維素水解液進行丙酮丁 醇發(fā)酵的潛力。序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120> 一種解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效應的方法<130>P5091068<160>10<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>53<212>DNA<213> 引物<400>1aaaactcgag ataattatcc ttaaaggacg tagatgtgcg cccagatagg gtg53<210>2<211>60<212>DNA<213> 引物<400>2cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcgtagat gttaacttac ctttctttgt60<210>3<211>49<212>DNA<213> 引物0112]<400>30113]tgaacgcaag tttctaattt cggtttccttccgatagagg aaagtgtct490114]<210>40115]<211>200116]<212>DNA0117]<213>引物0118]<400>40119]gatggaacag acggaataaa200120]<210>50121]<211>220122]<212>DNA0123]<213>引物0124]<400>50125]atcccatatc gtaagtaggt tg220126]<210>60127]<211>80320128]<212>DNA0129]<213> 質粒 pSY60130]<400>60131]tcgagataattatccttacc agcccatagggtgcgcccagatagggtgttaagtcaagta600132]gtttaaggtactactctgta agataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaa1200133]gctgatacgggaacagagca cggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggtac1800134]gactgagtcgcaatgttaat cagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagttt2400135]ctaatttcggttgctggtcg atagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggt3000136]aagttaagcctatggactta tctgttatcaccacatttgtacaatctgtaggagaaccta3600137]tgggaacgaaacgaaagcga tgccgagaatctgaatttaccaagacttaacactaactgg4200138]ggataccctaaacaagaatg cctaatagaaaggaggaaaaaggctatagcactagagctt4800139]gaaaatcttgcaagggtacg gagtactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttaca5400140]tggcaaaggggtacagttat tgtgtactaa￡1￡Ι ￡1￡1￡1￡1￡Ι tgattagggaggaaaacctc6000141]aaaatgaaaccaacaatggc aattttagaaagaatcagta￡1￡1￡1￡CclCclagaaaatata6600142]gacgaagtttttacaagact ttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcg7200143]acgcgttgggaaatggcaat gatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcat7800144]tgtcatcgtcacgtgattca taaacacaagtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacga8400145]acaataacagagccgtatac tccgagaggggtacgtacggttcccgaagagggtggtgca9000146]aaccagtcacagtaatgtga acaaggcggtacctccctacttcaccatatcattttctgc9600147]agccccctagaaataatttt gtttaactttaagaaggaga ￡Ι ￡10￡Ι ￡Ι ￡1tggctagatc10200148]gtccattccgacagcatcgc cagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatg10800149]caatttctatgcactcgtag tagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggt11400150]acagttattgtgtactaaaa ttaaaaattgattagggagg￡l￡l￡l￡lCCtC￡l￡laatgaaacca120010
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〈213〉質粒 pANSl<400>7gtcgactctagaggatcccccatatgcaagattagaatgaatatttcccaccaccattttttcaatttttttataatttttttcattagtccattcaataaaaattctctccctatgttctaatggagaatttggtatgattttacccgtgtccatagttttggtttcatcatcctgataattatctattctcacatcagaaaatggaatatcaggtagtcttttattttttcgttttgcttggtaaagctgaggaatgtatccttgttcataaagctctttgggaggatgattccacggtaccatttctcgtaagttgcttttatctcctatttttttttctttactttgatctgtcaatggttcagatggttttagtccactctcaactcctgatccaaaatgtttccgaagtatttttttcactttactcctcactattttgattagtacctattttatttagtttatttatagatttcattggctttagttaattttattctagattatatatgatagtgtaaacctattcattgt 3.3.3.3.3. 3.atagttattataacatgtattcacgaacgaacggtctggttataggtacattgagcaacttgccattgggatatatcaacggtggtatatttagctcctgaaaatctcga133C C 3.3.3.3.tggtgaaagttggaacctcttacgtgccgacagggcttcccggtatcaacagggacaccagtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtttcagctactgacggggtggtgcgtaacgggagtgtatactggcttactatgttggcactgcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtccttcctcgctcactgactcgctacgctcggacgaacggggcggagatttcctggaagatgggccgcggcaaagccgtttttccataggctacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgactggcggctccctcgtgcgctctcctgttccgttatggccgcgtttgtctcattccacgccccaagctggactgtatgcacgaaccccccgggtttattgttttctaaaatctgattacca60Q-Q-X^Q-Q-Q-Q-CQ-Q-aaaaattgaaaaaagtgttt120tttaatctgt 3. 3.3.3. 3.gtttatagtt180ttctctccaagataactacgaactgctaac240gattcagccactgcatttcccgcaatatct3003.3.3.3. C 3. 3. Cggcataaagttaatatagag360aattcctctgacgaatccataatggctctt420aattcctctaagtcataatttccgtatatt480attatggttaaatctgaatttaattccttc540tgtaaccattctccataaataaattcttgt600tgctgaataataattgttaattcaatatat660gaaataggtctaattttttgtataagtatt720acgacgactaaaaagtcaagatcactattt780aacatgtaagtaccaataaggttatttttt840ttaatttgttcgtatgtattcaaatatatc900atatccatagttgttaatta960ctaaattttttatctagataataattattt1020atgatctttcatttccataaaactaaagta1080tctcttgccagtcacgttacgttattagtt1140aaatcgatgggctgcaggaattcgatctga1200gactgaaatgcctcaaaatgttctttacga1260ccagtgatttttttctccattttagcttcc1320aatacgcccggtagtgatcttatttcatta1380tcaacgtctcattttcgccaaaagttggcc1440ggatttatttattctgcgaagtgatcttcc1500tcgggtgatgctgccaacttactgatttag1560ggcttctgtttctatcagctgtccctcctg1620caaaagcaccgccggacatcagcgctagcg1680gatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtg1740agcagaatatgtgatacaggatatattccg1800tcgttcgactgcggcgagcggaaatggctt1860ccaggaagatacttaacagggaagtgagag1920ccgcccccctgacaagcatcacgaaatctg1980aggactataaagataccaggcgtttccccc2040tgcctttcggtttaccggtgtcattccgct2100tgacactcagttccgggtaggcagttcgct2160ttcagtccgaccgctgcgccttatccggta2220
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1.一種解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效應的方法，其特征在于，所述方法通過抑制丙 酮丁醇梭菌的CcpA基因表達實現(xiàn)。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達通過 中斷丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達實現(xiàn)。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述中斷丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達通過 在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入DNA片段實現(xiàn)。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌為 Clostridium acetobutylicum ATCC 824。
5.一種Clostridium acetobutylicum重組菌株，其特征在于，所述菌株的基因組中丙 酮丁醇梭菌的ccpA基因表達被抑制。
6.如權利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述菌株的丙酮丁醇梭菌ccpA基因表 達被中斷。
7.如權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述菌株的的丙酮丁醇梭菌ccpA基因 中插入DNA片段。
8.如權利要求5-7中任一項所述的重組菌株用于生產丙酮、丁醇、乙醇的應用，其特征 在于，所述菌株同步利用葡萄糖-木糖混合糖進行發(fā)酵。
9.一種提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖發(fā)酵生產丙酮、丁醇、乙醇能力的 方法，其特征在于，所述方法通過抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達實現(xiàn)。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達通過 中斷丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效應的方法，以及一種基因組中丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達被抑制的重組菌株。本發(fā)明提供的解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效應的方法通過抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表達來實現(xiàn)。使用本發(fā)明提供的方法，中斷了丙酮丁醇梭菌ccpA基因的表達。本發(fā)明提供的菌株中，ccpA基因經二類內含子插入失活后菌株同步利用木糖和葡萄糖的能力顯著提高，同時轉化生成的ABE濃度相應提高。本發(fā)明構建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效應，能同步利用葡萄糖和木糖進行發(fā)酵，因此該菌株有利用木質纖維素水解液進行丙酮丁醇發(fā)酵的潛力。
文檔編號C12N15/74GK102041267SQ20091019728
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權日2009年10月16日
發(fā)明者任聰, 姜衛(wèi)紅, 楊晟, 胡世元, 顧陽 申請人:中國科學院上海生命科學研究院