專利名稱：：混合石蠟、pcr反應(yīng)試劑的保存方法以及反應(yīng)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種混合石蠟，采用該混合石蠟對PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行保存的方法以及含有該混合石蠟的PCR反應(yīng)試劑盒。
背景技術(shù)：
：實(shí)時熒光定量PCR(RealTimePolymeraseChainReaction,RealTimePCR實(shí)時PCR)技術(shù)是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量或定性分析的方法。目前在&出科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。其基本原理為在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號強(qiáng)度，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，在曲線指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定量分析。但是在一般的PCR試劑盒中(反應(yīng)液體積一般為10(il~100nl),由于反應(yīng)液體積較少，在高溫條件或長途運(yùn)輸過程中，又易因蒸發(fā)而體積減少，造成反應(yīng)液體積和成分的變化，從而影響檢測結(jié)果；并且長時間保存后，反應(yīng)液中的Taq酶(耐熱性多聚酶)、UNG酶(尿嘧啶DNA糖基酶)易失活也影響擴(kuò)增效率。如果能采用一種方法，能保證少量的反應(yīng)液體積在高溫或運(yùn)輸?shù)臈l件下不發(fā)生體積和成分的變化，并且能長時間的保持Taq酶的活性，這將給PCR試劑盒的使用帶來更大的方便。為解決上述問題，目前有兩種方法，一種是使用植物油作為熱啟動PCR反應(yīng)中的蒸汽障礙，以減少溶劑揮發(fā)，但這種方法并不能解決長時間保持Taq酶活性的問題，另一種是采用固體石蠟將PCR反應(yīng)中的酶4與其他成分隔離，創(chuàng)造了更多的實(shí)用和有效的熱啟動PCR方法，但現(xiàn)有固體石蠟熔點(diǎn)太高，約為5070。C，而且在-20。C的條件下，PCR反應(yīng)試劑只能保存1~2周。另外，若PCR反應(yīng)體系中還含有UNG酶，UNG酶適合的作用溫度為37~50°C,現(xiàn)有固體石蠟熔點(diǎn)太高，若要熔化，需要加熱到5(TC以上，影響了UNG酶在PCR反應(yīng)液中發(fā)揮防污染的作用，從而可能會影響實(shí)驗結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明實(shí)施例的第一目的在于提供一種混合石蠟，用于將PCR反應(yīng)中的酶與其他成分隔離，旨在解決PCR反應(yīng)液在低溫條件下長時間保存的問題。本發(fā)明實(shí)施例的第二目的在于提供一種利用上述混合石蠟進(jìn)行PCR反應(yīng)試劑的保存方法。本發(fā)明實(shí)施例的第三目的在于提供一種含有上述混合石蠟的PCR反應(yīng)試劑盒。本發(fā)明實(shí)施例的混合石蠟，由液體石蠟(LiquidParaffin)和熔化后的固體石蠟(Paraffinwax)均勻混合而成，其中，固體石蠟選自熔點(diǎn)高于50°C的固體石蠟，固體石蠟和液體石蠟的比值為1:4~1:12(w/v)。本申請文件中質(zhì)量體積比w/v單位均為g/ml,不再贅述。本發(fā)明實(shí)施例的PCR反應(yīng)試劑的保存方法，PCR反應(yīng)試劑中含有酶和其它必要成份，該方法為利用上述混合石蠟將PCR反應(yīng)試劑中的酶與其他成份隔離。本發(fā)明實(shí)施例的PCR反應(yīng)試劑盒，包括反應(yīng)容器及置于反應(yīng)容器中的反應(yīng)液，所述反應(yīng)液包括酶和其它必要成份，該P(yáng)CR反應(yīng)試劑盒中還包括用于將反應(yīng)液中酶和其它成份隔離的混合石蠟，所述混合石蠟為上述的混合石蠟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案采用熔點(diǎn)高于50。C的固體石蠟熔化后和液體石蠟按一定比例混合配制成一種混合石蠟，經(jīng)過測試(參見具體實(shí)施例)，該混合石蠟熔點(diǎn)在2738。C之間，用于將PCR反應(yīng)液中酶和其它成份隔離，熔點(diǎn)適中，在-2(TC的條件下PCR反應(yīng)試劑可保存半年。若PCR反應(yīng)體系中還含有UNG酶，當(dāng)需要熔化石蠟，使酶和其它成份混合時，無須加熱到50。C或以上，不會影響UNG酶在PCR反應(yīng)液中發(fā)揮防污染作用，從而不會因此而對實(shí)驗結(jié)果產(chǎn)生影響。此外，本發(fā)明實(shí)施例的混合石蠟制造方法簡單，成本低。圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的PCR反應(yīng)試劑中加入石蠟后對基因1擴(kuò)增的Ct值影響圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的PCR反應(yīng)試劑中加入石蠟后對基因2擴(kuò)增的Ct值影響圖3是是本發(fā)明實(shí)施例6混合石蠟的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例提供一種與現(xiàn)有技術(shù)相比，用于將PCR反應(yīng)中的酵與其他成分隔離，能使PCR反應(yīng)液在低溫條件下長時間保存的混合石蠟。另外，采用固體石蠟隔離PCR反應(yīng)液中酶和其它成份，在PCR反應(yīng)液中加入有UNG酶時，該固體石蠟如能滿足以下要求最為理想(1)為利于UNG酶(最適溫度為50°C)與PCR反應(yīng)液完全混合，該石蠟在5(TC前應(yīng)完全融化，進(jìn)一步考慮到儀器溫控性能，該石蠟熔點(diǎn)適宜在40。C以下；(2)在室溫條件下，石蠟應(yīng)為固體狀悉，才能將酶與PCR反應(yīng)液隔離。因現(xiàn)有的液體石蠟(熔點(diǎn)一般為15°C)和固體石蠟(熔點(diǎn)一般為50~70°C)均不滿足上述要求。為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種與現(xiàn)有技術(shù)相比，制造方法簡單，熔點(diǎn)適中，適合用于隔離用于隔離PCR反應(yīng)液中酶和其它成份，不影響熒光定量PCR反應(yīng)效果的混合石蠟。具體而言，本發(fā)明實(shí)施例的混合石蠟，由液體石蠟和熔化后的固體石蠟均勻混合而成，其中，固體石蠟選自熔點(diǎn)高于50。C的固體石蠟，固體石蠟和液體石蠟的比值為1:4~1:12(w/v),得到的混合石蠟的熔點(diǎn)為27~38°C。固體石蠟和液體石蠟的優(yōu)選比值為1:7~1:9(w/v),此時得到的混合石蠟的熔點(diǎn)為3036°C。本發(fā)明實(shí)施例中固體石蠟(Paraffinwax)并無特別限制，為本領(lǐng)域常用固體石蠟，只要是熔點(diǎn)高于50。C即可。固體石蠟熔點(diǎn)一般為50~70°C,在本實(shí)施例中，采用的固體石蠟為切片石蠟。本發(fā)明實(shí)施例中液體石蠟(LiquidParaffin)并無特別限制，為本領(lǐng)域常用液體石錯，液體石蠟又名白油、石蠟油、白色油、礦物油，常溫下為液體，主要成分為C16C20正構(gòu)烷烴的混合物，通式為CnH2n+2。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種PCR反應(yīng)試劑的保存方法，該P(yáng)CR反應(yīng)試劑中含有酶和其它必要成份，該方法為利用上述混合石蠟將PCR反應(yīng)試劑中的酶與其他成份隔離。采用本發(fā)明實(shí)施例的保存方法，在-2(TC的條件下PCR反應(yīng)試劑可保存半年，而現(xiàn)有的酶與PCR反應(yīng)液混合的保存方法一般在相同條件下只能保存12周。更進(jìn)一步，上述反應(yīng)試劑包括第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，第一反應(yīng)液包括緩沖液、dNTPs、催化劑、引物、探針、滅菌水，第二反應(yīng)液即上述酶，該酶包括Taq酶和UNG酶，在反應(yīng)容器中加入第一反應(yīng)液后，將上述混合石蠟滅菌且熔化后加入反應(yīng)容器，待混合石蠟?zāi)虒⒎磻?yīng)液覆蓋后，加入第二反應(yīng)液并將反應(yīng)容器口密封。本發(fā)明實(shí)施例混合石蠟熔點(diǎn)在27。C38。C的范圍，當(dāng)需要熔化石蠟，使第一反應(yīng)液與第二反應(yīng)液混合時，無須加熱到50。C或以上，不會影響UNG酶在PCR反應(yīng)液中發(fā)揮防污染的作用，從而不會因此而對實(shí)驗結(jié)果產(chǎn)生影響。上述混合石蠟的滅菌方法為本領(lǐng)域常用方法，在本實(shí)施例中，混合石蠟經(jīng)121。C滅菌15分鐘。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種PCR反應(yīng)試劑盒，包括反應(yīng)容器及置于反應(yīng)容器中的反應(yīng)液，上述反應(yīng)液包括酶和其他必要成份，該P(yáng)CR反應(yīng)試劑盒中還包括用于將反應(yīng)液中酶和其它成份隔離的混合石蠟，該混合石蠟為上述的混合石蠟。上述反應(yīng)液包括第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包括緩沖液、dNTPs、催化劑、引物、探針、滅菌水，所述第二反應(yīng)液為所述酶，所述酶包括Taq酶和UNG酶。上述第一反應(yīng)液包括5~50mM的Tris-Cl和40~100mM的KC1,0.10.5mM的dNTPs，1.0~5.0mM的MgCl2，0.(H~0.5|iM的引物，0.0卜0.5[iM的4笨4十，以及余量滅菌水；第二反應(yīng)液中含有0.5~10unitTaq酶和0.008-0.1unitUNG酶。上述第一反應(yīng)液優(yōu)選包括10mM的Tris-Cl和50mM的KC10.25mM的dNTPs，3.5mM的MgCl2，O.ljxM的引物，0.22pM或0.4pM的探針，以及余量滅菌水。實(shí)施例1將固體石蠟(上海標(biāo)本模型廠)和液體石蠟(天津福晨化學(xué)試劑公司)按l:4(W/V)的比例加熱熔化，混合均勻，配制成混合石蠟。按照"中國藥典(第二版)"中石蠟測定的方法進(jìn)行實(shí)驗，用兩端開口的毛細(xì)管吸取，高約10mm，在4。C冰箱中放置24小時，混合石蠟?zāi)毯笥孟鹌鼘⒚?xì)管緊縛在溫度計上，使毛細(xì)管的內(nèi)容物附在溫度計汞球中部。將毛細(xì)管連同溫度計浸入傳溫液中，混合石蠟的上端應(yīng)處于傳溫液液面下約10mm處；小心加熱，當(dāng)溫度上升至熔點(diǎn)低限低約5"C時，調(diào)節(jié)升溫速率使每分鐘上升不超過0.5。C，至混合石蠟在毛細(xì)管中開始上升時，檢讀溫度計顯示的溫度，即為混合石蠟熔點(diǎn)，結(jié)果見表l。實(shí)施例210與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別在于實(shí)施例2~10中固體石蠟和液體石蠟比例依次為1:5、1:6、1:7、1:8、1:8.5、1:9、1:10、1:11、1:12(W/V)?；旌鲜炄埸c(diǎn)，結(jié)果見表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、6000轉(zhuǎn)離心30秒，加陽性模板5W/組;<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>探針0.05Taq酶0.4UNG酶0.1模板8滅菌雙蒸水32.33、PCR擴(kuò)增條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、結(jié)果石蠟對PCR反應(yīng)中Ct值的影響見表3，擴(kuò)增圖譜見圖1、圖2。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3中基因1引物探針序列為invAF:5，-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3'invAR:5，-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3'invAProbe:ROX5'-CCGCCATTGTATTGGTTGTTACGGCGG陽3，Dabcyl表3中基因2引物探針序列為IpaH-F5'陽TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3'IpaH-R5'-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3'IpaHProbe5'-FAM-C4CGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGrG-DABCYL—3'由圖1、圖2及表2、3可以看出，該配方的石蠟對基因1、基因2擴(kuò)增的各Ct值間經(jīng)ttest檢驗與未加石蠟組沒有顯著性差異。基因1、基因2的Ct值分別延后0.10和0.03，即各延后0.5%和0.15%。質(zhì)i普試驗取上述實(shí)施例6所得混合石蠟進(jìn)行質(zhì)譜試驗，得到其質(zhì)譜圖，參見圖3。由該圖3可觀察到，本實(shí)施例的混合石蠟由兩組物質(zhì)構(gòu)成，第一組物質(zhì)是由20~32個碳的直鏈烷烴或支鏈烷烴、環(huán)烷烴產(chǎn)生10-20個特征峰的混合物；第二組物質(zhì)是由16-20個碳的直鏈、支鏈烷烴或環(huán)烷烴構(gòu)成的成分復(fù)雜的、不能產(chǎn)生特征峰(每種物質(zhì)的含量均不高，故不能產(chǎn)生特征峰)的混合物。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種混合石蠟，由液體石蠟和熔化后的固體石蠟均勻混合而成，其中，所述固體石蠟選自熔點(diǎn)高于50℃的固體石蠟，固體石蠟和液體石蠟的比值為1∶4～1∶12(w/v)。2、如權(quán)利要求1所述的混合石蠟，其特征在于，所述固體石蠟和液體石蠟的比值為1:7~1:9(w/v)。3、如權(quán)利要求1所述的混合石蠟，其特征在于，所述固體石蠟為切片石蠟。4、一種PCR反應(yīng)試劑的保存方法，PCR反應(yīng)試劑中含有酶和其他必要成份，其特征在于，該方法為利用如權(quán)利要求13任一項所述混合石蠟將PCR反應(yīng)試劑中的酶與其他成份隔離。5、如權(quán)利要求4所述反應(yīng)試劑的保存方法，其特征在于，所述反應(yīng)試劑包括第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包括緩沖液、dNTPs、催化劑、引物、探針、滅菌水，第二反應(yīng)液為所述酶，所述酶為Taq酶，在反應(yīng)容器中加入第一反應(yīng)液后，將如權(quán)利要求l-3任一項所述混合石蠟滅菌且熔化后加入.反應(yīng)容器，待混合石蠟?zāi)虒⒎磻?yīng)液覆蓋后，加入第二反應(yīng)液并將反應(yīng)容器口密封。6、如權(quán)利要求5所述PCR反應(yīng)試劑盒的保存方法，所述第二反應(yīng)液中酶還包括UNG酶。7、一種PCR反應(yīng)試劑盒，包括反應(yīng)容器及置于反應(yīng)容器中的反應(yīng)液，所述反應(yīng)液包括酶和其他必要成份，其特征在于，所述PCR反應(yīng)試劑盒中還包括用于將反應(yīng)液中酶和其它成份隔離的混合石蠟，所述混合石蠟如權(quán)利要求1~3任一項所述的混合石蠟。8、如權(quán)利要求7所述PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液包括第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包括緩沖液、dNTPs、催化劑、引物、探針、滅菌水，所述第二反應(yīng)液為所述酶，所述酶包括Taq酶和UNG酶。9、如權(quán)利要求8所述PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于，所述第一反應(yīng)液包括8~15mM的Tris-Cl和45~55mM的KC1，0.20.4mM的dNTPs;2.5~4.0mM的MgCl2，0.10.3i!M的引物，0.20.5nM的探針，以及余量滅菌水；所述第二反應(yīng)液為卜5unitTaq酶和0.008-0.1unitUNG酶。10、如權(quán)利要求9所述PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于，所述第一反應(yīng)液包括10mM的Tris-Cl和50mM的KCl,0.25mM的dNTPs,3.5mM的MgCl2,O.lpM的引物，0.22pM或0.4^iM的探針，以及余量滅菌水。全文摘要本發(fā)明提供了一種混合石蠟，采用該混合石蠟對PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行保存的方法以及含有該混合石蠟的PCR反應(yīng)試劑盒，該混合石蠟由液體石蠟和熔化后的固體石蠟均勻混合而成，其中，固體石蠟選自熔點(diǎn)高于50℃的固體石蠟，固體石蠟和液體石蠟的比值為1∶4～1∶12(w/v)。本發(fā)明的混合石蠟熔點(diǎn)在27～38℃之間，用于隔離PCR反應(yīng)液中酶和其它成份，熔點(diǎn)適中，不影響熒光定量PCR反應(yīng)的效果。而且，本發(fā)明實(shí)施例的混合石蠟制造方法簡單，成本低。文檔編號C12P19/00GK101665816SQ20091019011公開日2010年3月10日申請日期2009年9月8日優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日發(fā)明者嚴(yán)瓊英,吳炳義,鵬張,論彭,汪再興申請人:深圳市生科源技術(shù)有限公司