專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，涉及利用非植物來(lái)源的幾丁酶基因提 高植物對(duì)病害的抗性，特別是提高棉花對(duì)黃萎病的抗性。
背景技術(shù)：
自從人類(lèi)開(kāi)始栽培作物以來(lái)，由病原菌引起的作物病害一直是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主 要因素之一。病害每年可造成全世界作物減產(chǎn)15%以上，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)300 500億美元 (李潤(rùn)植等，2001 ；Osusky等，2000)。此外，病害還引起作物產(chǎn)品品質(zhì)下降，病原菌產(chǎn)生的毒 素嚴(yán)重危害人體健康。在作物病害綜合防治策略中，培育和推廣應(yīng)用抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有 效的措施。由于病原菌變異迅速，植物抗性資源有限以及常規(guī)育種方法耗時(shí)費(fèi)力，所培育的 抗病品種遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需要。利用現(xiàn)代生物技術(shù)分離、克隆和轉(zhuǎn)化抗性基因，不僅定向性 強(qiáng)、基因型來(lái)源豐富，而且不受抗源親緣關(guān)系限制、育種周期短、理論上也不存在性狀的負(fù) 相關(guān)連鎖，可對(duì)單一性狀進(jìn)行根本改良。此外，將某些抗病基因轉(zhuǎn)入植物中，不僅可以提高 植物對(duì)病原真菌致病因子的解毒能力，而且可以提高植物獲得性系統(tǒng)抗性能力。通過(guò)這種 方法獲得的抗病植物，具有抗性不易喪失、抗性基因來(lái)源廣容易轉(zhuǎn)育等優(yōu)點(diǎn)(Cornelissen 等，1993)。因此，基因工程技術(shù)已成為植物抗病育種的重要途徑。幾丁質(zhì)酶是一種水解酶，廣泛存在于植物和微生物中，具有降解幾丁質(zhì)的作用。幾 丁質(zhì)是植物病原真菌中絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，而植物中還未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的作 用底物。此外，真菌細(xì)胞壁的降解產(chǎn)物還可進(jìn)一步誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)(Grison et al., 1996 ；Velazhahan et al. ,2000 ；Lorito et al.，1998)。因此，幾丁質(zhì)酶基因一直受到人們關(guān)注。作為重要經(jīng)濟(jì)作物的棉花是世界上最重要的天然纖維作物。在中國(guó)，棉花歷來(lái)是 關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要物資，我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)涉及約2億農(nóng)村人口的收入，關(guān)系到1900萬(wàn)紡織 工人就業(yè)和1000多億美元的出口創(chuàng)匯，對(duì)紡織工業(yè)乃至整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有舉足輕 重的作用。但是，棉花黃萎病自1935年傳入我國(guó)后，對(duì)我國(guó)棉花生產(chǎn)的危害逐年加重，重病 年份損失皮棉超過(guò)40萬(wàn)噸，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)60多億元(陳捷胤等，2005)。黃萎病為害嚴(yán) 重的棉田，可減產(chǎn)70%以上，同時(shí)還嚴(yán)重降低纖維品質(zhì)。棉花黃萎病這一世界性的重大病 害，嚴(yán)重阻礙著我國(guó)棉花生產(chǎn)的發(fā)展。棉花黃萎病(cotton Verticillium wilt)屬土傳維 管束病害，其特點(diǎn)是分布廣、危害重、寄主范圍廣、傳播途徑多、存活時(shí)間久，是棉花生產(chǎn)中 最具毀滅性的病害之一。在我國(guó)，生產(chǎn)上一直沒(méi)有找到理想的防治技術(shù)與控制方法，因此被 稱(chēng)之為棉花的“癌癥”(陳捷胤等，2005)。選育和推廣抗黃萎病品種，是我國(guó)也是世界各產(chǎn) 棉國(guó)防治黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效，而且是唯一有效的途徑(顧本康等，1996)。我國(guó)育種專(zhuān)家經(jīng)過(guò)幾十年的努力，利用常規(guī)育種手段，獲得了一些對(duì)黃萎病具有 一定抗病能力的地方品種。但是，黃萎病菌變異快、小種多，具有明顯的致病力分化，針對(duì) 黃萎病菌這種特性的廣譜抗性棉花品種基本沒(méi)有，因此，在一個(gè)地區(qū)表現(xiàn)為抗病的棉種到 另一個(gè)不同生理和地理?xiàng)l件下抗病性就會(huì)喪失。另一方面，由于陸地棉栽培種內(nèi)缺乏高抗黃萎病的抗源，直接導(dǎo)致了我國(guó)棉花抗黃萎病育種進(jìn)程緩慢，特別是抗落葉型黃萎病育種 基本沒(méi)有進(jìn)展(馬存等，2002)。此外，不同地域種子交流導(dǎo)致病原菌在地方上的種類(lèi)越來(lái) 越多，形成了復(fù)合種群。各地的棉花黃萎病菌均存在致病力的分化和提高，強(qiáng)致病力菌系 的出現(xiàn)是造成棉花黃萎病逐年加重的主要原因之一(房衛(wèi)平等，2001)。為此，解決生產(chǎn)中 抗黃萎病資源缺乏的問(wèn)題已迫在眉睫，急需獲得具有廣譜和持久抗性的抗源以減輕棉花生 產(chǎn)中因黃萎病造成的巨大損失。利用幾丁酶基因提高棉花對(duì)黃萎病的抗性，我國(guó)的樂(lè)錦華 (2002)和程紅梅(2005)等已取得了一些進(jìn)展。但他們所用的幾丁酶基因都來(lái)自植物。由于 進(jìn)化的原因，來(lái)自植物的基因轉(zhuǎn)入植物后，病原菌對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物容易產(chǎn)生耐性。因此， 利用幾丁酶基因提高棉花對(duì)黃萎病的抗性還有待進(jìn)一步的進(jìn)行研究和尋找新的基因，特別 是尋找和研究非植物來(lái)源的幾丁酶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低、效果好的利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物 抗病性的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的 方法，其特征在于，包括如下步驟1)獲得球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl 設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)后， 以球孢白僵 菌基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pUC-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài) 細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆獲得Bbchitl基因；2)構(gòu)建組成型表達(dá)幾丁酶基因植物表達(dá)載體將Bbchitl基因插入植物表達(dá)載體 Ρ5，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為p5-35S-Bbchitl，組成型表達(dá)啟動(dòng)子為花椰菜花葉 病毒CaMV35S啟動(dòng)子；3)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將所述CaMV35S啟動(dòng)子控制下的球孢白僵菌幾丁酶基 因Bbchitl整合入植物基因組，實(shí)現(xiàn)Bbchitl基因在植物內(nèi)的組成型表達(dá)，提高植物對(duì)真菌 病害的抗病能力；4)將步驟3)獲得的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)栽培、分子鑒定、人工氣候室和溫 室內(nèi)的抗病鑒定，獲得抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)一步，組成型表達(dá)的p5-35S_Bbchitl植物表達(dá)載體構(gòu)建的步驟包括從球孢 白僵菌中提取基因組總DNA后，設(shè)計(jì)上游引物5’-CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTT CAAACC A-3，，下游引物5，-CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CTT-3，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接入PUC-T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆得 到Bbchitl基因；然后將該基因插入植物表達(dá)載體Ρ5，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)體，命名為 p5-35S-Bbchitl，以實(shí)現(xiàn)該基因在植物內(nèi)的組成型表達(dá)。所述植物主要是指番茄或棉花。步驟2)所述構(gòu)建組成型表達(dá)幾丁酶基因植物表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方 法，使用的載體為植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域所使用的常規(guī)載體，組成型表達(dá)啟動(dòng)子為花椰菜花葉病 毒CaMV35S啟動(dòng)子。步驟3)所述根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，其中將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的方法為電轉(zhuǎn) 化法，將植物表達(dá)載體整合入番茄和棉花基因組的方法為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
步驟4)所述分子鑒定為分子生物學(xué)，生物技術(shù)領(lǐng)域常用的檢測(cè)鑒定技術(shù)，如⑶S 組織化學(xué)染色、PCR以及RT-PCR等。步驟4)所述的抗病鑒定指人工氣候室內(nèi)幼苗植株抗性鑒定，以及溫室內(nèi)進(jìn)行的 棉花幼苗和整個(gè)生育期對(duì)黃萎病的抗性鑒定。轉(zhuǎn)基因棉花的鑒定方法為常規(guī)的抗黃萎病鑒 定法，如灌菌液法，病圃鑒定等；轉(zhuǎn)基因番茄為常規(guī)的離體葉片接種方法。本發(fā)明所提供的培育抗病植物的方法，是將來(lái)自球孢白僵菌的幾丁酶基因重組植 物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入番茄或棉花細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)該基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的組成型表達(dá)，提高植物 對(duì)病害的抗病能力，特別是提高植物對(duì)真菌病害的抗病能力。含有該幾丁酶基因的重組植 物表達(dá)載體、重組菌和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因番茄可明顯提高對(duì)早疫病的抗性；轉(zhuǎn)基因棉花溫室 內(nèi)接種非落葉型黃萎病菌后，病情指數(shù)可小于20，較野生型對(duì)照低80%左右。本發(fā)明利用基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法和常規(guī)載體，構(gòu)建CaMV35S(35S)啟動(dòng)子控 制Bbchitl基因的植物表達(dá)載體，再利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將Bbchitl基因整合入番茄和 棉花基因組，獲得抗病性提高的轉(zhuǎn)基因再生植株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組成型表達(dá)Bbchitl基因 的番茄可明顯提高對(duì)早疫病的抗性，離體葉片接種早疫病菌塊10d，轉(zhuǎn)基因株系的病情指數(shù) 低于25，甚至為0，與野生型對(duì)照(100)相比可降低70%以上。轉(zhuǎn)基因棉花純合T3代溫室 病池接種落葉型和非落葉型黃萎病菌30d，與對(duì)照相比，病情指數(shù)可分別降低60%和80%。 說(shuō)明，本發(fā)明提供的提高植物抗病性的方法效果顯著。該方法不僅適用于棉花和番茄，還可 用于其它植物抗病性的提高。因此，本發(fā)明具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。


圖1為35S啟動(dòng)子控制幾丁酶基因Bbchitl植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖Amp 氨芐青霉素抗性基因；NPT 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptll ；⑶S β -葡萄糖 酸苷酶基因；35S 來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成型表達(dá)啟動(dòng)子；LB，T-DNA左邊界；RB， T-DNA右邊界。用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的骨架載體為ρ5，具有CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下的⑶S 基因，便于在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，以篩選轉(zhuǎn)化子。圖2為pBI121植物表達(dá)載體改造為P5載體的流程3為轉(zhuǎn)基因番茄中Bbchitl基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M =Marker 2000 ；1 水對(duì)照；2 野生型植株對(duì)照；3 質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照；4-13 ⑶S 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄。黑色箭頭示840bp的Bbchitl特異片段。圖4為離體葉片接種早疫病菌10d，Bbchitl轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)CK 再生的野生型植株；Bb3、Bb5和Bbl5 =Bbchitl轉(zhuǎn)基因株系。圖5為番茄離體葉片接種早疫病菌菌塊IOd的病癥Bb3和Bbl5 =Bbchitl轉(zhuǎn)基因番茄不同株系葉片；CK 野生型番茄葉片。圖6為轉(zhuǎn)基因棉花中幾丁酶基因Bbchitl的PCR分析M =Marker 2000 ；1 野生型植株對(duì)照；2 陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；3_12 =GUS陽(yáng)性植株；13 水對(duì)照；黑色箭頭示Bbchitl基因840bp的目標(biāo)特異帶。圖7為轉(zhuǎn)基因棉花中Bbchitl基因的RT-PCR分析1 非純合轉(zhuǎn)基因株系中分離的⑶S陰性非轉(zhuǎn)基因植株；2-9 =GUS陽(yáng)性植株Bb 以轉(zhuǎn)基因和⑶S陰性植株的CDNA為模板擴(kuò)增Bbchitl基因的結(jié)果；HIS 以轉(zhuǎn)基因和⑶S陰 性植株的cDNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果；RNAas template 以轉(zhuǎn)基因和⑶S陰性植株 的RNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果。Bbchitl基因擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，HIS3基因擴(kuò)增20個(gè)循 環(huán)。圖8為純合T2代株系人工氣候室內(nèi)接種落葉型黃萎病菌15d的病情指數(shù)CK 未純合株系分離的⑶S陰性非轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照；Bb21和Bb23 純合Bbchitl轉(zhuǎn) 基因棉花不同株系
圖9為純合T2代株系人工氣候室內(nèi)接種落葉型黃萎病菌15d植株的表型Bb21和Bb23 =Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花不同株系；GUS-轉(zhuǎn)基因株系分離的⑶S陰性非 轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；WT 野生型植株對(duì)照。圖10為人工氣候室內(nèi)，純合T2代株系接種非落葉型黃萎病菌20d的病情指數(shù)CK 未純合株系分離的⑶S陰性接種對(duì)照植株；Bb21和B23 =Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花 純合T2代不同株系。圖11為純合T2代株系人工氣候室內(nèi)接種非落葉型黃萎病菌20d植株表型Bb =Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花植株；CK:⑶S陰性非轉(zhuǎn)基因植株接種對(duì)照。白色箭頭示 植株葉片或子葉的病癥。圖12為純合T3代株系溫室接種落葉型黃萎病菌30d的病情指數(shù)CK 未純合株系分離的⑶S陰性植株對(duì)照；Bb21和Bb23 純合T3代不同株系。圖13為純合T3代株系溫室接種落葉型黃萎病菌30d植株的表型圖14為純合T3代溫室接種落葉型黃萎病菌植株生長(zhǎng)后期莖桿內(nèi)部組織的病情指 數(shù)CK 未純合株系分離的⑶S陰性植株對(duì)照；Bb21和Bb23 純合T3代不同株系。圖15為純合T3代溫室接種落葉型黃萎病菌后，植株生長(zhǎng)后期莖桿內(nèi)部組織的病
癥圖16為溫室內(nèi)純合T3代株系接種非落葉型黃萎病菌30d的病情指數(shù)CK 來(lái)自未純合株系分離的⑶S陰性非轉(zhuǎn)基因植株接種對(duì)照；Bb21和Bb23 純合 T3代不同株系。圖17為純合T3代株系溫室接種非落葉型黃萎病菌30d植株的表型圖18為純合T3代株系接種非落葉型黃萎病菌后，植株生長(zhǎng)后期莖內(nèi)部組織的病 情指數(shù)CK 未純合株系分離的非轉(zhuǎn)基因植株接種對(duì)照；Bb21和Bb23 純合轉(zhuǎn)基因株系。圖19為溫室內(nèi)，純合株系接種非落葉型黃萎病菌植株生長(zhǎng)后期莖內(nèi)部組織的病
癥
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但以下說(shuō)明并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限 定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求 所定義的范圍。本發(fā)明實(shí)施實(shí)例中的藥品試劑未進(jìn)行具體說(shuō)明的均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)化學(xué)試劑，材料方法未進(jìn)行具體說(shuō)明的均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook和Russell，2001)。實(shí)施例1 :DNA的提取1.1DNA提取緩沖液(1)真菌DNA提取緩沖液Tris-HCl (pH 7. 5)0. 2mol/L, NaCl 0. 5mol/L, EDTA 0. 01mol/L, SDS 1% (w/v)。(2)植物DNA提取緩沖液CTAB 提取液100mmol/L Tris-HCl(pH8. 0),20mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，1. 5mol/ LNaCl,2% CTAB (w/v), 4% PVP40 (w/v)和2%巰基乙醇(ν/ν)，PVP和巰基乙醇使用前加入。(3)堿裂解法質(zhì)粒提取緩沖液STE 0. lmol/L NaCl，IOmmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，lmmol/L EDTA(pH 8. 0)。溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，IOmmol/L EDTA (ρΗ8· 0)。溶液II 0. 2mol/L NaOH, 1 % (w/v) SDS0溶液III :50mL 5mol/L 乙酸鉀，11. 5mL 冰醋酸，28. 5mL 水。1. 2球孢白僵菌基因組DNA的提取方法1. 5ml離心管收集菌液，IOOOOrpm離心5min，棄上清液，加入真菌DNA提取液500μ1，于渦旋器充分混勻，65°C水浴30min后加入等體積的酚(PH8.0)氯仿，然后 IOOOOrpm離心lOmin，取上清液，加入等體積氯仿抽提1_2次，取上清液，加入2倍體積的無(wú) 水乙醇，-20°C沉淀30min。IOOOOrpm離心5min，棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀2次，然后風(fēng) 干。沉淀雙蒸水溶解后加入適量RNaseA (RNA酶A)，37°C靜置3h，IOOOOrpm離心5min，取其 上清液即為基因組DNA溶液。1. 3質(zhì)粒DNA的提取根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取按盧圣棟方法(1993)略作修改。取根癌農(nóng)桿菌菌液lmL，10000r/min離心Imin收集菌體；用200 μ L STE重懸菌 體后，離心(lOOOOr/min，lmin)收集菌體；加入180 μ L溶液I和20 μ L溶菌酶重懸菌體， 37°C溫浴30min，加入400 μ L溶液II，上下顛倒多次，冰浴不超過(guò)3min ；再加入300 μ L冰 預(yù)冷的溶液III，上下顛倒多次，冰浴3min。12000r/min、4°C離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 離心管中；等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)和等體積的氯仿異戊醇(24 1) 先后各抽提一次；再將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后室溫靜置 2min ； 12000r/min、4°C離心IOmin收集沉淀DNA，然后用75%的乙醇洗滌沉淀一次；室溫干 燥，50 μ L TE溶解沉淀即得到質(zhì)粒DNA。1. 4番茄和棉花基因組DNA的提取方法采用改良的CTAB法(Doyle，1987 ；肖月華等，2002a)提取番茄和棉花組織DNA，方 法為番茄和棉花等植物幼嫩組織0.5-lg，在液氮中迅速研成粉末，加入3mL 65°C預(yù) 熱的CTAB提取液，快速振蕩混勻，65°C水浴30min，加入ImL 5mol/L KAc冰浴20min。用 等體積的氯仿異戊醇(24 1)抽提1次，10，000印111，41離心51^11，上清液加入2/3倍 體積-20°C預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20°C靜置30min，用玻棒挑出絮狀沉淀，并用75%的乙醇 反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無(wú)水乙醇漂洗一次，風(fēng)干后重懸于500 μ L TE溶液。加入lOmg/mL的 RNaseA 2yL，37°C處理lh，然后用酚(pH8. 0)氯仿異戊醇(25 24 1)和氯仿異戊醇(24 1)各抽提一次，10，OOOrpm, 4°C離心5min，上清液加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行 沉淀，離心棄上清液。沉淀用75%的乙醇漂洗，風(fēng)干，溶于200μ1 TE，-20°C保存?zhèn)溆?。yL 實(shí)施例2 棉花RNA的提取2. IRNA提取緩沖液CTAB 提取緩沖液2% CTAB (w/v)，2 % 聚乙烯吡咯烷酮 PVP40 (w/v)，IOOmmol/ LTris-HCl (pH8. 0，DEPC 處理的水配制)，25mmol/L EDTA, 0. 5g/L 亞精胺 Spermidine, 2. 0mol/LNaCl，2%巰基乙醇(v/v，使用前加入)。SSTE 溶解液lmol/L NaCl,0. 5 % SDS(w/v),10mmol/L Tris-HCl(ρΗ8· 0)， 1. Ommol/LEDTAo2. 2RNA提取方法用CTAB法提取棉花組織的總RNA。取約3g棉花組織新鮮材料，在液氮中迅速研成 粉末，裝入DEPC水處理的50ml離心管，然后加入15ml 65°C預(yù)熱的RNA提取液，顛倒混勻 后65°C水浴3min，8，000rpm、4°C離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入一新的DEPC水處理的50ml離心 管，用等體積的氯仿異戊醇(24 1)抽提兩次。10，OOOrpmm，室溫離心5min后取上清液， 加入1/4體積IOmol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，OOOrpm，4°C離心lOmin，棄上清液， 沉淀用500 μ L SSTE溶解。再用等體積的酚(ρΗ4. 5)氯仿異戊醇(25 24 1)和氯 仿異戊醇(24 1)各抽提一次，10，OOOrpm，室溫離心5min，上清液加入2倍體積-70°C預(yù) 冷的無(wú)水乙醇，_70°C沉淀30min以上。12，OOOrpm，4°C離心lOmin，棄上清液，沉淀用200 μ L 的DEPC處理水溶解，非變性凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA質(zhì)量后，-80°C保存?zhèn)?用。實(shí)施例3 =Bbchitl植物表達(dá)載體的構(gòu)建3. 1組成型表達(dá)Bbchitl基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建以球孢白僵菌基因組總DNA為模板，以序列6和序列7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回 收擴(kuò)增產(chǎn)物并與PUC-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆得到 Bbchitl基因(序列1)。以含有NPTII篩選標(biāo)記基因和⑶S報(bào)告基因的植物表達(dá)載體ρ5為基本骨架， 將Bbchitl基因連接入載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體，并命名為 p5-35S-Bbchitl。p5-35S-Bbchitl植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1。所有限制性?xún)?nèi)切酶均 購(gòu)自Roche公司，按照使用說(shuō)明書(shū)操作完成。P5植物表達(dá)載體為改選常用的PBI121載體而得，改選的流程圖見(jiàn)圖2。3. 2植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404參考Bio-RAD MicroPulser用戶(hù)說(shuō)明書(shū)，將構(gòu)建的組成型表達(dá)幾丁酶Bbchitl基 因的植物表達(dá)載體P5-35S-Bbchitl通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。實(shí)施例4 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化4. 1番茄遺傳轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基MSB0 (MS無(wú)機(jī)+B5有機(jī)+30g/L蔗糖，pH5. 8)。固體培養(yǎng)基加入6g/L 的瓊脂(Murashige 和 Skoog, 1962 ；Gamborg 等，1968)； 共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSBl :MSB0+2. 0mg/L 6_BA (6-芐氨基嘌呤)+0. 2mg/L IAA (吲哚乙 酸)+IOOuMAS (乙酰丁香酮)+6g/L 瓊脂，ρΗ5· 4 ；
篩選培養(yǎng)基 MSB2 :MSBl+500mg/L cb (羧芐青霉素)+100mg/L Km (卡那霉素)+6g/ L 瓊脂，pH5. 8 ；繼代培養(yǎng)基MSB3 :MSB0+200mg/Lcb+100mg/L Km+6g/L 瓊脂，ρΗ5· 8 ；生根培養(yǎng)基MSB4:MSB0+0. 5mg/L IAA+200mg/L Cef+50mg/L Km+6g/L瓊脂，ρΗ6· O。4. 2番茄的遺傳轉(zhuǎn)化(1)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌浸染液的制備挑取含P5-35S_Bbchitl載體的根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種入附加50mg/L Km(卡那霉素)和125mg/L Sm(鏈霉素)10mL液體YEB(5g/L蔗糖，lg/L細(xì)菌用酵母抽提物，10g/L 細(xì)菌用胰化蛋白胨，0. 5g/L MgSO4 · 7H20, pH7.0)，28°C、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，然后按5%的比 例將菌液接種入20mL不含抗生素的液體YEB，28°C、200rpm培養(yǎng)至0D600約為0. 8。取5mL 菌液6000rpm離心5min，傾去上清液，用IOmL MSBO液體培養(yǎng)基重懸菌體，重懸菌液即為浸 染外植體的農(nóng)桿菌浸染液。(2)番茄遺傳轉(zhuǎn)化參考Cortina等(PlantCell,Tissue and Organ Culture, 2004, 76 (3) :269_275) 的方法，以生長(zhǎng)約IOd無(wú)菌苗的子葉為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。具體操作為番茄種子次氯酸鈉溶液滅菌10-15min，無(wú)菌自來(lái)水沖洗5_6次， 25°C、16h光照/8h黑暗的光周期于固體MSBO萌發(fā)約10d，生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌幼苗子葉作為 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。農(nóng)桿菌浸染液浸染外植體IOmin后傾去菌液，無(wú)菌吸水紙 吸去外植體表面多余菌液，然后接種入鋪有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB1，25°C暗共 培養(yǎng)2d。共培養(yǎng)完成后，將外植體接種入篩選培養(yǎng)基MSB2中進(jìn)行分化培養(yǎng)，25°C、16h光照 /8h黑暗的光周期培養(yǎng)2周，然后將外植體繼代入MSB3培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷生成，每2周繼代一 次。產(chǎn)生Km抗性幼芽后，將幼芽切下接種入MSB4生根培養(yǎng)基，獲得Km抗性再生植株。根 長(zhǎng)3-5cm的再生幼苗，移栽入溫室生長(zhǎng)成苗。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)基因番茄的分子生物學(xué)鑒定5. 1轉(zhuǎn)基因番茄⑶S組織化學(xué)染色參照J(rèn)efferson等(1987)的方法，取再生植株幼嫩的根和葉片少許置⑶S染色 液(500mg/L X-Gluc, 0. lmol/L K3Fe (CN)6,0. lmol/L K4Fe (CN) 6,1% Triton X-100 (ν/ν), 0.01mOl/LNa2EDTA，0. lmol/L 磷酸緩沖液(pH7. 0))中，37°C保溫 2h。染色后，75% 乙醇脫 色，每2h更換一次脫色液，直至未著色部分的顏色完全褪去。根和葉片都沒(méi)有藍(lán)色出現(xiàn)的 再生材料為非轉(zhuǎn)基因植株，染出藍(lán)色的為轉(zhuǎn)基因植株。5. 2轉(zhuǎn)基因番茄Bbchitl基因的PCR驗(yàn)證以轉(zhuǎn)基因番茄基因組DNA為模板，以序列2和序列3為引物，擴(kuò)增Bbchitl基因片 段。PCR 25μ 1 反應(yīng)體系包括1XPCR buffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 2mmol/L 的 dNTPs，上下游引物均為 0. 2ymol/L，25ng Template DNA, IU Taq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)擴(kuò)增 5min，然后 94°C，30s ；55°C，30s ；72°C,60s ；30 個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，所有⑶S陽(yáng)性反應(yīng)的植株都能擴(kuò)增出Bbchitl基因840bp的目 標(biāo)特異帶。說(shuō)明GUS陽(yáng)性植株都是Bbchitl轉(zhuǎn)基因植株。部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖3。
實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)早疫病的抗性為了研究轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)葉片病害早疫病的抗性，以4 6片真葉的T1代GUS陽(yáng)性植株頂部完全展開(kāi)幼葉為材料，參考Emani等(Plant Biotechnology Journal, 2003,1 (5) 321-336)的方法，利用離體葉片對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄T1代進(jìn)行早疫病抗性檢測(cè)。早疫病病菌單孢 菌落接種于PDA平板，260C暗培養(yǎng)7d,用9mm無(wú)菌打孔器切取菌絲生長(zhǎng)邊緣的菌塊，分別接 種于PDA平板中央，26°C暗培養(yǎng)10d，然后于菌絲生長(zhǎng)邊緣切取9mm大小的菌苔，對(duì)稱(chēng)接種于 每葉片頂部3個(gè)小葉的中部葉脈處，接種后26°C保濕培養(yǎng)10d，按0-5級(jí)的6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí) 無(wú)??；1級(jí)病斑面積占葉片面積的0 3% ;2級(jí)病斑面積占葉片面積的3 6% ;3級(jí) 病斑面積占葉片面積的6 12% ;4級(jí)病斑面積占葉片面積的12 25% ;5級(jí)病斑面積 占葉片面積的25%以上)統(tǒng)計(jì)葉片的病級(jí)，并按下列公式計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)=Σ (病級(jí)數(shù)*株數(shù))/(4*總株數(shù))*100每植株剪取頂部1片葉，每株系檢測(cè)10株，以野生型和空載載體轉(zhuǎn)基因植株為 對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。三次重復(fù)病情指數(shù)的平均值見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示，Bb3株系的病情指 數(shù)為21. 2，Bbl5株系的病情指數(shù)為0，都極顯著地低于野生型植株的病情指數(shù)(97. 7) (ρ < 0. 01) ；Bb5的病情指數(shù)雖然達(dá)到了 42. 5，但是與野生型植株的病情指數(shù)(97. 7)相比，亦 顯著低于對(duì)照(0. 01 < P < 0. 05)。接種IOd所有野生型植株葉片都有明顯病癥，并擴(kuò)展至 整個(gè)葉片，甚至葉片因感染而壞死，而抗病植株葉片沒(méi)有失綠和組織壞死現(xiàn)象(圖5)。結(jié)果 說(shuō)明，利用Bbchitl基因可顯著提高番茄對(duì)早疫病的抗性。實(shí)施例7:棉花遺傳轉(zhuǎn)化以無(wú)菌下胚軸為受體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化，將 P5-35S-Bbchitl植物表達(dá)載體整合入棉花基因組。7. 1根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化常用培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基:MSB(MS 無(wú)機(jī)鹽 +B5 有機(jī))(T. Murashige, 1962 ；0. L. Gamborg, 1968)；種子萌發(fā)培養(yǎng)基l/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂，自來(lái)水配制，自然pH ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/LIAA(吲哚乙酸)+0. lmg/LKT(6_糠氨基嘌呤)+30g/L 葡萄糖 +100 μ mol/L 乙酰丁香酮 +2. 0g/L Gelrite (Sigma)，ρΗ5· 4 ；篩選脫菌培養(yǎng)基:MSB+0.5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/ Lcef (頭孢霉素)+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite，pH5. 8 ；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MSB+0.5mg/L IAA+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖+2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0.lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；液體懸浮培養(yǎng)基MSB+1.91g/L 硝酸鉀 +0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖，pH5. 8 ；體胚成熟培養(yǎng)基MSB+15g/L蔗糖 +15g/L 葡萄糖 +0. lmg/L KT+2. 5g/L Gelrite, ρΗ6· 0 ；成苗培養(yǎng)基SH+0.4g/L 活性碳+20g/L 蔗糖，ρΗ6. 0。(Schenk & Hildebrandt， 1972)7. 2棉花遺傳轉(zhuǎn)化具體操作方法(1)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的培養(yǎng)挑取含p5-35S-Bbchitl表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種入5ml附加50mg/L卡那霉素(Km)和125mg/L鏈霉素(Sm)的TCB液體培養(yǎng)基，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至 OD600約為1. 0，取100 μ L菌液接種入IOOmL不附加抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，28°C、180rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，至培養(yǎng)液OD6tltl約為1. 0，菌液室溫SOOOrpm離心5min，無(wú)菌條件下棄上清液， 以原菌液體積并附加ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮(AS)的無(wú)菌MSB液體培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基 不附加Gelrite固化劑)重懸菌體，備用。(2)轉(zhuǎn)化外植體的獲得陸地棉栽培種冀棉14號(hào)種子去殼，籽仁0. 1 %升汞滅菌lOmin，無(wú)菌水漂洗5_6次 后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)5-7d。無(wú)菌下胚軸切成3-5mm長(zhǎng)的切段，作為轉(zhuǎn)化 外植體。(3)下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化和胚性愈傷的誘導(dǎo)農(nóng)桿菌浸染液浸染3-5mm下胚軸切段20min，傾去菌液，再用無(wú)菌濾紙吸去外植體 表面多余的菌液，浸染后的下胚軸切段接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，26°C暗培養(yǎng)2d，將下胚軸接種 至篩選脫菌培養(yǎng)基，20d后繼代入附加卡那霉素(Km)和頭孢霉素(cef)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，間隔20d繼代一次，60d后繼代入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷后 進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，以獲得大量生長(zhǎng)一致的胚性愈傷。(4)體胚的誘導(dǎo)和成苗培養(yǎng)液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷，30目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，篩下的胚性愈傷均勻分散地接 種入體胚成熟培養(yǎng)基，約15d大量的體胚產(chǎn)生后，將體胚繼代入SH培養(yǎng)基，促進(jìn)體胚成苗。 3-4片真葉的再生體胚苗移栽入溫室，然后于溫室內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。實(shí)施例8 =Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定8. 1轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織化學(xué)檢測(cè)參照J(rèn)efferson(1987)的方法，切取少許再生轉(zhuǎn)基因植株幼嫩的根和葉片組織 放入擴(kuò)增管內(nèi)，加入少許⑶S組織化學(xué)染色液(500mg/L X-Gluc, 0. lmol/L K3Fe (CN)6, 0. lmol/LK4Fe (CN)6,1 % Triton Χ-100 (ν/ν), 0. 01mol/LNa2EDTA, 0. lmol/L 磷酸緩沖液 (pH7. 0))，37°C暗處理lh，再用75%乙醇脫色，脫色后的根和葉片組織體視鏡下觀察組織 著色情況。以野生型植株材料為對(duì)照。組織染成藍(lán)色為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，否則為陰性非轉(zhuǎn) 基因植株。8. 2轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)Bbchitl基因的PCR檢測(cè)以棉花幼嫩葉片為材料，提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的總DNA，然后以總DNA為 模板，Bbchitl目標(biāo)基因特異引物(序列2和序列3)擴(kuò)增Bbchitl基因片段。PCR擴(kuò)增采 用25 μ 1反應(yīng)體系進(jìn)行。PCR 反應(yīng) 25 μ 1 總體系包括IXPCR buffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 2mmol/L 的 dNTPs，上下游引物均為 0. 2ymol/L，25ng DNA, IU Taq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)擴(kuò)增 5min，然后 94°C，30s ；55°C，30s ；72°C,60s ；30 個(gè)循環(huán)， 最后再72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有經(jīng)⑶S檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株都能擴(kuò)增獲得840bp的Bbchitl 目標(biāo)特異帶，部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖6。說(shuō)明GUS陽(yáng)性植株內(nèi)Bbchitl基因都已整合入棉花基因組。8. 3轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)Bbchitl基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)
以轉(zhuǎn)基因棉花幼嫩葉片為材料，提取植株RNA，然后用cDNA —鏈合成試劑盒(MBI公司產(chǎn)品)合成各樣品RNA的一鏈cDNA，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用一鏈產(chǎn)物cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μ L PCR擴(kuò)增體系包括cDNA —鏈產(chǎn)物1 μ L，10 X PCR緩沖液(無(wú) Mg2+) 2. 5 μ L，5. Ommo 1/L dNTP 1 μ L、序列 2 和序列 3 引物(5. O μ mol/L)各 1 μ L，Taq DNA 聚合酶1.0U，25mmol/L MgCl22 μ L，加入ddH20(雙蒸水)至25 μ L。用棉花組蛋白HIS3基 因作內(nèi)標(biāo)，以檢測(cè)RNA質(zhì)量的一致性。HIS3的引物為序列4和序列5 (Zhu YQ等，2003)。線 性擴(kuò)增程序:94°C,5min ；94°C，30s，55°C，30s，72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 結(jié) 果顯示，外源基因在⑶S陽(yáng)性植株內(nèi)都能有效轉(zhuǎn)錄表達(dá)，部分RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。實(shí)施例9 轉(zhuǎn)基因棉花抗黃萎病鑒定方法9. 1抗病鑒定接種用致病菌的制備挑取少許固體PDA保存的落葉型和非落葉型黃萎病菌接種入液體PD培養(yǎng)基， 180rpm，25°C振蕩培養(yǎng)7d，再按10% (菌液/PD培養(yǎng)基)的比例接種入新鮮無(wú)菌PD培養(yǎng) 基，180rpm，25°C振蕩培養(yǎng)10d，用兩層無(wú)菌粗布過(guò)濾去除菌液中的菌絲及雜質(zhì)，去離子水調(diào) 整落葉型黃萎病菌孢子濃度達(dá)到IO8個(gè)孢子/ml，非落葉型黃萎病菌孢子濃度達(dá)到IO9個(gè)孢 子/ml作為接種菌液。9. 2人工氣候室內(nèi)抗病鑒定接種方法Ttl代轉(zhuǎn)基因棉花4-6片真葉，其余世代3-4片真葉，生長(zhǎng)相對(duì)一致的幼苗植 株采用傷根灌菌液法接種致病菌。移栽入盆缽時(shí)每株慢慢澆灌菌液IOOmL,盡量讓菌 液濕潤(rùn)有棉花植株的土壤團(tuán)，接種兩天后澆透水，以保持盆缽內(nèi)土壤的濕度。接種后于 200C (夜)_25°C (晝)，濕度80%以上，14h光照/IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下生長(zhǎng)，接種 15d按5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí)棉花植株外表無(wú)病癥；1級(jí)棉株葉片1/3以下顯病癥；2級(jí)棉株葉 片1/3-2/3顯病癥；3級(jí)棉株葉片2/3以上顯病癥；4級(jí)棉株葉片全部出現(xiàn)病癥，葉片和 花蕾脫落嚴(yán)重或植株光桿甚至死亡)統(tǒng)計(jì)植株病級(jí)，并計(jì)算植株的病情指數(shù)。Ttl代每次接種 均以野生型和空載轉(zhuǎn)基因棉花幼苗為對(duì)照。其余各世代以野生型和未純合株系分離的⑶S 陰性非轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照。落葉型黃萎病菌接種濃度為IO8個(gè)孢子/ml，非落葉型黃萎病菌 接種濃度為IO9個(gè)孢子/ml。病情指數(shù)=[Σ (病級(jí)數(shù)*株數(shù))/(4*總株數(shù))]*1009. 3溫室內(nèi)抗病鑒定接種方法純合T3代株系3-4片真葉幼苗移栽入溫室時(shí)，采用傷根灌菌液法分別接種落葉型 和非落葉型黃萎病菌。按2500株/畝的密度栽種，移栽時(shí)每株澆灌黃萎病菌液200ml，盡 量讓菌液濕透營(yíng)養(yǎng)團(tuán)，然后于幼苗周?chē)鰸駶?rùn)土壤，移栽?xún)商旌鬂餐杆员ＷC溫室內(nèi)幼苗 正常生長(zhǎng)。接種30d后統(tǒng)計(jì)植株的病情指數(shù)。并于植株生長(zhǎng)后期將莖桿均分為上部、中部 和下部三部分，然后剖桿按五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí)木質(zhì)部無(wú)變色；1級(jí)莖桿變暗褐色部分占剖面 的25%以下；2級(jí)變色部分占25% -50% ；3級(jí)變色部分占50% -70% ；4級(jí)變色部分 占70%以上，或莖桿木質(zhì)部全部變暗褐色)統(tǒng)計(jì)莖桿不同部位內(nèi)部組織的病級(jí)，并計(jì)算病 情指數(shù)。以接種分離于未純合轉(zhuǎn)基因株系的GUS陰性植株和野生型植株為對(duì)照，并設(shè)置未 接種野生型植株對(duì)照。溫室內(nèi)接種試驗(yàn)按隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)材料重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)30 株幼苗。落葉型黃萎病菌接種濃度為IO8個(gè)孢子/ml，非落葉型黃萎病菌接種濃度為IO9個(gè) 孢子/ml。
實(shí)施例10 人工氣候室內(nèi)Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花純合T2代株系對(duì)黃萎病的抗性轉(zhuǎn)基因棉花Ttl和T1代分別于人工氣候室內(nèi)接種落葉型黃萎病菌進(jìn)行抗病鑒定和篩選，抗病植株于溫室內(nèi)進(jìn)行繁殖，收獲自交種子。并利用GUS組織化學(xué)染色法篩選獲得純 合T2R株系。10. 1轉(zhuǎn)基因純合T2株系對(duì)落葉型黃萎病的抗性人工氣候室內(nèi)，純合T2代株系植株高劑量接種落葉型黃萎病菌孢子懸浮液15d， Bb21和Bb23株系的病情指數(shù)分別為68. 6和56. 7，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?00. 0相比，差異明 顯(圖8)。接種15d，對(duì)照植株嚴(yán)重發(fā)病，多數(shù)葉片因發(fā)病而脫落，而抗病植株生長(zhǎng)正常，沒(méi) 有葉片脫落現(xiàn)象(圖9)。10. 2轉(zhuǎn)基因純合T2株系對(duì)非落葉型黃萎病的抗性人工氣候室內(nèi)，純合T2代株系植株高劑量接種非落葉型黃萎病菌孢子懸浮液20d， Bb21和Bb23株系的病情指數(shù)分別為41. 7和50. 0 (圖10)，都極顯著地低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?(100. 0) (P < 0. 01)。接種20d，對(duì)照植株嚴(yán)重發(fā)病，所有葉片都出現(xiàn)明顯的病癥，而抗病或 耐病的植株生長(zhǎng)正常(圖11)。人工氣候內(nèi)接種落葉型和非落葉型黃萎病菌后，Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花株系的病情 指數(shù)和病癥說(shuō)明，Bbchitl基因在棉花內(nèi)組成型表達(dá)可明顯提高棉花對(duì)黃萎病的抗性。實(shí)施例11 溫室內(nèi)轉(zhuǎn)基因棉花純合T3代株系對(duì)黃萎病的抗性11. 1轉(zhuǎn)基因棉花純合T3代株系對(duì)落葉型黃萎病的抗性溫室接種落葉型黃萎病菌30d，Bb21和Bb23兩個(gè)株系的病情指數(shù)都低于對(duì)照。 Bb21的病情指數(shù)為41. 5，極顯著地低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?6. 9 (ρ < 0. 01)。Bb23的病情指 數(shù)為79. 6，也明顯低于對(duì)照(圖12)。非轉(zhuǎn)基因接種對(duì)照植株葉片都有病癥，并出現(xiàn)葉片脫 落現(xiàn)象。而抗病植株與未接種對(duì)照沒(méi)有明顯差異，生長(zhǎng)正常，葉色鮮綠(圖13)。植株生長(zhǎng)后期，Bb21株系植株莖桿下部、中部和上部?jī)?nèi)部組織的病情指數(shù)分別為 50.0、25.0和0.0，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?100.0)相比，差異極顯著(P < 0. 01)。Bb23株系植株 下部的病情指數(shù)雖然達(dá)到87. 5，和對(duì)照的100相比，差異不顯著，但其上部和中部的病情指 數(shù)(37. 5和50. 0)卻極顯著地低于對(duì)照(100. 0)(圖14)。接種的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晟L(zhǎng)前 期葉片全部脫落并且死亡，這部分植株剖桿后內(nèi)部組織各部位都因黃萎病菌的侵染出現(xiàn)了 嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象。而轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)后期只是中心維管組織有病癥，周?chē)举|(zhì)部部分沒(méi) 有變褐現(xiàn)象(圖15)。溫室內(nèi)Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花株系植株的病情指數(shù)、植株葉片病癥以及莖內(nèi)部的病 癥說(shuō)明，Bbchitl基因在棉花內(nèi)組成型表達(dá)可明顯提高棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗性。11. 2轉(zhuǎn)基因棉花純合T3代株系對(duì)非落葉型黃萎病的抗性溫室接種非落葉型黃萎病菌孢子30d，Bb21和Bb23的病情指數(shù)分別為19. 1和 24. 6，與非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)照的病情指數(shù)94. 3相比，差異都達(dá)到極顯著水平(P < 0. 01)(圖
16)。接種30d，對(duì)照植株葉片都有明顯的病癥，抗病植株與未接種對(duì)照沒(méi)有明顯差異(圖
17)。植株生長(zhǎng)后期，對(duì)照植株莖下部、中部和上部?jī)?nèi)部組織的病情指數(shù)分別為100.0,92. 1 和89. 4 ；Bb21株系植株的則分別為26. 4、10. 3和3. 9，都極顯著低于非轉(zhuǎn)基因接種對(duì)照(P < 0. 01)(圖18)。對(duì)照植株莖內(nèi)部的木質(zhì)部都因黃萎病菌的侵染出現(xiàn)了嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象， 而轉(zhuǎn)基因抗病植株只是中心維管組織有少許褐色斑點(diǎn)產(chǎn)生(圖19)。
溫室內(nèi)接種非落葉型黃萎病菌后，Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花株系植株的病情指數(shù)、植株 葉片病癥以及莖內(nèi)部的病癥表明棉花內(nèi)組成型表達(dá)Bbchitl基因可有效提高棉花對(duì)非落 葉型黃萎病的抗性。上述實(shí)施實(shí)例表明，本發(fā)明利用球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl提高植物抗病性 的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)Bbchitl基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)組成型表達(dá)，有效提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)真菌 病害的抗性。經(jīng)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因棉花可同時(shí)提高對(duì)落葉型和非落葉型黃萎病的抗性。 本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，具有很好的市場(chǎng)前景。序列表序列IBbchitl基因核苷酸序列，長(zhǎng)1047bp1 ATGGCTCCTT TTCTTCMAC CAGCCTCGCG CTCCTTCCAT TGTTGGCTTC CACCATGGTC61 AGCGCCTCGC CCTTGGCGCC GCGAGCCGGC ACCTGCGCCA CCAAAGGCCG GCCGGCCGGC121 AMGTGCTCC AGGGCTACTG GGAGAACTGG GACGGTGCCA AGAACGGGGT GCACCCTCCG181 TTTGGCTGGA CGCCCATCCA MACCCCGAC ATTCGCAAGC ACGGCTACAA CGTCATCAAT241 GCTGCCTTTC CCATCATCCA GCCTGACGGC ACCGCGCTCT GGGAGGACGG CATGGACACG301 GGCGTCMGG TGGCGAGCCC GGCCGACATG TGCGAGGCCA AGGCAGCAGG TGCCACCATC361 TTGATGTCGA TTGGCGGTGC TACTGCGGCC ATTGACCTGA GCTCGTCGGC TGTGGCTGAC421 AAGTTTGTCT CGACCATTGT GCCGATTCTG AAAAAGTACA ACTTTGACGG CATTGATATC481 GACATTGAAT CCGGCCTCAC AGGCAGCGGA AACATAAACA CCCTGTCCAC CTCGCAGACC541 AACCTGATTA GAATCATTGA CGGCGTTCTC GCGCAGATGC CCGCCAACTT TGGCTTGACC601 ATGGCGCCAG AGACTGCCTA CGTTACCGGT GGGACTATTA CGTACGGATC AATCTGGGGC661 TCTTACCTCC CCATTATCAA MAGTACCTG GACAATGGTC GTCTCTGGTG GCTCAACATG721 CAGTACTACA ATGGCGMAT GTACGGCTGC TCCGGCGACT CGCACAAGGC CGGTACTGTC781 GMGGATTCA TTGCTCAGAC CGACTGCCTG AACAAGGGAC TTAGTATTCA GGGCGTGACA841 ATCACGATTC CCTATGACAA GCAAGTGCCT GGCCTTCCTG CCCAGCCTGG GGCTGGCGGC901 GGCCACATGT CCCCGTCCAA CGTGGCGCAA GTTCTCTCCC ACTACAAGGG CGCTTTGAAG961 GGATTGATGA CTTGGTCTCT GAACTGGGAC GGCTCCAAGA ATTGGACATT TGGCGACAAT1021 GTCAAGGGGA CTTTGGGGAC TGCGTAA序列2 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物15' -TGC ACA ATG CTG ATC GCG-3'序列3 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物25， -TGG CAA GCG TTT TCA GGC-3，序列4 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)GhHIS3基因擴(kuò)增引物15' -GAA GCC TCA TCG ATA CCG TC-3'序列5 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)GhHIS3基因擴(kuò)增引物25' -CTA CCA CTA CCA TCA TGG C-3序列6 基因組內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物15' -CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTT CAA ACC A-3'序列7 基因組內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物25' -CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CTT-3'.
權(quán)利要求
一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的方法，其特征在于，包括如下步驟1)獲得球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchit1設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)后，以球孢白僵菌基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pUC-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆獲得Bbchit1基因；2)構(gòu)建組成型表達(dá)幾丁酶基因植物表達(dá)載體將Bbchit1基因插入植物表達(dá)載體P5，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為p5-35S-Bbchit1，組成型表達(dá)啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子；3)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將所述CaMV35S啟動(dòng)子控制下的球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchit1整合入植物基因組，實(shí)現(xiàn)Bbchit1基因在植物內(nèi)的組成型表達(dá)，提高植物對(duì)真菌病害的抗病能力；4)將步驟3)獲得的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)栽培、分子鑒定、人工氣候室和溫室內(nèi)的抗病鑒定，獲得抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的方法，其特征 在于，所述步驟2)組成型表達(dá)的p5-35S-Bbchitl植物表達(dá)載體構(gòu)建方法為從球孢白 僵菌中提取基因組總DNA后，設(shè)計(jì)上游引物5’-CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTTCAA ACC A-3，，下游引物5，-CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CTT-3，進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接入PUC-T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆得到 Bbchitl基因；然后將該基因插入植物表達(dá)載體Ρ5，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為 p5-35S-Bbchitl，以實(shí)現(xiàn)該基因在植物內(nèi)的組成型表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的方法，其特 征在于，所述植物是指番茄或棉花。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的方法。該方法首先構(gòu)建幾丁酶基因組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體，然后利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因?qū)敕鸦蛎藁?，?shí)現(xiàn)其在番茄或棉花內(nèi)的組成型表達(dá)，從而提高番茄和棉花的抗病性。應(yīng)用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因番茄可明顯提高對(duì)早疫病的抗性；轉(zhuǎn)基因棉花溫室內(nèi)接種非落葉型黃萎病菌后，病情指數(shù)可小于20，較野生型對(duì)照低80％左右。
文檔編號(hào)C12N15/84GK101812476SQ200910190940
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者侯磊, 宋水清, 李先碧, 李德謀, 羅小英, 羅明, 肖月華, 范艷華, 裴炎 申請(qǐng)人:西南大學(xué)