專利名稱：一種適用于熒光偏振技術(shù)檢測基因甲基化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光偏振檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測基
因甲基化的方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾，是在基因組內(nèi)啟動子區(qū)CpG島胞嘧啶第五位碳原子上加一甲基基團(tuán)，使之變成5-甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過程，不改變堿基序列，通過影響基因表達(dá)改變其功能。DNA甲基化水平變化是人類癌癥的特征性改變，重要DNA甲基化的檢測在腫瘤預(yù)警、診斷、預(yù)防及早期干預(yù)治療、耐藥性預(yù)測、科學(xué)用藥方面具重要指導(dǎo)價值。 目前，國內(nèi)外DNA甲基化檢測技術(shù)主要有電泳技術(shù)、DHPLC技術(shù)、Methylight技術(shù)、微陣列技術(shù)、焦測序技術(shù)，大多數(shù)設(shè)計、操作復(fù)雜，多需要電泳和多步后處理，費時費力、成本高，儀器設(shè)備昂貴，而效率有待提高，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要提供一種適用于熒光偏振技術(shù)檢測基因DNA甲基化的方法，以克服現(xiàn)有
技術(shù)存在的操作步驟繁瑣、成本高、和效率低的問題。 為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是 —種適用于熒光偏振技術(shù)檢測基因DNA甲基化的方法，是對下述的試劑進(jìn)行擴增 所采用的試劑由MgC12，10X反應(yīng)緩沖液，dNTPs， T叫DNA聚合酶，耙基因啟動子區(qū)CpG島非甲基化區(qū)引物，耙區(qū)域甲基化及非甲基化序列的3'端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成；所采用的PCR擴增試劑包括10倍的PCR緩沖液；濃度各為2. 0 2. 5mmol/L的
dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度為0. 05-0. 2 y mol/L的耙基因的啟動子區(qū)CpG島非甲基化區(qū)
上游引物及3'端帶熒光標(biāo)記的探針、濃度為0. 5-2ymol/L的靶基因的下游引物以及l(fā)-5U/
iil的TaqDNA聚合酶，其中上游引物與下游引物濃度之比為5 10 : 1;所述擴增反應(yīng)條件是94-95。C變性4-10min后，95。C孵育5-40秒，55-65。C孵育
10-60秒，72t:孵育10-40秒，35-45個循環(huán)，最后一個循環(huán)無72。C孵育。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是 1、首次將熒光偏振技術(shù)用于基因DNA甲基化檢測，開辟了基因DNA甲基化檢測的新技術(shù)平臺。 2、首次通過應(yīng)用單端標(biāo)記的甲基化與非甲基化特異的探針與靶區(qū)域的雜交，導(dǎo)致
熒光偏振值的增加，據(jù)此全面檢測靶區(qū)域多個甲基化位點，檢測結(jié)果更全面準(zhǔn)確。 3、本方法步驟簡單，操作簡單；由于本發(fā)明應(yīng)用非對稱PCR、3'端熒光標(biāo)記的探針
及特定的擴增循環(huán)條件，實現(xiàn)了基因DNA甲基化檢測在閉管中完成，因此不易污染，結(jié)果準(zhǔn)確。
4、結(jié)果分析簡單結(jié)果判斷時僅需數(shù)字比較，易標(biāo)準(zhǔn)化、自動化，應(yīng)用范圍廣；可用于檢測臨床血液或組織標(biāo)本；

具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。
實施例1 :抑癌基因P16啟動子甲基化熒光偏振檢測中， 1、所用的試劑是由MgC12，10X反應(yīng)緩沖液，Taq polymerase, dNTPs，抑癌基因P16啟動子引物，耙區(qū)域甲基化及非甲基化序列的3'端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成。
2、將上述試劑進(jìn)行擴增反應(yīng)在25uL體系中進(jìn)行，加入PCR緩沖液2. 5 y L， 1. 0UTaq polymerase ;濃度分別為2. 0mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP ;濃度各為0. 05uM的上游引物和3'端帶熒光標(biāo)記的探針混合物，濃度為0. 5uM的下游引物，及過硫酸鹽試劑盒處理的模板DNA 5ul.擴增反應(yīng)條件是94t:變性5min后，95。C孵育10秒，6(TC孵育10秒，72。C孵育10秒，45個循環(huán)，最后一個循環(huán)無72t:孵育。然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行熒光偏振值的檢測，根據(jù)熒光偏振值與對照組的差異變化判讀血液或組織標(biāo)本的甲基化檢測結(jié)果。
實施例2 :在對抑癌基因P53啟動子甲基化熒光偏振檢測中 1、所用的試劑是由MgC12，10X反應(yīng)緩沖液，Taq polymerase, dNTPs，P53啟動子基因的上、下游引物，耙區(qū)域甲基化及非甲基化序列的3'端帶熒光標(biāo)記的DNA探針探針組成。 2、將上述試劑PCR方法進(jìn)行擴增反應(yīng)在25uL體系中進(jìn)行，加入PCR緩沖液2. 5 ii L， 1. 0U Taq polymerase ;濃度分別為2. 5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP ;濃度各為0. 2uM的上游引物和3'端帶熒光標(biāo)記的探針混合物，濃度為1. 5uM的下游引物，及過硫酸鹽試劑盒處理的模板DNA 2ul. 擴增反應(yīng)條件是94t:變性5min后，95。C孵育5秒，6rC孵育15秒，72。C孵育20秒，45個循環(huán)，最后一個循環(huán)無72t:孵育。然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行熒光偏振值的檢測，根據(jù)熒光偏振值與對照組的差異變化判讀血液或組織標(biāo)本的甲基化檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
一種適用于熒光偏振技術(shù)檢測基因DNA甲基化的方法，是對下述的試劑進(jìn)行擴增所采用的試劑由MgCl2，10×反應(yīng)緩沖液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，靶基因啟動子區(qū)CpG島非甲基化區(qū)引物，靶區(qū)域甲基化及非甲基化序列的3’端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成；所采用的PCR擴增試劑包括10倍的PCR緩沖液；濃度各為2.0～2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度為0.05-0.2μmol/L的靶基因的啟動子區(qū)CpG島非甲基化區(qū)上游引物及3’端帶熒光標(biāo)記的探針、濃度為0.5-2μmol/L的靶基因的下游引物以及1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，其中上游引物與下游引物濃度之比為5～10∶1；所述擴增反應(yīng)條件是94-95℃變性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育10-60秒，72℃孵育10-40秒，35-45個循環(huán)，最后一個循環(huán)無72℃孵育。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光偏振檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于熒光偏振技術(shù)中檢測基因甲基化的方法。本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的操作步驟繁瑣、成本高、和效率低的問題，現(xiàn)采用的技術(shù)方案是一種適用于熒光偏振技術(shù)檢測基因DNA甲基化的方法，是對下述的試劑進(jìn)行擴增所采用的試劑由MgCl2，10×反應(yīng)緩沖液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，靶基因啟動子區(qū)CpG島非甲基化區(qū)引物，靶區(qū)域甲基化及非甲基化序列的3’端帶熒光標(biāo)記的DNA探針組成；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是1、開辟了新平臺；2、全面準(zhǔn)確；3、本方法步驟簡單，操作簡單；4、結(jié)果分析簡單。
文檔編號C12Q1/68GK101736083SQ20091002404
公開日2010年6月16日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者劉文超, 張菊, 張賀龍, 顏真 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)