專利名稱：有效利用氮的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
分離白水稻(Oryza saliva)的谷氨酸脫羧酶(GAD)基因序列及其在植物中增強(qiáng)氮攝取和氮利用效率中的用途。
背景技術(shù)：
作物植物已有近10000年的歷史，并且大多數(shù)時間沒有強(qiáng)力施肥。然而，近50年間，世界范圍內(nèi)作物的氮肥使用量增加了超過20倍。這些肥料的使用效率不佳，因?yàn)閮H有約50%在植物收獲中被回收。作物植物并未在高氮營養(yǎng)條件下進(jìn)化，許多機(jī)制不一定適合在這種營養(yǎng)條件下的生長。因此問題在于，根據(jù)已有知識和實(shí)驗(yàn)，能否提高作物植物的氮利用效率？有兩種可能方式，一是充分利用基因庫中氮利用特征的可用變化，二是嘗試引入可能增加這種變化的新基因。增加植物的氮利用效率產(chǎn)生多種有益影響。例如，有效利用氮的植物在貧氮土壤中能夠生長，并且比常規(guī)植物產(chǎn)量更好。有效利用氮的植物減少對于施用氮肥的需求。施肥占了作物生產(chǎn)費(fèi)用的一大部分，因此減少肥料的使用將直接導(dǎo)致節(jié)約費(fèi)用。減少施肥還將減少氮肥廣泛應(yīng)用造成的環(huán)境損害。這些使用氮肥對環(huán)境造成的不利影響表現(xiàn)在增加水體富營養(yǎng)化、酸雨、土壤酸化和溫室效應(yīng)。現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)植物生物化學(xué)和生理學(xué)提供了更好了解作物生產(chǎn)系統(tǒng)與N供應(yīng)之間關(guān)系的方法。二氧化碳(CO2)和硝酸鹽(NO3_)同化的相互作用及動態(tài)對于作物生產(chǎn)至關(guān)重要。 NO3-的充足供應(yīng)，同化為氨基酸(這需要光合成碳化合物)和及其對于蛋白質(zhì)合成的可用性是代謝所必需。NO3-充足供應(yīng)刺激葉片生長和光合成，前者通過細(xì)胞生長和分裂實(shí)現(xiàn)，后者則由光反應(yīng)組分的較大成分以及CO2同化和相關(guān)步驟實(shí)現(xiàn)。然而，代謝和產(chǎn)量之間的聯(lián)系少有量化。必須更好的使用生化特征和刺激模型并將其組合以改進(jìn)N肥應(yīng)用、N使用效率和產(chǎn)量。使用遺傳學(xué)全部潛能，以及充足的N，每單位N更多的C同化，將增加生物量。遺傳學(xué)潛能可定義為當(dāng)沒有環(huán)境限制時，植物形成生物量或產(chǎn)量的全部能力；育種家和農(nóng)學(xué)家經(jīng)常提到產(chǎn)量潛能，但在考慮如何增加作物的潛在生長時，總產(chǎn)量更加切合。 產(chǎn)量潛能與遺傳信息相關(guān)聯(lián)，它說明了蛋白質(zhì)的特征，因此確定了結(jié)構(gòu)、生長和發(fā)育以及系統(tǒng)能夠生長的大小。生長周期中的最大尺寸成為遺傳學(xué)潛能。關(guān)鍵點(diǎn)是當(dāng)N供應(yīng)低于達(dá)到遺傳學(xué)潛能所需時，必須提高N攝取以得到更高的生物量?；蛘?，可增加每單位蓄積N的C同化，以從更小的N蓄積中得到更高的生物量。理論上通過增加每單位N蓄積的C同化，可增加產(chǎn)生生物量的遺傳學(xué)潛能，其代價是增加C/N比值。前提是光能量充足。如果同化了更多的N，但不改變與C同化的平衡，理論上可增加生物量并保持當(dāng)前的C/N比。植物學(xué)家長久以來意識到需要開發(fā)出更加有效吸收和利用營養(yǎng)的作物。兩種方法用于增加作物植物的營養(yǎng)利用效率(NUE)。第一種方法包括傳統(tǒng)育種，以及標(biāo)記物輔助選擇以鑒定涉及的基因。第二種方法使用經(jīng)設(shè)計(jì)提高NUE的特定方面的新基因構(gòu)建物。
硝酸鹽還原酶氮同化通路中兩個連續(xù)的酶催化步驟將硝酸鹽還原為氨。首先硝酸鹽還原酶(NR) 將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，然后亞硝酸鹽從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體，在葉綠體中被亞硝酸鹽還原酶(NiR)還原為氨。植物中NR基因的表達(dá)受多種內(nèi)源和環(huán)境因素影響，并且在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平高度受到調(diào)控?？傊诜治龅慕M織中，NR過表達(dá)似乎降低亞硝酸鹽的水平。在植物中過表達(dá)NR或NiR基因能增加mRNA水平，并常常影響N攝取。然而，無論可用的氮源如何，N攝取的增加似乎都不提高植物的產(chǎn)量或生長。這被認(rèn)為部分是因?yàn)镹R調(diào)節(jié)和整體通路調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。谷胺酰胺合成酶和谷氨酸合酶在高等植物中發(fā)現(xiàn)了氨同化中的重要酶對谷胺酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶 (GOGAT)之后[Miflin和Lea，1976]，多個實(shí)驗(yàn)室聚焦于理解該通路的調(diào)控機(jī)理[Harrison 等，2000]。此外，已產(chǎn)生GS/G0GAT水平改變的突變體或轉(zhuǎn)基因植物以確定這些蛋白質(zhì)在植物發(fā)育中的效應(yīng)，并研究GS多基因家族不同成員的表達(dá)。多個研究表明轉(zhuǎn)基因植物中GS 活性增強(qiáng)與生物量或產(chǎn)量的直接相關(guān)性。與GS相比，很少有報道描述過表達(dá)GOGAT的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量。過表達(dá)苜蓿GOGAT基因的轉(zhuǎn)基因植物顯示GOGAT蛋白含量增加，但沒有表現(xiàn)任何與此性狀相關(guān)的表型。GABA 旁路Y-氨基丁酸(GABA)是含四個碳原子的非蛋白質(zhì)氨基酸，在細(xì)菌、植物和脊椎動物中具有保守性。GABA是游離氨基酸池的重要組分。GABA在γ碳而非α碳上具有氨基， 以未結(jié)合的形式存在。它具有高水溶性。就結(jié)構(gòu)而言，它是柔性分子，可在溶液中采取若干構(gòu)象，包括與脯氨酸1類似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。GABA在生理ρΗ值(ρΚ值為4. 03和10. 56)下為兩性離子(同時攜帶正電荷和負(fù)電荷)。這于半個多世紀(jì)前在植物中發(fā)現(xiàn)，但揭示GABA在大腦中以高水平產(chǎn)生并在神經(jīng)傳遞中發(fā)揮主要作用時，對GABA的興趣轉(zhuǎn)移到了動物上。此后，在脊椎動物中對GABA的研究就主要集中在其作為信號傳導(dǎo)分子特別是在神經(jīng)傳遞中的作用上。在植物和動物中， GABA主要經(jīng)包含三種酶的短途徑進(jìn)行代謝，所述短途徑稱為GABA旁路，因?yàn)樗@過了三羧酸(TCA)循環(huán)中兩個步驟。所述途徑包含胞質(zhì)酶谷氨酸脫羧酶(GAD)與線粒體酶GABA氨基轉(zhuǎn)移酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脫氫酶(SSADH)。該保守代謝途徑的調(diào)節(jié)在植物中似乎具有特定特征。經(jīng)GABA將谷氨酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸的途徑稱為GABA旁路。該旁路的第一步是通過谷氨酸脫羧酶(GAD，EC 4. 1. 1. 15)對谷氨酸進(jìn)行直接和不可逆的α -脫羧化。已在多個植物種類和組織的粗提物中對體外GAD活性進(jìn)行了表征(Brown和Shelp，1989)。GAD對 L-谷氨酸具有特異性，具有吡多醛5’-磷酸依賴性，受已知與巰基反應(yīng)的試劑的抑制作用， 具有鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，顯示約-5. 8的明顯酸性的最適宜ρΗ。已鑒定了來自矮牽?；?(Baum 等，1993)、番茄(Gallego 等，1995)、煙草(Yu 和 Oh, 1998)和擬南芥(Zik 等，1998) 的GAD基因。參與GABA旁路的第二個酶是GABA氨基轉(zhuǎn)移酶(GABA-T ；EC 2. 6. 1. 19)，其將丙酮酸或a-酮戊二酸作為氨基受體，催化GABA可逆地轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛。在粗提物中，相對于α-酮戊二酸，體外GABA-T活性似乎更愿選擇丙酮酸。然而，煙草葉的粗提物中存在不同的丙酮酸依賴性和α “酮戊二酸依賴性活性，它們可通過離子交換色譜進(jìn)行相互分離(Van Cauwenberghe和Shelp)。兩種活性顯示的最適宜pH很寬，為8_10。來自煙草的純化約1000倍的丙酮酸特異性線粒體GABA-T的米氏常數(shù)(Km)就GABA為1. 2mM,就丙酮酸為 0. 24mM(Van Cauwenberghe 禾口 Shelp)。GABA旁路的最后一步由琥珀酸半醛脫氫酶(SSADH ；EC 1. 2. 1. 16)催化，不可逆地將琥珀酸半醛氧化為琥珀酸。所述部分純化的植物酶具有約為_9的堿性最適宜pH，與NAD 的活性最多是與NADP的活性的20倍(Shelp等，1995)。實(shí)際上，對植物中GABA旁路的興趣主要來自關(guān)于GABA主要在對生物性脅迫和非生物性脅迫作出應(yīng)答時快速產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)觀察。從此將GABA旁路與各種生理應(yīng)答聯(lián)系起來， 包括胞質(zhì)PH調(diào)節(jié)、TCA循環(huán)碳流入、氮代謝、阻止昆蟲、針對氧化脅迫的保護(hù)作用、滲透調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)。本發(fā)明中，我們將植物中自從發(fā)現(xiàn)GABA的這些發(fā)現(xiàn)和其它發(fā)現(xiàn)以及最近的證據(jù) (主要來自擬南芥功能基因組方法)聯(lián)系在一起，表明GABA在植物中作為信號分子的可能作用，以及在植物應(yīng)激反應(yīng)和碳氮(C:N)平衡中的其它作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在植物(包括單子葉植物和雙子葉植物)中使用谷氨酸脫羧酶基因通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化增加氮利用效率的方法。此外，本發(fā)明涉及一種使植物表達(dá)氮利用效率相關(guān)基因的植物修飾方法，以及采用該方法產(chǎn)生的植物。本文首次報道利用谷氨酸脫羧酶基因增加植物氮攝取和氮利用效率的方法。并且使用了硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶基因。迄今為止沒有人嘗試過使用參與GABA旁路的基因，尤其是谷氨酸脫羧酶來增加植物的氮利用效率。許多研究聚焦于植物碳氮平衡和氮同化中谷氨酸脫氫酶的工作，并對谷氨酸脫氫酶的重要性進(jìn)行綜述(Miflin和Habash 2002)。然而之前的嘗試集中在水稻OsGADl和0sGAD2的兩種谷氨酸脫羧酶基因，通過土壤桿菌將兩者同時引入水稻愈傷組織以建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，產(chǎn)生表型異常，如矮小、葉片黃化和不育的水稻植株(Akama和Takaiwa，2007)。因此在低氮條件下生長時需要對氮進(jìn)行有效利用。序列表SEQ ID 1顯示水稻谷氨酸脫羧酶基因的核酸序列。起始密碼子和終止密碼子用斜體表示。SEQ ID 2顯示水稻谷氨酸脫羧酶基因的氨基酸序列。星號表示終止密碼子。附圖簡要說明


圖1顯示攜帶谷氨酸脫羧酶編碼DNA序列的植物轉(zhuǎn)化載體。圖2顯示通過土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移用GAD基因轉(zhuǎn)化煙草葉的不同階段。圖3顯示用以下不同的引物組合對轉(zhuǎn)化和再生的具有GAD基因的煙草TO幼苗進(jìn)行的PCR證實(shí)，-a) HygR基因的正向和反向引物；b)基因特異性正向和反向引物和c)基因正向引物和Nos反向引物。圖4顯示對具有GAD基因的煙草TO幼苗中引入基因(GAD)表達(dá)的證實(shí)，其中采用以cDNA為模板的RT-PCR用GAD基因特異性正向和反向引物分析GAD基因。圖5顯示與對照植物相比，TO代不同的轉(zhuǎn)基因植株葉片中的總氮含量百分?jǐn)?shù)。
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圖6顯示了溫室中生長的三種GAD轉(zhuǎn)基因植物(D1A，E2和Hl)的Tl幼苗的植物氮狀態(tài)，幼苗生長于不含N源的l/10th MS培養(yǎng)液中，以不同濃度的硝酸銨(2、4和8mM)獨(dú)立提供N，并與野生型的葉綠素含量作比較。用明諾塔(Minolta) SPAD讀數(shù)儀讀值，并以SPAD 單位表示。數(shù)值來自5株幼苗(生物樣品)，每株幼苗進(jìn)行3次讀值(實(shí)驗(yàn)樣品)。圖7顯示了溫室中生長的三種GAD轉(zhuǎn)基因植物(D1A、E2和Hl)的Tl幼苗的植物氮狀態(tài)，幼苗生長于不含N源的l/10th MS培養(yǎng)液中，以不同濃度的硝酸鉀(2、4和8mM)獨(dú)立提供N，并與野生型的葉綠素含量作比較。用明諾塔SPAD讀數(shù)儀讀值，并以SPAD單位表示。數(shù)值來自5株幼苗(生物樣品)，每株幼苗進(jìn)行3次讀值(實(shí)驗(yàn)樣品)。圖8顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(Hl)Tl幼苗和野生型幼苗植株高度的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。圖9顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(Hl)Tl幼苗和野生型幼苗節(jié)間距的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖10顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI) Tl幼苗和野生型幼苗分枝數(shù)目的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖11顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(Hl)Tl幼苗和野生型幼苗葉片數(shù)目的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖12顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI) Tl幼苗和野生型幼苗莖周長的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖13顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI) Tl幼苗和野生型幼苗葉面積的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖14顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI) Tl幼苗和野生型幼苗以干重計(jì)算的總生物量(葉、莖和根)的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量 (RD) ,50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖15顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI)Tl幼苗和野生型幼苗以單位干重計(jì)算的葉片總N百分?jǐn)?shù)的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量 (RD) ,50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
圖16顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI) Tl幼苗和野生型幼苗以單位干重計(jì)算的氮利用效率(NUE)的比較(根據(jù)生物量/生物量中的N含量進(jìn)行計(jì)算)，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD) ,50% RD和10% RD)，而磷肥和鉀肥水平恒
定的溫室罐中。
圖17顯示來自潮霉素抗性陽性的GAD轉(zhuǎn)基因(HI) Tl幼苗和野生型幼苗總谷物產(chǎn)量的比較，這些幼苗生長于含有不同水平氮肥(100%推薦劑量(RD)、50% RD和10% RD)， 而磷肥和鉀肥水平恒定的溫室罐中。
發(fā)明詳述提供以下對本發(fā)明的詳細(xì)說明來協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。即使如此，不應(yīng)將對本發(fā)明的詳細(xì)說明理解為對本發(fā)明構(gòu)成不適當(dāng)?shù)南拗?，因?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可作出本文所討論的實(shí)施方式中的修改和變動，而不背離本發(fā)明的精神或范圍。本發(fā)明涉及一種具有谷氨酸脫羧酶特征的純化分離的DNA序列。如本發(fā)明所述，所述純化分離的DNA序列通常由谷氨酸脫羧酶核苷酸序列或其片段組成。本發(fā)明還包括上述序列或片段的互補(bǔ)序列，其可通過任何手段產(chǎn)生。本發(fā)明包括上述序列的變體，即通過保守核苷酸取代而不同于參考序列的核苷酸序列，其中一個或多個核苷酸被其它具有相同特征的核苷酸取代。如本發(fā)明所述，上述核苷酸序列可位于表達(dá)載體中包含啟動子和感興趣基因的序列的5’和3’端。本發(fā)明包括上述序列在增加由其產(chǎn)生的植物的氮利用效率中的用途?！暗眯省敝冈诤线m條件下將DNA序列引入宿主植物后，與沒有轉(zhuǎn)化所述DNA序列的對照植物相比，所述序列能夠提高植物中的氮水平。以下定義用來幫助理解本發(fā)明?！叭旧w”是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DNA和蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)?！叭旧|(zhì)”是在真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合體，其組成染色體。“DNA”或脫氧核糖核酸包含遺傳信息。其由不同的核苷酸構(gòu)成?！盎颉笔蔷幋a成熟蛋白質(zhì)的脫氧核糖核苷酸(DNA)序列，“基因”不應(yīng)包含不翻譯側(cè)翼序列如RNA轉(zhuǎn)錄起始信號、多聚腺苷酸化添加位點(diǎn)、啟動子或增強(qiáng)子?！皢幼印笔强刂苹虮磉_(dá)的核酸序列?！霸鰪?qiáng)子”指不依賴基因位置或取向而啟動基因轉(zhuǎn)錄的基因序列。本文定義的“載體”指可向其中插入外源DNA片段的DNA分子。載體通常衍生自質(zhì)粒，其作用類似“分子運(yùn)載體”，攜帶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞?！百|(zhì)粒”是在細(xì)菌和一些其它生物體中發(fā)現(xiàn)的小環(huán)狀DNA。質(zhì)?？瑟?dú)立于宿主細(xì)胞染色體進(jìn)行復(fù)制?！稗D(zhuǎn)錄”指從DNA模板合成RNA?！胺g”指從信使RNA合成多肽?！叭∠颉敝窪NA序列中核苷酸的次序?！盎驍U(kuò)增”指對某個基因進(jìn)行重復(fù)復(fù)制而不引起其它基因拷貝數(shù)量成比例增多。“轉(zhuǎn)化”指通過任何轉(zhuǎn)移手段向植物細(xì)胞引入外源遺傳材料(DNA)。不同的轉(zhuǎn)化方法包括基因槍轟擊(生物射彈)、電穿孔、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等?！稗D(zhuǎn)化植物”指將外源DNA引入其中的植物。該DNA將成為宿主染色體的一部分。“穩(wěn)定的基因表達(dá)”指制備永久性表達(dá)感興趣基因的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植物取決于質(zhì)粒穩(wěn)定整合到宿主染色體中。盡管本發(fā)明如上述定義廣泛，但本發(fā)明的熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明并不限于此，還包括下文中包含實(shí)施例的實(shí)施方式。實(shí)施例1
從水稻分離和純化GAD基因核苷酸序列，構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體。將GAD基因克隆到35S花椰菜花葉病毒啟動子下游，用NOS終止子終止，全部為操作性連接。植物材料將水稻(Rasi變種)用于制備核酸。種子萌發(fā)后，將其置于培養(yǎng)室的水栽溶液中培育。用150mM NaCl對幼苗處理7-16小時。RNA抽提和EST文庫構(gòu)建從整株幼苗中提取RNA。構(gòu)建受鹽脅迫的Rasi cDNA的EST文庫。從EST文庫中鑒定顯示與谷氨酸脫羧酶具有相同性的EST。鑒定和分離GABA旁路中的基因在高等植物中GABA在各種應(yīng)激開始之后發(fā)生累積，所述應(yīng)激如酸化作用、缺氧、 低溫、熱激、機(jī)械性刺激、病原體侵襲、干旱和鹽脅迫。已從水稻的鹽脅迫文庫中分離出GABA 旁路中的谷氨酸脫羧酶基因。克隆谷氨酸脫羧酶基因已將谷氨酸脫羧酶基因克隆到克隆載體和植物轉(zhuǎn)化載體中(生物射彈，二等分)， 位于組成型啟動子之下。使用如下BglII和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)(有下劃線的核苷酸序列)標(biāo)記引物對從秈稻(RASI變種)的cDNA中擴(kuò)增編碼谷氨酸脫羧酶基因的完整編碼序列的cDNA。正向5'-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-3‘反向5'GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-3‘采用以下PCR條件94°C 1分鐘；94°C 30秒；75°C 3分鐘(循環(huán)5次)；94°C 30 秒；68°C 3分鐘(循環(huán)30次)，68°C最后延伸7分鐘。擴(kuò)增的cDNA由1479個核苷酸堿基對組成，編碼成熟的谷氨酸脫羧酶。將擴(kuò)增的片段克隆到pGEMT輕便(pGEMT easy)載體中。用限制酶在BamHI和 EcoRI位點(diǎn)消化所述基因，并連接到生物射彈載體pVl中。在BglII和EcoRI限制位點(diǎn)切割該生物射彈載體(BglII和BamHI酶產(chǎn)生相容性末端)以證實(shí)存在所述基因。還通過測序證實(shí)所述基因。所得載體(pVl-GAD)具有受35S花椰菜花葉病毒(35S CaNfV)啟動子驅(qū)動和NOS終止子終止的GAD基因(1. 479kb)，其中用氨芐青霉素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。在HindIII和BamHI位點(diǎn)限制性消化來自pVl_GD的由35S CaMV啟動子驅(qū)動和 NOS終止子終止的GAD基因的基因盒。將該基因盒連接到在HindIII和BamHI位點(diǎn)限制性消化的pCAMBIA 1390pNG15中。所得載體(pAPTV1390_GAD)具有由35S花椰菜花葉病毒 (35S CaMV)啟動子驅(qū)動和NOS終止子終止的GAD基因(1. 479kb)，其中nptll (卡那霉素抗性)基因和hph (潮霉素抗性)基因作為選擇性標(biāo)記(
圖1)。實(shí)施例2產(chǎn)生GAD基因改變并且氮含量更高的植物植物轉(zhuǎn)化以通過土壤桿菌將谷氨酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)化到煙草(模式植物)，以證明所鑒定基因的構(gòu)思。土壤桿菌介導(dǎo)的用攜帶GAD基因的二元載體(binary vector)轉(zhuǎn)化煙草葉外植體的詳細(xì)步驟如下1.將土壤桿菌的陽性菌落接種到含50mg/L卡那霉素(Kan)和10mg/L利福霉素 (Rif)的LB肉湯中作為由Kan和Rif抗性基因組成的載體主鏈，同時也作為一次進(jìn)行的雙
重選擇。2.然后將所述肉湯置于搖床上在28°C下培育。3.將過夜生長的菌落在早上接種到含50mg/L Kan和10mg/L Rif的50mLLB肉湯中，在28°C培育3-4小時，檢測600nm的0D,并使其繼續(xù)生長到OD為0. 6-1。4. 一旦所述肉湯達(dá)到所需0D，將其在5000rpm離心5分鐘。5.棄去上清液，將細(xì)胞沉淀溶解在穆拉什格斯固格(Murashige和Sk00ge，MS)液體培養(yǎng)基(Agro-MS肉湯)中。6.將煙草葉切為小方片作為外植體而不攜帶中脈，小心地在所有四個面上對葉進(jìn)行破壞而不損傷接種物的中心部分。7.將這些葉樣品置于MS普通培養(yǎng)基上，在培育箱中放置兩天。接種兩天后，用現(xiàn)處于Agro-MS肉湯中的土壤桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化這些葉樣品。8.將所述葉樣品在該Agro-MS肉湯中放置30分鐘，然后將其在共培養(yǎng)基上放置兩天，所述共培養(yǎng)基由MS+lmg/L鹽酸6-芐氨基嘌呤(BAP) +0. 2mg/L萘乙酸(NAA) +250mg/ L頭孢噻肟組成(圖2a)。9.在共培育后，在 MS+lmg/L BAP+0. 2mg/L NAA+40mg Hyg+250mg/L 頭孢噻肟組成的第一選擇培養(yǎng)基中放置外植體15天，當(dāng)愈傷組織出芽時將這些外植體再次置于第一選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行亞培養(yǎng)，以便使愈傷組織足夠成熟(圖2b)。10. 一旦發(fā)現(xiàn)所述愈傷組織達(dá)到成熟，將這些愈傷組織接種到第二選擇培養(yǎng)基上， 所述第二選擇培養(yǎng)基由MS+lmg/L BAP+0. 2mg/L NAA+50mgHyg+250mg/L頭孢噻肟組成。隨著潮霉素濃度增大，從第一選擇逃離的逃離例受到抑制，僅有轉(zhuǎn)化的愈傷組織開始在該培
養(yǎng)基上存活。11.隨后10天中在該第二培養(yǎng)基上進(jìn)行一次亞培養(yǎng)。12.這時候，愈傷組織開始長出小植株。取出來自第二選擇的小植株置于生根培養(yǎng)基上，所述生根培養(yǎng)基由1/2MS+0. 2mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)組成。此處的小植株在12-15 天時開始伸出根部。由于也開在該階段鑒定逃離例，一旦形成成熟的根，將所述植物在含 20mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行亞培養(yǎng)(圖2c)。13.使該階段的植物習(xí)服，其中將瓶蓋在開放狀態(tài)保持兩天，使植物適應(yīng)其生長空間環(huán)境。之后將植物從瓊脂培養(yǎng)基上移出并在1/4MS液體培養(yǎng)基上放置兩天。再將這些植物轉(zhuǎn)移到蛭石上，每天澆水，持續(xù)一周。14.根據(jù)植株的條件，將合適的植株轉(zhuǎn)移到溫室。15.在將植株送到溫室之前的習(xí)服期間收集植株的老葉。16.從各葉樣品提取DNA，用基因特異性引物和選擇性標(biāo)記如潮霉素引物進(jìn)行 PCR0再將PCR證實(shí)的陽性植物轉(zhuǎn)移到溫室。用引入的GAD基因證實(shí)植物提取GAD煙草轉(zhuǎn)基因品系的基因組DNA收集轉(zhuǎn)基因GAD煙草植株的葉樣品，提取基因組DNA。
基因組DNA提取的步驟·從各植株收集約Igm葉。·用液氮在研缽和臼中研磨所述樣品。·向所述樣品中加入 Iml 提取緩沖液(0. 2M Tris Cl pH-8. 0 ；2M NaCl ；0. 05M EDTA ；2% CTAB)，在 13000rpm 離心 10 分鐘?！な占锨逡?。加入RNA酶[Iml加入3yl(lmg/mL)]，在37°C培養(yǎng)半小時?！と缓蠹尤胂嗟润w積的氯仿-異戊醇，在13000rpm離心10分鐘。 將上清液收集在新試管中，加入相等體積的冷異丙醇，在13000rpm離心10分鐘?！び?0%的醇洗滌沉淀，將沉淀干燥并溶解在30 μ 1溫?zé)岬母邏簻缇小?將1 μ 1 DNA加樣到凝膠上進(jìn)行檢測。用不同引物組合進(jìn)行PCR證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物1.用潮霉素正向(Hyg F)和潮霉素反向(Hyg R)引物進(jìn)行PCR:
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生氮含量升高或氮利用效率增高的轉(zhuǎn)化植物的方法，包括將包含與編碼功能性谷氨酸脫羧酶(GAD)的核苷酸序列操作性連接的啟動子的DNA構(gòu)建物摻入植物基因組中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼功能性谷氨酸脫羧酶的核苷酸序列包含SEQ ID No. 1所列核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述啟動子選自操作性連接于SEQID No. 1 所列核苷酸序列的組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異性啟動子和細(xì)胞類型特異性啟動子。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述啟動子選自誘導(dǎo)型啟動子，對于選自下組的信號產(chǎn)生響應(yīng)營養(yǎng)匱乏、機(jī)械性刺激、洪水、鹽、干旱、熱、冷、創(chuàng)傷、缺氧、病原體、紫外線B、開花信號、結(jié)果信號、細(xì)胞特化及其組合。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述啟動子選自組織特異性啟動子，在選自下組的植物組織中表達(dá)葉、莖、根、花、花瓣、花藥、胚珠等，及其組合。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述啟動子選自細(xì)胞類型特異性啟動子，在選自下組的植物細(xì)胞中表達(dá)薄壁組織、葉肉、木質(zhì)部、韌皮部、保衛(wèi)細(xì)胞、氣孔細(xì)胞等，及其組合。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脫羧酶包含SEQIDN0:2所列的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述SEQID No. 2所列的氨基酸序列有效催化谷氨酸到Y(jié)-氨基丁酸(GABA)的反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化植物表達(dá)SEQID No. 1所列的谷氨酸脫羧酶(GAD)基因，其表達(dá)水平高于在相同條件下同種非轉(zhuǎn)化植物表達(dá)GAD基因的水平。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶植物選自單子葉植物、雙子葉植物、 谷類、飼料作物、豆科植物、豆類植物、蔬菜、水果、油料種子、纖維作物、花卉、園藝植物、藥用植物和芳香植物。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將DNA構(gòu)建物摻入植物基因組的方法包括(i)用所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化來自宿主植物的細(xì)胞、組織或器官；( )選擇包含所述DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、細(xì)胞愈傷組織、體細(xì)胞胚或種子；(iii)從所選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、細(xì)胞愈傷組織、體細(xì)胞胚或種子再生完整植株；和(iv)選擇表達(dá)所述多核苷酸的再生完整植株。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，采用顆粒槍、生物射彈或土壤桿菌介導(dǎo)所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述來自宿主植物的細(xì)胞組織或器官。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述方法獲得的轉(zhuǎn)化植物及其后代。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，所述SEQID No. 1所列的DNA構(gòu)建物摻入雜合或純合狀態(tài)的植物中。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，所述植物在選自下組的環(huán)境應(yīng)激下氮含量或者氮利用效率顯著增加營養(yǎng)匱乏、機(jī)械性刺激、洪水、鹽、干旱、熱、 冷、創(chuàng)傷、缺氧、病原體及其組合。
16. 一種用包含與編碼GAD酶的多核苷酸操作性連接的組成型啟動子的載體轉(zhuǎn)化的植物或其后代；其中所述植物表達(dá)所述多核苷酸；并且與非轉(zhuǎn)化植物相比，所述植物的氮含量、氮利用效率、生長特征、產(chǎn)量、繁殖功能或其它形態(tài)學(xué)或農(nóng)藝學(xué)特征顯著改善。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離自水稻(Oryza sativa)(Rasi變體)的谷氨酸脫羧酶(GAD)基因序列以及其對應(yīng)的編碼多肽，它們產(chǎn)生提高植物氮利用效率的性狀。本發(fā)明還涉及這些核酸分子和多肽在制備氮利用效率提高的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物材料或植物種子中的用途。
文檔編號A01H5/00GK102177241SQ200980136157
公開日2011年9月7日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者M·蘭馬克里斯南, M·文卡塔拉曼恩, S·尼姆巴爾卡, S·薩達(dá)西范, V·M·帕特爾 申請人:阿維斯塔根有限公司