專利名稱：一種新型抗腫瘤amiRNA序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種新型抗腫瘤amiRNA序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段重復(fù)的DNA序列5’-GGTTAG_3’，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”結(jié)構(gòu)，維持著染色體和基因組的完整性與穩(wěn)定性(Rlackburn，E. H. Nature, 350, 569-573 ;1991·)。在正常體細(xì)胞中，細(xì)胞每分裂一次，由于DNA復(fù)制時(shí)的“岡崎片段”效應(yīng)，端粒就縮短一點(diǎn)。一旦端粒消耗殆盡，染色體則易于突變而導(dǎo)致凋亡或其它癌變。因此，端粒和細(xì)胞 老化有明顯的關(guān)系。其長(zhǎng)度反映著細(xì)胞復(fù)制史及復(fù)制潛能，被稱作細(xì)胞壽命的“有絲分裂鐘” (Kim Sh, S. H.，et al. Oncogene 21,503-511 ；2002.)。當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，某些細(xì)胞為了逃避短端粒帶來的凋亡效應(yīng)，只有突變產(chǎn)生相應(yīng)的“端粒維持機(jī)制”。通過“端粒維持機(jī)制”，這些細(xì)胞進(jìn)行瘋狂的増殖和復(fù)制，慢慢走向癌化的道路。目前已經(jīng)報(bào)道的“端粒維持機(jī)制”除少數(shù)是‘非端粒酶依賴型’的外，絕大部分都是‘端粒酶依賴型’的，簡(jiǎn)單的說就是通過表達(dá)端粒酶來實(shí)現(xiàn)端粒的延伸或維持((Shayand Roninson,2004)ο端粒酶(Telomerase),在細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒的延長(zhǎng)的ー種酶,是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端。簡(jiǎn)單來說，端粒酶是RNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合體，如人的端粒酶分別由起模板作用的端粒酶RNA(hTR)、起組裝作用的端粒酶結(jié)合蛋白(hTPl)和起催化作用的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)組成(01ovnikov，1971)。越來越多的研究表明，在哺乳動(dòng)物中，各細(xì)胞中hTR的表達(dá)是普遍的，特異性不強(qiáng)；而hTERT則呈現(xiàn)與端粒酶活性極強(qiáng)的正相關(guān)性，是端粒酶活性的限速成份(Meyerson et al. , 1997)。實(shí)驗(yàn)表明，約85% -90%的腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)端粒酶活性顯著升高，而正常的成體細(xì)胞則顯示低活性，因而端粒酶作為腫瘤治療的最理想靶點(diǎn)早已是ー個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)(Hahnet al.，1999)。近年來通過調(diào)節(jié)端粒酶活性來干預(yù)腫瘤的研究日益增多，同時(shí)也取得了很好的效果，但主要局限在寡核苷酸和疫苗的臨床研究方面(Brunsvig et al. ,2006;Gandellini et al. , 2007)。杰隆(Geron)的GRN163L是此類藥物開發(fā)中最前沿的一個(gè)候選藥物，早在2005年，F(xiàn)DA同意GRN163L在患慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的臨床實(shí)驗(yàn)。2007年，Geron公司開始GRN163L單獨(dú)治療多發(fā)性骨髓瘤的I期臨床試驗(yàn)。2008年開始了 GRN163L治療乳腺癌的I期臨床實(shí)驗(yàn)。同年12月，Geron發(fā)布了有關(guān)GRN163L治療再發(fā)的和難治的多發(fā)性骨髓瘤的暫時(shí)性臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)。2009年,Greron又發(fā)布了 Geronl63L對(duì)腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，包括非小型細(xì)胞肺癌、乳癌、胰臟炎、前列腺癌、小兒科神經(jīng)腫瘤。數(shù)據(jù)顯示，在以Geix)nl63L治療后，人類乳癌細(xì)胞MCF7的假定干細(xì)胞數(shù)量與自我再生的能力大幅減弱。目前Geronl63L正處于臨床II期試驗(yàn)中同樣令人振奮的是KAEL-GemVax公司的抗端粒酶疫苗GVlOOl業(yè)已進(jìn)入臨床III期。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指ー種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA吋，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默(C，NapoliCet al.，Plant Cell. 2 :279-289 ；1990)。RNAi現(xiàn)象是生物體中非常普遍的ー種基因調(diào)節(jié)行為，按其引發(fā)源分可以劃分為內(nèi)源性的微RNA(microRNA，miRNA)干擾和外源性的小RNA(small RNA, siRNA)干擾現(xiàn)象(Jinek and Doudna, 2009) amiRNA是一種內(nèi)源性、20_25bp長(zhǎng)的雙鏈RNA，通過與目的基因的部分(極少是完全)互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用，在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段從未停止工作過。在人體中，高達(dá)30%的基因受到miRNA的調(diào)控作用(Bartel，2004)。如果單純從片段長(zhǎng)度上進(jìn)行推算的話，理論上人體基因組應(yīng)該存在42°_25種符合miRNA長(zhǎng)度的微RNA片段，但到目前為止在人類中卻只發(fā)現(xiàn)1424 種 miRNA,且沒有一種已知 miRNA 是直接革巴向 hTERT 的(miRBase Release 17 April,27，2011)。因此，若能根據(jù)miRNA形成原理來設(shè)計(jì)更多靶向作用的人工miRNA (artificialmiRNA, amiRNA)，我們將有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶依賴的腫瘤RNAi治療的新突破。因?yàn)槟壳皩?duì)端粒酶依賴的腫瘤RNAi治療方面，由于沒有找到ー種直接靶向hTERT的miRNA及siRNA的脫靶效應(yīng)及毒副作用使得miRNA和siRNA途 徑都黯然失色。這就迫使我們將注意力轉(zhuǎn)向新的RNAi方向(即amiRNA)，實(shí)驗(yàn)表明，針對(duì)于相同的靶點(diǎn)，amiRNA融合了單純miRNA和siRNA的優(yōu)點(diǎn)。首先，由于amiRNA設(shè)計(jì)時(shí)采用了 miRNA的原則，具有miRNA的內(nèi)源性優(yōu)勢(shì)，具有比siRNA更高的表達(dá)、包裝和基因沉默效率，并且能很好的規(guī)避siRNA帶來的干擾素效應(yīng)這ー大難題；其次，同樣由于amiRNA設(shè)計(jì)時(shí)兼顧了 siRNA的完全配對(duì)原則，必然導(dǎo)致amiRNA比常規(guī)miRNA具有更強(qiáng)的靶向性和基因沉默作用，同時(shí)也降低了難以控制的多靶、脫靶效應(yīng)(Zeng et al.，2002)。盡管siRNA和miRNA技術(shù)都已經(jīng)非常成熟，也取得了一定的成果，但其干擾效果、特異性和副作用(如脫靶、干擾素效應(yīng))卻始終不容樂觀(Gandellini et al.，2007)。然而，被寄予厚望的amiRNA卻只剛剛開始，目前雖有少數(shù)有關(guān)利用amiRNA來調(diào)控靶基因表達(dá)的成功案例，但卻尚未有利用amiRNA靶向hTERT來實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的高效、低毒治療的報(bào)道(Dickins et al.，2005)。因此，尋找和篩選ー些高效、專ー的靶向人端粒酶hTERT基因的amiRNA序列將成為腫瘤RNAi療法的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種新型抗腫瘤amiRNA序列及其應(yīng)用，本發(fā)明的端粒酶hTERT本身是腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記之一，本發(fā)明涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、増殖和遷移，同時(shí)使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)而促進(jìn)其凋亡。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是根據(jù)miRNA和siRNA形成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)了多條可能靶向hTERT的amiRNA-hTERT序列，通過實(shí)驗(yàn)篩選出高效抑制hTERT的amiRNA-hTERT的3條序列，該序列為下述序列中的任意一條或一條以上amiRNA-hTERT I (amiRl):正義鏈 5，-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3，；反義鏈 5，-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3 ’ ；amiRNA-hTERT2 (amiR2):正義鏈 5’ -CAGAGCCACTCACCTTCAA-3 ’ ；反義鏈 5’ -TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’ ；amiRNA-hTERT3 (amiR3):正義鏈 5’ -CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3 ’ ；
反義鏈 5 ’ -TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3 ’。所述的序列中，優(yōu)選對(duì)hTERT沉默效率最好的amiRNA為amiRNA-hTERT3 (amiR3):正義鏈 5’ -CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3 ’ ；反義鏈 5，-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3，。本發(fā)明所提供的amiRNA由正義鏈和反義鏈組成，amiRNA-hTERT I, amiRNA-hTERT2的正義鏈模擬了常規(guī)siRNA，長(zhǎng)度為19個(gè)核苷酸；它的反義鏈則模擬了常規(guī)miRNA，長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸；amiRNA-hTERT3則是將amiRNA_hTERT2的正義鏈改造成完全跟其反義鏈互補(bǔ)配對(duì)。
本發(fā)明所提供的3對(duì)amiRNA經(jīng)Realtime PCR驗(yàn)證可以顯著降低hTERT的mRNA表達(dá)，經(jīng)Western blot方法證明可以明顯降低hTERT的蛋白表達(dá)水平，在酶活性方面，Telo-TRAP和ElISA方法同時(shí)驗(yàn)證了 3對(duì)amiRNA都能明顯抑制hTERT的活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)hTERT在轉(zhuǎn)錄本、蛋白和酶活多個(gè)層面抑制作用。并在體外細(xì)胞系列實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了設(shè)計(jì)并合成的3對(duì)amiRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、増殖、遷移的特異性抑制作用和促進(jìn)凋亡效果，而對(duì)正常細(xì)胞沒有顯著作用。并且能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成，為將來腫瘤治療中抑制腫瘤周邊血管形成提供了可能。動(dòng)物水平的裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了合成的3對(duì)amiRNA能抑制移植瘤的形成和生長(zhǎng)。整體效果來說，設(shè)計(jì)并合成的3對(duì)amiRNA中，其中以amiRNA-hTERT 3效果最佳。ー種新型抗腫瘤amiRNA序列在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的amiRNA序列可用于制備與hTERT基因相關(guān)疾病的治療藥物，如抗腫瘤藥物。該amiRNA序列可以通過化學(xué)合成以化學(xué)藥物用于腫瘤的預(yù)防和治療，也可以經(jīng)過包裝(如質(zhì)?；虿《绢愝d體)最后以基因藥物形式用于腫瘤的預(yù)防和治療中。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的端粒酶hTERT本身是腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記之一，本發(fā)明涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和遷移，同時(shí)使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)而促進(jìn)其凋亡；在有效濃度方面，本發(fā)明中的amiRNA-hTERT 3只需I. 56nM的濃度就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela的81 %的生長(zhǎng)抑制作用，比以往報(bào)道的靶向hTERT的siRNA(約50-100nM)等效作用濃度降低近2個(gè)數(shù)量級(jí)；在RNAi治療的副作用方面，本發(fā)明中的3對(duì)amiRNA都沒有檢測(cè)到明顯的干擾素效應(yīng)和脫靶效應(yīng)。


圖I是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446，Hela, U2-0S，Huvec轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定。1-1為Cy3標(biāo)記的amiRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞后熒光、白光及擬合圖片；1_2為根據(jù)熒光細(xì)胞所占比例計(jì)算所得的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果；圖2是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI_H446hTERT mRNA表達(dá)水平的抑制效果；圖3是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI_H446hTERT蛋白表達(dá)水平的抑制效果；其中3_1是hTERT蛋白的Western blot圖譜；3_2為根據(jù)蛋白條帶顯色亮度計(jì)算所得的蛋白表達(dá)效率；圖4是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446細(xì)胞hTERT酶活的抑制效果；其中4_1為TRAP法檢測(cè)hTERT酶活的電泳圖譜；4-2為3-2為以NC為參照，根據(jù)條帶顯色亮度計(jì)算所得的相對(duì)總體酶活；圖5 是本發(fā)明 amiRNA 對(duì) Hela，NCI-H446，U2-0S，Huvec 的增殖影響及amiRNA-hTERT 3對(duì)Hela細(xì)胞增殖影響的量效曲線；其中5_1為MTT法測(cè)定amiRNA對(duì)Hela，NCI-H446, U2-0S, Huvec的增殖影響的結(jié)果；5_2為amiRNA-hTERT 3對(duì)Hela細(xì)胞增殖影響的量效曲線；圖6是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446，Hela, U2-0S，Huvec細(xì)胞遷移能力的影響；其中6-1為劃痕法測(cè)定細(xì)胞遷移能力的細(xì)胞圖譜；6-2為根據(jù)劃痕愈合率計(jì)算得到的細(xì)胞遷移能力結(jié)果；圖7是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H4 46，Huvec細(xì)胞侵襲能力的影響；其中7_1為transwell法測(cè)定細(xì)胞侵襲能力的細(xì)胞圖譜；7_2為根據(jù)通過小室的細(xì)胞量計(jì)算得到的細(xì)胞侵襲能力結(jié)果；圖8是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446單細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力的影響；其中8_1為細(xì)胞在軟瓊脂上形成的細(xì)胞克隆圖譜；8_2為根據(jù)有效克隆的總體積計(jì)算得到的細(xì)胞克隆形成能力結(jié)果；圖9是本發(fā)明amiRNA對(duì)Huvec小管形成能力的影響；其中9_1為細(xì)胞在ECM膠上形成的小管的細(xì)胞圖譜；9_2為根據(jù)有效小管結(jié)點(diǎn)量計(jì)算得到的細(xì)胞小管形成能力結(jié)果；圖10是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446，Hela, Huvec, U2-0S細(xì)胞凋亡的影響；其中10-1為用PI單染細(xì)胞后做的流式圖譜；10-2為根據(jù)細(xì)胞流式儀顯示的凋亡率得到的細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖11是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446細(xì)胞干擾素通路相關(guān)基因IFN-beta，OASl，STATl的影響；圖12是本發(fā)明pAM-CAG-EGFP載體圖譜及amiRNA對(duì)靶點(diǎn)基因的沉默效果；其中
12-1為靶點(diǎn)沉默實(shí)驗(yàn)中所用的pAM-CAG-EGFP載體圖譜；12_2為細(xì)胞轉(zhuǎn)染含靶點(diǎn)質(zhì)粒的amiRNA后的熒光表達(dá)變化；12_3為根據(jù)熒光表達(dá)效率所得的沉默效果統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖13是本發(fā)明amiRNA對(duì)NCI-H446細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤性及凋亡的影響；其中
13-1為裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中裸鼠及其移植瘤的圖譜；13-2為根據(jù)腫瘤體積計(jì)算所得的腫瘤生長(zhǎng)曲線；13-3為腫瘤的免疫組化圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IamiRNA-hTERT 的設(shè)計(jì)與合成。從GenBank中查得人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT的cDNA序列號(hào)(NM_198253)，結(jié)合目前常用的siRNA, miRNA mimics設(shè)計(jì)原理及天然miRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)綜合進(jìn)行amiRNA設(shè)計(jì)①先用siRNA法則進(jìn)行定位,再將預(yù)選的作用位點(diǎn)演變成miRNA mimics形式,最后根據(jù)天然miRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到待選amiRNA ;②分別選擇靶基因hTERT序列的翻譯區(qū)(ORF)和3’非翻譯區(qū)(3’ -UTR)為靶區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)；(DGC的百分比含量控制在35% -55% ;④評(píng)估等級(jí)設(shè)為最高級(jí)的5星BLAST驗(yàn)證序列的特異性。結(jié)果得到2條 amiRNA (amiRNA-hTERT I, amiRNA-hTERT 2)，同時(shí)對(duì) amiRNA-hTERT 2 進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到amiRNA-hTERT 3，見表I (只列舉最后驗(yàn)證有效的3條)。如表I所示，表I為設(shè)計(jì)的amiRNA-hTERT的三條有效引物序列設(shè)計(jì)所得3條amiRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為合成，合成時(shí)采用以下原則①進(jìn)行G，C堿基的2’ Ome修飾在各鏈的3’末端人為添加2個(gè)胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸dTdT ;③產(chǎn)品經(jīng)PAGE純化驗(yàn)證。陰性對(duì)照(NC)同時(shí)也購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。實(shí)施例2體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)amiRNA-hTERT的抗腫瘤效果。I.細(xì)胞培養(yǎng)及amiRNA-hTERT轉(zhuǎn)染效率的 測(cè)定本實(shí)施例根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康尼槍?duì)性的選擇了 4株細(xì)胞(均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，分別為端粒酶低表達(dá)的正常細(xì)胞(HUVEC)、端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞(U2-0S)和端粒酶高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(Hela和NCI-H446)。所有細(xì)胞均在含有10%胎牛血清(Gibico公司)、100U/ml氨芐青霉素和100ug/ml 硫酸鏈霉素(Sigma 公司)的 RPMI1640 培養(yǎng)基(Invitrogen 公司)中，37°C、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境條件下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞以4000個(gè)/孔的量接種于96孔板中。amiRNA-hTERT的轉(zhuǎn)染完全按照Invitrogen的Lipo2000 (Invitrogen公司)方案進(jìn)行，amiRNA的轉(zhuǎn)染濃度為50nM，使用Silencer siRNALabeling Kit轉(zhuǎn)染檢測(cè)試劑盒(Ambion公司)。即先將待轉(zhuǎn)染的amiRNA進(jìn)行熒光染料Cy3標(biāo)記，amiRNA的轉(zhuǎn)染濃度為50nM，轉(zhuǎn)染后6h用PBS洗去殘余標(biāo)記物，接著進(jìn)行熒光觀察(Nikon Ti-U, Japan)及軟件分析(NIS-Elements software, Nikon)。具體操作完全按照 Lipo2000 和Silencer siRNALabeling Kit廠家提供的使用說明進(jìn)行，并且全部操作均在避光條件下進(jìn)行。結(jié)果表明amiRNA-hTERT能對(duì)所選細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，分別為NCI-H446 (93. 4 % )、Hela (95. I % )、U2-0S (95. 2% ), HUVEC(96. 5% ),結(jié)果見圖 I 所示。2.分析 amiRNA-hTERT 對(duì) hTERT 的沉默效果為了充分評(píng)價(jià)amiRNA-hTERT對(duì)hTERT的沉默效果，我們將從hTERT發(fā)揮作用的不同層面(轉(zhuǎn)錄本、蛋白和酶活)進(jìn)行測(cè)定。(I)qPCR分析hTERT mRNA的變化。NCI-H446和Hela細(xì)胞在各自轉(zhuǎn)染 amiRNA-hTERT 1， amiRNA-hTERT 2， amiRNA-hTERT 3 和 NC 后 24h，用 TrizolReagent (Invitrogen公司)按其說明書進(jìn)行總RNA提取(由此開始在冰上進(jìn)行操作)，接著用Bio Mate儀器(Thermo，USA)測(cè)定RNA純度和濃度，立刻進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(相關(guān)試劑購(gòu)自 Zoman 公司)加入 5xRT 緩沖液 IOul，dNTP (2. 5mM) 4ul, Rnasin (40U/ul) Iul，RTase (200u/ul) lul, 01igol8 (50uM) 0. lul, RNA 2ug，補(bǔ)充 ddH20 到 50ul，充分混勻后 42°C孵育60min。完成反轉(zhuǎn)錄之后用RealtimePCR(ABI，USA)對(duì)hTERT表達(dá)水平進(jìn)行定量，內(nèi)參為GAPDH。操作按Zoman的“ 2x SYBR Green qPCR kit”方案進(jìn)行，即模板2ul，上、下游引物(IOuM) lul，2xMix 10ul，補(bǔ)充 ddH20 到 20ul。擴(kuò)增條件為95°C 4min — (94°C 45s,60°C 45s, 72°C 45s) 40cycle — meltcurve。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3對(duì)amiRNA能明顯下調(diào)端粒酶陽性的兩種細(xì)胞(NCI-H446和Hela) hTERT的表達(dá)。以NCI-H446為例(如圖2所示)，相對(duì)于NC來說，amiRNA-hTERT I降低了 72 % 的 hTERT 表達(dá)，amiRNA-hTERT 2 為 89 %，而 amiRNA-hTERT 3 達(dá)到 99 %，初步認(rèn)定amiRNA-hTERT 3在抑制hTERT表達(dá)時(shí)最為有效。
(2) SDS-PAGE 和 Western Blot 分析hTERT 蛋白的變化。在轉(zhuǎn)染 amiRNA后用 CHAPS裂解液(Beyotime公司)裂解NCI-H446細(xì)胞，裂解液經(jīng)12000rpm x 20min離心后取上清。經(jīng)BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(Beyotime公司)測(cè)定蛋白濃度,取30ug蛋白上清進(jìn)行8%SDS-PAGE跑膠，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，剪下目的蛋白條帶，用1%脫脂奶粉(Beyotime公司)封閉過夜，按I : 500加入對(duì)應(yīng)性ー抗(兔抗人hTERT —抗、兔抗人Actin —抗，Santa公司)，37°C孵育2h，用TBST洗3次，用I : 1000的ニ抗(山羊抗兔IgG-HRP，Santa公司)孵育2h，再用TBST洗3次，用ECL檢測(cè)試劑盒(Beyotime公司)顯色。結(jié)果顯示，在端粒酶陽性的 NCI-H446 細(xì)胞中，相對(duì)于 NC 來說，amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2 和 amiRNA-hTERT3分別下調(diào)其hTERT的蛋白表達(dá)約58%，87%和98%，抑制效果明顯，尤其是amiRNA-hTERT3(如圖3所示)。相類似的結(jié)果也在另ー株端粒酶陽性的Hela細(xì)胞中得到。(3)端粒酶活性的測(cè)定。分別在NCI-H446 ，Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染amiRNA，轉(zhuǎn)后3d收集細(xì)胞，接著用TeloChaser試劑盒(Τ0Υ0Β0公司)進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)。具體操作為用TeloChaser試劑盒(Τ0Υ0Β0公司)自帶的裂解液配制細(xì)胞提取液并裂解細(xì)胞，離心后取上清液進(jìn)行BCA蛋白濃度定量，用三蒸水將相同蛋白量的上清液統(tǒng)ー配成20ul反應(yīng)液，配好Extension mix后加入20ul提取液上清進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng),之后用異丙醇和こ醇純化反應(yīng)產(chǎn)物，以所得產(chǎn)物為模板，加入TeloChaser試劑盒(Τ0Υ0Β0公司)自帶引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)束后用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠經(jīng)過夜固定后進(jìn)行銀染顯色。結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的3種amiRNA都能很有效的抑制端粒酶活性，以Hela細(xì)胞為例(如圖4所示)，3對(duì)amiRNA 的抑制率分另Ij 16%，77%和 99%。同時(shí)用 TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUSkit (Roche公司)對(duì)處理細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)，也得到相似的結(jié)果，具體操作同其說明書。3.分析各amiRNA對(duì)細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染前一天，將正常細(xì)胞Huvec，端粒酶陰性細(xì)胞U2-0S，端粒酶陽性細(xì)胞NCI-H446和Hela分別按3E+3個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，接板后20h進(jìn)行amiRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度統(tǒng)ー為50nM，除陰性對(duì)照組(NC)タト，同時(shí)增設(shè)一組只加Iipo 2000的Iipo對(duì)照組，用于評(píng)價(jià)整體實(shí)驗(yàn)操作可靠性。轉(zhuǎn)染后每2天更換一次培養(yǎng)基，第四天加入MTT標(biāo)記物(Roche公司)，吸去培養(yǎng)液,加入溶解液后孵育過夜,用分光光度計(jì)(Eppendorf, Germany)檢測(cè)580nm吸光度，具體操作同cell proliferation kit I (Roche公司)。結(jié)果顯示,相對(duì)于NC來說，3種amiRNA對(duì)端粒酶陰性(或低表達(dá))的細(xì)胞(U2-0S，Huvec)沒有顯著作用，而對(duì)端粒酶陽性的細(xì)胞(NCI-H446，Hela)卻有明顯的增殖抑制作用，尤其是amiRNA-hTERT3效果更為顯著，對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)到85%。選擇最為有效的amiRNA-hTERT 3進(jìn)ー步做量效曲線，以確定其最低有效濃度。同樣轉(zhuǎn)染前一天，將Hela分別按3E+3個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，接板后20h進(jìn)行amiRNA-hTERT 3轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度從IOOnM開始逐漸進(jìn)行半量遞減(ΙΟΟηΜ，50nM, 25nM，12. 5ηΜ，6· 25ηΜ, 3. 13ηΜ, I. 56ηΜ，0· 78ηΜ, OnM)，同時(shí)設(shè)ー個(gè)完全的空白組(Blank)來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的操作可靠性。實(shí)驗(yàn)組中各濃度的Iipo 2000用量統(tǒng)ー為lipo2000操作方案的推薦用量，其余操作完全按lipo2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)讓后第四天用cell proliferationkit I (Roche公司)進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定，操作按其說明進(jìn)行。結(jié)果表明，對(duì)應(yīng)Hela來說，amiRNA-hTERT 3在(λ 78nM時(shí)開始呈現(xiàn)強(qiáng)勁的細(xì)胞增殖抑制效果，在I. 56nM時(shí)基本達(dá)到其最大的抑制率(82%)，這個(gè)濃度是目前報(bào)道的靶向hTERT的最低有效濃度。結(jié)果見圖5所
/Jn ο4.分析各amiRNA對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響NCI-H446, Hela, U2-0S，Huvec細(xì)胞按8000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，20h后進(jìn)行amiRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)后48h用200ul黃槍頭在培養(yǎng)孔的中間位置劃“十”字，再用PBS洗去懸浮細(xì)胞，換上新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h并拍照。此劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NCI-H446, Hela,Huvec三種細(xì)胞的遷移能力明顯收到amiRNA的影響，尤其是amiRNA_hTERT3的作用更為顯著，如圖6所示，圖6為Huvec, NCI-H446 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外,選NCI-H446, Huvec細(xì)胞進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)的amiRNA是否會(huì)影響細(xì)胞的侵襲性能。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染amiRNA 48h后，分別將NCI-H446，Huvec細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(Invitrogen公司)稀釋，并按3E+5、5E+4個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于Transwell (Costar公司)上層小室中，放入含有正常血清濃度培養(yǎng)基(Invitrogen公司)的小室中繼續(xù)培養(yǎng)4-8h，取出小室用含1%こ醇的結(jié)晶紫溶液(Sigma公司)固定、染色，再用棉球檫去小室上層細(xì)胞，顯微鏡(Nikon，Japan)下統(tǒng)計(jì)已經(jīng)侵襲到小室下層的細(xì)胞。結(jié)果表明3對(duì)amiRNA都能不同程度的顯著抑制細(xì)胞的侵襲，如圖7所示。5.軟瓊脂實(shí)驗(yàn)分析各amiRNA對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響將I. 2%低熔點(diǎn)瓊脂糖(Sigma公司)與2X細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen公司)以I : I的體積比混合制備O. 6%的混合瓊脂鋪著24孔培養(yǎng)板(Corning公司)(O. 25ml/孔),凝固形成底層瓊脂。NCI-H446，Hela細(xì)胞在轉(zhuǎn)染amiRNA或NC后24h消化并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞(300個(gè)細(xì)胞/孔)與預(yù)先制備好的O. 3%的混合瓊脂混勻后鋪在培養(yǎng)板底層瓊脂的上面，凝膠后形成頂層瓊脂，培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d后用結(jié)晶紫染色，隨即選擇5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)有效克隆(細(xì)胞量大于50個(gè))的數(shù)量和大小，最后以各自有效克隆的總體積為克隆能力形成評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組NC來說，所選amiRNA都能顯著減少處理細(xì)胞的克隆數(shù)目，尤其是amiRNA-hTERT 3處理過的細(xì)胞基本不能形成有效克隆，如圖8所示，圖8為NCI-H446的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6.小管形成實(shí)驗(yàn)分析各amiRNA對(duì)細(xì)胞小管形成能力的影響Huvec細(xì)胞按5E+4個(gè)細(xì)胞/孔接到24孔板后20h分別進(jìn)行amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2, amiRNA-hTERT 3及NC轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑使用lipo2000，轉(zhuǎn)染濃度統(tǒng)ー為50nM,具體操作按照lipo2000說明書進(jìn)行。第二天將matrigel膠(BD公司)放入4で解凍，解凍完成后在冰上用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)將matrigel膠配成Ix的工作液，50ul/孔平鋪到96孔板中，之后轉(zhuǎn)染培養(yǎng)箱中凝固待用。Huvec細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h后進(jìn)行消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至I. 5E+4個(gè)細(xì)胞/ml取IOOul細(xì)胞細(xì)胞懸液加入昨天預(yù)制好的matrigel膠上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h后進(jìn)行顯微觀察并拍照。統(tǒng)計(jì)完整小管和有效接點(diǎn)數(shù)作為評(píng)價(jià)小管形成指標(biāo)。結(jié)果表明，陰性對(duì)照NC組能形成完整的小管，而amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2除少數(shù)有效接點(diǎn)并不能形成完整小管，尤其是amiRNA-hTERT 3連有效接點(diǎn)都不能形成，細(xì)胞基本呈散點(diǎn)狀或簡(jiǎn)單的短線狀。說明所選3對(duì)amiRNA都能顯著的抑制小管形成，尤其是amiRNA-hTERT 3效果最為顯著。如圖9所不。7.流式細(xì)胞術(shù)分析各amiRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
NCI-H446, Hela, Huvec, U2-0S細(xì)胞按2E+5個(gè)細(xì)胞/well接種到6孔板中，接板后20h用Lipo2000進(jìn)行amiRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度為50nM，具體操作按照lipo2000說明書進(jìn)行，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后每2天更換一次培養(yǎng)基，第四天消化收集細(xì)胞，將相同3個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞混合成一管，用PBS重懸后，IOOOrpm X 5min離心收集細(xì)胞。用300ul預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，加入700ul冰凍的無水こ醇后混勻，放入4度冰箱過夜。細(xì)胞固定24h后棄固定液，用Iml預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，IOOOrpm X IOmin收集細(xì)胞，再用Iml PBS重懸細(xì)胞和離心收集，重復(fù)3次。用750ul預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,加入50 μ L lmg/mLRNase A(Beyotime公司)，37°C水浴處理30min。取出EP管，在冰上放置2min后加200 μ L 100g/mL PI (Sigma公司)，4°C避光染色30min,過400目篩網(wǎng)(Zoman公司)后立刻上流式細(xì)胞儀(Beckman,USA)進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)488nm,收集波長(zhǎng)630nm,姆組樣品檢測(cè)3E+4個(gè)細(xì)胞。用Beckman流式細(xì)胞儀自帶的軟件生成圖譜并進(jìn)行凋亡分析。結(jié)果表明，對(duì)于正常細(xì)胞Huvec和端粒酶陰性的U2-0S來說，3對(duì)amiRNA都沒有明顯的促凋亡效果，而對(duì)端粒酶陽性的NCI-H446和Hela來說，3對(duì)amiRNA都能明顯的促進(jìn)細(xì)胞的凋亡， 尤其是amiRNA-hTERT 2最為明顯。如圖10所示。8. amiRNA專一性的驗(yàn)證(I)對(duì)干擾素信號(hào)通路的影響測(cè)定NCI-H446以5E+4個(gè)細(xì)胞/well接種到24孔板中，接板后20h用lipo2000進(jìn)行amiRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度為50nM，轉(zhuǎn)染操作按lipo2000方案進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24h用TrizolReagent(Invitrogen公司)按其說明書進(jìn)行總RNA提取(由此開始在冰上進(jìn)行操作)，接著用Bio Mate儀器(Thermo，USA)測(cè)定RNA純度和濃度，立刻進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(相關(guān)試劑購(gòu)自 Zoman):加入 5xRT 緩沖液 IOul，dNTP (2. 5mM) 4ul, Rnasin (40U/ul) lul，RTase (200u/ul) lul, 01igol8(50uM)0. lul, RNA 2ug，補(bǔ)充 ddH20 到 50ul，充分混勻后 42°C孵育 60min。完成反轉(zhuǎn)錄之后用Realtime PCR儀器(ABI，USA)對(duì)干擾素信號(hào)通路中的標(biāo)志性基因(IFN-beta，OAS-1, STATI)的表達(dá)水平進(jìn)行定量，內(nèi)參為GAPDH。操作按Zoman的“2x SYBRGreen qPCR kit” 方案進(jìn)行，即模板 2ul，上、下游引物(IOuM) lul，2xMix 10ul，補(bǔ)充 ddH20到 20ul。擴(kuò)增條件為:95°C 4min — (94°C 45s, 60°C 45s, 72°C 45s) 40cycle — meltcurve。qPCR結(jié)果表明，3對(duì)amiRNA雖然都能不同程度的影響到3個(gè)干擾素基因的表達(dá)變化，但只是輕微的發(fā)生改變，跟常規(guī)的siRNA引起的干擾素效應(yīng)(通常為10倍以上變化)有本質(zhì)差異，說明所選amiRNA不會(huì)引起明顯的干擾素效應(yīng)，副作用小。如圖11所示。(2)靶點(diǎn)沉默實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證amiRNA的專ー性根據(jù)amiRNA-hTERT I, amiRNA-hTERT 2, amiRNA-hTERT 3 在人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT (NM_198253)上的靶點(diǎn)位置，以各自靶點(diǎn)為中心在hTERT基因序列上分別向上下游延伸 IOObp 作為各自的待驗(yàn)證片段(amiRNA-hTERT I :3890-4010 ； ami RNA-hTERT 2 2820-3040 ； ami RNA-hTERT 3 :2820-3040)，由上海生工合成上述片段，并通過 Clal，Sail兩個(gè)酶切位點(diǎn)克隆到pAM-CAG-EGFP載體中的EGFP表達(dá)框下游，得到2個(gè)靶點(diǎn)沉默載體(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT I, pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2)。HEK293細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，20h后進(jìn)行質(zhì)粒和amiRNA的共轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)染按lipo2000操作方案進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)2組陰性對(duì)照組(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERTI+NC, pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+NC)、3 組實(shí)驗(yàn)組(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT1+amiRNA-hTERT 1， pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+amiRNA-hTERT 2，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+ami RNA-hTERT 3)。轉(zhuǎn)染后 48h 進(jìn)行熒光檢測(cè)，以確定amiRNA對(duì)靶點(diǎn)質(zhì)粒表達(dá)的沉默效果。熒光照片顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，3組實(shí)驗(yàn)組雖然也有微量的綠色熒光表達(dá)，但表達(dá)量非常低，而陰性對(duì)照組則呈現(xiàn)正常轉(zhuǎn)染后的高熒光表達(dá)，表明amiRNA-hTERT I, amiRNA-hTERT 2, amiRNA-hTERT 3能夠高效的沉默含各自靶點(diǎn)的基因片段，作用位點(diǎn)專一。如圖12所示。實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)amiRNA-hTERT的抗腫瘤效果。NCI-H446細(xì)胞按I. 5E+7個(gè)細(xì)胞/皿接種到直徑15cm的培養(yǎng)皿中(Corning公司)，接板后 20h 用 Lipo2000 分別進(jìn)行 amiRNA-h TERT 1，amiRNA-hTERT 2 和 NC 轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度為50nM，轉(zhuǎn)染方案按lipo2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24h消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，800rpm x5min離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞并離心收集，用PBS重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為
O.5E+8個(gè)細(xì)胞/ml，按IOOul/只細(xì)胞量接種到4周齡的BABL/c裸鼠左前肢腋下(國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心(NLARSH)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，每組設(shè)6只裸鼠。接瘤后第5天開始每3天測(cè)一次腫瘤的長(zhǎng)a和寬b，按l/2*a*b*b公式計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。接瘤后29天腹腔注射2%的無巴比妥鈉(Sigma公司)IOOul/只，等裸鼠完全麻醉后拍照，接著脫頸處死裸鼠并剝離移植瘤，將取下的瘤體排列好拍照后制作冰凍切片。腫瘤生長(zhǎng)曲線表明，amiRNA處理組先有ー個(gè)腫瘤變小的過程，緊接著是平緩生長(zhǎng)期，再進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而NC只經(jīng)過ー個(gè)平緩生長(zhǎng)期就很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，說明amiRNA處理后能抑制腫瘤的成瘤能力。切片經(jīng)TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(Beyotime公司)染色表明，amiRNA-hTERT2能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。見圖13所示。表I
權(quán)利要求
1.ー種新型抗腫瘤amiRNA序列，其特征在于，其包含下列序列中的任意一條或一條以上，它們的序列為amiRNA-hTERT I(amiRl) 正義鏈 5’ -TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’ ；反義鏈 5’ -TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’ ；amiRNA-hTERT2(amiR2) 正義鏈 5’ -CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’ ；反義鏈 5’ -TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’ ；amiRNA-hTERT3(amiR3) 正義鏈 5’ -CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’ ； 反義鏈 5’ -TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種新型抗腫瘤amiRNA序列，其特征在于，所述的序列為 amiRNA-hTERT3 (amiR3):正義鏈 5’ -CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3 ’ ； 反義鏈 5’ -TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。
3.如權(quán)利要求I或2所述的ー種新型抗腫瘤amiRNA序列在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的amiRNA序列用于制備與hTERT基因相關(guān)疾病的治療藥物，該amiRNA序列能通過化學(xué)合成以化學(xué)藥物用于腫瘤的預(yù)防和治療，也能經(jīng)過包裝，質(zhì)?；虿《绢愝d體最后以基因藥物形式用于腫瘤的預(yù)防和治療中。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新型抗腫瘤amiRNA序列，其包含下列序列中的任意一條或一條以上amiRNA-hTERT 1正義鏈5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；反義鏈5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；amiRNA-hTERT 2正義鏈5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；反義鏈5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；amiRNA-hTERT 3正義鏈5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；反義鏈5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。本發(fā)明能抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和遷移，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)而促其凋亡。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102676518SQ201210047319
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者唐明青, 許瑞安 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)