專利名稱：海雀稗體細胞⁶⁰Co r射線輻射誘變方法
技術領域：
本發(fā)明海雀稗體細胞6GCo r射線輻射誘變方法，涉及一種適用于植物細胞離體培 養(yǎng)植株再生和6QCo r射線輻射誘變技術，屬于植物培養(yǎng)方法技術領域。
背景技術：
海雀稗(Pa^a/ww vag/"a^m Sw.)作為草坪草，在世界熱帶與亞熱帶地區(qū)廣為 種植，是繼狗牙根、結縷草和假儉草等暖季型禾草之后興起的后起之秀(解新明，盧 小良.海雀稗種質資源的優(yōu)良特性及其利用價值[J]，華南農(nóng)業(yè)大學學報，2004，25(增 刊II): 64 67)。三倍體的海雀稗因花粉敗育、自交不親和等障礙(馬國華，趙南先. 雀稗屬細胞學和繁殖生物學研究[J]，亞熱帶植物科學，2003， 32 (3): 5 9)，給常 規(guī)育種工作帶來困難。
自20世紀50年代后期，我國開始進行植物輻射誘變育種技術的研究；60年代后 期，在農(nóng)作物新品種選育上獲得成功；70年代后期，大批優(yōu)良農(nóng)作物新品種陸續(xù)育成， 并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開始大面積推廣應用(王志東.我國輻射誘變育種的現(xiàn)狀分析[J]，同 位素，2005, 18(3): 183~185)。
輻射誘變在雜交狗牙根、扁穗純?nèi)~草、假儉草、草地早熟禾、狗牙根、高羊茅等 草坪草育種中也得到應用(程金水主編.園林植物遺傳育種學.北京中國林業(yè)出版 社，2000， 5:153-170)。已報道的草坪草輻射誘變的研究材料多為種子或匍匐莖，輻 射源以^Cor射線為主(王丹，任少雄，蘇軍，等.核技術在觀賞植物誘變育種上的 應用[J]，核農(nóng)學報，2004,18(6):443-447)。迄今為止，在草坪草上國內(nèi)外僅有1篇以 匐匍翦股穎的愈傷組織為材料，6GCor輻照劑量為20Gy，獲得抗旱的變異體植株報 道(周小梅，趙運林，周樸華，等.匐匍翦股穎L-93抗旱變異體的離體篩選與鑒定 [J].草業(yè)學報，2007,16(5):121-126)。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明要解決的技術問題和提出的技術任務是以海雀稗的顆粒狀胚 性愈傷組織為材料，以6QCo r射線為輻射源，研究不同劑量的6QCo r射線對愈傷組織 生長、分化和植株再生的影響，運用離體培養(yǎng)方法從突變細胞再生出植株，建立海雀稗體細胞6QCo r射線輻射誘變方法。 技術方案
海雀稗體細胞^Cor射線輻射誘變方法，包括
1) 材料
選用海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，6QC0 r射線為輻射源；
2) 培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與B5維生素組成，添加蔗糖30 g/L; 愈傷組織繼代培養(yǎng)基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L， 6-芐基氨基嘌呤0.05 mg/L，瓊脂條16g/L;
愈傷組織分化培養(yǎng)基添加6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L，瓊脂條8g/L; 生根培養(yǎng)基附加萘乙酸0.5mg/L，瓊脂條8g/L; 上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8;
3) 方法
選擇顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，用作輻射處理 材料。6GCor射線的劑量率為1Gy/min，輻照劑量設置分別為60 Gy、 70Gy或80 Gy， 其(|' 60Gy或70Gy輻照10 min， 80 Gy輻照20 min。經(jīng)過輻射誘變處理的愈傷組織 轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)，21d左右分化產(chǎn)生綠芽；綠芽先 轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，然后再轉移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，21d左右 形成具有根、莖、葉的完整再生植株。
離體培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26±2"，光照強度為15001x，光照時間為16h/d。 有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點和積極效果 本發(fā)明克服現(xiàn)有植物輻射誘變方法主要是以植物的整體植株或不同部位的組織、 器官等為材料，輻射誘變獲得的往往是隱性突變體和嵌合體的缺陷。在離體培養(yǎng)條件 下，選用具有高頻率植株再生能力的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，進行^Cor射線輻 照處理，從經(jīng)過輻射處理的細胞再生出植株，有利得到誘變純合體，減少誘變中嵌合 體，提高輻射誘變的育種效率。本發(fā)明建立的海雀稗體細胞MCor射線輻射誘變方法 適宜用于植物新品種開發(fā)，如體細胞突變體篩選，為在細胞水平上開展植物細胞輻射 誘變育種提供條件。
以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，^Cor射線的劑量率為lGy/min，輻照
4劑量為60Gy，愈傷組織綠芽分化率在76%左右，綠芽的成苗率為42%。海雀稗顆粒 狀胚性愈傷組織在6QCo r射線輻照劑量為70、80 Gy處理下，也獲得了少量再生植株。


1對照愈傷組織分化綠芽。
2 60Gy劑量輻射處理的愈傷組織分化綠芽。 3對照分化的綠芽。
4 60Gy劑量輻射處理分化的綠芽。 5對照再生植株。
6 60Gy劑量輻射處理再生植株。
具體實施例方式
1.材料和方法 1. 1試驗材料
以海雀稗品種"Adalay" (P"i/ a/wn vagz力a&m Sw. cv. Adalay) ("Adalay"草種 由深圳觀瀾湖高爾夫球場對外提供)幼穗誘導產(chǎn)生的顆粒狀胚性愈傷組織為材料(梁 流芳，佘建明，吳瑛瑛，等.海雀稗幼穗離體培養(yǎng)植株再生[J].草地學報,2008, 16(6): 590~593)， 6()0^射線為輻射源。
1. 2培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T, Skoog F. A revised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol plant, 1962, 15:473 497 )和B5維生素(Gamborg O L, Miller R A, Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells[J].Exp. Cell Res.， 1968. 50:151 158)組成，為植物組織培養(yǎng)中一種常用的培養(yǎng)基，蔗糖30g/L;
愈傷組織繼代培養(yǎng)基附加激素2,4-二氯苯氧乙酸(簡稱2,4-D，上?；瘜W試劑 四廠)2.0mg/L， 6-芐基氨基嘌呤(簡稱BAP，上海雪滿生物科技有限公司)0.05 mg/L;
愈傷組織分化培養(yǎng)基附加激素6-芐基氨基嘌呤(簡稱BAP，上海雪滿生物科 技有限公司)2.0 mg/L;
生根培養(yǎng)基附加生長素萘乙酸(簡稱NAA，南京生興生物技術有限公司)0.5 mg/L;
在愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，瓊脂條(乘風牌，福建泉州市泉港化工廠)的用量為
16g/L;在愈傷組織分化和生根培養(yǎng)基中，瓊脂條的用量為8g/L;
培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8;
1.3方法
選擇顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，用作輻射處理 材料。經(jīng)過輻射誘變處理的愈傷組織轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培 養(yǎng)，21d左右分化產(chǎn)生綠芽；綠芽先轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，然后再 轉移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，21d左右形成具有根、莖、葉的完整再生植株。
離體培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26±2QC，光照強度為15001x，光照時間為16h/d。
愈傷組織繼代培養(yǎng)在散射光下進行，愈傷組織分化和生根培養(yǎng)在光照條件下進行。 在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院原子能研究所用6°Co r射線對顆粒狀胚性愈傷組織進行輻射
處理。劑量率為lGy/min，輻射劑量分別設置0、 20、 30、 40、 50 、 60、 70、 80 Gy
八個處理，20、 30、 40、 50Gy輻照7min， 60、 70Gy輻照10min， 80Gy輻照20min。
2.結果
2.1 ^Cor射線對愈傷組織分化綠芽的影響
試驗結果顯示^Cor射線劑量在20、 30、 40、 50Gy四個處理中，輻射處理的 愈傷組織的綠芽分化率在94~85%之間，綠芽分化率的變化幅度不大；6GCor射線為 70Gy劑量時，輻射處理的愈傷組織綠芽分化率降至50%左右(表l)。在愈傷組織分 化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d時，對照愈傷組織分化出大量綠芽(圖1)， 60Gy劑量輻射處 理的愈傷組織僅分化出少量綠芽(圖2)。
在綠芽再次轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)時，注意到來自對照愈傷組 織分化的綠芽發(fā)育正常(圖3)， 60Gy劑量幅射處理的愈傷組織分化的綠芽發(fā)育遲緩 (圖4)， 70、 80Gy劑量幅射處理的愈傷組織分化的綠芽發(fā)育明顯受阻。
表1不同劑量的MCo i"射線對愈傷組織分化綠芽的影響
劑量 I II
(Gy) - -
愈傷組織總數(shù)綠芽愈傷組織數(shù)綠芽分化率(％) 愈傷組織總數(shù)綠芽愈傷組織數(shù)綠芽分化率(％)
010410096.1511811597.46
2011310693.8112111494.21
3011510389.5711610590.52
4012711288.1912511188.80
5012310585.3712811085.94
6021917077.6322416975.45
702099947.3723812150.84
802126430.192276227.312.2 ^Cor射線對綠芽成苗的影響
試驗結果顯示，50 60Gy劑量為敏感區(qū)。6()0)〃射線為50Gy劑量時，經(jīng)過輻 射處理的愈傷組織分化綠芽的成苗率為75%; 60Gy劑量時，經(jīng)過輻射處理的愈傷組 織分化綠芽的成苗率降至42% (表2)。
本試驗在^Cor射線劑量為60Gy處理中獲得了批量具有根、莖、葉的再生小植 株，與對照再生植株相比，60Gy劑量輻射處理得到的再生植株在長勢上偏弱(圖5， 6)。
表2不同劑量的6 Co /"射線對綠芽發(fā)育成苗的影響
劑量
(Gy)綠芽數(shù)綠苗數(shù)成苗率(％)
020619494.17
5022416875.00
602179141.94
701823318.13
809888.16
在生根培養(yǎng)基上，70、 80Gy劑量^Cor射線幅射處理的愈傷組織分化的綠芽中 有高比例的綠芽停止進一步發(fā)育，部分綠芽甚至夭折，從而導致綠芽的成苗率顯著降 低，得到的少量具有根、莖、葉的再生小植株生長明顯受阻，呈細弱狀。
3.結論
在輻射誘變中半致死劑量是指輻射處理后植株成活率為50%的劑量，臨界劑量是 指輻射處理后植株成活率為40%的劑量。以^Cor射線為誘變源，觀賞植物愈傷組織 的適宜輻射劑量為10~30Gy。周小梅等(周小梅，趙運林，周樸華，等.匐匍翦股 穎L-93抗旱變異體的離體篩選與鑒定[J].草業(yè)學報，2007,16(5):121-126)以匐匍翦 股穎的胚性愈傷組織為試驗材料，6QCo r輻照劑量為20 Gy時，綠苗相對分化率為 48.9%，因此將20 Gy作為適宜的誘變劑量。本發(fā)明以海雀稗顆粒狀胚性愈傷組織為 材料，MCor射線輻照劑量為60Gy，愈傷組織綠芽分化率在76%左右，綠芽的植株 再生率為42%，據(jù)此確認60Gy為適宜的誘變劑量。本試驗在6QCo r射線劑量為60、 70、 80Gy處理中都獲得了具有根、莖、葉的再生小植株。
以上以一個具體的例子對本發(fā)明的技術方案作出了詳細說明，但并非只限于上述 具體實施細節(jié)；以本發(fā)明技術方案的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)的其它數(shù)據(jù)實施本發(fā)明的技術方案， 達到了同樣的技術效果，在此不再贅述。
權利要求
1、海雀稗體細胞60Cor射線輻射誘變方法，其特征在于1)材料選用海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，60Cor射線為輻射源；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與B5維生素組成，添加蔗糖30g/L；愈傷組織繼代培養(yǎng)基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，6-芐基氨基嘌呤0.05mg/L，瓊脂條16g/L；愈傷組織分化培養(yǎng)基添加6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L，瓊脂條8g/L；生根培養(yǎng)基附加萘乙酸0.5mg/L，瓊脂條8g/L；上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；3)方法選擇顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，用作輻射處理材料，60Co r射線的劑量率為1Gy/min，輻照劑量設置分別為60Gy、70Gy或80Gy，其中60Gy或70Gy輻照10min，80Gy輻照20min。經(jīng)過輻射誘變處理的愈傷組織轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)，21d分化產(chǎn)生綠芽；綠芽先轉移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，然后再轉移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，21d形成具有根、莖、葉的完整再生植株；離體培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26±2℃，光照強度為15001x，光照時間為16h/d。
2、 根據(jù)權利要求1所述的海雀稗體細胞^Cor射線輻射誘變方法，其特征在于 輻照劑量設置為60Gy。
全文摘要
本發(fā)明涉及海雀稗體細胞⁶⁰Co r射線輻射誘變方法，屬于植物培養(yǎng)方法技術領域。以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，⁶⁰Co r射線為輻射源，劑量率為1Gy/min，輻照劑量為60Gy。顆粒狀愈傷組織在附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L、6-芐基氨基嘌呤0.05mg/L的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，用作輻射處理材料。輻射處理后的愈傷組織轉到附加6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L的愈傷組織分化培養(yǎng)基上，綠芽分化率在76％左右。綠芽轉到附加萘乙酸0.5mg/L的生根培養(yǎng)基上，綠芽的成苗率為42％。本發(fā)明建立的海雀稗體細胞⁶⁰Co r射線輻射誘變方法適宜用于植物新品種開發(fā)，為在細胞水平上開展植物細胞輻射誘變育種提供條件。
文檔編號C12N15/01GK101508987SQ20091002611
公開日2009年8月19日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權日2009年4月1日
發(fā)明者佘建明, 倪萬潮, 葉曉青, 吳瑛瑛, 楊莉林, 梁流芳, 湯日圣, 王松鳳, 董民強, 黃益洪 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院;杭州白云草業(yè)研究所有限公司;浙江紹興白云建設有限公司