專利名稱：熒光偏振hERG試驗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心血管安全試驗領(lǐng)域，特別涉及用于篩選測試化合物引起受試者心 臟中毒的能力的試驗、方法和試劑盒。本文公開的試驗、方法和試劑盒基于新型熒光示 蹤化合物與hERG K+通道的相互作用，該相互作用通過膜制劑進(jìn)行利用，所述膜制劑來 自設(shè)計具有高水平hERG K+通道表達(dá)的細(xì)胞系。本文公開的試驗、方法和試劑盒可用于 確認(rèn)對人類心臟復(fù)極具有不利影響(特別是延長心電圖的Q-T間期的傾向)的化合物。
背景技術(shù)：
人類ether-a-go-go相關(guān)基因(hERG)編碼深刻影響人類心室復(fù)極的快速延遲 內(nèi)向整流鉀通道(1&)(參見 Curran，M.E. ； Splawski, I. ； Timothy, K.W. ； Vincent, G.M. ； Green, E.D. ； Keating, Μ.T., A molecular basis for cardiac arrhythmia HERG mutations cause long QT syndrome.Cell 1995, 80, (5), 795—803; Sanguinetti, M.C.; Jiang, C. ； Curran, M.E. ； Keating, M.T., A mechanistic link between an inherited and an acquired cardiac arrhythmia HERG encodes the IKr potassium channel.Cell 1995, 81, (2)，299-307 ； Trudeau, M.C. ； Warmke, J.W. ； Ganetzky, B. ； Robertson, G.A., HERG, a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family.Sciencel995, 269, (5220), 92-5 ；以及 Warmke, J.W. ； Ganetzky, B., A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila and mammals.Proc Natl Acad Sci U S A1994, 91, (8), 3438-42)。流經(jīng)心室肌中的通道的1&復(fù)極電流的阻滯可導(dǎo)致Q-T間期的延長，所述Q-T 間期的延長為稱作尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsades de pointes)以及可能的致命性心律 失常的特征心電案(參見 Sanguinetti，M.C. ； Tristani-Firouzi, M.，hERG potassium channels and cardiac arrhythmia.Nature 2006, 440, (7083), 463-9 ； 以及 Haverkamp, W. ； Breithardt, G. ； Camm, A.J. ； Janse, M.J. ； Rosen, M.R. ； Antzelevitch, C.， Escande，D. ； Franz, Μ. ； Malik, Μ. ； Moss, Α. ； Shah, R., The potential for QT prolongation and pro arrhythmia by non-antiarrhythmic drags clinical and regulatory implications.Report on a policy conference of the European Society of Cardiology.Eur Heart J 2000，21，(15)，1216-31)。該通道(本文稱作hERGK+通道)結(jié)合各種不同類型的 化學(xué)結(jié)構(gòu)的混雜性質(zhì)(參見 Cavalli，Α. ； Poluzzi, Ε. ； De Ponti, F. ； Recanatini，M.; Toward a pharmacophore for drugs inducing the long QTsyndrome insights from a CoMFA study of HERG K (+) channel blockers.J Med Chem2002，45，(18)，3844-53)以及來自該
9相互作用的潛在致命后果已使得國際協(xié)調(diào)會議(International Congress of Harmonization)和 美國食品和藥物管理局推薦所有新的候選藥物均進(jìn)行在使用人類hERG蛋白質(zhì)(天然形式 或以重組形式表達(dá))的功能膜片鉗試驗中的測試(參見Bode，G. ； Olejniczak, K., ICH topic the draft ICH S7Bstep 2 note for guidance on safety pharmacology studies for human pharmaceuticals.Fundam Clin Pharmacol 2002, 16，(2)，105-18)。盡管自動化的高通量 膜片鉗方法在近期得以發(fā)展，但這種體系需要專業(yè)操作者、活細(xì)胞和相當(dāng)大的資本投資 (參見 Bridgland-Taylor, M.H. ； Hargreaves, A.C. ； Easter, Α.; Orme, Α.; Henthorn, D.C. ； Ding, Μ. ； Davis, A.M. ； Small, B.G. ； Heapy, C.G. ； Abi-Gerges, N.； Persson, F. ； Jacobson, I. ； Sullivan, Μ. ； Albertson, N. ； Hammond, T.G. ； Sullivan, Ε. ； Valentin, J.P. ； Pollard, C.E., Optimisation and validation of a medium-throughput electrophysiology-based hERG assay using IonWorks HT.J Pharmacol Toxicol Methods 2006, 54, (2)，189-99 ； 以及 Dubin, Α.Ε. ； Nasser, N. ； Rohrbacher, J. ； Hermans, A.N. ； Marrannes, R. ； Grantham, C. ； Van Rossem, K. ； Cik, Μ. ； Chaplan, S.R.； Gallacher, D.; Xu, J. ； Guia, Α.; Byrne, N.G. ; Mathes, C.， Identifying modulators of hERG channel activity using the PatchXpress planar patch clamp.J Biomol Screen 2005, 10，(2)，168-81)。此外，由于膜片鉗測試較昂貴，并且由于許多化學(xué)上不同的構(gòu) 架(scaffolds)阻塞hERG K+通道，在早期藥物開發(fā)過程中用于減輕潛在的心臟傾向性 (liability)的策略通常利用結(jié)合試驗來預(yù)測化合物在功能膜片鉗試驗中阻滯hERG電流的 能力(參見 Whitebread， S.; Hamon, J.; Bojanic, D.; Urban, L., Keynote review in vitro safety pharmacology profiling an essential tool for successful drag development. Drag Discov Today 2005，10，(21)，1421-33;以及 Diaz，G.J. ; Daniell，K. ; Leitza， S.T. ； Martin, R丄.；Su, Ζ. ； McDermott, J.S. ； Cox, B.F. ； Gintant, G.A., The[3H] dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade and proarrhythmia Comparison of intact cell and membrane preparations and effects ofaltering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187—99)。使用[3H]-多非利特(參見 Diaz，G.J. ； Daniell，K. ； Leitza, S.T. ； Martin, R.L. ； Su, Ζ. ； McDermott, J.S. ； Cox, B.F. ； Gintant, G.A., The[3H]dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade and proarrhythmia Comparison of intact cell and membrane preparations and effects of altering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187-99 ；以及 Finlayson，K. ； Turnbull, L. ； January, C.T. ； Sharkey, J. ； Kelly, J.S.， [3H]dofetilide binding to HERG transfected membranes a potential high throughput preclinical screen.Eur J Pharmacol 2001，430，(1)，147-8)，[3H]-阿司咪唑 (參見 Chiu，P.J. ； Marcoe, K.F. ； Bounds, S.E. ； Lin, C.H. ； Feng, J.J. ； Lin, A.; Cheng, F.C. ; Crumb, W.J. ； Mitchell, R.，Validation of a[3H]astemizolebinding assay in HEK293 cells expressing HERG K+channels.J Pharmacol Sci 2004, 95， (3)，311-9)，或 [35S]_MK499(參見 Wang, J. ； Delia Penna, K. ； Wang, H. ； Karczewski, J. ； Connolly, T.M. ； Koblan, K.S. ； Bennett, P.B. ； Salata，J.J.，F(xiàn)unctional and pharmacological properties of canine ERG potassium channels.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003，284， (1)，H256-67)的放射配體結(jié)合試驗顯示出對hERG K+通道阻滯的預(yù)測。然而，放射配體的制備、儲存和處理增加了試驗程序的時間和成本。此外，已描述評估化合物與hERG K+通道的結(jié)合的放射試驗為非均質(zhì)過濾結(jié)合試驗，并需要通過使用真空歧管在濾紙上捕 獲放射配體結(jié)合的膜蛋白質(zhì)而分離未結(jié)合的放射配體。該程序使得所述試驗對于大規(guī)模 篩選或常規(guī)化合物評價(profiling)難以自動化，因此限制了其實際用途。此外，在過去 十年內(nèi)，工業(yè)界和學(xué)術(shù)界中均力主開發(fā)非放射方法以取代這種試驗。熒光偏振(FP)試驗提供了完全均質(zhì)的混合讀取形式以表征配體對受體的親合 性，在許多情況中其可用于取代許多放射結(jié)合試驗(參見Burke，T.J. ； Loniello, K.R.； Beebe, J.A. ； Ervin, K.M., Development and application of fluorescence polarization assays in drag discovery.Comb Chem High Throughput Screen 2003, 6, (3), 183-94)。 該技術(shù) 基于化合物從受體置換熒光探針(“示蹤物”)的能力，其通過光學(xué)信號的變化進(jìn)行檢 測。在這種試驗中，示蹤物通常由已知的受體的高親合性配體組成，所述配體化學(xué)已連 接至熒光分子而不顯著干擾受體-配體相互作用的親合性(參見Huang，X.，F(xiàn)luorescence polarizaion competition assay the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J BiomolScreen 2003，8，(1)，34-8)。在 FP 試驗中，當(dāng)示蹤物 分子用平面偏振光激發(fā)時，若在光子激發(fā)和發(fā)射之間的時間過程(通常為納秒)中熒光團(tuán) 保持其取向，則發(fā)射光的偏振得以保持。在溶液中，當(dāng)示蹤物結(jié)合至如蛋白質(zhì)的較大分 子時，由于蛋白質(zhì)-示蹤物絡(luò)合物相比于自由示蹤物本身旋轉(zhuǎn)更緩慢，因此該取向大量 保持。當(dāng)示蹤物通過連接至受體的配體而從受體置換時，來自示蹤物的光發(fā)射相對于激 發(fā)源而被消偏振。常規(guī)放射配體結(jié)合試驗和FP試驗之間的重要實際區(qū)別在于，與放射配體結(jié)合試 驗不同，F(xiàn)P試驗得以優(yōu)化設(shè)置，其使用有限量的示蹤物，以及Kd值或Kd值以上的受體 濃度用于受體-示蹤物相互作用。這是因為所測量的光學(xué)信號取決于來自存在的所有示 蹤物(自由的或結(jié)合的)的信號，這不同于放射配體結(jié)合試驗，在放射配體結(jié)合試驗中 (分離之后)，僅有的測量信號歸因于結(jié)合的配體，而自由配體并不貢獻(xiàn)該信號。因此， 在FP試驗中，任何未結(jié)合的示蹤物貢獻(xiàn)存在的消偏振光的含量，由此減少所測量的偏振 信號，并減小試驗窗口。通常，配置FP試驗使得在不存在競爭配體下總示蹤物的50至 70%得以結(jié)合，從而在試驗窗口(所測得的最大-最小偏振值)與試驗靈敏度(IC5tl值接近 真實 Ki 值的能力)之間取得平衡(參見 Huang, X.，F(xiàn)luorescence polarization competition assay the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J Biomol Screen 2003, 8，(1)，34-8) 0 當(dāng)開發(fā)使用純化的可溶性重組蛋白質(zhì)的 FP試驗時，由于許多這種蛋白質(zhì)易于以足夠用于這種試驗的量制得，因此這通常不是問 題。然而，當(dāng)開發(fā)用于如hERG的膜相關(guān)蛋白質(zhì)(在大部分情況中所述蛋白質(zhì)并未從它們 的膜組分以功能形式純化，其包含不可溶脂質(zhì)組分以及其他蛋白質(zhì))的試驗時，該需要 構(gòu)成了挑戰(zhàn)。此外，大量膜組分的存在會通過散射光(參見Banks，P. ； Gosselin, M.； Prystay，L., Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence polarization assays of G protein-coupled receptors.J Biomol Screen 2000, 5, (5), 329-34)或通過導(dǎo)致增 加的示蹤物(其經(jīng)常含有親脂性熒光團(tuán))與膜本身的非特異性結(jié)合而干擾試驗。因此，迄今為止仍未實現(xiàn)確認(rèn)和表征小分子對hERG K+通道的親合性，并說明 與得自放射配體結(jié)合或膜片鉗試驗的數(shù)據(jù)的密切關(guān)聯(lián)的均質(zhì)FP基試驗的開發(fā)。
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發(fā)明內(nèi)容
為了避免與放射試驗相關(guān)的問題而評估hERG K+通道的結(jié)合，開發(fā)了用于這些 試驗的均質(zhì)FP基替代物。首先使用常規(guī)的放射配體置換試驗確認(rèn)候選的高親合性熒光 示蹤物。然而，由于在初始細(xì)胞系中的hERG K+通道表達(dá)水平(Bmax)不足以配置FP試 驗，發(fā)展了通過使用編碼兩種蛋白質(zhì)的雙順反子表達(dá)載體將細(xì)胞表面標(biāo)志(CD8)的表達(dá) 連接至hERG K+通道的表達(dá)從而增加hERG K+通道表達(dá)水平的策略。該策略允許使用流 式細(xì)胞儀克隆分離高表達(dá)hERG K+通道細(xì)胞系，并能夠發(fā)展FP試驗(包括進(jìn)一步的示蹤 物開發(fā)和試驗優(yōu)化)。所得FP試驗可預(yù)測hERGK+通道結(jié)合，易于使用標(biāo)準(zhǔn)的板讀取器 (plate readers)進(jìn)行，并良好適于取代常規(guī)的放射結(jié)合試驗而用作hERG K+通道傾向性的 化合物的分類方式。本文描述了用于篩選小分子，即測試化合物，以表征它們對hERG K+通道的親 合性，以及它們引起受試者心臟中毒的能力的FP試驗、方法和試劑盒。此外，本文描述 了用于所公開的試驗、方法和試劑盒的具有高的hERG K+通道表達(dá)水平的新型熒光示蹤 化合物和膜制劑的制備方法。本發(fā)明的一個方面提供了一種新型的具有如下結(jié)構(gòu)通式⑴的熒光示蹤化合 物
權(quán)利要求
1. 一種具有如下結(jié)構(gòu)式的熒光示蹤化合物
2.一種用于篩選測試化合物的試驗，其中所述試驗為使用結(jié)合至hERG K+通道或其 片段的源的如權(quán)利要求1所述的熒光示蹤物或其藥物可接受的鹽的結(jié)合試驗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試驗，其中篩選測試化合物提供了該測試化合物延長人類心 電圖的Q-T間期并由此引起人類受試者的心臟中毒或心律失常的傾向的指示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試驗，其包括如下步驟a)在存在或不存在不同含量的測試化合物或測試化合物的混合物下在試驗緩沖液中 培養(yǎng)熒光示蹤物或其鹽以及hERG K+通道或其片段的源；以及b)測量測試化合物或測試化合物的混合物對結(jié)合至hERGK+通道或其片段的熒光示蹤物的含量的影響。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試驗，其中所述試驗緩沖液為含有KC1、MgCl2* PLURONIC F-127 的 HEPES 基緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試驗，其中所述試驗緩沖液包含15mM至50mM的HEPES、 5mM 至 20mM 的 KC1、0.5mM 至 2mM 的 MgCl2,和 0.02 % 至約 0.1 % 的 PLURONIC F-127。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試驗，其中所述試驗緩沖液包含25mM的HEPES、15mM的 KCL ImM 的 MgCl2,禾Π 0.05%的 PLURONIC F—127。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試驗，其中所述試驗緩沖液在室溫下的pH為pH7.2至pH7.6。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試驗，其中所述試驗緩沖液為pH7.4。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試驗，其中測試化合物或測試化合物的混合物的影響通過 熒光偏振測得。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試驗，其中步驟b)包括如下步驟i)測定每個樣品的特定結(jié)合的熒光示蹤物；和ii)計算由測試化合物或測試化合物的混合物所抑制的熒光示蹤物結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試驗，其中hERGK+通道或其片段的源選自i)源自細(xì)胞的膜制劑，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERGK+通道或其片段；ii)細(xì)胞，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERGK+通道或其片段；或iii)源自組織的膜制劑，在所述組織表面上表達(dá)hERGK+通道或其片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試驗，其中hERGK+通道或其片段的源為源自細(xì)胞的膜 制劑，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERG K+通道或其片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗，其中細(xì)胞表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總膜蛋白質(zhì) 的hERG K+通道。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗，其中細(xì)胞表達(dá)hERG電流為約1500pA至約2500pA 的hERG K+通道，所述hERG電流通過使用完全自動化的高通量膜片鉗體系的膜片鉗技 術(shù)測定。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗，其中所述細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試驗，其中所述細(xì)胞用選自如下的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染i)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有與SEQ ID NO 1或其片段至少80%同源的氨基酸序列；或ii)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有SEQ ID NO 1或其片段的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試驗，其中所述核酸進(jìn)一步包含編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點 蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試驗，其中編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點蛋白質(zhì)和CD-8細(xì)胞 質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列連續(xù)位于編碼hERG K+通道的核苷酸序列的下游。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試驗，其中hERGK+通道的表達(dá)通過編碼內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
21.一種表征測試化合物作為hERG K+通道阻滯劑的活度的方法，所述方法包括如下 步驟a)在權(quán)利要求1的熒光示蹤物或其藥物可接受的鹽的存在下，在試驗緩沖液中將測 試化合物與含有hERG K+通道的膜制劑接觸，所述hERG K+通道具有SEQ IDNO 1的 氨基酸序列，所述膜制劑源自用包含編碼hERG K+通道的核苷酸序列的核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞；b)監(jiān)測測試化合物是否影響熒光體示蹤物與含有hERGK+通道的膜制劑的結(jié)合；以及C)測定測試化合物的hERG K+通道阻滯劑活度。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中細(xì)胞表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總膜蛋白質(zhì) 的hERG K+通道。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中細(xì)胞表達(dá)hERG電流為約1500pA至約2500pA 的hERG K+通道，所述hERG電流通過使用完全自動化的高通量膜片鉗體系的膜片鉗技 術(shù)測定。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述核酸表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點蛋白質(zhì)和CD-8細(xì)胞 質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列連續(xù)位于編碼hERG K+通道的核苷酸序列的下游。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述核酸表達(dá)載體具有SEQID NO 2的核苷 酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中hERGK+通道的表達(dá)通過編碼內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述試驗緩沖液包含25mM的HEPES、15mM 的 KC1、ImM 的 MgCl2,禾Π 0.05% 的 PLURONIC F—127。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述試驗緩沖液在室溫下的ρΗ為ρΗ7.2至ρΗ7.6。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述試驗緩沖液為ρΗ7.4。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中監(jiān)測測試化合物是否影響熒光體示蹤物與含有 hERG K+通道的膜制劑的結(jié)合通過熒光偏振進(jìn)行測量。
33.一種用于篩選測試化合物的試劑盒，所述試劑盒包含a)權(quán)利要求1所述的熒光示蹤物或其藥物可接受的鹽；b)hERG K+通道或其片段的源；和c)試驗緩沖液。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述hERGK+通道或其片段的源為源自細(xì) 胞的膜制劑，在所述細(xì)胞表面上表達(dá)hERG K+通道或其片段。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中細(xì)胞表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總膜蛋白 質(zhì)的hERG K+通道。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中細(xì)胞表達(dá)hERG電流為約1500pA至約2500pA的hERG K+通道，所述hERG電流通過使用完全自動化的高通量膜片鉗體系的膜 片鉗技術(shù)測定。
37.根據(jù)扒利要求34所述的試劑盒，其中所述細(xì)胞為HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述細(xì)胞用具有SEQID NO 2的核苷酸序 列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中hERGK+通道的表達(dá)通過編碼內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
40.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述試驗緩沖液包含25mM的HEPES、 15mM 的 KC1、ImM 的 MgCl2,禾Π 0.05% 的 PLURONIC F-127。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑盒，其中所述試驗緩沖液在室溫下的ρΗ為ρΗ7.2至 ρΗ7.6。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述試驗緩沖液為ρΗ7.4。
43.一種hERG K+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群表達(dá)至少約100皮摩爾/毫克總 膜蛋白質(zhì)的hERG K+通道。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞表達(dá)hERG電 流為約1500pA至約2500pA的hERG K+通道，所述hERG電流通過使用完全自動化的高 通量膜片鉗體系的膜片鉗技術(shù)測定。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞為HEK 293細(xì) 胞或CHO細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞用選自如下的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染i)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有與SEQ ID NO 1或其片段至少80%同源的氨基酸序列；或ii)包含編碼hERGK+通道的核苷酸序列的分離并純化的核酸，所述hERG K+通道具 有SEQ ID NO 1或其片段的氨基酸序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中所述核酸進(jìn)一步包含編 碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點蛋白質(zhì)和CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的核苷酸序列連續(xù)位于編碼hERG K+通道的核苷酸序列 的下游。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的hERGK+通道表達(dá)細(xì)胞群，其中hERG K+通道的表達(dá)通 過編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點蛋白質(zhì)的核苷酸序列而連接至CD-8細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。
50.一種制備具有結(jié)構(gòu)式⑴的熒光示蹤化合物的方法，
全文摘要
本發(fā)明公開了用于篩選測試化合物引起受試者心臟中毒的能力的試驗、方法和試劑盒。特別地，本發(fā)明公開了測試化合物是否具有延長Q-T間期的效果，所述Q-T間期由人類心電圖測得。本文公開的試驗、方法和試劑盒利用新型熒光示蹤物與hERG K+通道之間的結(jié)合相互作用，以及測試化合物影響所述結(jié)合相互作用的傾向。
文檔編號G01N33/58GK102016590SQ200980114211
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者D·派珀, K·沃格爾, M·S·謝卡哈尼, S·赫斯, S·達(dá)夫, T·利韋利, Z·鐘 申請人:生命技術(shù)公司