專利名稱：一種基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物細胞電融合的裝置。具體地，本發(fā)明涉及提供細胞電融合的芯片，
提供并產(chǎn)生細胞排隊、電致穿孔、融合所需要的電場強度和電場梯度。本發(fā)明涉及細胞電融 合中細胞的精確控制、細胞的高效融合，適用于遺傳學、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學、 藥物篩選、單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領域。
背景技術：
細胞電融合技術自上世紀80年代起，因為其效率較高、操作簡便、對細胞無毒害，
便于觀察，適于儀器應用和規(guī)范操作等優(yōu)點，得到了快速發(fā)展和廣泛應用。
細胞電融合可以分為兩個主要階段細胞排隊和細胞融合。 細胞排隊的原理在于生物細胞處于非均勻電場中時，被電場極化形成 偶極子，該偶極子在非均勻電場作用中會受到特定的力而發(fā)生運動，即介電電泳 (dielectrophoresis)。利用介電電泳可以控制細胞的運動，在細胞電融合過程中，利用介 電電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電融合過程所需的排隊和融 合后壓緊。 細胞融合的原理在于強電場作用會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致 穿孔效應(electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜 穿孔，從而使細胞間進行膜內(nèi)物質(zhì)交換，使細胞質(zhì)、膜融合，在一定強度的電場作用下的電 穿孔是一種可逆穿孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，產(chǎn)生細胞電融合過程 的膜融合。 傳統(tǒng)的細胞電融合系統(tǒng)通常都采用大型融合槽，其優(yōu)點在于(1)操作較為簡便， 采用大型融合槽降低了包括樣品進樣與出樣等步驟的難度；(2)加工簡便，大型融合槽的 尺寸一般都在厘米量級，利用傳統(tǒng)的機械加工手段可以較為方便地加工出所需要的融合槽 結構；(3)融合量大，傳統(tǒng)的融合槽可以容納數(shù)毫升樣品，一次實驗即可獲得足夠的細胞進 行后期篩選、培養(yǎng)等工作。 但傳統(tǒng)的細胞電融合設備也存在一些缺點(l)由于融合槽中的電極間距較大， 要達到夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅(qū)動電壓，往往高達幾百上千 伏，對系統(tǒng)的電氣安全性要求高，系統(tǒng)的成本也因此大為提高；(2)電極間的較大間距不利 于對細胞的精確控制等。 為解決這一問題，研究者將細胞電融合技術與MEMS加工技術相結合。MEMS技術的 加工范圍通常在1 50iim，這與細胞的直徑范圍相當，所產(chǎn)生的微結構能有效控制細胞。 有多家研究機構開始研究利用微流控芯片技術或者微電極陣列技術構建生物芯片來實現(xiàn) 細胞電融合操作。 例如，美國MIT的研究人員提出了利用微流控芯片技術實現(xiàn)對細胞的精確控制， 達到高效的細胞配對和融合；國內(nèi)趙志強等研究人員也提出了利用MEMS技術構建微電極 陣列，通過構建微米量級間距的微電極陣列，實現(xiàn)在低電壓條件下的細胞電融合。日本研究者提出的利用一對微電極，通過流路控制細胞的流動，使細胞運動到微電極對位置區(qū)域后， 利用電場作用使兩個細胞形成配對，再借助于電脈沖實現(xiàn)電融合。 但上述芯片仍然存在一定的問題，如美國MIT所研究的微流控芯片雖然較好的解
決了細胞配對的問題，但該芯片兩電極間的間距較大，仍然需要較高的外界電壓才能夠?qū)?br> 現(xiàn)電融合。而趙志強提出的芯片所集成的微電極數(shù)量較少，不能實現(xiàn)高通量融合；微電極所
產(chǎn)生的電場強度和電場梯度也比較弱，難以實現(xiàn)細胞的精確控制；所選擇的加工材料的抗
腐蝕、抗氧化能力也較差；同時，由于未集成進出樣裝置，操作也較為不便。日本研究者提出
的方法效率較低，融合通量遠不能滿足融合后細胞研究的要求。 國內(nèi)外相關專利如下CN200810069511. 3， 2008年，重慶大學，楊軍CN200810070158. 0，2008年，重慶大學，楊軍CN200810070159. 5， 2008年，重慶大學，楊軍CN200710092892. 2， 2007年，重慶大學，楊軍CN200610054121. x，2006年，重慶大學，趙志強等；CN1482234，2003年，中國科學院上海技術物理研究所，張濤等；CN86210174，1995年，遼寧腫瘤研究所，梁偉；4326934，April 27，1982，Pohl ;441972，April 10，1982，Pohl ;4578168， March 25，1986， Hofman ; 4695547， S印22， 1987， Hillard ; 4699881， Oct 13，1987， Matschke， et al ; 5007995，Apr 16，1991，Takahizuki。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提出一種用于細胞電融合的芯片裝置， 芯片上集成了陣列化的微小室結構，通過調(diào)節(jié)微小室尺寸結構使每個微小室中僅能容納兩 個細胞，從而實現(xiàn)極高的細胞兩兩排隊效率及后期的兩兩融合率。
本發(fā)明的技術方案如下 —種基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，由微小室陣列芯片、外圍印制 電路板和流路控制裝置共同組成。外圍電信號通過外圍印制電路板加載于微小室陣列芯片 上，在每個微小室結構中形成一定的電場，控制細胞在微小室結構中的排隊和融合；流路控 制裝置的功能在于實現(xiàn)細胞懸浮液在芯片裝置中的進樣、出樣和流動。 其中，所述微小室陣列芯片是以石英為基底層，所述微小室陣列芯片是以石英為 基底層，在石英基底層之上采用微加工技術形成有金屬微電極陣列、多聚物側(cè)壁和多聚物 圍水欄，金屬微電極陣列集成了大量的金屬微電極，金屬微電極與多聚物側(cè)壁等高，相對的 兩金屬微電極和相對的兩多聚物側(cè)壁構成了一個微小室，微小室也呈陣列排布；多聚物圍 水欄圍繞在整個陣列化微小室之外，金屬微電極陣列有兩個端頭伸出于多聚物圍水欄外， 用于和外圍印制電路板鍵合。 為實現(xiàn)每一微小室中僅容納兩個細胞進行單層排隊，微小室的深度為15 m，寬度為5 30 m，長度可根據(jù)目標細胞的大小在10 60 m間進行調(diào)節(jié)。構建微小室的金屬微電極的厚度與微小室的深度相同，長度為10iim，寬度為20iim，相對金屬微電極間大小在10 60 ii m間調(diào)節(jié)，微小室結構之間的相鄰金屬微電極間間距為20 40 ii m。多聚物側(cè)壁厚度與金屬微電極厚度一致，多聚物側(cè)壁置于相鄰電極中間，寬度與相鄰微電極間的間距相同，長度與所處位置微小室長度一致，以隔絕兩相鄰微小室間的細胞相互運動。金屬微電極材料盡量選擇導電性好，抗腐蝕、抗氧化能力強，生物相容性好的材料，如金、鉬等。多聚物材料也應具備較好的生物相容性，可選擇聚酰亞胺、聚對二甲苯等。
所述微小室陣列芯片鍵合于外圍印制電路板上，與印制電路板形成電氣連接。外
圍印制電路板采用標準印制電路板工藝進行設計與制造，印制電路板上主要布置了多個可與微小室陣列芯片上的陣列化微電極進行鍵合連接的鍵合點，并分布有與外界電信號進行
連接的焊盤。 所述流路控制模塊覆蓋在所述微小室陣列芯片之上，由PDMS流路控制蓋片和導管組成。在PDMS流路控制蓋片的面向微小室陣列芯片一面上形成有與陣列化微小室區(qū)域面積相當?shù)膬映?，儲樣池兩?cè)有微通道和進樣口 、出樣口 ，所述儲樣池的底平面與陣列化微小室的頂平面之間留有容細胞流動通過的間隙。流路控制模塊的功能在于在細胞電融合過程中控制細胞懸浮液在芯片內(nèi)的流動，配合微小室的獨特結構實現(xiàn)每個微小室內(nèi)僅容納兩個細胞，并利用微流體吹出儲樣池內(nèi)多余的細胞，其通路可描述為導管-進樣口 _微通道_儲樣池_微通道_出樣口 _導管。微通道和儲樣池的深度均為40 ii m ;進樣口 /出樣口需要貫穿P匿S流路控制蓋片，進樣口和出樣口置于凹槽的兩側(cè)，進樣口與出樣口的直徑為2mm，可根據(jù)實際情況進行調(diào)節(jié)。
本發(fā)明提出的微小室陣列結構具有如下優(yōu)點 本裝置構建的結合微小室的特殊結構和流路控制模塊，可實現(xiàn)每個微小室內(nèi)僅容納兩個細胞，細胞的兩兩排隊率和兩兩融合率高； 金屬微電極良好的電導率和相對電極間的較短間距，使裝置僅需要很低強度的外圍電信號即可在微小室內(nèi)產(chǎn)生足夠強度的電場，實現(xiàn)細胞排隊和電融合過程，降低了裝置對外圍信號發(fā)生器的要求和系統(tǒng)的制作成本；
低的工作電壓也提高了系統(tǒng)的安全性； 金屬微電極選用金、鉑等材料提高了芯片的生物相容性和抗氧化、抗腐蝕性能，也提高了芯片的可靠性； 微小室陣列可實現(xiàn)大量細胞的同時融合，融合效率高； 自動進樣和自動出樣減小對融合后細胞的物理損傷，提高其存活能力。


圖1基于微小室結構的細胞電融合微電極陣列芯片裝置的結構示意圖； 圖2基于微小室結構的細胞電融合微電極陣列芯片裝置的結構分解示意圖； 圖3微小室陣列芯片的各部分分解圖； 圖4微小室結構的示意圖； 圖5流路控制模塊的組裝示意圖； 圖6外圍印制電路板的結構示意圖。
具體實施方式
實施例1 : 參見圖1、圖2，基于微小室結構的細胞電融合微電極陣列芯片裝置由微小室陣列芯片1、流路控制模塊2和外圍印制電路板3組成。 參見圖2、圖3和圖4，微小室陣列芯片1具有石英基底層8，在石英基底層8之上采用微加工技術形成有金屬微電極陣列4、多聚物側(cè)壁7和多聚物圍水欄6。金屬微電極陣列4集成了大量的金屬微電極5，相對的兩金屬微電極5和相對的兩多聚物側(cè)壁7構成了一個微小室9，微小室9也呈陣列排布。金屬微電極陣列4材料可選擇金、鉬等材料，多聚物材料可選擇聚酰亞胺、聚對二甲苯等材料；微小室9的深度為15 ii m，寬度為5 30 y m，長度可根據(jù)目標細胞的大小在10 60 ii m間進行調(diào)節(jié)。構建微小室的金屬微電極5的厚度與微小室9的深度相同，長度為10 ii m，寬度為20 ii m，相對微電極間大小在10 60 y m間調(diào)節(jié)，相鄰微電極間間距為20 40 ii m。多聚物側(cè)壁7厚度與金屬微電極陣列4的厚度一致，多聚物側(cè)壁7置于相相鄰電極中間，寬度與相鄰微電極間的間距相同，長度與所處位置微小室9長度一致，以隔絕兩相鄰小室間的細胞相互運動。金屬微電極陣列4的端頭可用于和外圍印制電路板3鍵合。 參見圖5，流路控制模塊2則由PDMS流路控制蓋片11和導管10組成，PDMS流路控制蓋片11覆蓋在微小室陣列芯片1之上。PDMS流路控制蓋片11面向微小室陣列芯片1一面集成了進樣口 14、出樣口 15、微通道13和與陣列化微小室區(qū)域面積相當?shù)膬映?2。儲樣池12的底平面與陣列化微小室9的頂平面之間留有容細胞流動通過的間隙。微通道13和儲樣池12的深度均為40iim;進樣口 14/出樣口 15的需要貫穿PDMS流路控制蓋片ll，進樣口 14和出樣口 15置于儲樣池12的兩側(cè)，進樣口 14與出樣口 15的直徑為2mm，可根據(jù)實際情況進行調(diào)節(jié)。 微小室陣列芯片1置于外圍印制電路板3上，通過鍵合與印制電路板形成電氣連接。參見圖6，外圍印制電路板3采用標準印制電路板工藝進行設計與制造，外圍印制電路板3中央為方形觀察窗16，為實驗的觀察提供良好的觀察通路，外圍印制電路板3上布置了多個可與微小室陣列芯片1上的金屬微電極陣列4的端頭進行鍵合連接的鍵合點18，并分布有與外界電信號進行連接的焊盤17。 該芯片裝置的封裝方式為將微小室陣列芯片l置于外圍印制電路板3上，利用金絲，采用鍵合工藝連接微小室陣列芯片1上金屬微電極陣列4的端頭和外圍印制電路板上的鍵合點18 ;隨后，將微小室陣列芯片1和流路控制模塊2用氧等離子體處理30秒鐘，再將流路控制模塊2反扣于微小室陣列芯片1上，儲樣池12與金屬微電極陣列4區(qū)域吻合，二者將在物理作用下緊密結合在一起。
實施例2 :上述裝置中部分結構的加工工藝 1、微小室陣列芯片采用MEMS加工工藝實現(xiàn)，加工步驟如下(此處所描述的金屬陣列電極層材料選金Au，多聚物層材料選用聚酰亞胺)
A.選用石英作為加工芯片的基片； B.在石英基片上濺射一層Ti/W，其中，Ti/W層的厚度為50nm ;
C.通過電鍍的方式在Ti/W層表面電鍍一層金，厚度為15iim;
D.通過光刻的方式在Ti/W/Au層上刻蝕出微電極陣列的形狀； E.旋涂聚酰亞胺膠于上述結構表面，形成一厚度與Ti/W/Au層厚度相當(15 y m)
的聚酰亞胺層； F.光刻聚酰亞胺形成微小室的側(cè)壁結構。 2、 PDMS流路控制蓋片的加工通過倒模工藝實現(xiàn)，加工步驟如下 A.利用印刷電路板制作工藝，加工厚度為40ym的模具，模具結構為細胞懸浮液
儲樣池、進樣口、出樣口和微通道； B.將模具固定于一培養(yǎng)皿上； C.倒入混合好的PDMS混合膠，靜止后抽真空； D.置于加熱臺上75"固化； E.揭下固化后P匿S，根據(jù)微小室陣列芯片形狀剪裁，并去除進樣口、出樣口的膠 即可。
實施例3 :細胞電融合的應用 從實施例1中所述的進樣口 14中，使用微量泵注入細胞懸浮液；當細胞懸浮液經(jīng) 導管10、進樣口 14及微通道13組成的通路進入儲樣池12后，細胞將在重力作用下將沉入 儲樣池12對應的下方微小室9 ;微小室9的特殊結構使其單層僅能容納2個細胞，多余細胞 將堆積其上；此時，結合流路控制裝置2，利用微量泵注入細胞電融合緩沖液；由于微小室9 是一微坑結構，在多聚物側(cè)壁7的阻攔下，微小室9中的兩個細胞不會被微流沖出；而堆積 其上的多余細胞由于缺乏微7的阻攔，將會順著微通道13、出樣口 15和導管10通路流出； 此時，微小室陣列芯片1中的每個微小室中僅有2個細胞；再通過外圍印制電路板3向金屬 微電極陣列4施加正弦波電剌激信號，微小室9中兩相對的微電極5之間將形成一非均勻 梯度電場，微小室9中的兩個細胞將在介電電泳力作用下進行細胞排隊；完成排隊后，施加 方波脈沖序列信號，完成排隊的細胞對將在微小室9內(nèi)高強度的脈沖電場作用下完成細胞 電穿孔-細胞電融合等過程。完成細胞電融合過程后，將該裝置翻轉(zhuǎn)，靜置，利用細胞自身 重力使融合后的細胞從微小室9中沉入儲樣池12中；此時，再結合流路控制裝置2，利用微 量泵注入細胞培養(yǎng)液，將儲樣池12中的細胞緩沖液經(jīng)微通道13、出樣口 15和導管10通路 沖 。獲得細胞緩沖液可利用培養(yǎng)皿進行收集，進行后期的培養(yǎng)。
權利要求
一種基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于它由微小室陣列芯片，外圍印制電路板和流路控制模塊組成；所述微小室陣列芯片是以石英為基底層，在石英基底層之上采用微加工技術形成有金屬微電極陣列、多聚物側(cè)壁和多聚物圍水欄，金屬微電極陣列集成了大量的金屬微電極，金屬微電極與多聚物側(cè)壁等高，相對的兩金屬微電極和相對的兩多聚物側(cè)壁構成一個微小室，微小室也呈陣列排布；多聚物圍水欄圍繞在整個陣列化微小室之外，金屬微電極陣列有兩個端頭伸出于多聚物圍水欄外，用于和外圍印制電路板鍵合；所述微小室陣列芯片鍵合于外圍印制電路板上，與印制電路板形成電氣連接；所述流路控制模塊覆蓋在所述微小室陣列芯片之上，其由PDMS流路控制蓋片和導管構成，在PDMS流路控制蓋片的面向微小室陣列芯片一面上形成有與所述陣列化微小室區(qū)域面積相當?shù)膬映?，儲樣池兩?cè)有微通道和進樣口、出樣口，所述儲樣池的底平面與陣列化微小室的頂平面之間留有容細胞流動通過的間隙。
2. 根據(jù)權利要求1所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述的微小室的深度控制在以容納目標細胞在其內(nèi)單層排布為限。
3. 根據(jù)權利要求2所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述微小室的深度為15 y m，寬度為5 30 ii m，長度根據(jù)目標細胞的大小在10 60 y m間 進行調(diào)節(jié)，保證每個微小室內(nèi)僅供兩個細胞進行融合。
4. 根據(jù)權利要求2所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述微小室結構的深度為15iim，長度為10iim，寬度為20iim，相對電極間大小在10 60 ii m間調(diào)節(jié)，相鄰微電極間間距為20 40 ii m。
5. 根據(jù)權利要求1所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述的微小室陣列芯片中的金屬微電極材料選擇金或鉑；構建側(cè)壁的多聚物材料選用具備 絕緣性和生物相容性的聚酰亞胺或聚對二甲苯。
6. 根據(jù)權利要求1所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述外圍印制電路板上布置了多個與微小室陣列芯片上的陣列化微小室進行鍵合連接的 鍵合點，并分布有與外界電信號進行連接的焊盤。
7. 根據(jù)權利要求1所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述的微通道和儲樣池的深度均為40 ii m，進樣口與出樣口的直徑為2mm。
8. 根據(jù)權利要求1所述的基于微小室陣列結構的細胞電融合芯片裝置，其特征在于 所述外圍印制電路板的中央與陣列化微小室區(qū)域?qū)奈恢脼橛^察窗。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種基于微小室結構的細胞電融合微電極陣列芯片裝置，它由微小室陣列芯片，外圍印制電路板和流路控制模塊組成。微小室陣列芯片是由石英基底層、金屬微電極陣列、多聚物側(cè)壁和多聚物圍水欄構成，相對的兩金屬微電極和相對的兩多聚物側(cè)壁構成一個微小室，微小室呈陣列排布；微小室陣列芯片鍵合于外圍印制電路板上，形成電氣連接；流路控制模塊覆蓋在所述微小室陣列芯片之上。本發(fā)明通過外界電信號在微小室中形成一定的電場，控制微小室內(nèi)部的細胞的高效排隊與電融合，從而實現(xiàn)每個微小室中僅有一對細胞進行融合，提高細胞融合的通量和安全性。
文檔編號C12N15/02GK101693874SQ20091019105
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權日2009年9月30日
發(fā)明者劉琳琳, 夏斌, 張小玲, 楊軍, 田 浩, 胡南, 胡寧, 蔣鳳, 趙麗蘋, 鄭小林 申請人:重慶大學;