專利名稱：：生物催化法生產(chǎn)r-扁桃酸及其衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物催化法生產(chǎn)R-扁桃酸及其衍生物的方法。(二)
背景技術(shù)：
：R-扁桃酸是一種重要的藥物中間體，廣泛地應(yīng)用于多種藥物的合成，如頭孢菌素、青霉素、抗腫瘤制劑、抗肥胖藥物、光學(xué)純的氨基酸、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑、輔酶A等，還可以用來制成手性溶劑。研究表明，單一構(gòu)型的扁桃酸(或扁桃酸的衍生物)所合成的藥物與外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的藥物相比，不僅藥效更高，更關(guān)鍵的是副作用下降了，因此在許多藥物合成方面應(yīng)用必須要求是單一型化合物；R-扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受矚目的酸性光學(xué)拆分劑，可使多數(shù)外消旋體胺類和氨基酸類經(jīng)非對映體異構(gòu)鹽形成法進(jìn)行光學(xué)拆分，如治咳藥甲嗎南的中間體八氫異喳琳衍生物可由R型扁桃酸拆分。R-扁桃酸新的用途正在不斷被開發(fā)，市場需求日益擴(kuò)大。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國外扁桃酸主要生產(chǎn)公司有德國瓦克公司、日本山川藥品公司和日東化學(xué)公司等。目前國際市場上光學(xué)活性的扁桃酸需求約以年均10%以上的速度增長，已成為熱點(diǎn)的精細(xì)化工中間體。制備R-扁桃酸的旋光性單體大致有以下三種方法不對稱合成法、光學(xué)異構(gòu)體拆分法、生物合成法，其中生物合成法為最理想的方法。1、不對稱合成法是直接利用化學(xué)合成的方法來合成扁桃酸的異構(gòu)體的一種方法。Blacker等人采用不對稱合成法，以TMSCN為氰化劑，Jacobsen催化劑合成了扁桃酸及其衍生物。所得產(chǎn)物的e.e^為65^85X。但是該法所采用的催化劑價(jià)格昂貴，且回收不便，反應(yīng)條件的要求也比較嚴(yán)格，造成成本過高，難以工業(yè)化生產(chǎn)。吳珊珊等人用自制的手性相轉(zhuǎn)移催化劑來催化苯甲醛和氯仿合成手性扁桃酸，但是所得的扁桃酸e.e^都不高，最大的僅為3.4%。2、光學(xué)異構(gòu)體的拆分是先合成扁桃酸的外消旋體，再采用一定的方法對其進(jìn)行拆分。R-扁桃酸作為一種高附加值的物質(zhì)，其應(yīng)用非常廣泛、且市場需求量大，其制備越來越受到重視。國內(nèi)外已有很多學(xué)者嘗試用各種途徑來制備該物質(zhì)。其中通過對外消旋扁桃酸的拆分可以得到R-扁桃酸。拆分的方法主要有以下幾種。①非對映體鹽結(jié)晶拆分法，面臨的共同的問題就是價(jià)格昂貴，且有一定的毒性，因此在一定程度上造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。②色譜拆分法，色譜法具有較好的容量、選擇性和穩(wěn)定性，拆分純度最高，在手性拆分中發(fā)揮越來越重要的作用，但是該法設(shè)備費(fèi)用太高，消耗大，成本太高，處理量小，因此僅限于檢測以及實(shí)驗(yàn)室制備，無法用于商業(yè)生產(chǎn)。③手性萃取拆分法，手性萃取分離法是近幾年才提出的手性分離方法，其基本原理是依靠手性選擇體與兩種對映體生成兩種非對映體的自由能差將外消旋體分開，在足夠多的級(jí)數(shù)下，可實(shí)現(xiàn)對映體的高純度分離。離商業(yè)化生產(chǎn)還有很大的距離。④毛細(xì)管電泳拆分法，毛細(xì)管電泳(CE)是一種電遷移技術(shù)，因具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種藥物對映體的分離其原理是加入手性選擇劑使與對映體分別結(jié)合，根據(jù)對映體和選擇劑結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)的區(qū)別進(jìn)行分離。該方法就有成本高等缺點(diǎn)。⑤酶法拆分，從外消旋扁桃酸出發(fā)，先利用具有立體選擇性的脂肪酶將其中的R型對映體酯化，再利用外消旋酶酯化外銷旋的的S型異構(gòu)體，從而達(dá)到了拆分的目的。但是不管用那種拆分的方法，理論收率也只有50%。3、生物法制備R-扁桃酸大致有三種方法(1)先合成扁桃酸外消旋體，而后酯化或氨解，獲得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到單一對映體扁桃酸。Gan即ati等人首先將外消旋體扁桃酸用交換樹脂催化轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜峒柞ィ笥眉俳z酵母中的水解酶立體水解成R-扁桃酸，光學(xué)純度只有78%。(2)以苯乙酮酸為底物直接利用具有氧化還原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，多數(shù)是形成R-扁桃酸。TakaoM等人利用鏈球菌、假絲酵母、腸球菌、紅酵母、酵母等中的還原酶將苯乙酮酸立體還原為R-扁桃酸，但是收率較低。(3)以苯甲醛和氫氰酸為原料，先制得扁桃腈，后在腈水解酶的作用下，得到R-扁桃酸。目前已報(bào)導(dǎo)的含有能催化扁桃腈生產(chǎn)R-扁桃酸腈水解酶的微生物主要有AlcaligenesfaecalisATCC8750，AlcaligenesECU0401，PseudomonasputidaMTCC5110等。但是面臨著活性低，工業(yè)化困難等問題。
發(fā)明內(nèi)容為克服上述技術(shù)的缺陷，本發(fā)明利用篩選得到的高活性腈水解酶菌株，提供一種收率高的生物催化外消旋扁桃腈化合物生成R-扁桃酸及其衍生物的方法，應(yīng)用于R-扁桃酸和R-鄰氯扁桃酸的工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是生物催化法生產(chǎn)手性R-扁桃酸及其衍生物的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物為底物、以糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168培養(yǎng)獲得的腈水解酶為催化劑(催化劑可以為純化后的酶液，也可直接以含酶細(xì)胞形式參與反應(yīng))的反應(yīng)體系中，于pH8.08.5、206(TC下進(jìn)行水解反應(yīng)，得到式(II)所示的手性R_扁桃酸化合物OHOH(II)式(1)、(II)中，R為H或鹵素。涉及反應(yīng)式如下4R-扁桃酸化合物I+HCN所述糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168為糞產(chǎn)堿桿菌的突變株糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTBIO，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo:M208168，保藏日期2008年10月22日，該菌株已作為新菌株在在先申請"微生物催化法生產(chǎn)亞氨基二乙酸及其菌株"(申請?zhí)朇N200810122191.3)中予以保護(hù)。發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株除了可以用于亞氨基二乙酸的生產(chǎn)以外，還可用于R-扁桃酸化合物的生產(chǎn)，不同于已經(jīng)報(bào)道的用于生產(chǎn)R-扁桃酸的其它菌種。該菌株一個(gè)顯著的特點(diǎn)是催化扁桃腈生產(chǎn)R-扁桃酸的活性比現(xiàn)有的菌種都高，更適合于R-扁桃酸和R-鄰氯扁桃酸的工業(yè)化生產(chǎn)。所述反應(yīng)體系中底物外消旋扁桃腈化合物的初始濃度為10100mmol/L。所述反應(yīng)在pH8.08.5的水溶液或磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。所述腈水解酶來自糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168培養(yǎng)獲得的含酶細(xì)胞，每10ml反應(yīng)體系添加所述含酶細(xì)胞濕重為1090mg。所述含酶細(xì)胞由如下方法制備得到糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M20816S接種至常規(guī)適用于糞產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)開始后06小時(shí)加入15g/L的誘導(dǎo)劑，于204(TC下培養(yǎng)2496小時(shí)，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)分離(離心或膜分離)，得到所述含酶細(xì)胞；所述誘導(dǎo)劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內(nèi)酰胺。本發(fā)明采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對Alcaligenes-faecalis產(chǎn)腈水解酶的培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，初始pH7.5，溶劑為水(誘導(dǎo)劑正丁腈直接加入至發(fā)酵培養(yǎng)基中)。用以上培養(yǎng)基，在151發(fā)酵罐中的生長與產(chǎn)酶情況，發(fā)酵條件溫度3(TC，接種量6%(v/v)，在上述條件下培養(yǎng)20h后，生物量為2.64g/L，以R-扁桃腈為底物，腈水解酶的活力達(dá)到997U/L。具體的，所述方法如下(1)糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于2040。C下培養(yǎng)2496小時(shí)，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)分離，得到所述含酶細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，pH7.5，溶劑為水；5(2)將底物外消旋扁桃腈或鄰氯扁桃腈和步驟(1)含酶細(xì)胞加入至pH8.08.5的磷酸鹽緩沖液中，底物初始濃度為1050mmol/L，含酶細(xì)胞加入量為15g/L，于206(TC下進(jìn)行水解反應(yīng)，制得R-扁桃酸或R-鄰氯扁桃酸。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在菌種腈水解酶活性高，菌體用量少，反應(yīng)過程中廢水產(chǎn)量少，污染少；反應(yīng)條件溫和、能耗低；成本低，轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。(四)圖1為實(shí)施例1中菌株WT10的誘變譜；圖2為15L發(fā)酵罐中A.faecalisZJUTB10的生長和產(chǎn)酶曲線；圖3為不同底物濃度的產(chǎn)物生成曲線。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:菌株的篩選及鑒定1、菌種的篩選從浙江省各地的工廠的排污口，垃圾廢棄物堆放處以及實(shí)驗(yàn)室附近采集到約80份土樣用于菌種篩選。富集培養(yǎng)基終濃度組成(NH4)2S04lg/L，KH2P040.2g/L，Na2HP040.8g/L，MgS047H200.2g/L，CaCl20.lg/L，F(xiàn)eCl30.005g/L，pH7.O，溶劑為水。斜面培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP045g/L，MgS047H200.2g/L，F(xiàn)eS040.03g/L，NaCllg/L，瓊脂20g/L，pH7.0，溶劑為水。產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP045g/L，MgS047H200.2g/L，F(xiàn)eS040.03g/L，NaCllg/L，己內(nèi)酰胺lg/L，pH7.O，溶劑為水。在富集培養(yǎng)基中加入2mM苯乙腈作為碳氮源，土樣中的微生物經(jīng)過兩次富集培養(yǎng)，每次富集培養(yǎng)時(shí)間為3d左右，培養(yǎng)溫度為3(TC，將培養(yǎng)液稀釋涂布，涂布完畢后置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間以長出合適的單菌落為宜，大致為2d左右。待長出合適大小的單菌落后，將單菌落轉(zhuǎn)接于試管斜面并編號(hào)，繼續(xù)置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)23d。再從已長好的斜面中挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。觀察微生物的生長情況，培養(yǎng)23d后，將發(fā)酵液高速冷凍離心(10000rpm，4°C，10min)得到菌體，并用生理鹽水洗滌一次，離心后棄上清用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化條件如下磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7.2)中，加入菌體，使得菌懸液濃度為6g/l，扁桃腈10mM。通過HPLC分析產(chǎn)物R-扁桃酸的濃度及其光學(xué)活性。經(jīng)過兩次富集培養(yǎng)得到225株菌株，它們可以利用該腈化合物作為碳氮源。將這225株菌株在以己內(nèi)酰胺作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，用于轉(zhuǎn)化底物扁桃腈。其中編號(hào)為WT10的菌株活性最高，達(dá)到了53.09U/g，ee>99%。2、菌種的鑒定菌種WT10養(yǎng)約ld后，在平板上形成紅色略透明、略突起、邊緣薄、不整齊的菌落。通過革蘭氏染色確定其為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞為短桿狀，成對或成鏈狀生長。掃描電鏡下放大可以清楚地觀察到其大小約為1.21.5X0.60.8iim，周生鞭毛。生化反應(yīng)特點(diǎn)為不分解任何糖類，在氧化發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生堿性反應(yīng)，在蛋白胨肉湯中產(chǎn)氨，可使pH值達(dá)8.6以上。應(yīng)用革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定試驗(yàn)卡(GNI)鑒定，菌種WT10生化特征如下characteristicsResultsGramstainingDP3-300Glucoese(oxidative)GrowthControl+Acetamide+EsculinPl肌tlndic肌UreaCitrate+Malonate+Phenylal肌inePolymyxinBLactoseMaltoseMannito1XyloseRaffinose7characteristicsResultsSorbitolSucoseInositolAdonitolp-CounmricH2So_NitrophenolRhamnoseArabinoseGlucose(Fermentative)ArginineLysineOrnithineOxidase10%lactose+，陽性；-，陰性。根據(jù)該菌種的生理生化特征，由此可以確定菌株WT10為糞產(chǎn)堿桿菌。3、菌種的誘變選育紫外線與氯化鋰復(fù)合誘變在液體培養(yǎng)基中加入0.5%的氯化鋰，培養(yǎng)后經(jīng)離心獲得菌體，用生理鹽水制成菌懸液，加入玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙過濾，使形成單細(xì)胞，進(jìn)行紫外誘變，菌懸液的濃度約為1.0X108個(gè)/ml。取制備好的菌懸液約3ml于平皿中，將盛有菌懸液的平皿置于磁力攪拌器上，離紫外燈管約25cm，紫外燈功率為15W，打開皿蓋，邊攪拌邊照射，照射時(shí)間為20s，且照射過程在暗室中進(jìn)行，以免光修復(fù)，挑選正突變株進(jìn)行等離子注入誘變。等離子注入誘變同上制備濃度為1.0X101Q個(gè)/ml的菌懸液，吸取0.lml涂布于8培養(yǎng)皿，于超凈工作臺(tái)中自然干燥，用10kev的氮離子(N+)照射處理，離子注入量為30s(離子束單位為X2.6X1013ions/cm2s)。誘變后用無菌水洗滌平皿，將誘變后菌株涂布與平板上培養(yǎng)，繼續(xù)挑選正突變株進(jìn)行紫外線與光復(fù)活交替處理。紫外線與光復(fù)活交替處理紫外照射同上所述，經(jīng)紫外照射20s后自然光照30s，如此交替重復(fù)兩次。篩選高活性，高選擇性，并且遺傳穩(wěn)定的菌株作為進(jìn)一步研究的對象。誘變譜見圖1:對突變株CCTCCNo:M208168的傳代穩(wěn)定性進(jìn)行了研究；其結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由此可以看出，以篩選到的A.faecalisWT10為出發(fā)菌株，結(jié)合紫外氯化鋰復(fù)合誘變，等離子誘變以及紫外和光復(fù)活交替處理誘變方法，得到突變株CCTCCNo:M20S168，活力由53U/g提高到260U/g，且具有很好的傳代穩(wěn)定性。實(shí)施例2:1、含腈水解酶細(xì)胞的培養(yǎng)種子培養(yǎng)基終濃度組成醋酸銨10g/L，酵母膏6g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂O.2g/L，溶劑為水。將CCTCCNo:M208168菌株接種至種子培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)28h，得種子液。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，溶劑為水。種子液以6%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，15L發(fā)酵罐中裝液量為8L。培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣量為0.4vvm，并且取樣檢測生物量和酶活力。結(jié)果見圖2?？梢?，前9個(gè)小時(shí)內(nèi)，菌體生長速度比較緩慢，之后進(jìn)入指數(shù)生長期，菌體生長快速，至30h時(shí)，生物量達(dá)到最大，之后生物量基本保持不變。通過對酶活力的分析發(fā)現(xiàn)，酶活力隨著菌體的生長逐漸增大，在20h時(shí)達(dá)到最大，生物量為2.64g/L，以R-扁桃腈為底物，腈水解酶的活力達(dá)到997U/L，之后酶活力呈下降趨勢。2、腈水解酶在不同的pH條件下轉(zhuǎn)化外消旋扁桃腈生產(chǎn)R-扁桃酸分別將10ml水溶液配成不同的pH值(4.9、5.3、6.2、6.9、7.7、8.3、8.6、9.1)，各自加入菌體和底物外消旋扁桃腈，使反應(yīng)體系中菌體濃度(以濕重計(jì))為5mg/ml，外消旋扁桃腈濃度為20mM，置于30°C，150r/min水浴搖床中反應(yīng)2h，從而考察pH值對酶催化反應(yīng)的影響。得到的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可見，在pH值較低的條件下，該菌的酶活力很低，隨pH值的增大有所提高。pH值增至6.2時(shí)，酶催化能力較大提高，增大至8.3時(shí)，上升至最高。再增大pH值，酶催化能力則略有所下降。3、腈水解酶在不同溫度下轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化外消旋扁桃腈生產(chǎn)R-扁桃酸10ml磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋扁桃腈濃度分別為20mM，細(xì)胞濃度(以濕重計(jì))為5mg/ml，分別置于20，30，40，50，60。C，150r/min水浴搖床中反應(yīng)2h，分析反應(yīng)液中的R-扁桃酸含量，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可見，較合適的轉(zhuǎn)化溫度為30-40°C。4J青水解酶在不同的底物濃度下轉(zhuǎn)化外消旋扁桃腈生產(chǎn)R-扁桃酸10ml磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0)中，加入不同量的外消旋扁桃腈，使底物濃度分別為10、20、30、40、50mM，含酶細(xì)胞濃度(以濕重計(jì))為5mg/ml，置于30°C，150r/min水浴搖床中反應(yīng)，每隔一段時(shí)間取樣分析反應(yīng)液中的R-扁桃酸含量，結(jié)果見圖3。當(dāng)?shù)孜餄舛确謩e為10、20、30、40和50mM時(shí)，完全轉(zhuǎn)化底物所需要的時(shí)間分別為60、150、300、420和540min。5、不同的腈水解酶濃度轉(zhuǎn)化外消旋扁桃腈生產(chǎn)R-扁桃酸10ml磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋扁桃腈濃度分別為20mM，加入不同濃度的細(xì)胞菌體，使其濃度(以濕重計(jì))分別為1，3，5，7，9mg/ml，置于3(TC，150r/min水浴搖床中反應(yīng)2h，分析反應(yīng)液中的R-扁桃酸含量，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>隨著腈水解酶濃度的增大，轉(zhuǎn)化體系中R-扁桃酸的濃度逐漸升高，當(dāng)腈水解酶濃度增加到大于5mg/ml時(shí)，轉(zhuǎn)化體系中R-扁桃酸的濃度幾乎不變。5mg/ml的腈水解酶濃度已經(jīng)能夠滿足催化的需要。6、不同的腈水解酶濃度轉(zhuǎn)化外消旋鄰氯扁桃腈生產(chǎn)R-鄰氯扁桃酸10ml磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋鄰氯扁桃腈濃度分別為20mM，加入不同濃度的細(xì)胞菌體，使其濃度(以濕重計(jì))分別為1，3，5，7，9mg/ml，置于3(TC，150r/min水浴搖床中反應(yīng)2h，分析反應(yīng)液中的R_鄰氯扁桃酸含量，結(jié)果如下579R-鄰氯扁桃酸濃度(mM)6.810.114.315.415.3可見，CCTCCNo:M208168不僅可以用于R_扁桃酸的生產(chǎn)，對于底物外鄰氯扁桃腈也具有較高的催化活性，還可以用于R-鄰氯扁桃酸的生產(chǎn)。權(quán)利要求生物催化法生產(chǎn)手性R-扁桃酸及其衍生物的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物為底物、以糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNoM208168培養(yǎng)獲得的腈水解酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于pH8.0～8.5、20～60℃下進(jìn)行水解反應(yīng)，得到相應(yīng)式(II)所示的手性R-扁桃酸化合物式(I)、(II)中，R為H或鹵素。F2009101544844C0000011.tif2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中底物外消旋扁桃腈化合物的初始濃度為10100mmol/L。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)在pH8.08.5的水溶液或磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水解酶來自糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168培養(yǎng)獲得的含酶細(xì)胞，每10ml反應(yīng)體系添加所述含酶細(xì)胞濕重為1090mg。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含酶細(xì)胞由如下方法制備得到糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168接種至適用于糞產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)開始后06小時(shí)加入15g/L的誘導(dǎo)劑，于204(TC下培養(yǎng)2496小時(shí)，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)分離，得到所述含酶細(xì)胞；所述誘導(dǎo)劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內(nèi)酰胺。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNo:M208168接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于2040。C下培養(yǎng)2496小時(shí)，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)分離，得到所述含酶細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下醋酸銨12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.2g/L，pH7.5，溶劑為水;(2)將底物外消旋扁桃腈或鄰氯扁桃腈和步驟(1)含酶細(xì)胞加入至pH8.08.5的磷酸鹽緩沖液中，底物初始濃度為1050mmol/L，含酶細(xì)胞加入量為15g/L，于2060°C下進(jìn)行水解反應(yīng)，制得R-扁桃酸或R-鄰氯扁桃酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種生物催化法生產(chǎn)R-扁桃酸及其衍生物R-鄰氯扁桃酸的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物為底物、以糞產(chǎn)堿桿菌CCTCCNoM208168培養(yǎng)獲得的腈水解酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于pH8.0～8.5、20～60℃下進(jìn)行水解反應(yīng)，得到相應(yīng)式(II)所示的手性R-扁桃酸及其衍生物本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在菌種腈水解酶活性高，菌體用量少，反應(yīng)過程中廢水產(chǎn)量少，污染少；反應(yīng)條件溫和、能耗低；成本低，轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)率高，易于手性R-扁桃酸及R-鄰氯扁桃酸的工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12R1/05GK101701243SQ20091015448公開日2010年5月5日申請日期2009年11月2日優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日發(fā)明者徐賽珍,柳志強(qiáng),沈寅初,薛亞平,鄭裕國申請人:浙江工業(yè)大學(xué)