專利名稱：一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光偏振檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于熒光偏振技術(shù)中 檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)指在某一人群的正常個(gè)體的基因組內(nèi)特定核酸位
置上有著不同堿基，是人類DNA序列的差異，即染色體基因組序列中單核苷酸
改變時(shí)發(fā)生的DNA序列的多態(tài)性變化，人類三等位和四等位基因的SNPs是非
常少見的，因此SNPs也被稱作雙等位基因標(biāo)記。人類基因組30億個(gè)堿基中，
大約每300到500個(gè)堿基就有一個(gè)SNP發(fā)生，整個(gè)人類基因組大約有2000萬
SNP。 SNP既能在編碼基因又能在非編碼基因中發(fā)生，對(duì)人類個(gè)體的表型(形態(tài)、
代謝和免疫狀態(tài)等)，個(gè)體對(duì)環(huán)境致病因素的易感性、抵抗力、藥物和治療的
反應(yīng)敏感性產(chǎn)生重大影響，其檢測(cè)對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)、醫(yī)學(xué)診斷、生
物醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)發(fā)展有重要意義。
對(duì)SNP的檢測(cè)可為新的治療方法、預(yù)計(jì)藥物療效、預(yù)警病情發(fā)展提供基礎(chǔ)， 對(duì)決定常見疾病相關(guān)的易感等位基因、基因型(DNA序列)與表現(xiàn)型(疾病和健 康)的關(guān)系及個(gè)性化藥物及健康計(jì)劃的實(shí)現(xiàn)提供堅(jiān)實(shí)后盾，臨床意義重大。 目前，RFLP、等位基因特異的寡核苷酸雜交、寡核苷酸連接分析、等位基因特 異的PCR、 DNA測(cè)序等技術(shù)都可分別進(jìn)行SNP及基因變異檢測(cè)，但這些方法多 需要電泳和多步后處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力而效率有待提高?；騼x器設(shè)備昂貴，難以大 規(guī)模推廣應(yīng)用。
1999年，Chen等將熒光偏振檢測(cè)與PCR擴(kuò)增及末端終止子延伸反應(yīng)結(jié)合用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)。該方法是在純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，加入3' 端緊鄰SNP位點(diǎn)上游的SNP引物，兩種熒光標(biāo)記的Acyclo終止堿基，當(dāng)某熒 光標(biāo)記的Acyclo終止堿基與模板中SNP位點(diǎn)堿基互補(bǔ)摻入時(shí)，該熒光FP值增 加；反之，無摻入，F(xiàn)P值小。但因該方法涉及擴(kuò)增、消化純化、滅活、雜交延 伸分管等步驟，這些步驟分步進(jìn)行，不僅成本高，而且在操作過程因需要更換 反應(yīng)管而易發(fā)生污染，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些問題都限制了該方法的推 廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要提供一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)存在的成本高、操作步驟繁瑣、易發(fā)生污染和影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確 性問題。
為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，所采用的試劑由 MgC12， IOX反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，靶基因DNA引物，靶區(qū)域的3' 端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成；
將上述試劑進(jìn)行擴(kuò)增所述PCR擴(kuò)增試劑包括5 10倍的PCR緩沖液；濃度 各為2. 0 2. 5咖ol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP，濃度各為O. 05-2. 0 y mol/L 的靶基因的上游引物、下游引物、3'端帶熒光標(biāo)記的探針以及l(fā)-2U/ul的 TaqDNA聚合酶，其中上游引物與下游引物濃度的之比為5 10: 1 ;所述擴(kuò)增 反應(yīng)條件是94-95。C變性4-10min后，95 0 C孵育0-l秒，60° C孵育0-1秒， 72° C孵育10秒，35-45個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)無72。 C孵育。
由于本發(fā)明應(yīng)用非對(duì)稱PCR、 3'端熒光標(biāo)記的探針及縮短的擴(kuò)增循環(huán)條件，
實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增與探針和單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在閉管中一步完成。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、 本方法步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單；擴(kuò)增雜交閉管中一步進(jìn)行，不易發(fā)生污 染，結(jié)果準(zhǔn)確。
2、 結(jié)果分析簡(jiǎn)單，結(jié)果判斷時(shí)僅需數(shù)字比較，易標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，應(yīng)用
范圍廣；可用于檢測(cè)臨床血液或組織標(biāo)本；
3、 成本低，不需任何專用試劑及熒光淬滅或微溝槽結(jié)合劑。
具體實(shí)施方式
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下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明能夠進(jìn)行詳細(xì)地描述。
實(shí)施例l:在對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)相關(guān)ERCC1基因第4個(gè)外顯子第118位密碼子上 C/T單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)中，
1、 所用的試劑是由MgC12， IOX反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶，dNTPs， ERCC1基因第4個(gè)外顯子DNA引物，第118位密碼子上C/T單核苷酸多態(tài)性的DNA探 針組成。
2、 將上述試劑按非對(duì)稱PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在25uL體系中進(jìn)行，加入 PCR緩沖液2. 5叱，加入1.0U TaqDNA聚合酶；濃度分別為2. 0 mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP;濃度各為0.5uM的ERCCl上游引物和3'端帶熒光標(biāo)記的探 針混合物，濃度為0.05uM的ERCC1下游引物。
擴(kuò)增反應(yīng)條件是94'C變性5min后，95° C孵育l秒，60° C孵育l秒，72° C 孵育10秒，45個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)無72。 C孵育。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光 偏振值的檢測(cè)，根據(jù)熒光偏振值的高低變化判讀臨床血液或組織標(biāo)本的C/T單 核苷酸多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例2:在對(duì)鉑類藥物敏感性預(yù)測(cè)相關(guān)XRCCl基因Argl94Trp多態(tài)性的檢 測(cè)中，1、 所用的試劑是由MgC12， IOX反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶，dNTPs, XRCC1基因DNA引物，第194位密碼子上單核苷酸多態(tài)性的DNA探針組成。
2、 將上述試劑按非對(duì)稱PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在25uL體系中進(jìn)行，加入 PCR緩沖液2. 5叱，加入2. 0U TaqDNA聚合酶；濃度分別為2. 5mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP;濃度各為2.0uM的XRCCl上游引物和3，端帶熒光標(biāo)記的探 針混合物，濃度為O. 4uM的XRCC1下游引物。
擴(kuò)增反應(yīng)條件是95"變性10min后，95 ° C孵育1秒，56° C孵育l秒， 72 ° C孵育10秒，40個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)無72。 C孵育。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行熒光偏振值的檢測(cè)，根據(jù)熒光偏振值的高低變化判讀臨床血液或組織標(biāo)本的 單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例3:在對(duì)磺脲類藥物療效預(yù)測(cè)相關(guān)SUR1基因多態(tài)性Serl369Ala
的檢測(cè)中，
1、 所用的試劑是由MgC12， IOX反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶，dNTPs， SUR1基因DNA引物，第1369位密碼子上單核苷酸多態(tài)性的DNA探針組成。
2、 將上述試劑按非對(duì)稱PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在25uL體系中進(jìn)行，加入 PCR緩沖液2. 5叱，加入l. 5U TaqDNA聚合酶；濃度分別為2. 0咖ol/L的dGTP、dCTP、 dATP和dTTP;濃度各為2.0uM的SURl基因上游引物和3'端帶熒光標(biāo)記的探針 混合物,濃度為0.4uM的SUR1基因下游引物。
擴(kuò)增反應(yīng)條件是94。C變性8min后，72° C孵育10秒，35個(gè)循環(huán)，最后一 個(gè)循環(huán)無72。 C孵育。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光偏振值的檢測(cè)，根據(jù)熒光偏振 值的高低變化判讀臨床血液或組織標(biāo)本的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，所采用的試劑由MgCl2，10×反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，靶基因DNA引物，靶區(qū)域的3’端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成；將上述試劑進(jìn)行擴(kuò)增所述PCR擴(kuò)增試劑包括5～10倍的PCR緩沖液；濃度各為2.0～2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度各為0.05-2.0μmol/L的靶基因的上游引物、下游引物、3’端帶熒光標(biāo)記的探針以及1-2U/μl的TaqDNA聚合酶，其中上游引物與下游引物濃度的之比為5～10∶1；所述擴(kuò)增反應(yīng)條件是94-95℃變性4-10min后，95℃孵育0-1秒，60℃孵育0-1秒，72℃孵育10秒，35-45個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)無72℃孵育。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光偏振檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法。本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的成本高、操作步驟繁瑣、易發(fā)生污染和影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性問題，現(xiàn)采用的技術(shù)方案是一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，所采用的試劑由MgCl2，10×反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶，dNTPs，靶基因DNA引物，靶區(qū)域的3’端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成；將上述試劑進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.本方法步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單；擴(kuò)增雜交閉管中一步進(jìn)行，不易發(fā)生污染，結(jié)果準(zhǔn)確。2.結(jié)果分析簡(jiǎn)單，結(jié)果判斷時(shí)僅需數(shù)字比較，易標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，應(yīng)用范圍廣；3.成本低，不需任何專用試劑及熒光淬滅或微溝槽結(jié)合劑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101538607SQ20091002226
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者劉文超, 菊 張, 張賀龍 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)