一種6-apa的制備方法及青霉素酰化酶激活劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種6-氨基青霉烷酸的制備方法和青霉素酰 化酶激活劑及其在制備6-氨基青霉烷酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 6-氨基青霉燒酸(6-aminopenicillanic acid，6-APA)為白色片狀結(jié)晶，是合成各 種半合成青霉素的重要中間體，用途很廣。以此為原料進行化學結(jié)構(gòu)修飾，接上不同結(jié)構(gòu)的 側(cè)鏈，可以制造出對青霉素耐藥菌敏感、抗菌譜更廣的新的半合成青霉素，如氨芐青霉素、 羥氨芐青霉素、苯氧甲基青霉素，以及其它的具有更寬抗菌譜的各種半合成青霉素。目前國 內(nèi)6-APA的年產(chǎn)量超過30000噸。
[0003]目前工業(yè)上去除青霉素側(cè)鏈裂解成6-APA，主要有微生物酶催化裂解法和化學裂 解法。隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，采用固定化酶或固定化細胞生產(chǎn)6-APA，不僅工藝大 為簡化，經(jīng)濟效益明顯，且可得到純度較高的6-APA。近年來酶法逐漸成為工業(yè)上生產(chǎn)6-APA 的主流。
[0004] 化學裂解法。用于工業(yè)生產(chǎn)的化學裂解的工藝路線是:在極低的溫度下，先將青霉 素的羧基轉(zhuǎn)變成硅酯保護起來，再使側(cè)鏈上的酰胺活化，通過形成青霉素取代亞胺醚衍生 物，然后在極溫和的條件下，選擇性地水解斷鏈成6-APA。
[0005] 生物酶催化法。在自然界中細菌、放線菌、酵母和高等真菌都可以產(chǎn)生青霉素?；?酶。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，在酶的菌株改良、發(fā)酵自動化、酶的大規(guī)?；?、酶的固定化、 反應(yīng)器設(shè)計、后續(xù)工藝等各個領(lǐng)域同時取得進展，青霉素?；赣糜?-APA的制備已經(jīng)非常 成熟。固定化酶可以重復使用，容易從反應(yīng)液中分離，可以有效防止對產(chǎn)物的蛋白污染和微 生物污染等。在反應(yīng)器內(nèi)加入一定量的固定化酶，把一定濃度的青霉素溶液與固定化酶在 攪拌的作用下，使酶和青霉素充分接觸。在酶的催化下，青霉素不斷的裂解成6-APA和苯乙 酸，溶液的pH值下降，補加一定濃度的氨水使pH值維持在8.0，當pH值不在下降并維持10分 鐘，到達反應(yīng)終點。上述的裂解液中加入一定的甲醇，用鹽酸調(diào)pH值至4.2,使6-APA結(jié)晶析 出，然后過濾、干燥得到成品。
[0006] 直通工藝流程。現(xiàn)有的工藝是把青霉素鉀鹽成品溶解成水溶液，然后裂解。而青霉 素鉀鹽是從水溶液中提取結(jié)晶出來的。為進一步縮短工藝流程，降低成本和能耗，不再使青 霉素結(jié)晶出來。在青霉素發(fā)酵液的前處理工藝中作適當?shù)墓に嚫倪M，得到一定濃度和純凈 度的RB液(青霉素提取過程中的水溶液)進行裂解。并對裂解液萃取，然后結(jié)晶得到6-APA。 這樣大大簡化了工藝流程。
[0007] 以上三種工藝，是隨著生物技術(shù)的發(fā)展和青霉素提取工藝的不斷改進等技術(shù)進步 的結(jié)果。其中，化學法反應(yīng)條件要求嚴格，需要使用多種昂貴的化學試劑，并要求在-40°c極 低的溫度下反應(yīng)。另一方面產(chǎn)生環(huán)保難處理的高濃度的有機廢水。因此化學法基本淘汰。生 物法使用固定酶裂解，固定酶能反復使用上千次，收率也比化學法高3%~5%，因此在很大 程度水提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本，并減輕了環(huán)保壓力。
[0008] 生物酶催化法中，若能尋找到青霉素?；傅募せ顒?，或許能進一步提高6-APA的 生產(chǎn)效率。目前尚未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種青霉素?；傅募せ顒摷せ顒┠茱@著提高青霉素 ?；傅拇呋?，用于制備6-APA時能顯著提高6-APA的生產(chǎn)效率。
[0010]上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0011] -種青霉素?；讣せ顒瘜W結(jié)構(gòu)式如下： v
〇.
[0013] 所述的青霉素?；讣せ顒┰谥苽?-氨基青霉烷酸中的應(yīng)用。
[0014] 一種6-氨基青霉烷酸的制備方法，包括如下步驟：
[0015] 步驟Sl，向青霉素發(fā)酵液中加入青霉素酰化酶進行裂解反應(yīng)，同時加入如上所述 的青霉素酰化酶激活劑，反應(yīng)結(jié)束后得到包含6-氨基青霉烷酸、苯乙酸和青霉素菌絲的混 合液；
[0016] 步驟S2,將混合液依次經(jīng)過微濾、超濾分離除去青霉素菌絲和大分子物質(zhì)，將溶液 經(jīng)過納濾濃縮得到6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液;所述微濾、超濾和納濾中所 使用的過濾膜為有機膜、陶瓷膜或金屬膜；
[0017] 步驟S3,將6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液進行脫色處理后，使用樹脂 將濃縮混合溶液中的苯乙酸吸附分離，得到6-氨基青霉烷酸的水溶液；
[0018] 步驟S4,調(diào)節(jié)6-氨基青霉烷酸的水溶液的pH值至6-氨基青霉烷酸的等電點即可得 到6-氨基青霉烷酸結(jié)晶，過濾洗滌干燥后即可得到6-氨基青霉烷酸。
[0019] 進一步地，所述裂解反應(yīng)的溫度為26~38°C，反應(yīng)過程中發(fā)酵液的pH為7.0~8.5， 裂解反應(yīng)的反應(yīng)時間為0.5~2h。
[0020] 進一步地，所述超濾中過濾膜的截留分子量為3000~50000道爾頓;所述的納濾中 過濾膜的截流分子量為100~260道爾頓。
[0021] 進一步地，所述脫色處理中脫色劑為活性炭、三氧化二鋁或其組合，所述的樹脂為 超高交聯(lián)樹脂或者大孔吸附樹脂;所述的超高交聯(lián)樹脂型號為AH或NDa-150,所述大孔吸附 樹脂的型號為Amberlite XAD-4。
[0022]進一步地，所述步驟S4具體包括:控制6-氨基青霉烷酸水溶液的溫度在10~25°C， 使用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至6-氨基青霉烷酸的等電點，得到6-氨基青霉烷酸的結(jié)晶，過濾、洗 滌、干燥;所述6_氨基青霉烷酸的等電點為4.3。
[0023]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述裂解反應(yīng)的溫度為26~38°C，反 應(yīng)過程中發(fā)酵液的pH為7.0~8.5。裂解反應(yīng)所需要的青霉素?；赣昧扛鶕?jù)其活性添加， 青霉素?；讣せ顒┑挠昧扛鶕?jù)青霉素?；傅挠昧刻砑?，反應(yīng)過程中使用氨水調(diào)節(jié)PH， 當停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)時間一般在0.5~2h 小時，轉(zhuǎn)化率高達99 %。
[0024]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述微濾、超濾和納濾中所使用的過 濾膜為有機膜、陶瓷膜或金屬膜，其中超濾膜的精度根據(jù)發(fā)酵液的質(zhì)量和膜的通量進行選 擇，優(yōu)選為截留分子量為3000~50000道爾頓的膜組。所述的納濾膜的截流分子量為100~ 260道爾頓。上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述的6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的 濃縮混合溶液中6-氨基青霉烷酸的質(zhì)量百分濃度為5~15 %。
[0025]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，還可以包括苯乙酸脫吸附步驟，其中 所述的苯乙酸脫吸附包括如下步驟:使用添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌吸附有苯乙 酸的樹脂使苯乙酸脫吸附。這樣樹脂得到再生，同時得到的苯乙酸鈉經(jīng)過進一步精制可以 作為原料應(yīng)用于青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0027] 本發(fā)明提供的青霉素酰化酶激活劑能顯著提高青霉素?；傅拇呋剩糜谥?備6-APA時能顯著提高6-APA的生產(chǎn)效率，是不添加激活劑時生產(chǎn)效率的3倍多。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0029] 實施例1:6-APA的制備
[0030]將濃度為100000U/mL的青霉素發(fā)酵液1000 mL放置在溫度控制在30~34°C的攪拌 反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達到30~34°C時，加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和 如下結(jié)構(gòu)所示的青霉素?；讣せ顒?mg，進行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為10% 的氨水，將反應(yīng)器中pH值維持在7.6左右，當停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不 變時，反應(yīng)結(jié)束。
[0031]將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、1微米的過濾器除去固體的青 霉素菌絲。然后再將混合溶液依次經(jīng)過截留分子量為30000~50000道爾頓的超濾器和截留 分子量為3000~5000道爾頓的超濾器，除去大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
[0032]將除雜后的混合溶液經(jīng)過截留分子量為100~260道爾頓的納濾器，使混合溶液得 到濃縮，濃縮至6-APA的質(zhì)量濃度為10%。
[0033]利用活性炭、三氧化二鋁等將濃縮液脫色，得到脫色后的混合液。
[0034]利用特定選擇吸附性的超高交聯(lián)樹脂AH將脫色后的混合液中的苯乙酸吸附，經(jīng)固 液分離，分別得到6 -AP A的水溶液和吸附有苯乙酸的樹脂。樹脂AH可以用ND a -15 0和 Amberlite XAD-4代替。
[0035] 將6-APA的水溶液轉(zhuǎn)移至結(jié)晶器中，結(jié)晶器內(nèi)溫度控制在15~20°C，向結(jié)晶器內(nèi)加 氨水，逐漸調(diào)節(jié)結(jié)晶器內(nèi)溶液PH值至6-APA的等電點(PI = 4.3)，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗 滌、干燥后得到6-APA。相關(guān)結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0036]青霉素酰化酶激活劑結(jié)構(gòu)式如下：
[0038] 實施例2:6-APA的制備
[0039]將濃度為100000U/mL的青霉素發(fā)酵液1000 mL放置在溫度控制在26~30°C的攪拌 反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達到26~30°C時，加入青霉素?；?0g(酶活120U/g)和 青霉素酰化酶激活劑5mg，進行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為10%的氨水，將反應(yīng) 器中pH值維持在7.0~7.6,當停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié) 束。
[0040] 將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、1微米的過濾器除去固體的青 霉素菌絲。然后再將混合溶液依次經(jīng)過截留分子量為30000~50000道爾頓的超濾器和截留 分子量為3000~5000道爾頓的超濾器，除去大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
[0041] 將除雜后的混合溶液經(jīng)過截留分子量為100~260道爾頓的納濾器，使混合溶液得 到濃縮，濃縮至6-APA的質(zhì)量濃度為5%。
[0042]利用活性炭、三氧化二鋁等將濃縮液脫色，得到脫色后的混合液。
[0043]利用特定選擇吸附性的超高交聯(lián)樹脂AH將脫色后的混合液中的苯乙酸吸附，經(jīng)固 液分離，分別得到6 -AP A的水溶液和吸附有苯乙酸的樹脂。樹脂AH可以用ND a -15 0和 Amberlite XAD-4代替。
[0044] 將6-APA的水溶液轉(zhuǎn)移至結(jié)晶器中，結(jié)晶器內(nèi)溫度控制在10~15°C，向結(jié)晶器內(nèi)加 氨水，逐漸調(diào)節(jié)結(jié)晶器內(nèi)溶液PH值至6-APA的等電點(PI = 4.3)，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗 滌、干燥后得到6-APA。相關(guān)結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0045] 實施例3:6-APA的制備
[0046]將濃度為100000U/mL的青霉素發(fā)酵液1000 mL放置在溫度控制在34~38°C的攪拌 反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達到34~38°C時，加入青霉素?；?0g(酶活120U/g)和 青霉素酰化酶激活劑5mg，進行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為10%的氨水，將反應(yīng) 器中pH值維持在7.6~8.5,當停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié) 束。
[0047]將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、