專利名稱：基于熒光偏振分析的IP₃受體靶標(biāo)藥物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向藥物功效預(yù)測方法的技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
1擬6年P(guān)errin首次在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。以一束單一波長的偏振光照射溶液中的熒光物質(zhì)，后者可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光。如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，該物質(zhì)仍將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，該物質(zhì)發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂熒光去偏振現(xiàn)象。近年來，以這種物理學(xué)現(xiàn)象為基礎(chǔ)的技術(shù)正在生命科學(xué)研究的多個領(lǐng)域中扮演著越來越重要的角色。本申請人將熒光偏振現(xiàn)象結(jié)合現(xiàn)代物理中的熱動力學(xué)應(yīng)用于藥學(xué)研究當(dāng)中，發(fā)明了一套高通效的藥物功效預(yù)測技術(shù)。1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3受體)是調(diào)節(jié)Ca2+釋放的配體門控通道。該受體可以結(jié)合IP3后被激活。IP3受體是四聚體。每個亞單位包括2700個殘基，每個亞基N末端 (NT, 1-604)附近具有1&結(jié)合中心(IBC，2M-604)，C-末端具有6個跨膜蛋白。最末端的一對跨膜區(qū)域，連同其四個亞單位的每個轉(zhuǎn)彎環(huán)區(qū)，構(gòu)成孔隙結(jié)構(gòu)。當(dāng)3 4個部位被IP3 占據(jù)時，IP3受體復(fù)合物構(gòu)象發(fā)生改變，打開孔隙結(jié)構(gòu)，儲存的Ca2+隨即釋放?，F(xiàn)有技術(shù)中，大部分研究者采用電生理技術(shù)(electro physiology)或者核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance)來預(yù)測候選的IP3靶向藥物的藥效。電生理技術(shù)雖然精確度高，但是它操作十分復(fù)雜，且失敗率非常高(98%)，因此對實驗人員的技術(shù)和經(jīng)驗要求相當(dāng)高。一位擁有10年以上經(jīng)驗的電生理博士后研究員，可能會花上2天的時間才能預(yù)測一種候選藥物的功效。對于核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance)，其耗費的時間起碼在2天以上的時間。一個新藥研發(fā)項目最初的候選藥物通常超過10萬個，經(jīng)過初篩以后進入藥學(xué)研究階段的藥物通常也超過1萬個。因此，如果單一藥物的預(yù)測時間都要幾天的時間，那么對于上萬種藥物都進行精確預(yù)測所花費的時間和費用是非常高昂的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法。該篩選方法可以把藥物對細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的影響進行量化，比較精確的預(yù)測出藥物的功效；基于熒光偏振技術(shù)操作簡單的特點，結(jié)合現(xiàn)代機器人技術(shù)，還可以實現(xiàn)藥物篩選的高通量，即能同時預(yù)測上百種藥物的功效；大大縮減實驗時間，節(jié)省藥物研發(fā)費用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法，步驟如下
A.提供熒光標(biāo)記配體、作為競爭配體的待測化合物、以及3種包含IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的受體多肽；分別為受體IBC、受體NT和受體V3!3K-NT ；所述受體IBC是位于IP3R受體2M-604位的IP3結(jié)合中心，所述受體NT是野生型的位于IP3R受體1-604位的IP3受體N末端片段， 所述受體V3!3K-NT是受體NT的33位氨基酸突變?yōu)橘嚢彼岬耐蛔冃虸P3受體N末端片段；
B.競爭結(jié)合分析實驗將所述步驟A中的熒光標(biāo)記配體、待測化合物、至少一種受體多肽置于容器內(nèi)混合；
C.通過熒光偏振技術(shù)測定所述步驟B的容器在不同溫度下對應(yīng)的熒光各向異性度A， 計算對應(yīng)溫度下待測化合物與相應(yīng)受體多肽競爭結(jié)合時的平衡解離常數(shù)忍值，根據(jù)平衡解離常數(shù)忍值計算得到相應(yīng)溫度下的焓變ΔΗ，每種受體的焓變ΔΗ分別表示為ΔΗ ιβ。、ΔΗντ 禾口 Δ Hy33K ；
D.計算ΔH IBC與Δ Hnt的差值，Δ H IBC與Δ Hnt的差值用Δ ( Δ H IBC _NT)表示，Δ ( Δ H IBC_NT)的絕對值越小，則待測化合物的藥效越強；或者計算Δ Hv33k和Δ Hnt的差值，Δ Hv33k和 ΔHnt的差值用Δ (ΔΗν )表示，Δ (ΔΗν33Κ_ΝΤ)的絕對值越大，則待測化合物的藥效越強。進一步的技術(shù)方案，所述熒光標(biāo)記配體是將熒光素通過共價鍵連接到IP3制備的。進一步的技術(shù)方案，所述熒光標(biāo)記配體是FITC_IP3。
綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點
(1)本發(fā)明首次測定了不同溫度下配體的解離平衡常數(shù)KD值，首次測定了不同溫度下配體結(jié)合的自由能變。(2)本發(fā)明與目前最精確的藥物功效預(yù)測技術(shù)相比，比如電生理技術(shù)(electro physiology)，核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance)等，它能更準(zhǔn)確的預(yù)測藥物效能(efficacy)，因為它通過熱動力學(xué)可以把藥物對靶點的作用進行精確的量化。從熱動力學(xué)的角度來說，藥物與靶點結(jié)合是兩種過程的推動結(jié)果，即熵(entropy，物質(zhì)混亂的程度)，和焓(enthalpy，物質(zhì)能量)。把熱動力學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合起來，則我們可以根據(jù)藥物與靶點結(jié)合的熵值和焓值來推測藥物與靶點結(jié)合后對其造成了多大的改變，從而預(yù)測該藥物對細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生了多大的影響。更為重要的是，通過這一技術(shù)，我們可以把藥物對細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的影響進行量化，比較精確的預(yù)測出藥物的功效。通過對8種已知藥物的實驗，并與電生理技術(shù)對比，證明了熒光偏振技術(shù)對藥物功效預(yù)測的準(zhǔn)確性。(3)本發(fā)明的第二個特點是它的微型實驗性質(zhì)，本發(fā)明所需實驗耗材的費用只有其它傳統(tǒng)技術(shù)的一半。核磁共振技術(shù)需要大量高純度的靶點蛋白，而電生理技術(shù)由于成功率非常低，也需要非常多的帶有研究靶點的轉(zhuǎn)基因細胞與其它實驗試劑。而熒光偏振技術(shù)則不同，它對靶點蛋白的純度與數(shù)量的需求相當(dāng)小。通過應(yīng)用現(xiàn)代機器人技術(shù)與高精度微量液體取樣技術(shù)，本申請人實現(xiàn)了該技術(shù)的微型實驗性質(zhì)，大大降低了所需實驗耗材，從而減小了新藥研發(fā)的費用。(4)本發(fā)明的第三個特點是它的高通效，本發(fā)明技術(shù)能以較高的成功率同時預(yù)測上百種藥物的功效。傳統(tǒng)藥理研究中預(yù)測藥物功效的技術(shù)，如電生理技術(shù)(electro physiology)操作十分復(fù)雜，且失敗率非常高(98%)，因此對實驗人員的技術(shù)和經(jīng)驗要求相當(dāng)高。一位擁有10年以上經(jīng)驗的電生理博士后研究員，可能會花上2天的時間才能預(yù)測一種候選藥物的功效。對于核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance)，其耗費的時間起碼在2天以上的時間。一個新藥研發(fā)項目最初的候選藥物通常超過10萬個，經(jīng)過初篩以后進入藥學(xué)研究階段的藥物通常也超過1萬個。因此，如果單一藥物的預(yù)測時間都要幾天的時間，那么對于上萬種藥物都進行精確預(yù)測所花費的時間和費用是非常高昂的?；跓晒馄窦夹g(shù)操作簡單的特點，本申請人通過結(jié)合現(xiàn)代機器人技術(shù)，實現(xiàn)了該技術(shù)的高通效性， 使該技術(shù)能同時預(yù)測上百種藥物的功效。因此，本發(fā)明能大大縮減實驗時間，節(jié)省研發(fā)費用。


附圖1為Δ ( AHibc _m)值與藥效的關(guān)系圖。附圖2為Δ ( Δ Hv33mt)值與藥效的關(guān)系圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的實施方式不僅限于此。實施例1 FITC-IP3的制備及純化
將以下反應(yīng)設(shè)置在NMR樣品管中反應(yīng)，以便于通過核磁共振譜對反應(yīng)過程進行監(jiān)測。 包括如下步驟將20 ymol 2-氧-(2-氨乙基)-IP3溶解于0. 75 ml四氘代甲醇中，添加 50 μ 1三乙基胺，添加30 ymol FITC固體，封口，搖勻，避光室溫孵育4h后；再次添加20 μ mol FITC固體，繼續(xù)避光室溫孵育44h。上述步驟所得到的混合物純化后，即得到產(chǎn)物FITC_IP3。所述的純化步驟為用甲醇將步驟(2)處理后的反應(yīng)體系沖洗到圓底燒瓶中，然后減壓濃縮至圓底燒瓶中物質(zhì)呈固體粉末狀；往圓底燒瓶中添加IOml去離子水吸收減壓濃縮后的固體；將圓底燒瓶的液體加載到避光的Q Sepharose Fast Flow resin凝膠 (8 X 2cm,碳酸氫鹽)上；先用去離子水洗提，再用0.6M的TEAB緩沖液洗提，直到洗脫液無色為止；Q Sepharose Fast Flow resin 凝膠繼續(xù)用梯度濃度的 ΤΕΑΒ(0. 6-2. 0M，250ML) 洗脫，收集IOml的洗脫液作為目標(biāo)液體；將目標(biāo)液體濃縮和結(jié)晶后，得到橙黃色的結(jié)晶體即為 FITC-IP3O進一步的純化步驟還包括將所得到的結(jié)晶體重新溶解于去離子水中，加載到 Chelex 100分子生物純樹脂柱(Na+，2. 5ml)，然后用去離子水洗提；洗提液經(jīng)過冷凍干燥后，得到高純度的FITC-IP3。通過核磁共振譜驗證，產(chǎn)物分子式SC29H31N2O2tlP3S,分子量為 851.0330。使用磷酸分析法精確定量，得到16umol FITC-IP3,產(chǎn)率為80%。實施例2 IP3Rl的N末端片段的表達和純化
本實施例IP3Rl的N末端片段是指具有IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IP3受體多肽片段，本實施例使用的受體有3種，分別為位于殘基1-604的N末端片段(簡稱為NT);殘基224-604的IP3 結(jié)合中心(簡稱為IBC) ;NT的突變體(簡稱為V33k-NT)，V33k-NT與NT的區(qū)別僅在于，33位纈氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷3!3k-NT核苷酸的制備可以采用QuickChange mutagenesis kit突變試劑盒獲得。克隆制備的核苷酸序列都通過DNA測序確認(rèn)后再轉(zhuǎn)化表達。制備所得到的所有肽段都包括一個通過!^rescission剪切位點連接的N末端的GST標(biāo)簽。GST標(biāo)簽的肽段純化可以采用現(xiàn)有技術(shù)，也可以根據(jù)本實施例下文描述的方式進行。將克隆制備的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到五coli AVB101, 1 ml培養(yǎng)物，37°C在LB培養(yǎng)基(含100 ug/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)12h，然后放置在22°C直到OD66tl達到1.5，添加誘導(dǎo)劑異丙基-β- D-半乳糖苷(IPTG)，15°C，誘導(dǎo)20h，使蛋白誘導(dǎo)表達。取誘導(dǎo)后的菌液，離心(6000g，5min)收集菌體，固體重懸于Tris/EDTA培養(yǎng)基 (TEM; 50 mM Tris 和 1 mM EDTA, / H=8. 3)。在上述菌懸液中添加溶菌酶(100 ug/ml)和RNAase (10 ug/ml)后，冰上放置 30分鐘，然后裂解液超聲粉碎。離心(30，000g，60min), 50 ml上清液中添加0.5 ml glutathione Sepharose 4B beads (GST柱材料)20°C持續(xù)旋轉(zhuǎn)30分鐘使其結(jié)合。所有的 GST柱材料填充到PD-10空層析柱中，使用添加了 ImM 4°C二硫蘇糖醇(DTT)的無Ca 2+細胞液類似的CLM培養(yǎng)液沖洗5次。GST柱材料然后在0.5 ml (1柱床體積)的CLM培養(yǎng)液中，和1 mM 二硫蘇糖醇和120單位/ml的GST標(biāo)簽蛋白!^rescission蛋白酶，4°C，孵育12h。收集洗脫的不含 I^eScission 蛋白酶的 IP3R 片段。蛋白濃度以 γ-球蛋白(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Hertfordshire, UK)作為對照標(biāo)準(zhǔn)，使用DC蛋白定量試劑盒(去垢劑兼容)
對蛋白進行定量。實施例3使用FITC-IP3*熒光標(biāo)記的熒光偏振(FP)實驗
FP測量在溫控室內(nèi)，96-孔、半?yún)^(qū)、黑色圓底的聚苯乙烯微孔板(Greiner Bio-One, Gloucester, UK)上進行，使用 Pherastar 酶標(biāo)儀(BMG Labtech, Aylesbury, UK)讀數(shù)。 本實施例使用一套自動液體處理系統(tǒng)Oliagility; QIAGEN，Crawley, WestSussex, UK)進行液體稀釋的自動操作。往微孔板添加液體的大部分動作也是由這套系統(tǒng)自動化進行。隔一定時間定期評價這套自動化系統(tǒng)的精度和重復(fù)性(經(jīng)過8次連續(xù)稀釋后通常是5%的誤差)都高于人工移液。熒光偏振飽和結(jié)合分析實驗用CLM培養(yǎng)液按梯度濃度稀釋的受體多肽(包含 0. 4-400 nM的IP3結(jié)合位點)與FITC-IP3 (0.5 nM )混合，最終體積為50ul。熒光偏振競爭結(jié)合分析實驗將用CLM培養(yǎng)液按梯度濃度稀釋的作為競爭配體的待測化合物、固定濃度0.5 nM的FITC-IP3、以及飽和濃度的受體多肽(NT 80 nM或IBC 15 nM)三種成分置于容器內(nèi)混合。每個溫度(4_37°C)的微孔板在達到平衡(約20分鐘后)進行FP測量。在4_37°C 這個溫度范圍內(nèi)進行，F(xiàn)P測量時，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm，測定水平方向和垂直方向的熒光強度。熒光各向異性度(J) 是從垂直方向(J)和水平方向(Jh) 的熒光強度計算得來的
A 二 (lv—Ih)/(!v+2I心。游離態(tài)FITC-IP3的熒光各向異性度(^)是在不含受體多肽時測量的，結(jié)合態(tài) FITC-IP3的熒光各向異性度(戽)是在飽和濃度IBC (100 nM)或飽和濃度NT (300 nM)和飽和濃度V3!3K-NT (200 nM)情況下測量。FITC-IP3結(jié)合率(&)與體系熒光各向異性度之間的關(guān)系如下fb = [am - af)/(Ab - af)。FITC-IP3結(jié)合率(&)是指與受體多肽結(jié)合的結(jié)合態(tài)FITC-IP3在熒光體總量中所占的分?jǐn)?shù)。非特異性結(jié)合導(dǎo)致的熒光各向異性度Ui)通過檢測受體多肽在每個濃度條件下被IP3飽和結(jié)合(濃度10 μ M)時的熒光各向異性度(A)來進行校正。因為當(dāng)
NT或IBC結(jié)合時，游離的FITC-IP3濃度減少，對于IP3沒有飽和的情況，義值必定高估了其非特異性結(jié)合。我們的校正使非特異性結(jié)合和游離的FITC-IP3濃度呈線性關(guān)系
~ ~ ^4, ), (1 _ fg ) OFITC-IP3與IP3受體多肽的特異性結(jié)合的熒光各向異性度(先)計算如下
權(quán)利要求
1.基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法，其特征在于，步驟如下A.提供熒光標(biāo)記配體、作為競爭配體的待測化合物、以及3種包含IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的受體多肽；分別為受體IBC、受體NT和受體V3!3K-NT ；所述受體IBC是位于IP3R受體2M-604 位的IP3結(jié)合中心，所述受體NT是野生型的位于IP3R受體1-604位的IP3受體N末端片段， 所述受體V3!3K-NT是受體NT的33位氨基酸突變?yōu)橘嚢彼岬耐蛔冃虸P3受體N末端片段；B.競爭結(jié)合分析實驗將所述步驟A中的熒光標(biāo)記配體、待測化合物、至少一種受體多肽置于容器內(nèi)混合；C.通過熒光偏振技術(shù)測定所述步驟B的容器在不同溫度下對應(yīng)的熒光各向異性度A， 計算對應(yīng)溫度下待測化合物與相應(yīng)受體多肽競爭結(jié)合時的平衡解離常數(shù)忍值，根據(jù)平衡解離常數(shù)忍值計算得到相應(yīng)溫度下的焓變ΔΗ，每種受體的焓變ΔΗ分別表示為ΔΗ ιβ。、ΔΗντ 禾口 Δ Hy33K ；D.計算ΔΗIBC與ΔHnt的差值，ΔΗ IBC與Δ Hnt的差值用Δ ( AHibc _ΝΤ)表示，Δ ( ΔΗ IBC_NT)的絕對值越小，則待測化合物的藥效越強；或者計算Δ Hv33k和Δ Hnt的差值，Δ Hv33k和 ΔHnt的差值用Δ (ΔΗν )表示，Δ (ΔΗν33Κ_ΝΤ)的絕對值越大，則待測化合物的藥效越強。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記配體是將熒光素通過共價鍵連接到IP3制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記配體是FITC-IP3。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于熒光偏振分析的IP3受體靶標(biāo)藥物的篩選方法，本發(fā)明首次測定了不同溫度下配體的解離平衡常數(shù)KD值，根據(jù)不同溫度下配體的解離平衡常數(shù)KD值首次測定了不同溫度下配體結(jié)合的自由能變。本發(fā)明與目前最精確的藥物功效預(yù)測技術(shù)相比，比如電生理技術(shù)(electrophysiology)，核磁共振技術(shù)(NuclearMagneticResonance)等，它能更準(zhǔn)確的預(yù)測藥物效能(efficacy)，因為它通過熱動力學(xué)可以把藥物對靶點的作用進行精確的量化。另外，本發(fā)明還具有高通量和微型實驗性質(zhì)的優(yōu)點。因此，本發(fā)明將是靶向藥物功效預(yù)測的趨勢所在。
文檔編號G01N21/64GK102410995SQ20111024214
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者丁兆 申請人:四川匯宇制藥有限公司