專利名稱：能夠在低照度下開花的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物、其制備方法、誘導(dǎo)所述植物開花的方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及通過導(dǎo)入FT基因從而在低照度環(huán)境(例如，屋內(nèi)) 下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物、其制備方法、誘導(dǎo)所述植物開花的方法等。
背景技術(shù)：
近年來，已知以阿拉伯芥為中心，許多基因與開花調(diào)節(jié)有關(guān)。有報(bào)道指出在此開 花調(diào)節(jié)中，來自阿拉伯芥的被稱為FT基因的基因發(fā)揮了主要作用，當(dāng)由該基因編碼的FT 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增加時(shí)促進(jìn)開花(W099/53070，Trends in Plant Science (2006) 11 550-558)。還已知FT基因及與此對(duì)應(yīng)的水稻基因Hd3a在葉中合成蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)向 莖頂部移動(dòng)，在莖頂部誘導(dǎo)花芽分化(Science (2007) 316 :1033-1036)。在制備使FT基因 組成型表達(dá)的重組植物時(shí)，其植物開花得到了促進(jìn)(Trends in Plant Science (2006) 11 550-558 非專利文獻(xiàn)1)。例如，使FT基因過表達(dá)的菊花即使在菊花通常不開花的長(zhǎng)日照 條件下的組織培養(yǎng)下也開花(園藝學(xué)研究(2007)卷6、別冊(cè)1，214 非專利文獻(xiàn)2)。此外，許多植物具有與FT基因?qū)?yīng)的基因。從番茄和毛果楊 (Populustrichocarpa)中得到FT基因的異種同源物，這些異種同源物分別被命名為SFT和 PtFT0相同基因也從溫州蜜柑(Citrus unshiu)等中得到。有報(bào)道指出使這些基因在植 物中組成型過表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)阿拉伯芥、水稻、枳(Poncitrustrifoliate)等的開花(Plant Cell Physiol. (2002)43 :1095_1105，TransgenicResearch(2005) 14 :703_712 非專利文 獻(xiàn)3)。通常以柑橘類為主的果樹等樹木從發(fā)芽到開花需要數(shù)年，而導(dǎo)入FT基因的轉(zhuǎn)基因橙 子在約6個(gè)月 一年開花(Transgenic Research (2005) 14，703-712 非專利文獻(xiàn)4)。因此，認(rèn)為FT基因及與其對(duì)應(yīng)的來自其他植物種的基因的功能可超越種的范圍 而發(fā)揮促進(jìn)開花的功能。而且，利用FT基因及與來自其他植物的相應(yīng)基因(本說明書 中統(tǒng)稱為FT基因)時(shí)，預(yù)期代的交替得到促進(jìn)，縮短品種改良所需要的時(shí)間(日本特開 2000-139250 專利文獻(xiàn)1)。也就是說，將導(dǎo)入了 FT基因的植物在具有充分照度和溫度的 條件下栽培時(shí)，預(yù)期其比未導(dǎo)入基因的植物提前開花。或者，如果通過組織培養(yǎng)維持植物生 長(zhǎng)時(shí)，可預(yù)期可促進(jìn)開花，且植物比通常提前開花。以上的原因是，在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)通常 添加作為碳源和能源的糖，所以即使植物不進(jìn)行充分的光合作用也能生長(zhǎng)發(fā)育。另一方面，為使植物生長(zhǎng)和開花，日照的小時(shí)數(shù)極為重要。晴天時(shí)野外的照度為 lOOOOOLux左右。在溫室栽培矮牽牛等時(shí)，需要lOOOOLux左右的照度。相對(duì)于此，通常的室 內(nèi)(辦公室或家庭)的照度為500LUX左右，作為在此條件下能開花的觀賞用植物，只知有 道非洲紫羅蘭。因?qū)㈤_花的盆栽植物(仙客來、非洲菊等)可置于室內(nèi)觀賞，所以，存在在室內(nèi)享 受栽花樂趣的需求。為滿足此需求，通常銷售的是在溫室等中使其開花后用于室內(nèi)觀賞的 植物。即使在室內(nèi)，如果將植物暴露于充足的光照和適合的日長(zhǎng)，植物即可開花。開花所需 的照度和每日光照期因植物種和栽培品種的不同而不同。通常，當(dāng)暴露于例如通過使用熒光燈等給予的約lOOOLux左右的人工照明時(shí)，大多數(shù)植物均可開花。但是，在不具備充足的 光的條件下，即在通常的室內(nèi)(例如照度為200 600LuX左右，優(yōu)選為500LuX左右，更優(yōu) 選為300LUX左右)，栽培高照度下才能開花的通常的花木植物時(shí)，常見的現(xiàn)象是開不了花， 或者即使開花，植物的生長(zhǎng)也會(huì)出現(xiàn)被抑制、黃化、枯死的現(xiàn)象。這是因?yàn)楣馐侵参镞M(jìn)行光 合作用所必需的，而光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。也就是說，盡管需要在低照度下能夠開花的植物，但是因?yàn)楣馐侵参锷L(zhǎng)所必需 的能源，所以通常在野外栽培的植物在低照度條件下例如室內(nèi)是否生長(zhǎng)和開花仍是不清楚 的。專利文獻(xiàn)1日本專利申請(qǐng)公開第2000-139250號(hào)非專利文獻(xiàn)ITrends in Plant Science (2006) 11 :550_558非專利文獻(xiàn)2園藝學(xué)研究(2007)卷6、別冊(cè)1，214非專禾Ij文獻(xiàn) 3Plant Cell Physiol. (2002) 43 1095-1 105, TransgenicResearch(2005) 14 :703_712非專利文獻(xiàn)4Transgenic Research (2005) 14 :703_712。

發(fā)明內(nèi)容
在如上所述的情況下，需要在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物及其制備方法寸。本發(fā)明的發(fā)明人將FT基因?qū)腼@花植物中并進(jìn)行了各種實(shí)驗(yàn)，結(jié)果完成了本發(fā) 明。更具體而言，本發(fā)明涉及如下所述的包括將FT基因?qū)腼@花植物的步驟的在低照度環(huán) 境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因顯花植物的制備方法、以上述性狀為特征的顯花植物及包含所述顯 花植物的試劑盒。(1) 一種在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，所述方法包括將FT 基因?qū)腼@花植物中。(2)根據(jù)上述⑴所述的方法，包括將FT基因?qū)腼@花植物中使所述FT基因高表 達(dá)。(3)根據(jù)上述(2)所述的方法，包括將FT基因?qū)腼@花植物中使所述FT基因組成 型過表達(dá)。(4)根據(jù)上述⑴ (3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述FT基因來自阿拉伯芥。(5)根據(jù)上述⑷所述的方法，其中，所述FT基因是保持了促進(jìn)開花功能的變體。(6)根據(jù)上述⑴ (5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述FT基因的組成型表達(dá)被 來自植物病毒的啟動(dòng)子誘導(dǎo)。(7)根據(jù)上述(1) (6)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述顯花植物為玄參科的藍(lán) 豬耳(torenia)、茄科的矮牽牛(petunia)、茄科的賽亞麻(Nierembergia)、馬鞭草科的馬 鞭草(verbena)、薔薇科的薔薇屬植物(rose)或石竹科的康乃馨(carnation)。(8)根據(jù)上述(1) (7)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述低照度環(huán)境是在未導(dǎo)入 FT基因的同種植物中不引起開花的照明條件下的栽培環(huán)境。(9)根據(jù)上述(8)所述的方法，其中，所述低照度環(huán)境為50 lOOOLux的照度。(10) 一種轉(zhuǎn)基因植物，其是根據(jù)上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的方法制備的。
(11) 一種在低照度環(huán)境下誘導(dǎo)植物開花的方法，所述方法包括在與未導(dǎo)入FT基 因的同種非重組顯花植物的照度環(huán)境相比較低的照度環(huán)境下栽培導(dǎo)入了 FT基因的轉(zhuǎn)基因 顯花植物。(12)根據(jù)上述(11)所述的方法，所述較低的照度環(huán)境是在未導(dǎo)入FT基因的同種 植物中不引起開花的照明條件下的栽培環(huán)境。(13)根據(jù)上述(12)所述的方法，其中，所述較低的照度環(huán)境具有50 lOOOLux的照度。(14)根據(jù)上述(11) (13)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，栽培所述轉(zhuǎn)基因植物的條 件是組織培養(yǎng)或土壤栽培條件。(14a)根據(jù)上述⑴ (14)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述植物至少到開花時(shí)為 止沒有降低其商品價(jià)值的任何變化。(14b)根據(jù)上述(1) (14)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，降低其商品價(jià)值的變化為 葉色和/或花色的變化、黃化或枯死。(14c)根據(jù)上述(1) (14)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物能夠在比通常高 度矮的狀態(tài)下開花。(15) 一種通過上述(11) (14)中任一項(xiàng)所述的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所 述顯花植物為玄參科的藍(lán)豬耳、茄科的矮牽牛、茄科的賽亞麻、馬鞭草科的馬鞭草、薔薇科 的薔薇屬植物或石竹科的康乃馨。(16) 一種在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物試劑盒，其包含導(dǎo)入了 FT基因 的轉(zhuǎn)基因顯花植物。(17)根據(jù)上述(16)所述的試劑盒，其中，所述轉(zhuǎn)化體植物為種子或開花前的苗木 (seedling)狀態(tài)的植物。根據(jù)本發(fā)明，通過導(dǎo)入FT基因，可使通常在與室內(nèi)環(huán)境類似的低照度下不能開花 的植物即使在低照度環(huán)境下也能開花。因?yàn)榇朔N能夠在低照度下開花的植物容易在屋內(nèi)栽 培，所以，這些植物不僅在商業(yè)栽培者進(jìn)行栽培時(shí)，而且一般消費(fèi)者在屋內(nèi)栽培時(shí)也能容易 地開花。另外，通過組成型表達(dá)FT基因，顯花植物用比通常短的時(shí)間能夠開花，甚至在低 照度環(huán)境下顯花植物用比通常短的時(shí)間也能夠開花。而且，根據(jù)本發(fā)明的方法在低照度環(huán)境下栽培顯花植物能夠使其開花。因此，本發(fā) 明的方法還具有可使能量的消耗量顯著減少的優(yōu)點(diǎn)。序列表(TEXT文本)SEQ ID NO 1 擬南芥(Arabidopsis thaliana)FT基因序列及蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO 2 擬南芥FT蛋白質(zhì)序列SEQ IDNO :3:引物SEQ IDNO :4:引物
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明中使用的FT基因、其編碼的多肽、用于使FT基因表達(dá)的載體、轉(zhuǎn)化 體的制備、轉(zhuǎn)化體向植物體的組織培養(yǎng)方法、栽培等進(jìn)行詳細(xì)地說明。
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1.本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物及其制備方法1 · 1本發(fā)明中使用的FT基因 首先，本發(fā)明提供在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因顯花植物的制備方法，所述 方法包括將FT基因?qū)腼@花植物中。在該方法中，優(yōu)選將以上描述的FT基因?qū)腼@花植 物中，以使其高表達(dá)。進(jìn)一步優(yōu)選將所述FT基因?qū)腼@花植物中，以使其組成型過表達(dá)。在本說明書中使用時(shí)，“FT基因”是指但不限于編碼來自阿拉伯芥(擬南芥)的FT 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 2)的基因(SEQ ID NO :1，Genbank登錄號(hào)AB027504)，并且也可以是顯 示FT蛋白質(zhì)的促進(jìn)開花活性且屬于與FT相同家族的異種同源蛋白質(zhì)的基因。屬于與FT 相同家族的蛋白質(zhì)在許多植物中均有發(fā)現(xiàn)，并且在整個(gè)家族內(nèi)高度保守。作為與FT相同家 族的蛋白質(zhì)，可例舉擬南芥的FT蛋白質(zhì)、TSF蛋白質(zhì)、MFT蛋白質(zhì)，溫州蜜柑CiFT蛋白質(zhì)，以 及水稻的Hd3a蛋白質(zhì)、RFTl蛋白質(zhì)、AL662946蛋白質(zhì)、AP003079蛋白質(zhì)、AP002882蛋白質(zhì) 等。在此，AL662946蛋白質(zhì)、AP003079蛋白質(zhì)及AP002882蛋白質(zhì)的編號(hào)為來自水稻的EST 的注冊(cè)號(hào)。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語“多核苷酸”可與“基因”、“核酸”或“核酸分子，，互換 使用，指核苷酸的聚合體。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語“堿基序列”可與“核酸序列，，或“核 苷酸序列”互換使用，作為脫氧核糖核苷酸(省略為A、G、C及T)的序列表示。另外，“包含 SEQ ID NO 1的堿基序列的多核苷酸或其片段”是指包含SEQ ID NO=I的由各脫氧核苷酸 A、G、C和/或T表示的序列的多核苷酸或其片段部分。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以以RNA(例如mRNA)或DNA的形式(例如cDNA或基因 組DNA)存在。DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(也稱作正義鏈) 或其也可以是非編碼鏈(也稱作反義鏈)。作為用以獲得根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的供給源，無特別限定，但優(yōu)選包含F(xiàn)T基因 或其異種同源物的生物材料。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語“生物材料”指生物學(xué)樣品(從生 物體中得到的組織樣品或細(xì)胞樣品)。在下述實(shí)施例中，作為生物體使用矮牽牛、藍(lán)豬耳、賽 亞麻，但不限定于此。在一種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸也可以是突變體，其中編碼具有FT蛋 白質(zhì)活性的多肽的多核苷酸的堿基序列中1個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生缺失、插入、取代或添加。突 變體可在編碼區(qū)或非編碼區(qū)發(fā)生突變或者在這兩個(gè)區(qū)均發(fā)生突變。編碼區(qū)中的突變可產(chǎn)生 保守或非保守的氨基酸的缺失、插入、取代和/或添加。在本說明書中使用時(shí)，“FT基因”包 括編碼SEQ ID NO :2的氨基酸序列的基因或者編碼在所述氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)(例如， 1 40個(gè)、1 20個(gè)、1 15個(gè)、1 10個(gè)、1 9個(gè)、1 8個(gè)、1 7個(gè)、1 6個(gè)、1 5 個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、1 2個(gè)、1個(gè)等)或1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被缺失、取代或添加的氨基 酸序列的基因。多肽的氨基酸序列中的一些氨基酸對(duì)該多肽的結(jié)構(gòu)或功能無顯著影響，可被容易 地改造是該領(lǐng)域眾所周知的。而且，不僅可人為地對(duì)其改造，在天然的蛋白質(zhì)中，存在不使 該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生顯著變化的突變體也是眾所周知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用眾所周知的技術(shù)，可容易地對(duì)多肽的氨基酸序列中1個(gè)或多 個(gè)氨基酸進(jìn)行改造。例如，按照公知的定點(diǎn)誘變法，可對(duì)編碼多肽的多核苷酸的任意的堿基 進(jìn)行改造。另外，也可設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于編碼多肽的多核苷酸的任意位點(diǎn)的引物，制備缺失突變體或添加突變體。而且，使用本說明書中所記載的方法，即可容易地測(cè)定所制備的變體是否具 有所需活性。優(yōu)選的變體具有保守性或非保守性的氨基酸取代、缺失或添加。優(yōu)選沉默性取代、 添加及缺失，特別優(yōu)選保守性取代。這些均不使根據(jù)本發(fā)明的多肽活性發(fā)生變化。保守性取代的代表性實(shí)例是脂肪族氨基酸Ala、Val, Leu及Ile中的1個(gè)氨基酸 取代為另一個(gè)氨基酸；羥基殘基Ser及Thr的交換，酸性殘基Asp及Glu的交換，酰胺殘基 Asn及Gln之間的取代，堿基性殘基Lys及Arg的交換，以及芳香族殘基Phe及Tyr之間的 取代。如以上詳示，涉及何種氨基酸的變化為表型沉默的(即是否不具有對(duì)功能顯著有 害的效果)的進(jìn)一步的指導(dǎo)可在 Bowie，J. U.等 “Deciphering theMessage in Protein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science247 1306-1310(1990) (在本說明書中作為參考引用)中找到。只要使用上述所例舉的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，即可在轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞中合成具有 FT蛋白質(zhì)功能的多肽。表達(dá)載體本發(fā)明提供包括將FT基因?qū)腼@花植物中使FT基因高表達(dá)的方法。此外，本發(fā) 明還提供包括將FT基因?qū)腼@花植物中使FT基因組成型過表達(dá)的方法。本說明書中，“高表達(dá)”是指可表達(dá)地整合的基因在由于受到比原來情況下更強(qiáng)的 表達(dá)誘導(dǎo)或在細(xì)胞內(nèi)更長(zhǎng)時(shí)間地積累，從而使其在每個(gè)細(xì)胞中發(fā)揮更強(qiáng)的功能。該原因不 限于上述原因。“組成型過表達(dá)”是指基因表達(dá)等不依賴于外界刺激和生長(zhǎng)條件等而基本為 一定量地過表達(dá)?！翱杀磉_(dá)地整合”的基因是指，為使其可在被導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而整合進(jìn) 載體的基因。“在(載體中)可表達(dá)地整合的基因”可通過將調(diào)控該基因表達(dá)的適合的啟動(dòng) 子等的表達(dá)調(diào)控因子配置在可調(diào)控該載體中的該基因表達(dá)的位置(例如該基因的上游)上 來實(shí)現(xiàn)。在本說明書中使用時(shí)，“在植物內(nèi)可表達(dá)地整合的FT基因構(gòu)建體”是指通過公知的 基因?qū)敕ㄒ钥蓪?dǎo)入植物的形式(例如質(zhì)粒載體)插入FT基因的構(gòu)建體，并意欲指可表達(dá) 由FT基因編碼的FT蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。作為可導(dǎo)入植物中的形式的FT基因構(gòu)建體包括，例 如插入FT蛋白質(zhì)的cDNA的重組表達(dá)載體等。重組表達(dá)載體的制備方法包括但不限于本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的方法的使用質(zhì)粒、噬菌體或黏粒等的方法。載體的具體種類無特別限定，可適當(dāng)選擇可在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體。根據(jù)宿主 細(xì)胞的種類，選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列以確保FT蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且通過將該啟動(dòng)子序列與 FT基因?qū)胍欢愋偷馁|(zhì)粒中所制備的載體可作為表達(dá)載體使用。載體優(yōu)選含有至少1個(gè)選擇性標(biāo)記。用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括 那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和Basta抗性基因，用于大腸桿菌(E. coli)及其他細(xì)菌 的培養(yǎng)的選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、慶大霉素抗性基 因、卡那霉素抗性基因、博萊霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等。使用選擇性標(biāo)記，選擇在含 有上述抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的植物體，從而容易地選擇出轉(zhuǎn)基因植物體及細(xì)菌。質(zhì)粒的表達(dá)啟動(dòng)子可以是進(jìn)行組成型表達(dá)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，也可以是可從外部調(diào)控 的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。作為在本發(fā)明中使用的進(jìn)行組成型表達(dá)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，可優(yōu)選花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、胭脂堿合成酶的啟動(dòng)子、煙草raia基因啟 動(dòng)子、番茄核酮糖1，5-二磷酸羧化酶氧化酶小亞基啟動(dòng)子等。其中，可更優(yōu)選使用花椰菜 花葉病毒35S啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。通過使用上述任何啟動(dòng)子，當(dāng)給定基因?qū)胫参?細(xì)胞中時(shí)，所述基因能夠在所獲得的重組表達(dá)載體中強(qiáng)表達(dá)。此外，可從外部調(diào)控的啟動(dòng)子 的實(shí)例包括金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子等，但不限于此。 本發(fā)明中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合時(shí)，受轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的 作用，激活其調(diào)控下的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可根據(jù)作為編碼所述DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列而使用的序列來進(jìn)行適宜地選擇。例如，編碼小鼠AhR的DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域(氨基酸1 82)的DNA序列作為編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列使用時(shí)，優(yōu)選使 用來自大腸桿菌的6 X XRE序列(將6個(gè)小鼠XRE序列串聯(lián)連接的序列)，此外，編碼大腸桿 菌的阻遏蛋白LexA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列作為編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列使 用時(shí)，優(yōu)選使用8XLexA-46-P序列(在花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子的操作子區(qū)(轉(zhuǎn)錄開 始點(diǎn)開始46個(gè)堿基上游)上將LexA結(jié)合序列重復(fù)8次的序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包含1個(gè)或多個(gè)所需基因。所述基 因的實(shí)例包括抗藥基因(例如NPTII (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)等。這些基因優(yōu)選配置于適 合的啟動(dòng)子(例如胭脂堿合成酶啟動(dòng)子或Mac啟動(dòng)子)的調(diào)控下。本發(fā)明的載體通常含有表達(dá)調(diào)控區(qū)例如適合的啟動(dòng)子和終止子以及復(fù)制起點(diǎn)，這 取決于應(yīng)導(dǎo)入所述載體的宿主的種類。例如，為使基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，制備這樣的DNA 分子(表達(dá)盒)，使其以可發(fā)揮功能的形式具有(1)可在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的啟動(dòng)子、(2) 基因及(3)可在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的終止子，并將其導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)。此種DNA分子不 僅包含啟動(dòng)子，還可包含用于使轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步增強(qiáng)的DNA序列，例如增強(qiáng)子序列。所使用的 啟動(dòng)子無特別限制，只要能夠是在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，例如35S(Shcell，J. S.， 1987，Science,237 :1176_1183)、Nos(Schell, J.S.，1987，Science,237 :1176_1183)、 rbcS(Benefy,P. N.及 Ν_Η· Chua, 1989, Science, 244 174-181)、PRla(0hshima，M.等、1990、 Plant Cell，2 :95-106)、ADH(Benefy，P. N.及 Ν_Η· Chua，1989，Science，244 174-181)、 patatin(Benefy, P. N. R N-H. Chua, 1989, Science, 244 :174—181)、Cab (Benefy, P. N. R N-H. Chua，1989，Science, 244 :174-181)及 PAL(Lian，X.等，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 9284-9288)等。終止子無特別限定，只要其具有作為轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的功能，并且可以是公知的一 個(gè)終止子?？蓛?yōu)選使用的終止子的具體實(shí)例包括胭脂堿合成酶基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(Nos終 止子)、花椰菜花葉病毒35S的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(CaMV35S終止子)等。其中，可更優(yōu)選使用Nos 終止子。作為用于提高翻譯效率的堿基序列包括例如來自煙草花葉病毒的omega序列。通 過將該omega序列配置于啟動(dòng)子的非翻譯區(qū)(5’ UTR)，可提高目的基因的翻譯效率。如上 所述，在所述轉(zhuǎn)基因載體中可根據(jù)其目的而含有各種DNA片段。有關(guān)上述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法無特別限定。將上述啟動(dòng)子、編碼轉(zhuǎn)錄因子的 基因、轉(zhuǎn)錄抑制轉(zhuǎn)換多核苷酸以及根據(jù)需要的其他DNA片段按預(yù)定順序?qū)脒m當(dāng)選擇的作 為母體的載體中。例如，將編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因與轉(zhuǎn)錄抑制轉(zhuǎn)換多核苷酸連接而構(gòu)建嵌合 基因。然后，將該嵌合基因與啟動(dòng)子(以及根據(jù)需要的終止子等)連接以構(gòu)建表達(dá)盒，并將該盒導(dǎo)入載體中。在嵌合基因及表達(dá)盒的構(gòu)建中，例如，將各DNA片段的切割位點(diǎn)作為彼此互補(bǔ)的 突出末端，通過連接酶使其反應(yīng)，即可規(guī)定該DNA片段的順序。在表達(dá)盒中含有終止子的情 況下，以從上游開始的順序，可包含啟動(dòng)子、上述嵌合基因和終止子。此外，對(duì)于用于構(gòu)建重 組表達(dá)載體的試劑例如限制性內(nèi)切酶和連接酶等的種類無特別限定，并可適當(dāng)選擇市售品 使用。1.3轉(zhuǎn)基因植物的制備本發(fā)明提供如上所述的轉(zhuǎn)基因顯花植物。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語“顯花植物”統(tǒng)指所有開花的植物。但優(yōu)選為觀賞用園 藝植物、更優(yōu)選觀賞用花卉植物。所述顯花植物可以是被子植物或裸子植物。本說明書中，“轉(zhuǎn)基因植物”可與“轉(zhuǎn)化的植物”互換使用。作為公知的基因?qū)敕òǖ幌抻谕寥罈U菌介導(dǎo)的方法、基因槍法、病毒載體 法、電穿孔法、聚乙二醇法、顯微注射法、脂質(zhì)體法等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)導(dǎo)入的植物種 類選擇優(yōu)選的基因?qū)敕?。如上所述的載體的構(gòu)建可使用公知的限制性內(nèi)切酶等，根據(jù)通常方法進(jìn)行。例如， 使用土壤桿菌時(shí)，可使用PBI121等的雙元載體，使用基因槍時(shí)，可使用PUC19等的大腸桿菌 載體。而且，使用標(biāo)記基因例如抗生素抗性基因等選擇用所述載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞并使用 適合的植物激素或其他條件進(jìn)行再分化，可得到用目的基因轉(zhuǎn)化的植物體。載體導(dǎo)入植物細(xì)胞可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種方法進(jìn)行。例如，可使 用利用根癌農(nóng)桿菌、發(fā)根土壤桿菌的間接導(dǎo)入法(Heiei，Y.等，PlantJ.，6，271-282，1994、 Takaiwa, F.等，Plant Sci. 111，39-49，1995)，以電穿孔法(Tada, Y.等，Theor. Appl. Genet，80，475，1990)、聚乙二醇法(Datta, S. K.等，PlantMol Biol.，20，619-629，1992)、 基因槍法(Christou, P.等，Plant J. 2，275-281，1992，F(xiàn)romm, Μ. Ε.，Bio/Technology, 8, 833-839,1990)等為代表的直接導(dǎo)入法。本發(fā)明中作為進(jìn)行基因?qū)氲闹参锛?xì)胞，只要可再 生成植物體，無特別限制。植物細(xì)胞的實(shí)例包括懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和能夠形成愈傷組織、原生質(zhì) 體、葉切片等的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可通過使其再生而產(chǎn)生植物體。參照Ueyama等，Plant Biotechnology, 23 19-24,2006 ；Tamura 等，Plant Cell Reports，21，459-466，2002 ； Aida 等，Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 48,294-Transgenic Crops III (Y. P. S. Bajaj 編著)Springer-Verlag Berlin Heidelberg2001 ；Horsh 等的方法 (Science. 1985 ；227 :1229_1231)；以及Hazama等的方法(Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 48, Transgenic Crops III, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001)等的文獻(xiàn)。本發(fā)明提供用上述方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。用如上所述的本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的 優(yōu)選植物種包括顯花植物種。更優(yōu)選能夠獲得轉(zhuǎn)化體的植物種。此種植物種的實(shí)例是矮 牽牛、藍(lán)豬耳、馬鞭草、煙草、薔薇屬植物、菊花、康乃馨、金魚草、仙客來、蘭花、洋桔梗、小蒼 蘭、非洲菊、唐菖蒲、霞草、長(zhǎng)壽花、百合、天竺葵屬(Pelargonium)、老鸛草屬(Geranium)、 郁金香、萬壽菊、賽亞麻、牽?；ǖ?。例如，參照Chandler等、In Vitro Cellular andDevelopmental Biology Plant, 41 :591_601, 2005 ;Tanaka等，Geneticengineering infloriculture, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80，1_24，2005。 根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是通過導(dǎo)入FT基因而在不超過照射量為lOOOLux (優(yōu)選
IOOLux或以下的屋內(nèi)低照度條件)的栽培環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物。通過將本發(fā)明的載體導(dǎo)入植物體而改造的植物體以及由所述植物體的繁殖材料 (例如種子、后代、切花、塊根、塊莖、果實(shí)、切穗等)得到的植物體都包含在本發(fā)明的技術(shù)范 圍內(nèi)。在根據(jù)本發(fā)明的植物體的生產(chǎn)方法中，將上述基因?qū)胫参矬w中，從而由該植物 體通過有性生殖或無性生殖得到只是含量減少的子孫。此外，由該植物體及其子孫能夠得 到植物細(xì)胞或種子、果實(shí)、植株、愈傷組織、塊莖、切穗、塊等繁殖材料，從而大量生產(chǎn)該植物 體。因此，根據(jù)本發(fā)明的植物體的制備方法中可包含在選擇后繁殖植物體的繁殖步驟(大
量生產(chǎn))。在本發(fā)明中，所述植物體包括已生長(zhǎng)發(fā)育的植物體、植物細(xì)胞、植物組織、愈傷組 織、種子中的至少一個(gè)。也就是說，在本發(fā)明中，只要是最終可生長(zhǎng)發(fā)育成植物個(gè)體的植物 體均視為植物體。另外，上述植物細(xì)胞包括各種形態(tài)的植物細(xì)胞。作為所涉及的植物細(xì)胞， 例如，包括懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉的切片等。通過使這些植物細(xì)胞生長(zhǎng)和分化可獲得 植物體。而且，由植物細(xì)胞進(jìn)行的植物體的再生可根據(jù)植物細(xì)胞的種類，使用以往公知的方 法進(jìn)行。因此，在根據(jù)本發(fā)明的植物體的生產(chǎn)方法中，也可包括由植物細(xì)胞再生植物體的再 生步驟。2.誘導(dǎo)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物開花的方法接下來，本發(fā)明還涉及在低照度環(huán)境下誘導(dǎo)植物開花的方法，所述方法包括在與 未導(dǎo)入FT基因的同種非重組顯花植物的照度環(huán)境相比較低的照度環(huán)境下栽培導(dǎo)入了 FT基 因的轉(zhuǎn)基因顯花植物。在此所述的“低照度環(huán)境”是指在未導(dǎo)入FT基因的同種植物中不引起開花的照 明條件下的栽培環(huán)境。所述環(huán)境包括，例如作為開花前的總照明量，與作為同種植物的未 導(dǎo)入FT基因的非重組顯花植物相比，照明量減少10 70 %、照明量減少10 50 %、照 明量減少10 40%、照明量減少10 30%的環(huán)境。在此，“作為開花前的總照明量，與 作為同種植物的未導(dǎo)入FT基因的非重組顯花植物相比照明量減少10%”是指，例如，其 非重組顯花植物開花時(shí)，平均需要10，000LuX(光照期10小時(shí))、10天(10,000X10X10 =1，000, OOOLux ·小時(shí))，而重組體只用9，OOOLux (光照期10小時(shí))、10天的照明量 (9，000X10X10 = 900，OOOLux ·小時(shí))即足夠。更具體地說，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，使通常只在屋外開花的觀賞用顯花植 物即使在如屋內(nèi)的暗的照明條件下也能開花。此種低照度環(huán)境因植物的種類、導(dǎo)入的FT基因的種類、使用的啟動(dòng)子、載體等的 種類、包括溫度等的栽培條件不同而不同，但是通常為以下條件。組織培養(yǎng)條件或通常的土壤栽培條件下的日照條件包括例如在10 35°C的溫度 下、50 IOOOLux的光照期10 18小時(shí)，更優(yōu)選為100 500Lux的光照期10 18小時(shí) 的栽培環(huán)境。優(yōu)選的栽培和照明條件因顯花植物的種類不同而不同。藍(lán)豬耳、矮牽牛、賽亞麻為 長(zhǎng)日照植物，并且類似的條件可適用于這些植物。所述條件如下。
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例如，在加入了含有 3g/l 結(jié)冷膠(Gellan Gum, Kanto Chemical)、30g/l 蔗糖 禾口 4· 4g/l 的 Murashige—Skoog(Murashige and SkoogBasal Medium containing vitamins, Duchefa Biochemie公司)的培養(yǎng)基的容器中放入植物體,可通過 在IOOOLux左右(例如100 1200Lux、優(yōu)選為200 lOOOLux)的照度(使用熒光燈，16 小時(shí)光照期和8小時(shí)黑暗期)下、約22°C下的栽培進(jìn)行組織培養(yǎng)。此外，也可在通常的園藝用土壤中栽植植物，在屋外栽培。在屋外時(shí)，最好最低氣 溫為10 15°C或以上，最高氣溫為35°C或以下，日照時(shí)間為10 12小時(shí)或以上。在室內(nèi)栽 培時(shí)，比起土壤，消費(fèi)者有更喜好人工栽培土如EC0PAF、Hydro Ball、環(huán)保輕石(supersol) 等的趨勢(shì)，但也可以使用園藝用土壤。本發(fā)明中，“土壤栽培”是指使用天然土壤或人工土壤 進(jìn)行栽培。土壤栽培包括例如露地栽培、溫室栽培、塑料大棚栽培等的培養(yǎng)形式。本發(fā)明中使用的栽培條件不限定于上述條件。 3.在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物試劑盒本發(fā)明還進(jìn)一步提供包含導(dǎo)入了 FT基因的重組顯花植物的可在低照度環(huán)境下開 花的轉(zhuǎn)基因植物試劑盒。此轉(zhuǎn)基因植物試劑盒包括上述轉(zhuǎn)基因植物為種子或開花前的苗木 狀態(tài)。作為適用于根據(jù)本發(fā)明的植物試劑盒的植物，優(yōu)選觀賞用的顯花植物。作為可在 本發(fā)明中使用的顯花植物，只要可適用轉(zhuǎn)化技術(shù)，可為任何植物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地 選擇可容易地適用轉(zhuǎn)化技術(shù)的觀賞用顯花植物。優(yōu)選本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因顯花植物是在育種中 將穩(wěn)定的性狀傳遞給子孫并維持的植物。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選具備記載有適合栽培本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因顯花植物的條件 的說明書、栽培中使用的肥料等。作為特別優(yōu)選的照度條件，為屋內(nèi)照明條件即足夠的照度。只要是使用根據(jù)本發(fā)明的植物試劑盒，一般消費(fèi)者均可在自家、辦公室等內(nèi)栽培， 并使其在低照度的環(huán)境下容易地開花。本說明書中所列舉的所有文件均在本說明書中作為參考引用。本發(fā)明參照特定的 優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行了記載，但可在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)的前提下來進(jìn)行改造，這一點(diǎn)應(yīng)該 理解。此種改造包含于專利權(quán)利要求書中。以下使用實(shí)施例更進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限定于這些實(shí)施 例。實(shí)施例在以下的實(shí)施例中，除非特別指出，分子生物學(xué)的方法根據(jù)WogeAssoo或 Molecular Cloning (Sambrook et AL (1989)Cold Spring Harbour LaboratoryPress)中 所記載的進(jìn)行。實(shí)施例1 表達(dá)載體的構(gòu)建基于W099/53070中記載的FT基因合成以下2個(gè)引物FT-F 5，-CCTCTAGAATGTCTATAAATATAAGAGACCC-3，(SEQ ID NO 3),FT-R 5，-CTCTGAGCTAAAGTCTTCTTCCTCCGC-3，(SEQ ID NO :4)。從在長(zhǎng)日照條件下栽培的阿拉伯芥中得到mRNA，以其為模板，使用上述2個(gè)引物， 通過RT-PCR合成FT cDNA。RT-PCR使用KOD-Taq(Toyobo)，用制造者推薦的條件進(jìn)行。將合成的 cDNA 用 XbaI 酶切。另一方面，將 p35S_GFP Plant Vector(CLONTECH)用 BamHI 和 SacI酶切后，使用末端平滑化試劑盒(TaKaRa Bio)進(jìn)行末端平滑化后進(jìn)行自身環(huán)化。將所 得到的質(zhì)粒用XbaI酶切后，插入上述的XbaI酶切后的FT cDNA。選擇FT cDNA的起始密碼 子向靠近P35S-GFP的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的方向插入的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒用Hindi11 和EcoRI酶切，將酶切后的DNA片段中包含花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、FT基因和胭脂堿合 成酶終止子的DNA片段導(dǎo)入用HindIII和EcoRI酶切后的pBinPlus (Trangenic Research, 1995，4，288-290)中。將所得到的質(zhì)粒命名為pSPB3137。預(yù)期在pSPB3137中，F(xiàn)TcDNA被 花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子調(diào)控，并在植物中組成型表達(dá)。實(shí)施例2 重組矮牽牛的培育和評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化方法按照Horsh等的方法(Science，1985 ;227 1229-1231)。即在矮牽牛 (Petunia hybrida)品禾中Surfinia Purple Mini (Suntory Flowers,Ltd.)中通過使用葉片 的土壤桿菌法導(dǎo)入實(shí)施例1中構(gòu)建的雙元載體的T-DNA部分。通過將轉(zhuǎn)化細(xì)胞用卡那霉素 篩選后使其再分化，得到重組矮牽牛。在重組矮牽牛中，在照度5000LuX(光照期16小時(shí)、 黑暗期8小時(shí))、溫度23°C下進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)具有開花的個(gè)體，而未導(dǎo)入基因的矮牽牛及導(dǎo) 入了其他基因的重組矮牽牛在相同條件下均未開花。將導(dǎo)入了 FT基因的轉(zhuǎn)化矮牽牛栽入裝有BMl(泥炭土)赤玉土 珍珠巖= 2:2: 1的混合物的直徑IOcm的塑料盆中，在封閉式溫室中進(jìn)行栽培。從各轉(zhuǎn)化矮牽牛 的葉中提取RNA，通過RT-PCR法分析FT轉(zhuǎn)錄物的有無，篩選轉(zhuǎn)錄了 FT基因的株系。用于 檢測(cè)FT mRNA所使用的引物與實(shí)施例相同。從檢測(cè)有FT mRNA的株系中各取4個(gè)插穗，在 BMl (泥炭土)赤玉土 珍珠巖=2 2 1的混合物中進(jìn)行扦插。在封閉式溫室中繼 續(xù)栽培時(shí)，導(dǎo)入了 FT的轉(zhuǎn)化矮牽牛在25天 48天開花，而未導(dǎo)入的非轉(zhuǎn)基因矮牽牛在64 天 79天后開花。以上結(jié)果說明，通過FT基因的過表達(dá)，無論是組織培養(yǎng)條件還是通常的土壤栽培 均能夠促進(jìn)矮牽牛開花。實(shí)施例3 重組藍(lán)豬耳的育出和評(píng)價(jià)藍(lán)豬耳的轉(zhuǎn)化方法按照間等的方法(Biotechnology in Agriculture andForestry, Vol 48, Transgenic Crops III, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001)。即在藍(lán)豬耳(Torenia hybrida)品種 Summer Wave Blue (Suntory Flowers, Ltd.) 中導(dǎo)入實(shí)施例1構(gòu)建的雙元載體的T-DNA部分。通過將轉(zhuǎn)化細(xì)胞用卡那霉素篩選后使其再 分化，獲得重組藍(lán)豬耳。在重組藍(lán)豬耳中，在照度5，000LuX(光照期16小時(shí)、黑暗期8小 時(shí))、溫度23°C下進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)有開花的個(gè)體，而未導(dǎo)入基因的藍(lán)豬耳及導(dǎo)入了其他基 因的重組藍(lán)豬耳在相同條件下均未開花。從導(dǎo)入了 FT基因的藍(lán)豬耳40株系的葉中提取RNA，通過RT-PCR法分析FT轉(zhuǎn)錄物 的有無，篩選轉(zhuǎn)錄了 FT基因的株系。將轉(zhuǎn)化藍(lán)豬耳植入裝有BMl 赤玉珍珠巖=2:2:1的混合物的直徑IOcm 的塑料盆后，在封閉式溫室中進(jìn)行栽培。導(dǎo)入了 FT的轉(zhuǎn)化藍(lán)豬耳在上盆后33天 48天開 花，而未導(dǎo)入的藍(lán)豬耳在60天 63天后才開花。此外，還觀察到轉(zhuǎn)化矮牽牛的節(jié)間縮短， 株型變得緊湊的趨勢(shì)。以上結(jié)果說明，通過使FT基因組成型表達(dá)、使FT蛋白質(zhì)過表達(dá)，無論是通過組織
12培養(yǎng)的栽培還是土壤栽培均能夠促進(jìn)藍(lán)豬耳開花。實(shí)施例4 重組藍(lán)豬耳在低照度下的開花將轉(zhuǎn)化藍(lán)豬耳及宿主藍(lán)豬耳的莖扦插在Puffcal (Suntory Ltd.，在W02004/112461中記載)中。將這些扦插苗放入有孔的泡沫塑料中，漂浮于含有稀釋后的 液肥(例如，VIGOR LIFE (Suntory Flowers, Ltd.)的1000倍稀釋物)的水中。將這些藍(lán) 豬耳在照度300Lux(光照期16小時(shí)、黑暗期8小時(shí))、溫度23°C的條件下栽培3個(gè)月。在 此條件下，雖觀察到了宿主藍(lán)豬耳有新葉展開等的生長(zhǎng)，但花芽未能形成，未達(dá)到開花的程 度。另一方面，導(dǎo)入了 FT基因的重組藍(lán)豬耳在第25天 第60天花芽形成，在第52天 第 70天開花。此時(shí)，未觀察到葉和花的顏色或形態(tài)有異常，但如實(shí)施例3所述，節(jié)間比宿主縮 短，呈現(xiàn)緊湊的株型，開花后的樣子非常強(qiáng)健可愛。在暴露于充足的光照且供給蔗糖作為碳源的體外條件下植物均可開花，但在光線 不充足、碳源被限定的室內(nèi)條件下也可開花的植物則很有限。推測(cè)即使加入用于促進(jìn)開花 的信號(hào)(例如FT基因的過表達(dá))，仍需要用于充分進(jìn)行通常使植物開花的光合作用的光照。 因此，還不能預(yù)測(cè)只導(dǎo)入FT基因植物能否在室內(nèi)開花。不過，在實(shí)施例4中，令人意想不到 的是，轉(zhuǎn)基因藍(lán)豬耳在低照度條件下開了花，并且具有在商業(yè)中極具魅力的形態(tài)。實(shí)施例5 重組賽亞麻的育出和評(píng)價(jià)FairyBell Patioblue (Suntory Flowers, Ltd. ) Φ, jiffi Ueyama φ 的方法(Plant Biotechnology 23，19-24，2006)導(dǎo)入實(shí)施例1中構(gòu)建的雙元載體的T-DNA 部分，獲得重組賽亞麻。宿主從馴化到開花需要約2個(gè)月，但卻發(fā)現(xiàn)重組賽亞麻與其相比， 有很多提前7天 10天左右開花。上述結(jié)果說明，通過使FT基因組成型表達(dá)以使FT蛋白 質(zhì)過表達(dá)能夠促進(jìn)賽亞麻的開花。實(shí)施例6 =FT導(dǎo)入基因重組藍(lán)豬耳的通過水培的評(píng)價(jià)在室內(nèi)進(jìn)行植物栽培時(shí)，經(jīng)常進(jìn)行水培(在底部無孔的容器中盛水栽培植物的 方法)，為栽培植物，可使用Hydro Ball代替土壤。本實(shí)施例中，作為Hydro Ball使用 Neocoal (Toyo Denka Kogyo Co.，Ltd.的注冊(cè)商標(biāo))。將發(fā)根后的藍(lán)豬耳插穗移植到裝 有20ml左右的Neocoal的30ml管中開始栽培。在Neocoal干燥時(shí)，每次提供VIG0RLIFE V(Suntory Flowers, Ltd.的注冊(cè)商標(biāo))的2000倍稀釋液。在實(shí)施例4的日照條件下，導(dǎo) 入了 FT基因的藍(lán)豬耳在1個(gè)月 6星期時(shí)花芽形成，但未觀察到宿主藍(lán)豬耳的花芽形成。 這些植物生長(zhǎng)后，莖長(zhǎng)度達(dá)5cm左右時(shí)進(jìn)行一次修剪。之后繼續(xù)栽培時(shí)，在1個(gè)月左右重組 藍(lán)豬耳即開花，其后在生長(zhǎng)的同時(shí)不斷開花，而宿主藍(lán)豬耳則完全未開花。實(shí)施例7 薔薇屬植物中的FT基因?qū)胧褂脤?dǎo)入了 pSPB3137的土壤桿菌，在薔薇屬植物品種薰衣草(Lavande)中導(dǎo) 入FT基因。有關(guān)薔薇屬植物的轉(zhuǎn)化已報(bào)導(dǎo)了許多方法(例如Firoozababyet al. Bio/ Technology 12 :883_888 (1994)，US 5480789、US 5792927、EP 536327A1 以及 US 20010007157A1)，可根據(jù)上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具體地說，在導(dǎo)入了pSPB3137 的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AglO 株(Lazo等，Bio/Technology 9 =963-967,1991)的菌液中，將由無菌苗的葉誘導(dǎo)的薔薇屬 植物的愈傷組織浸入5分鐘，用滅菌濾紙拭去多余菌液后，移植到繼代用培養(yǎng)基中進(jìn)行2天 暗處共生培養(yǎng)。
而后，用加有400mg/l羧芐青霉素的MS液體培養(yǎng)基洗滌，從繼代用培養(yǎng)基向加有50mg/l卡那霉素和200mg/l羧芐青霉素的篩選/除菌用培養(yǎng)基移植。反復(fù)進(jìn)行在篩選培養(yǎng) 基上生長(zhǎng)發(fā)育未受抑制的正常增殖部分的移植和培養(yǎng)后，篩選卡那霉素抗性愈傷組織。實(shí)施例8 康乃馨中的FT基因?qū)牖厥諏⑸鲜鲑|(zhì)粒pSPB3137用AscI和PacI酶切后得到的含有FT基因的片段。將 該片段與用AscI和PacI酶切的雙元載體pCGP1988(W02004-020637中記載)連接，將所得 到的質(zhì)粒作為PSPB3432。該雙元載體作為植物的轉(zhuǎn)化標(biāo)記，含有SurB基因。使用在康乃馨品種Vega中導(dǎo)入了 pSPB3432的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) AglO株以導(dǎo)入FT基因。有關(guān)向康乃馨中導(dǎo)入基因的方法，如PCT/AU94/00265 以及 Bio/Technology 9,864-868(1991)等中所記載。根據(jù)本發(fā)明，通過導(dǎo)入促進(jìn)開花的FT基因，能夠開發(fā)出在室內(nèi)開花的植物。這在 屋內(nèi)開花的事業(yè)，例如室內(nèi)栽培事業(yè)上很有意義。此外，因可通過使室內(nèi)觀賞用植物更具魅 力而來吸引消費(fèi)者，所以在室內(nèi)觀賞用植物的商業(yè)中也很有價(jià)值。
權(quán)利要求
一種在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，所述方法包括將FT基因?qū)腼@花植物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包括將FT基因?qū)腼@花植物中使所述FT基因高表 達(dá)的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其包括將FT基因?qū)腼@花植物中使所述FT基因組成 型過表達(dá)的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述FT基因來自阿拉伯芥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述FT基因是保持了促進(jìn)開花功能的變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述FT基因的組成型表達(dá)被來自 植物病毒的啟動(dòng)子誘導(dǎo)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述顯花植物為玄參科的藍(lán)豬耳、 茄科的矮牽牛、茄科的賽亞麻、馬鞭草科的馬鞭草、薔薇科的薔薇屬植物或石竹科的康乃 馨。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述低照度環(huán)境是不引起未導(dǎo)入 FT基因的同種植物開花的照明條件下的栽培環(huán)境。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述低照度環(huán)境為50 lOOOLux的照度。
10.一種轉(zhuǎn)基因植物，其是根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法制備的。
11.一種在低照度環(huán)境下誘導(dǎo)植物開花的方法，所述方法包括在與栽培未導(dǎo)入FT基因 的同種非重組顯花植物的照度環(huán)境相比較低的照度環(huán)境下栽培導(dǎo)入了 FT基因的轉(zhuǎn)基因顯 花植物的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，所述較低的照度環(huán)境是在未導(dǎo)入FT基因的同種植物 中不引起開花的照明條件下的栽培環(huán)境。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述較低的照度環(huán)境為50 lOOOLux的照度。
14.根據(jù)權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，栽培所述轉(zhuǎn)基因植物的條件是 組織培養(yǎng)或土壤栽培條件。
15.一種通過權(quán)利要求11 14中任一項(xiàng)所述的方法誘導(dǎo)顯花的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所 述顯花植物為玄參科的藍(lán)豬耳、茄科的矮牽牛、茄科的賽亞麻、馬鞭草科的馬鞭草、薔薇科 的薔薇屬植物或石竹科的康乃馨。
16.一種在低照度環(huán)境下能夠開花的轉(zhuǎn)基因植物試劑盒，其包含導(dǎo)入了 FT基因的轉(zhuǎn)基 因顯花植物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物為種子或開花前的苗木狀 態(tài)的植物。
全文摘要
本發(fā)明提供在低照度下開花的顯花植物的制備方法。具體地說，本發(fā)明涉及在低照度環(huán)境下能開花的轉(zhuǎn)基因植物、所述轉(zhuǎn)基因植物的制備方法、使所述植物開花的方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及通過將FT基因?qū)胫参镏袕亩诘驼斩拳h(huán)境(例如屋內(nèi))下開花的工程化的轉(zhuǎn)基因植物、所述轉(zhuǎn)基因植物的制備方法、使所述其植物開花的方法等。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101888774SQ20088011941
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者田中良和 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社