專利名稱：：流感病毒rt-pcr檢測引物及檢測流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種RT-PCR檢測技術(shù)，尤其涉及一種流感病毒RT-PCR檢測引物及檢測流感病毒的方法。
背景技術(shù)：
：流感病毒基因組由8條負鏈RNA節(jié)段構(gòu)成。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同分為A型、B型、C型。A型流感病毒根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和9個NA亞型；B型和C型流感病毒不分亞型。A型常引起世界性大流行；B型、C型則以局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。2009年3月，墨西哥和美國先后發(fā)現(xiàn)了甲型H1N1流感病毒感染病例，至2009年5月21日，已經(jīng)有42個國家出現(xiàn)甲型H1N1流感確診病例，全球確診病例超過l萬，感染人數(shù)呈不斷上升趨勢。目前的數(shù)據(jù)顯示，該病毒己經(jīng)具備了人際傳播的能力，人群對該病毒的免疫低下，因此病毒在人際之間的傳播能力較普通流感病毒強。甲型H1N1流感潛伏期一般1至7天，早期癥狀與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。部分患者病情來勢兇猛、突然高熱、體溫超過39'C，甚至繼發(fā)嚴重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、休克及Reye綜合征、呼吸衰竭及多器官損傷，最后導(dǎo)致死亡。甲型流感H1N1亞型病毒的基因核酸序列與季節(jié)性流感病毒H1N1接近，病原的診斷需要采用較為復(fù)雜和繁瑣的基因序列測定，難以在普通實驗室進行?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用的流感病毒檢測方法為雞胚病毒分離培養(yǎng)方法，靈敏度高。上述現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下缺點操作費時、需3周時間，而且對實驗室的要求也比較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、應(yīng)用方便的流感病毒RT-PCR檢測引物及檢測流感病毒的方^i。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的流感病毒RT-PCR檢測引物，包括以下一種或多種引物甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒Hl特異性引物；所述甲型流感病毒通用性引物針對甲型流感病毒M基因相對保守區(qū)；所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物針對甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述新甲型mNl流感病毒Hl特異性引物針對新甲型HlNl流感病毒HA基因相對保守區(qū)。本發(fā)明的應(yīng)用上述的流感病毒RT-PCR檢測引物檢測流感病毒的方法，其特征在于，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法RT-PCR試劑盒加入所述引物進行核酸擴增；之后，利用RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)特異性條帶的大小判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述的流感病毒RT-PCR檢測引物及檢測流感病毒的方法，由于包括針對甲型流感病毒M基因、甲型H1N1流感病毒HA基因或新甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)的引物?？梢酝ㄟ^RT-PCR法檢測流感病毒，操作簡單、應(yīng)用方便。具體實施例方式本發(fā)明的甲型流感病毒RT-PCR檢測引物，其較佳的具體實施方式是，包括以下一種或多種引物甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒Hl特異性引物；所述甲型流感病毒通用性引物針對甲型流感病毒M基因相對保守區(qū)；所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物針對甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物針對新甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)。所述引物包括長度為2026bp的寡核苷酸片段。所述甲型流感病毒通用性引物包括以下兩條序列5'-TTCTMCCGAGGTCGAAACG-3';5'-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3，；所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物包括以下兩條序列5'-AAGAGCACACATAATGCCAT-3';5'-CCATTRGARCACATCCAG-3，；所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物包括以下兩條序列5'-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3';5'-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3，。每種所述引物的兩條序列中，其中一條與病毒基因正向序列互補；另一條與病毒基因反向序列互補。本發(fā)明應(yīng)用上述的甲型流感病毒RT-PCR檢測引物檢測流感病毒的方法包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法RT-PCR試劑盒加入所述引物進行核酸擴增；之后，利用RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)特異性條帶的大小判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。所述流感病毒可以包括以下一種或多種病毒甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒。本發(fā)明中，包括3種引物，每種引物包括兩條，其中一條與病毒基因正向序列互補，另一條與反向序列互補。引物序列(5'—3')及其檢測的靶片段和擴增效果描述如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明中，應(yīng)用RT-PCR反應(yīng)液檢測待測樣品中新甲型流感病毒H1N1的方式，從待測樣本中提取核酸RNA后，直接進行一步法RT-PCR檢測、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析，能夠準確、高效地檢出待檢樣本中甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒，可用于流感病毒的實驗室確診。具體實施例包括了寡核苷酸引物的設(shè)計、待檢樣本的處理、檢測和分析。為進一步說明新甲型H1N1流感病毒RT-PCR檢測引物及應(yīng)用方法，參照下列實施例進行說明實施例一甲型流感病毒H1N1RT-PCR寡核苷酸引物的設(shè)計與合成GenBank數(shù)據(jù)庫(http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov/ge畫es/FUJ/FUJ.html)中和中國國家流感中心病毒序列數(shù)據(jù)庫中下載豬源流感病毒H1N1和甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1等亞型M基因和HA基因全序列，軟件比對分析所有甲型流感病毒M基因序列的一致性，選擇相對保守區(qū)設(shè)計引物；將豬源H1N1、新甲型H1N1和季節(jié)性甲型流感病毒H1N1所有HA基因序列放在一起比對，分別選擇保守區(qū)和異變區(qū)設(shè)計引物。引物設(shè)計中允許同一變異位點允許2個及2個以下簡并堿基。將所提取的備選引物滿足以下要求進行篩選①探針長度L在1928bp之間；②Tm值在4259。C之間；③GC。/。在2575。/。之間；④polyN《4bp;⑤Hairpin《4bp;覆蓋率>90%;⑦進行BLAST篩選，特異性分數(shù)〉LX0.4。最佳Tm值設(shè)定在47。C，最佳探針長度為20-25bp。實施例二本發(fā)明檢測未知病毒的應(yīng)用舉例1.病毒RNA的提取取病毒采樣液200uL，加入500uL裂解液，按RNeasyMiniKit(Qiagen公司，catalogH74104)說明書提取病毒RNA50uL。2.RT-PCR反應(yīng)1)體系配置使用QIAGENOnest印RT-PCRKit(catalog#210212)反應(yīng)液。體積組分(ul)5XQIAGENOneSt印RT-PCRBuffer510mMdNTPMixture1QIAGENOneSt印RT-PCREnzymeMix1RNaseInhibitor0.1上游引物(20mM)0.5下游引物(20mM)0.5病毒核酸/RNA5RNaseFreeH20Upto252)RT-PCR:將加好上述反應(yīng)體系的反應(yīng)管放于PCR儀進行RT-PCR，反應(yīng)程序如下60。C作用l分鐘；42'C作用10分鐘；50。C作用30分鐘；95。C作用15分鐘；94。C變性30秒；50。C退火30秒；72'C延伸1分鐘；回到第5步，34個循環(huán)；72'C作用10分鐘；4°C保存。3.RT-PCR產(chǎn)物檢測各取5ul產(chǎn)物于1.5%Agrorosegel進行電泳觀察結(jié)果。4.結(jié)果判斷在系統(tǒng)成立即陰陽性參考均正常的條件下，判斷陰陽性結(jié)果，分別如下陽性FluA在234處、Hl在327bp處、SWHl在153bp、HuSwHl在527bp處出現(xiàn)特異性條帶，判為陽性結(jié)果。陰性未出現(xiàn)條帶，或不在上述位置出現(xiàn)非特異性條帶，均判為陰性結(jié)果。本發(fā)明提供了3套共6條用于甄別流感病毒的寡核苷酸引物序列，并提供了RT-PCR的檢測體系及其在流感病毒快速檢測中的應(yīng)用。檢測評價特異性評價共選取國內(nèi)近三年流行季節(jié)性流感病毒H1N1亞型20株進行檢測，Univer-FluA和Univer-Hl均能檢出，而SW-H1不能檢出；選取10株豬流感病毒H1N1亞型、2株新甲型流感病毒H1N1亞型進行檢測，三對引物均能檢出；選取甲型流感病毒H3N2進行檢測，除Univer-FluA檢測為陽性外，其余2對檢測均為陰性；選取B型流感病毒進行檢測，四對引物檢測均為陰性。靈敏性評價用來自美國血凝單位為32HA/50uL的H1N1毒株(A/California/09/2009)200liL提取RNA50uL,10倍梯度稀釋顯示靈敏性達到10—5_10—7稀釋度。本發(fā)明可以將RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于新甲型H1N1流感病毒(豬流感)的甄別、檢測體系中。為新甲型H1N1流感病毒的實驗室診斷提供了有效的檢測技術(shù)，為新甲型H1N1流感病毒的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早治療以及公共衛(wèi)生策略的制定提供技術(shù)手段和檢測依據(jù)。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。<110〉中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所〈120〉流感病毒RT-PCR檢測引物及檢測流感病毒的方法<160〉6〈210〉1〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列<220><223>甲型流感病毒通用性引物〈■>1ttctaaccgaggtcgaaacg〈210〉2〈211〉20〈212〉薩〈213〉人工序列<220><223>甲型流感病毒通用性引物〈400〉2acaaagcgtctacgctgcag〈210〉3〈211〉20<212>■〈213>人工序列<220><223>甲型H1N1流感病毒H1通用性引物〈400〉3aagagcacacataatgccat8210>4〈211〉18<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉甲型H1N1流感病毒H1通用性引物<400〉4ccattrgaxcacatccag〈210>5<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物〈400〉5astaacattagaagcaactgg<210〉6〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物<400〉6aggctggtgtttatrgcacc01-05-22關(guān)閉窗權(quán)利要求1、一種流感病毒RT-PCR檢測引物，其特征在于，包括以下一種或多種引物甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物；所述甲型流感病毒通用性引物針對甲型流感病毒M基因相對保守區(qū)；所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物針對甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物針對新甲型H1N1流感病毒HA基因相對保守區(qū)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒RT-PCR檢測引物，其特征在于，所述引物包括長度為2026bp的寡核苷酸片段。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒RT-PCR檢測引物，其特征在于所述甲型流感病毒通用性引物包括以下兩條序列5'-TTCTAACCGAGGTCGAMCG-3，；5，-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3';所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物包括以下兩條序列5'-AAGAGCACACATAATGCCAT-3';5'-CCATTRGARCACATCCAG-3';所述新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物包括以下兩條序列5'-AATMCATTAGAAGCAACTGG-3';5'-AGGCTGGTGTTTATRGCACC_3，。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感病毒RT-PCR檢測引物，其特征在于，每種所述引物的兩條序列中，其中一條與病毒基因正向序列互補；另一條與病毒基因反向序列互補。5、一種應(yīng)用權(quán)利要求1至4任一項所述的流感病毒RT-PCR檢測引物檢測流感病毒的方法，其特征在于，包括步驟首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;然后，利用一步法RT-PCR試劑盒加入所述引物進行核酸擴增；之后，利用RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)特異性條帶的大小判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一種或多種病毒甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種流感病毒RT-PCR檢測引物及檢測流感病毒的方法，包括甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒H1特異性引物等3對共6條寡核苷酸引物序列，同時公開了待檢樣本的處理、RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件、結(jié)果分析。能快速有效的甄別甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒，為臨床診斷、檢驗檢疫等領(lǐng)域的流感疫情早期預(yù)警機制提供了可行的技術(shù)支持。文檔編號C12R1/93GK101560575SQ20091008547公開日2009年10月21日申請日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者李德新,李曉丹,溫樂英,偉王,王大燕,舒躍龍,高榮保申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所