慢性心力衰竭相關(guān)的血清miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及多種內(nèi)源性的非編碼小RNA的新醫(yī)藥用途，更具體地說設(shè)及8種 microRNAs在慢性屯、力衰竭疾病的診斷和預(yù)后評(píng)估中的用途，屬于屯、血管疾病的診斷、預(yù)防 和治療領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性屯、力衰竭是不同的屯、血管疾病發(fā)展到終末階段的臨床綜合征，主要病理生理 特點(diǎn)為屯、室充盈和射血能力受損，最后導(dǎo)致屯、室累血功能低下，其預(yù)后不良，死亡率高，是 威脅人類健康和導(dǎo)致醫(yī)療負(fù)擔(dān)增加的最主要病因之一，對(duì)于人口老齡化日益加重的中國來 說尤為重要。到目前為止，W利尿劑、ACEI和0受體阻滯劑為基礎(chǔ)的治療藥物組合對(duì)部分 患者無效或效果不理想，新的治療措施亟待發(fā)掘；另一方面，慢性屯、力衰竭的危險(xiǎn)因素并未 完全闡明，因此需要尋找新的危險(xiǎn)因素和采用更加有效的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的在多種生物進(jìn)程中具有重要調(diào)控作 用的非編碼RNA，是來源于內(nèi)源性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本的長度大約為22個(gè)核巧酸的單鏈RNAs。 通常miRNA作為引導(dǎo)分子，與祀mRNA的3'UTR堿基互補(bǔ)結(jié)合，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。大多 數(shù)情況下，miRNA與祀mRNA結(jié)合后將抑制蛋白質(zhì)翻譯并激活核酸外切酶降解mRNA，若miRNA 與祀mRNA高度互補(bǔ)結(jié)合則可激活核酸內(nèi)切酶活性。在復(fù)雜的病理生理過程中，miRNA或 miRNAs簇協(xié)同參與多級(jí)調(diào)控是miRNA重要的生物學(xué)特征之一；也是針對(duì)miRNA的應(yīng)用治療 的理論基礎(chǔ)之一。與傳統(tǒng)的單祀點(diǎn)藥物治療相比，miRNA治療可W在單個(gè)核巧酸分子祀點(diǎn) 治療的情況下，從多個(gè)水平調(diào)控疾病病理生理狀態(tài)，達(dá)到更有效的治療效果。
[0004] 已有研究表明miRNAs可被細(xì)胞分泌至外周血循環(huán)，并穩(wěn)定存在，可作為各類疾病 的新的診斷標(biāo)志物。且RNA干擾技術(shù)作為具有突破性臨床應(yīng)用前景的生物技術(shù)，從出現(xiàn)開 始的短短數(shù)年間就有多個(gè)產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)，獲得了巨大的成功。但是否存在一類miRNAs 在慢性屯、力衰竭診斷和預(yù)后評(píng)估中具有生物標(biāo)志物作用，通過檢測(cè)該類miRNA能為慢性屯、 力衰竭診斷和預(yù)后提供新的策略仍是對(duì)該領(lǐng)域科研人員的挑戰(zhàn)。有研究者對(duì)慢性屯、力衰 竭患者外周血miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行過篩查（Circulation. 2014 ; 129巧）：1009-21 ;Proc化tl AcadSciUSA. 2014:111(30): 11151-6)，也有研究者對(duì)慢性屯、力衰竭患者治療前后外周 血miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行過檢測(cè)巧urJHeart化il. 2013:15(11): 1277-88)，但沒有對(duì)相同 患者屯、肌組織和外周血的miRNAs同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和比較，且缺乏相應(yīng)的流行病學(xué)隨訪研究。 本發(fā)明中，申請(qǐng)人原創(chuàng)性的對(duì)相同患者屯、肌組織和外周血的miRNAs同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和比較， 并對(duì)部分患者的病情發(fā)展進(jìn)行了流行病學(xué)隨訪研究。確定了外周血miRNAs表達(dá)譜作為慢 性屯、力衰竭疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有理論和技術(shù)的不足，確定在慢性屯、力衰竭 中起診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物作用的外周血miRNAs。
[0006] 本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不僅獲得了可w作為生物標(biāo)志物用于診斷慢性屯、 力衰竭患者外周血miRNAs表達(dá)譜，還獲得了慢性屯、力衰竭患者屯、肌miRNAs表達(dá)譜。同時(shí)， 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)同一慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs表達(dá)譜與其屯、肌中的miRNAs表達(dá)譜并 不完全一致，提示單純比較正常人和患者外周血miRNAs將得到非特異性生物標(biāo)志物。另一 方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)部分外周血miRNAs，例如hsa-miR-665或hsa-miR-660-化，與慢性屯、力 衰竭患者屯、功能呈顯著相關(guān)性，不僅可用于診斷，還可作為生物標(biāo)志物用于提示預(yù)后。
[0007] 具體的，本發(fā)明提供一種可用于診斷慢性屯、力衰竭患者的miRNAs生物標(biāo)志物。 [000引優(yōu)選的，所述外周血miRNAs生物標(biāo)志物為hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、 hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a_3p和 / 或 hsa-miR-330-化，其序列結(jié)構(gòu)分別如SEQ ID No. 1-8所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種可用于評(píng)估慢性屯、力衰竭預(yù)后的外周血miRNAs生物標(biāo)志物。
[0010] 優(yōu)選的，所述miRNAs生物標(biāo)志物為miR-1285-3p、hsa-miR-665和/或 hsa-miR-660-化，其序列結(jié)構(gòu)如SEQ ID No. 2、3和4所示。
[0011] 本發(fā)明還提供一種上述miRNAs生物標(biāo)志物用于評(píng)估慢性屯、力衰竭預(yù)后的用途。
[0012] 本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)上述miRNAs序列的試劑，其中，所述序列包括SEQID No. 1，2,3,4,5,6,7 和 / 或8。
[0013] 優(yōu)選的，所述miRNAs序列為SEQIDNo. 2、3和/或4。
[0014] 優(yōu)選的，所述的試劑為所述miRNAs序列的逆轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物。
[0015] 更優(yōu)選的，所述引物根據(jù)下列引物設(shè)計(jì)原則獲得；1)基于莖凸環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的的特 異性逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA3'端序列結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行針對(duì)特定miRNA的特異性 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；2)基于逆轉(zhuǎn)錄引物序列設(shè)計(jì)的特異性正向PCR引物、通用反向引物。
[0016] 本發(fā)明還提供一種上述試劑在制備診斷或者評(píng)估慢性屯、力衰竭患者預(yù)后的試劑 盒中的用途。
[0017] 優(yōu)選的，所述的慢性屯、力衰竭包括先天性屯、臟病、冠屯、病、急性屯、肌梗死、風(fēng)屯、病、 高血壓、屯、律失常、各種病因?qū)е碌耐汀⒓⊙?、屯、肌病等病因?qū)е碌穆酝?、力衰竭?br>[001引本發(fā)明還提供一種診斷或者評(píng)估慢性屯、力衰竭患者預(yù)后的試劑盒，其特征在于， 其中，所述試劑盒包括上述任一所述的試劑。
[0019] 優(yōu)選的，所述的慢性屯、力衰竭包括先天性屯、臟病、冠屯、病、急性屯、肌梗死、風(fēng)屯、病、 高血壓、屯、律失常、各種病因?qū)е碌耐?、肌炎、屯、肌病等病因?qū)е碌穆酝?、力衰竭?br>【附圖說明】
[0020] 圖1.慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs巧片表達(dá)譜及屯、肌miRNAs巧片表達(dá)譜分 析；圖1A為屯、肌組織miRNAs巧片表達(dá)譜散點(diǎn)圖；圖1B為外周血miRNAs巧片表達(dá)譜散點(diǎn) 圖；圖1C為屯、肌組織miRNAs巧片表達(dá)譜火山圖；圖1D為外周血miRNAs巧片表達(dá)譜火山 圖。
[0021] 圖2.外周血miRNAs巧片表達(dá)譜與屯、肌組織miRNAs巧片表達(dá)譜比較結(jié)果；圖2A 為屯、力衰竭時(shí)屯、肌組織巧片中均表達(dá)升高的miRNAs的變化值，及其在外周血巧片中的表 達(dá)改變情況；圖2B為屯、力衰竭時(shí)屯、肌組織巧片中均表達(dá)下降的miRNAs的變化值，及其在外 周血巧片中的表達(dá)改變情況。
[002引圖3.采用Real-time PCR法驗(yàn)證巧片篩查結(jié)果，其中為八種微小RNA(microRNA，miRNA)在慢性屯、力衰竭和正常對(duì)照人群血漿中的相對(duì)水平（*表示與對(duì)照 組相比，p<0. 05 ;**表示與對(duì)照組相比，p<0. 01)。
[002引圖4.8種miRNAs診斷慢性屯、力衰竭的靈敏度。圖4A為ROC值，血漿miRNAs診 斷慢性屯、力衰竭的靈敏度；圖4B為與超聲檢測(cè)屯、功能比較的結(jié)果，血漿miRNAs含量與屯、臟 超聲射血分?jǐn)?shù)相關(guān)性。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但該些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但該些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0025] 實(shí)施例1.慢性屯、力衰竭患者外周血及屯、肌組織miRNAs篩查結(jié)果
[0026] 1.收集10例慢性屯、力衰竭（取自2007-2014年在屯、血管內(nèi)科住院患者，每個(gè) 病例均由兩個(gè)或W上臨床醫(yī)師確診分類）及10例正常對(duì)照者外周血樣本。取材后，室 溫3, 50化pm離屯、6min，取上層血漿，保存于-80 °C冰箱。每0. 25ml外周血血漿中加入 1mlTRIZOLLS(Invitrogen公司），提取RNA，RNaseyMiniKit(Qiagen)處理樣品。使用 Nanodrop?ND-1000 檢測(cè)RNA質(zhì)量。miRCURY?ArrayPower1 油elingkit巧xqion)標(biāo) 記后，在雜交工作站進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner掃描獲得 巧片圖像。GenePixproV6.0軟件分析獲得數(shù)據(jù)，利用microarray技術(shù)高通量篩選出在 中差異性表達(dá)的miRNA譜。該巧片檢測(cè)miRNAs共3100種，篩選出差異性表達(dá)miRNAs599 個(gè)，其中347個(gè)miRNAs在屯、力衰竭患者外周血中表達(dá)升高，252個(gè)miRNAs在屯、力衰竭患者 外周血中表達(dá)下降。
[0027] 2.收集1中慢性屯、力衰竭患者（取自2007-2014年在屯、血管內(nèi)科住院患者，每個(gè) 病例均由兩個(gè)或W上臨床醫(yī)師確診分類）的屯、肌組織，及10例正常對(duì)照者外周血樣本。取 材后，室溫3, 50化pm離屯、6min，取上層血漿，保存于-80 °C冰箱。每0. 25ml外周血血漿中 加入 1mlTRIZOL(Invitrogen公司），提取RNA，RNaseyMiniKit(Qiagen)處理樣品。使 用Nanodrop?ND-1000 檢測(cè)RNA質(zhì)量。miRCURY?ArrayPower1 油elingkit(Exqion) 標(biāo)記后，在雜交工作站進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner掃描獲得 巧片圖像。GenePixproV6.0軟件分析獲得數(shù)據(jù)，利用microarray技術(shù)高通量篩選出在中 差異性表達(dá)的miRNA譜。該巧片檢測(cè)miRNAs共3100種，篩選出差異性表達(dá)miRNAs74個(gè)， 其中51個(gè)miRNAs在屯、力衰竭患者屯、肌組織中表達(dá)升高，23個(gè)miRNAs在屯、力衰竭患者屯、肌 組織中表達(dá)下降。
[002引結(jié)果表明慢性屯、力衰竭時(shí)屯、肌組織中miRNAs表達(dá)發(fā)生改變。
[0029] 實(shí)施例2.慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs巧片表達(dá)譜及屯、肌miRNAs巧片表達(dá) 譜分析
[0030] 采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)獲得的巧片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。
[0031] 1.散點(diǎn)圖反應(yīng)了巧片間或者組間的重復(fù)性，重復(fù)性越好越靠近對(duì)角線。另外使用 化arson相關(guān)系數(shù)衡量重復(fù)性，相關(guān)系數(shù)越接近1重復(fù)性越好。圖1A和1B結(jié)果表明；巧片 完成質(zhì)量可靠，重復(fù)性好。
[0032] 2.組間比較的情況見圖1C和1D。W-log(Pvalue)為縱坐標(biāo)，1〇肖2(化1(1change) 為橫坐標(biāo)對(duì)每一個(gè)miRNA作圖，可W直觀地看到顯著性差異的miRNAs(灰色點(diǎn)代表通過 Foldchange和P-value篩選的miRNAs)。圖1C和1D結(jié)果表明；miRNAs可作為一類慢性 屯、力衰竭診斷的候選生物標(biāo)志物。
[0033] 實(shí)施例3.外周血miRNAs表達(dá)譜與屯、肌組織miRNAs表達(dá)譜比較結(jié)果
[0034] 將外周血巧片和屯、肌組織巧片篩查獲得的差異性表達(dá)的作為慢性屯、力衰竭診 斷的候選生物標(biāo)志物的所有miRNAs的變化趨勢(shì)進(jìn)行分類。結(jié)果表明