專利名稱：：篩選細胞內化核酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學和生物化學領域。更具體地說，本發(fā)明涉及核酸定向，以及篩選和輸送包含RNA的分子的方法、組合物以及試劑盒。
背景技術：
：目前，將試劑輸送到細胞內需要對應的輸送裝置，這些裝置通常有毒性、效率低下，或者特異性很差。此外，許多輸送進入細胞的試劑有毒，并且要求特異和快速地內化進入適當?shù)募毎苑乐箤C體造成不希望有的毒性。
發(fā)明內容人們需要一種起到識別和篩選作用的化合物，這種化合物能夠將試劑輸送到細胞內，同時對機體的毒性和非特異性作用降低。另外，人們需要一種篩選能夠快速將試劑內化進入預定組織、細胞，或細胞群的化合物的方法。通過分析細胞內化的機制，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些種類的分子可以將分子"貨物"輸送進入細胞。該發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被用于提供篩選、優(yōu)化，和/或修飾這些分子的方法以利于細胞內化和分子貨物輸送。根據(jù)某些觀點，一些方法也可用來鑒別最快內化的分子。一方面，本發(fā)明提供一種篩選核酸酶抗性的包含RNA的分子的方法，在某些實施方式中，這些分子是固定化的。該方法包括使細胞(例如真核或原核細胞)與包含RNA的分子的隨機庫接觸，然后將與隨機庫接觸的細胞用一種或多種核酸酶處理。從細胞中提取出總RNA并且擴增，以篩選包含RNA的分子一這些分子已經(jīng)進入細胞并且是核酸酶抗性分子b因此，該方法可篩選核酸酶抗性的已經(jīng)內化進入細胞的包含RNA的分子。在一些特別的實施方式中，這些RNAs起到在其它輸送材料，如陽離子脂質體、脂質體，或電穿孔不存在的情況下使化合物內化進入細胞的功能。另一方面，本發(fā)明提供一種篩選可內化的包含RNA的分子的方法。該方法需要使細胞(例如一種真核細胞或原核細胞)與包含RNA的分子的隨機庫接觸。將與隨機庫接觸的細胞用一種或多種核酸酶處理。提取這些細胞的總RNA并且擴增，使得提取出來的包含RNA的分子得到擴增。在一些實施方式中，重復利用從一輪篩選中鑒別出包含RNA的分子的篩選方法。在其它的實施方式中，一種內化的包含RNA的分子是通過兩輪或更多輪的篩選方法篩選出來的。在某些實施方式中，一種內化的包含RNA的分子是通過至少十輪的篩選方法篩選出來的。在某些實施方式中，可內化的包含RNA的分子在每個后一輪的篩選中與細胞接觸的時間遞減。在一些特別的實施方式中，可內化的包含RNA的分子與細胞接觸大約24小時。在更特別的實施方式中，可內化的包含RNA的分子與細胞接觸的時間小于10小時。在更進一步的實施方式中，可內化的包含RNA的分子與細胞接觸的時間小于5小時。在其它實施方式中，可內化的包含RNA的分子與細胞接觸的時間小于2小時，小于1小時，小于30分鐘，小于20分鐘，小于10分鐘，小于5分鐘，小于2分鐘，小于1分鐘，或小于30秒。在很特別的實施方式中，該方法包括通過多輪的篩選來分離可內化的、包含RNA的分子，其中每個后一輪的篩選使得從前一輪獲得的可內化的包含RNA的分子與細胞接觸的時間與該前一輪處理的時間相比減少。例如，第一輪的篩選包括使可內化的包含RNA的分子與細胞接觸10小時，第二輪使得從第一輪中篩選出來的包含RNA的分子與細胞接觸5小時，然后，從第二輪篩選出來的包含RNA的分子與細胞接觸2小時等等。這樣的程序能夠鑒別出那些能夠最快地內化進入我們所感興趣的細胞內的化合物。在其他的實施方式中，文庫中包含從隨機序列庫中得到的功能性的包含RNA的分子。在某些實施方式中，這些RNAs的每一個至少包含一個隨機序列。在別的實施方式中，包含RNA的分子包含至少一個恒定序列。在更特別的實施方式中，RNAs包含兩個或更多恒定序列。在更多實施方式中，隨機序列包括至少10個核苷酸。在某些實施方式中，隨機序列包括至少20個核苷酸。在某些實施方式中，隨機序列包括至少30個核苷酸。在特別的實施方式中，隨機序列包括至少40個核苷酸。在更特別的實施方式中，隨機序列包括至少50個核苷酸、60個核苷酸、70個核苷酸、80個核苷酸、90個核苷酸，或超過IOO個核苷酸。在更多的實施方式中，隨機庫包括固定化的RNAs。在某些實施方式中，該固定化的RNAs是2'-熒光修飾的RNA庫。在一個實施例中，該方法包括確定內化核酸的步驟。在一些實施例中，該步驟包括直接測序，反轉錄酶-聚合酶鏈式反應，與陣列結合，質譜分析以及上述方式的組合。在特定的實施方式中，核酸酶包括核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶l、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素5'核糖核酸外切酶、脫帽酶、脫腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I，1*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2，0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(OligoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St以及上述酶的聯(lián)合，或者市場上可買到的核酸酶組合,在別的實施方式中，該核酸酶是脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶IIa或脫氧核糖核酸酶II!J。在某些實施方式中，篩選特定的核酸用于內化進入表達CD4受體的細胞(例如HeLa細胞)。在另外一些實施方式中，所篩選的包含RNA的分子連接有siRNAs、毒素、miRNAs、小分子及其他分子，用于轉送進入表達CD4的卻胞，如Hela細胞中。說明書第3/18頁在某些方面，一些篩選能夠內化進入細胞的RNA的方案沒有借助于己經(jīng)開發(fā)出的傳統(tǒng)的轉染或輸送裝置(例如，陽離子脂質體、電穿孔、轉染試劑等等)。該方案可適于產(chǎn)生內化進入特定細胞、不同狀態(tài)的細胞、或普通的細胞。包含RNA的分子可以篩選攜帶有不同的應用于治療、診斷、或檢測的分子貨物。這包括多種將小分子轉送進入細胞或標記細胞的技術，包括但不限于基因表達調節(jié)，如siRNA剔除研究；致死藥物轉送；FACS分析；腫瘤檢測等等。另外一個方面，本發(fā)明還提供了用于篩選可內化的包含RNA的分子組合物以及方法，它是使一種或多種細胞與包含恒定序列區(qū)域的隨機核酸文庫接觸；洗滌該細胞；使該細胞暴露于一種或多種核酸酶中；從該細胞中提取總核糖核酸；以及擴增內化的核糖核酸，例如，通過逆轉錄、聚合酶鏈式反應以及轉錄所提取的核酸，其中每個后一輪的篩選包括使細胞與擴增的核酸池接觸的時間遞減。包含RNA的分子可以包含RNA、DNA、修飾的RNA，或者嵌合的核酸。該分子還可以至少具有部分的核酸酶抗性。在一個實施例中，包括了一個確定內化核酸序列的步驟。該步驟可以包含直接測序、反轉錄酶-聚合酶鏈式反應、與陣列結合、質譜分析以及上述的組合。在某些實施方式中，用于該方法的核酸酶是RNases或稱核糖核酸酶。在一些實施例中，核酸酶包括核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶l、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒細胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳動物核糖核酸酶l、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5'-3'核糖核酸外切酶、3'-5'核糖核酸外切酶、脫帽酶、脫腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I，1*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2，0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(01igoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St以及上述酶的聯(lián)合，或者市場上可買到的核酸酶組合以及它們的組合或者市場上可買到的核酸酶混合物。在別的實施方式中，核酸酶是脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶IIa或脫氧核糖核酸酶II1J。在別的實施方式中，細胞可能經(jīng)過處理，以防止在細胞與文庫接觸期間的有活性的內吞作用(activeendocytosis)。為了便于利用，在某些實施方式中，核酸進行可檢測的標記。在特定的實施方式中，標記是染料標記、熒光標記、放射性標記、或化學發(fā)光標記?？蓹z測的標記的例子包括一種或多種發(fā)色團、一段擴增的核酸序列、一種酶、一種肽、一種金屬,、一種磁珠、一種聚合珠、一種樹枝狀化合物(dendrimer)、一種脂質體、一種量子點、一種熒光共振能量傳遞分子或別的核酸。在一些實施例中，細胞在與包含RNA的分子文庫接觸前被固定。在其它的實施方式中，包含RNA的分子包括第二種分子或者與第二種分子相連接，例如，siRNAs、miRNAs、小分子、毒素、或其它起轉運進入細胞作用的分子。在其它的實施方式中，包含RNA的分子通過雜交、共價結合、生物素化、與抗生物素蛋白鏈6菌素綴合、非特異性結合、螯合作用、定向于特定氨基酸序列，以及上述方式的組合而綴合到一種作為內化靶標的分子上。在其它的實施方式中，該包含RNA的分子進行可檢測的標記。在特定的實施方式中，包含RNA的分子可操作地連接于可檢測的標記，例如化學發(fā)光標記、放射性同位素標記、或熒光標記上。在某些實施方式中，包含RNA的分子經(jīng)由體內FISH、FACS、微陣列，或顯微術而鑒別出來。在其它的實施方式中，篩選那些不進入細胞而保持在細胞外溶液中的核酸。在一個實施例中，篩選進入細胞然后再從細胞中重新出來的核酸，例如，通過ti環(huán)胞吞途45(cyclingendocytoticpathway)。另一方面，該方法也包括接觸一種或多種宿主有機體內細胞的步驟，在其中宿主核酸酶破壞沒有被靶細胞、器官、或代謝區(qū)(compartment)吸收的核酸，并且剩余的核酸被分離出來。用于內化核酸篩選的細胞的篩選是基于細胞或分子表型，包括細胞形態(tài)、熒光蛋白表達、表面標志表達、或凋亡等特性。另一個方面，本發(fā)明提供一種篩選穩(wěn)定的、可內化的包含RNA的分子的方法，其包括使一種或多種細胞與包含RNA的分子的隨機文庫接觸，該隨機文庫中的包含RNA的分子包括穩(wěn)定的核酸以及恒定序列區(qū)域。細胞經(jīng)洗滌，然后與一種或多種核酸酶接觸。然后提取出細胞中的總核糖核酸，再將內化的包含RNA的分子進行擴增。重復這些篩選步驟，每個后一輪的篩選包括反復地使細胞與擴增的核糖核酸分子池接觸的時間遞減。在一些實施例中，包含RNA的分子通過RT-PCR進行擴增。在一些實施例中，包含RNA的分子包括RNA、DNA、修飾的RNA、或嵌合的核酸。在某些實施方式中，包含RNA的分子至少具有部分的核酸酶抗性。在特定的實施方式中，穩(wěn)定的包含RNA的分子包括2'-熒光修飾的核酸。在一些實施例中，包含RNA的分子與siRNAs、miRNAs、小分子、毒素，或適體連接。在特定的實施方式中，包含RNA的分子中的核酸具有可檢測的標記，例如帶有熒光標記、放射性標記或化學發(fā)光標記。在一些實施例中，隨機序列文庫中包含RNA的分子的序列包括至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、至少70個核苷酸、至少80個核苷酸、至少90個核苷酸，或超過100個核苷酸。在某些實施方式中，包含RNA的分子包括兩個或更多恒定序列。'在一些實施例中，一種或多種核酸酶是RNases或核糖核酸酶。在某些實施方式中，一種或多種核酸酶是微球菌核酸酶、5'-3'核糖核酸外切酶、3，-5'核糖核酸外切酶、脫帽酶、脫腺苷酶，或以上酶的組合。在其它的實施方式中，一種或多種核酸酶是脫氧核糖核酸酶，如脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶IIa或脫氧核糖核酸酶IIB，或以上酶的組合。在特別的實施方式中，一種或多種核酸酶經(jīng)混合成為核酸酶混合物。在某些實施方式中，包含RNA的分子經(jīng)由體內FISH、，ACS、微陣列，或熒光顯微術而鑒別出來。在一些實施例中，該方法進一步包括處理細胞以防止有活性的內吞作用的步驟。另外，該方法的一些實施方式中，內化核酸的序列可以決定。在某些實施方式中，測序是通過直接測序、反轉錄酶-聚合酶鏈式反應、微陣列、質譜分析，或以上方法的組合而完成。此外，在一些實施例中，該方法進一步包括在與核酸文庫接觸前固定細胞的步驟。另一方面，本發(fā)明提供一種用于篩選可內化的包含RNA的分子的試劑盒。該試劑盒包括一種隨機的核酸分子庫；數(shù)量上足以降解所有非內化核酸的一種或多種核酸酶；一種逆轉錄酶、一種DNA聚合酶、或一種RNA轉錄酶；一種或多種緩沖液，以及根據(jù)本發(fā)明權利要求的方法的說明書。在某些實施例中，核酸酶是核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶l、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒細胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳動物核糖核酸酶l、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5'-3'核糖核酸外切酶、3，-5'核糖核酸外切酶、脫帽酶、脫腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I，1*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2，0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(01igoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St。為更完整地理解本發(fā)明的特色及優(yōu)點，下面對發(fā)明詳述及附圖的含義作出說明，其中圖l顯示一種實施方式中內化核酸的篩選方案。圖2顯示富集內化RNAs的篩選方法。圖3顯示摻入PSMA的輪次中輸送laminA/CsiRNA綴合物進入細胞的能力的改進。圖4顯示摻入的PSMA適體克隆有效地輸送laminA/CsiRNA綴合物進入到細胞內。圖5顯示在HeLa-CD4細胞上進行的N30分子池內化篩選進程。具體實施方式本專利以及本專利所引用的科學文獻的知識基礎是本領域技術人員所能夠達到的。本申請所引用的已頒布的美國專利、已允許的申請、已公開的外國申請，以及參考文獻，包括GenBank數(shù)據(jù)庫序列籍參考合并入本申請，其程度就如特別地、逐一地指出，籍參考而合并入本申請。在下面詳細論述本發(fā)明各種實施方式的完成以及利用時，應當理解在多種特定的情形下，有許多適當?shù)臉嬎伎梢愿爬ㄔ诶锩妗１旧暾堉兴撌龅奶囟ǖ膶嵤┓绞街皇怯糜谡f明完成和利用本發(fā)明的特定方式，而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明包括組合物、方法以及試劑盒，其可用于快速篩選容易內化進入特定類型細胞內的分離的核酸(DNA、RNA、以及它們的修飾形式)而不考慮其序列。一旦篩選和分離出核酸，包含RNA的分子的序列就可以被確定。包含RNA的分子可用于增強特異性治療分子或使特定的化合物附著于癌細胞中(用于殺死癌細胞)的藥物輸送裝置，或者增強治療傳染或其它疾病相關的病原體損害細胞療法。本申請描述的方法對于增強產(chǎn)物的功效或降低其毒性有很高的價值。8本申請包括組合物以及方法，用于篩選能夠內化進入細胞的包含RNA的分子而不借助于傳統(tǒng)的轉染或輸送裝置。這些方法適合于生產(chǎn)能夠內化進入特定細胞、不同狀態(tài)細胞(例如分化的細胞)或者一般細胞內的包含RNA的分子。本發(fā)明的優(yōu)點在于篩選出的包含RNA的分子能夠特異性地定向，并且，在一些實施例中，它還沒有相關的毒性。在一些實施例中，可內化的包含RNA的分子可用于定向地使"載荷"或"貨物"輸送到特定的細胞或組織而不需要對細胞或包含RNA的分子進行較高程度的表征。可內化的包含RNA的分子還可以用于標記細胞的內部狀態(tài)，而不需要損害細胞或組織的結構完整性。術語"基因"用于代表一種編碼功能蛋白、多肽或肽的編碼單位。如本申請中所使用的，"基因"是一個功能性術語，包括基因組序列、cDNA序列或片段，或者以上的組合，同樣，基因產(chǎn)物包括那些可能已經(jīng)人工改變的產(chǎn)物。純化的基因、核酸、蛋白質等等用于指代那些經(jīng)鑒別、并且與至少一種通常與其結合的污染核酸或蛋白質分離的物質。本申請中的術語"序列"用于指代核苷酸或氨基酸，無論其是天然的還是人工的，例如，修飾的核酸或氨基酸。"轉錄的核酸"指的是從相應的核酸序列模板產(chǎn)生的核糖核酸。術語"基因"包括基因的cDNA形式和基因組形式。一種基因可以產(chǎn)生多個RNA種類，其由原始RNA轉錄產(chǎn)物的不同剪切形成。本申請所使用的術語"擴增"意思是擴大一種樣品中目標分子的數(shù)或量。目標分子包括但不限于miRNA、siRNA，以及雙鏈RNA。示范性的擴增方法包括PCR、RT-PCR、體外轉錄、以及標準克隆技術。本發(fā)明中使用的術語"擴大"，當涉及核酸時，指利用本領域公知的任何方法生產(chǎn)一種核酸序列的大量拷貝。術語"擴大反應"通常指涉及核酸生物分子，例如RNA和DNA的反應。"核酸擴增"通常指增加核酸，特別是一種篩選的核酸和/或一種篩選的核酸規(guī)定的片段濃度的任何步驟。"擴增或擴增產(chǎn)物"或"擴增子"通常指的是實行一種核酸擴增反應而得到的產(chǎn)物。本發(fā)明中的術語"互補的"或"互補性"指的是多核苷酸在允許的鹽度和溫度條件通過堿基對與其它的核酸發(fā)生自然的結合。例如，序列"A-G-T"與互補序列"T-C-A"結合。兩條單鏈分子之間存在互補性時，互補性有可能是局部的，其中只有一些核酸結合，也可能是完全互補的。核酸鏈之間互補性的程度對于核酸鏈之間雜交的效率和強度有明顯的影響。這在擴增反應中具有特別的重要性，因為擴增反應依賴于核酸鏈之間的結合。本發(fā)明中使用的術語"可內化的"指的是一種核酸，例如一種包含RNA的分子，或一種修飾的核酸，其與細胞結合，并且能夠進入或者內化進入細胞，而不需要借助于外部的試劑或條件(例如，磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAF-右旋糖酐-介導的轉染、聚凝胺-介導的轉染、電穿孔、微量注射、脂質體熔合、原生質體融合、逆轉錄病毒傳染、和基因槍)。在有些情況下，可內化的包含RNA的分子在檢測到它的內化之前已經(jīng)內化進入細胞。另外，在已經(jīng)篩選出最初的可內化的核酸后，可內化的核酸可與試劑或其它條件結合，以增強內化率。9本發(fā)明中使用的術語"包含RNA的分子"指的是一種包含至少一部分RNA或修飾的RNA的分子。包含RNA的分子可以由多個部分連接組成。包含RNA的分子可與一種分子貨物，例如一種核酸、一種多肽、一種蛋白質、一種小分子、一種脂肪酸、和/或一種抗體連接。在某些實施方式中，包含RNA的分子是具有最少一個RNA部分的單個分子。在一些實施例中，包含RNA的分子也包含一個RNA分子貨物，例如siRNA或微小RNA。在某些實施方式中，包含RNA的分子與分子貨物通過接頭連接，連接方式取決于分子貨物的類型。例如，在RNA和分子貨物之間的接頭可以包括二硫基接頭，使得在進入細胞內的還原性環(huán)境時，分子貨物能夠被切除。其它有用的接頭有磷酸二酯接頭、硫代磷酸接頭、磷酸垸基酯、亞磷酰胺、氨基甲酸鹽、碳酸鹽、磷酸酯、乙酰胺、和羧甲基醚(例如，可參見，Agrawal#>L(1987)7^ra/zecfrw728:3539-3542;Agrawal#>U(1988)iWJS85:7079-7083;Uhlmann寧乂，(1990)C/e附.iev.90:534-583;Agrawal#>L(1992)7Ve"tfe5/Wec/z"o/.10:152-158)。包含RNA的化合物還可以與分子貨物通過HA肽或類似的化合物連接，或者通過能容許分子貨物從吞飲泡內逃逸的基因融合肽連接；或者與在暴露于一種特定光的波長時能夠使得分子貨物從包含核糖核酸的化合物上斷裂下來的光解元件連接。本發(fā)明中使用的術語"引物"指的是一種寡核苷酸，無論其是否是天然的，如限制性水解液中純化出來的，或者是通過合成制備出來的，它在能夠引發(fā)與一種核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下(B卩，在核苷酸和引發(fā)試劑如DNA聚合酶和適宜的溫度以及pH存在的情況下)能夠作為合成的起始點。為了最大程度地提高擴增效率，引物可以是單鏈的，但是也可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，引物在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先要經(jīng)過處理，以分開它的雙鏈。引物必須有足夠的長度，以便在引發(fā)試劑存在時啟動延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度依賴于許多因素，包括溫度、引物來源以及方法的應用。本發(fā)明中使用的術語"蛋白"、"多肽"或者"肽"指的是由氨基酸組成的化合物，其通過肽鍵連接，并且這些術語可以交互使用。本申請中使用的"隨機分子庫"指的是寡核苷酸的集合，例如包含RNA的分子，其包括不同的序列。分子庫中的每個成員可以至少部分是隨機的，但也可以具有一個或多個共同的和/或已知的序列或序列區(qū)域。例如，分子庫可以完全隨機、部分隨機、在核酸的某一部分隨機、長度和/或單鏈或雙鏈隨機。隨機的核酸分子庫可以通過合成、組合而制得，或來自天然源。本申請中使用的術語"可檢測的標記"指的是一些化合物和/或元件，由于他們的特定的功能性和/或化學特性能夠被檢測，利用它們可以檢測它們所連接的試劑，和/或如果需要的話進一步地定量，例如酶、抗體、接頭、放射性同位素、電子密度粒子、磁性顆粒和/或發(fā)色團或以上的組合，例如，熒光共振能量傳遞(FRET)。有許多種可檢測的標記，包括熒光標記，其容易操作、便宜而且無毒。本發(fā)明中使用的術語"接觸"指的是一個寡核苷酸分子庫暴露于一種或多種靶體，如細胞或組織，持續(xù)一段時間，導致一些或全部的核酸內化，而不需要輔助的試劑或條件。本發(fā)明中的術語"靶細胞"指的是任何細胞(例如真核細胞或原核細胞)，分子池的核酸與其接觸而內化進入細胞中。本發(fā)明中使用的內化性由核酸的功能定義，就是該核酸是可內化的和/或被內化的，而不需要一種定位載體、或任何輔助的試劑或條件來促進核酸進入靶細胞。本發(fā)明提供組合物、方法和試劑盒，用于分離和表征特異性定向和快速內化的包含RNA的分子。本發(fā)明公開的組合物和方法可以快速分離能夠內化進入細胞內的核酸，而無需借助于傳統(tǒng)的轉染或輸送裝置(例如，陽離子脂質體、電穿孔、轉染試劑，等等)。該方法可適于產(chǎn)生內化進入特定細胞、不同狀態(tài)的細胞、或普通的細胞。RNAs可以篩選攜帶有不同的應用于治療、診斷、或檢測的分子貨物。這包括多種將小分子轉送進入細胞或標記細胞的技術，包括但不限于基因表達調節(jié)，如siRNA剔除研究；致死藥物轉送；FACS分析；腫瘤檢測等等。在特定的實施方式中，與隨機文庫接觸的細胞包括從組織中分離的細胞或在活體外繁殖的細胞(例如細胞系)。在更特別的實施方式中，細胞可以是癌細胞，包括但不限于淋巴瘤細胞、黑素瘤細胞、肉瘤細胞、白血病細胞、成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞、肝癌細胞、骨髓瘤細胞、神經(jīng)膠質瘤細胞、間皮瘤細胞、以及癌細胞。在其它的實施方式中，細胞可以是細胞系。示范性的細胞系包括但不限于HeLa,MCF7，MDA，SKOV3，OVCAR3，2008，PC3，T84，HCT-116，腳，H460，HeLa，以及MOLT4。細胞系也可以通過公知的技術產(chǎn)生(例如，參見Griffin等人，(1984)Wamre309(5963):78-82)。此外，與隨機文庫接觸的細胞還包括原核細胞(即細菌細胞)。本發(fā)明描述的方法可用于鑒別包含RNA的分子，其能夠輸送和內化分子貨物(即，試劑，例如小分子、抗體、蛋白質、肽、脂肪酸、治療劑、抗生素或化學毒劑)進入細菌細胞。本發(fā)明描述的方法還可以用于鑒別能夠輸送和內化分子貨物進入真菌細胞的包含RNA的分子。在某些方面，本發(fā)明提供一種篩選可內化的包含RNA的分子的方法。這種包貪RNA的分子能夠內化進入細胞并且攜帶分子貨物(例如藥物、細胞毒素試劑、凋亡試劑)進入指定的細胞。該方法包括使細胞與一種包含RNA的分子的隨機文庫接觸，隨機文庫中的包含RNA的分子可以是經(jīng)修飾的以增加穩(wěn)定性。被接觸的細胞可以用一種變性劑洗滌以除去粘附在細胞表面的過量的包含RNA的分子?？捎玫南礈靹┌ㄗ冃詣?，例如陰離子洗漆劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)，非離子洗滌劑例如Tween-20⑧，以及陽離子洗滌劑例如十六垸基三甲基溴化銨，以上這些都可在市場上買到(Sigma公司，St.Louis，MO)。我們發(fā)現(xiàn)核酸酶可用于除去沒有內化的包含RNA的分子。這個結果是使人驚奇的，因為包含RNA的分子通常對于降解是穩(wěn)定的，由于下面更詳細描述的修飾以及二級結構。由于這個發(fā)現(xiàn)，該方法的某些實施方式需要使與細胞接觸的隨機文庫暴露于核酸酶或核酸酶的混合物，以除去保持在細胞表面而沒有內化進入細胞的包含RNA的分子。示范性的核酸酶包括、但不限于核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C、核糖核酸酶l、核糖核酸酶TI、核糖核酸酶T2、核糖核酸酶L、核糖核酸酶H、血管生成素核糖核酸酶、嗜酸性粒細胞核糖核酸酶、微球菌核酸酶、哺乳動物核糖核酸酶l、核糖核酸酶2、信使RNA核糖核酸酶、5，-3'核糖核酸外切酶、3，-5'核糖核酸外切酶、脫帽酶、脫腺苷酶、核糖核酸酶P、核糖核酸酶III、核糖核酸酶B、核糖核酸酶I,1*、核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶M、核糖核酸酶R、核糖核酸酶IV、F;核糖核酸酶P2，0、PIV、PC、核糖核酸酶N、核糖核酸酶II、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、核糖核酸酶D、核糖核酸酶BN、核糖核酸酶T、核糖核酸酶PH、寡核糖核酸酶(01igoRNase)、核糖核酸酶R、核糖核酸酶Sa、核糖核酸酶F1、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶Ms、或核糖核酸酶St以及它們的組合。在其它的實施方式中，核酸酶是脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶IIa或脫氧核糖核酸酶IIJ3。另外，核糖核酸酶混合物可以在市場上購自Ambion公司(Austin,TX)、新英格蘭BioLabs公司(Ipswich,MA)和EpicenterTechnologies公司(Madison，WI)。在特定的實施方式中，誶方法重復多次以從最初的包含RNA的分子的分子池中獲得能夠最快內化的包含RNA的分子。在這些實施方式中，將核酸分子池添加到細胞中，并且在篩選步驟的過程中同細胞保溫的時間持續(xù)減少(g卩，將反復執(zhí)行如上所述的方法)。當過程完成后，將細胞洗滌幾次和/或用核酸酶進行處理。在某些實施方式中，細胞與包含RNA的分子保溫的時間遞減。在細胞與包含RNA的分子接觸后，可以洗滌1小時至24小時或者更長的時間，以除去沒有內化的包含RNA的分子。細胞與包含RNA的分子接觸后，每個后一次洗滌的時間可以遞減。細胞與包含RNA的分子接觸保溫的時間可以持續(xù)任意長的時間。持續(xù)時間包括但不限于:l分鐘到10分鐘、11分鐘到20分鐘、21分鐘到30分鐘、31分鐘到40分鐘、41分鐘到50分鐘、51分鐘到1小時、l小時到2小時、2小時到3小時、3小時到4小時、4小時到5小時、5小時到6小時、6小時到7小時、7小時到8小時、8小時到9小時、9小時到10小時、IO小時或更久、15小時或更久、20小時或更久、或24小時或更久。在一個示范性的實施方式中，包含RNA的分子是通過細胞與包含RNA的分子接觸保溫24小時后第一次洗滌而篩選出來的。洗滌被接觸的細胞，分離包含RNA的分子，并與細胞接觸1小時。洗滌細胞并分離包含RNA的分子。分離的RNA與細胞接觸30分鐘，然后進行洗滌。然后再次分離出內化的包含RNA的分子，然后使該過程繼續(xù)，并且洗滌前的保溫時間持續(xù)減少。在某些實施方式中，從細胞中提取出總RNA，已內化的任何序列都可以通過RT-PCR和/或轉錄得以回收。這些包含RNA的分子代表了能夠最快內化進入細胞中的分子集合體。包含RNA的分子可以通過本領域公知的任何方法制得。例如，它們可以利用ExpediteTM核酸合成儀(應用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster市、CA)或其它類似裝置(例如，參見應用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster市、CA)進行合成生產(chǎn)。合成的寡核苷酸也可以通過本領域公知的技術進行生產(chǎn)，例如亞磷酰胺"法(例如，參見Pan等人，(2004)別o/.iVoc.<9"http://we.6:257-262)、氫膦酸酯法(例如，參見Agrawal等人，(1987)7Wra/^謂28(31):3539-3542)和phosphitetrimester法(泡c/e/cf&(1984)，12:4539;(1983)refm/^腦丄e".24:5843)。包含RNA的分子可與接頭連接，例如3'氨基接頭或5'氨基接頭，而不改變包含RNA的分子的功能。另外，在核酸合成期間，包含RNA的分子的3'端也可以連接附加的核苷酸作為接頭(例如，參見Steinberg#"乂，(2004)5/o;o/;we"73(5):597-605)。另外，包含RNA的分子可以進行多種方式的修飾，而不損害其內化進入細胞的能力。核酸結構的修飾可以包括合成性接頭，例如磷酸烷基酯、亞磷酰胺、氨基甲酸鹽、硫代磷酸、二硫代磷酸酯、碳酸鹽、磷酸酯、乙酰胺以及羧甲基醚(例如，參見Agrawal等人，(1987)7Wra/ec/TO"28:3539-3542;Agrawal等人，(1988)iWAS85:7079-7083;Uhlmann等人，(1990)C/ze附.90:534-583;Agrawal等人，(1992)7Ve"cfe5/o&c/mo/.10:152-158)。另外，核酸的修飾包括磷酸核苷內接頭，例如膽固醇基接頭或二胺化合物，在氨基和末端核糖之間碳殘基數(shù)可變。包含RNA的分子的其它的修飾包括轉變?yōu)樘遣糠?，如阿拉伯糖?'、5'取代的核酸，其在3'和5'端通過一種除羥基之外的化學基團連接有一種糖。因此，那些不會損害包含RNA的分子的內化或轉運分子貨物的修飾在本發(fā)明的范圍之內。包含RNA的分子可以利用標準的固相DNA化學進行合成，該技術在本領域是公知的。下面的描述表示一種生產(chǎn)RNA分子池的示范性的方法。將A、C、G和U的亞磷酰胺以3:3:2:2.4的摩爾比混合，這樣使得每種堿基的偶聯(lián)效率近似相等以產(chǎn)生隨機化的位點，并且最終一個隨機位點具有25。/。的機率是A、C、G或U。至于慘入型分子池，亞磷酰胺的混合物中可以進一步用于產(chǎn)生摻入A、摻入C、摻入G和摻入U的附加的分子池，使得任何摻入核苷酸的偶聯(lián)效率是70%，而其余3種核苷酸的效率為10%。例如，一種摻入A的容器將得到70Q/。的A，10。/。的C，10Q/。的G以及10。/。的U。接著進行脫保護和純化步驟，通過PCR或引物延伸使單鏈的DNA分子池轉變成為dsDNA。在該過程中，一種T7啟動子被添加到分子池的5'末端，使得到的雙鏈DNA成為T7RNA聚合酶的底物。然后通過失控轉錄產(chǎn)生RNA或修飾的RNA分子池。同類的分子池還可以通過商業(yè)來源購買得歪U，如Invitrogen公司(Carlsbad，CA)或IntegratedDNATechnologies公司(Coralville，IA)。在某些實施方式中，包含RNA的分子包含隨機區(qū)域。隨機區(qū)域可以具有合成法或純化法能夠實際上允許的任何長度。在特定的實施例中，隨機區(qū)的大小可以從10個隨機位點(N30)到超過100個隨機位點(N100)。包含RNA的分子還包含恒定區(qū)，使得PCR引物能夠結合以進行轉錄。因此，隨機長度與恒定長度的比值將依賴于隨機區(qū)域的長度而變化。也就是說，N30分子池中固定位點與隨機區(qū)域幾乎有相同的數(shù)量，而NIOO分子池相對于恒定區(qū)將會有更多的隨機位點。在少數(shù)幾種情況下，經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn)恒定區(qū)參與最終篩選得到的種類的功能。包含RNA的分子的分子池還可以合成為具有不同程度的隨機性。"摻入性的"分子池是通過對已經(jīng)存在的序列的部分位點隨機化而得到的。例如，篩選一種結合HIV逆轉錄酶(RT)的序列要求得到RT的天然底物，對該序列進行部分地隨機化，并篩選那些與RT的結合優(yōu)于它的天然底物的序列。13在其它的實施方式中，包含RNA的分子經(jīng)過修飾以增強其穩(wěn)定性。例如，包含RNA的分子可以在所有的嘧啶殘基上進行2'-氟代修飾以增強其對于堿降解以及天然產(chǎn)生的核酸酶的穩(wěn)定性。其它的堿基修飾在本領域中是公知的。對于本發(fā)明描述的方法，可在該過程的幾個不同的點引入變化。包含RNA的分子可以有不同的修飾，例如2'-氟代修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-0-甲基-修飾的RNAs、具有肽骨架的核酸，或者上述的聯(lián)合。另外，可以使用不同的核酸酶溶液，并且核酸酶的保溫時間可以不同。在一個特別的方面，包含RNA的分子可進行可檢測的標記。本發(fā)明中使用的"可檢測的標記"指的是一種包含RNA的分子可操作地連接有一個能夠被檢測的部分。"可檢測地連接"指的是該部分是通過一種共價或非共價鍵(例如，離子鍵)與探針連接。產(chǎn)生共價鍵的方法是已知的(參見下列通用實驗方案，例如Wong，S.S.，C/ze鵬'^70/iVoto'"C呵'wga"'ow浙C冊s-i!'"A:/wg，CRCPress1991;Burkhart#X，7TjeC7iew!'W7浙o/爿脂'wo00^//"A:/Mg^ge""orv4/w/wop/as^s，JohnWiley&SonsInc.,NewYorkCity,NY，1999)。根據(jù)本發(fā)明，一種"可檢測的標記"是一種可被檢測到的部分。這種標記可以是，但不限于熒光基團(例如熒光素(FITC)、藻紅蛋白、羅丹明)、化學染料、或者具有放射性、化學發(fā)光性、磁性、順磁性、親磁性的化合物，或者一種酶，其產(chǎn)物可以是有顏色的、化學發(fā)光的，或者是磁性的。信號可利用任何合適的方法進行檢測，包括光譜法、光化學法、生物化學法、免疫化學法、電學法、光學法或者化學方法。在某些情況下，信號可利用兩種或更多種方法進行檢測。在某些實施方式中，核酸標記包括熒光染料、放射性同位素，以及化學發(fā)光標記，其并非用于限制本發(fā)明的范圍。(例如，參見Yu等人，(1994)TVwc/e/c爿c/t^22(16):3226-3232;Zhu等人，(1994)TW/c/e/c22(16):3418-3422)。例如，包含RNA的分子中的核苷酸可以綴合到Cy5/Cy3熒光染料上。這些染料在本領域中經(jīng)常使用(例如，參見Yang等乂，(2005)C//m0"cw^5.11(2Ptl):612-20)。熒光標記可以選自各種結構種類，包括非限制性的例子，如l-和2-氨基萘、p,p，二氨基芪、嵌二萘、季菲啶鹽、9-氨基吖啶、p，p，-二氨基二苯甲酮亞胺、蒽、噁碳菁(oxacarbocyanine)、部花青(marocyanine)、3-氨基、氨基馬萘雌酮、二萘嵌苯、雙苯并惡唑、二-p-惡唑基苯、1,2-苯并吩嗪、視黃醇、二-3-氨基吡啶鹽、嚏根草甙元、四環(huán)素、立體苯酚(sterophenol)、苯并咪唑基苯胺、2-氧-3-色烯、卩引哚、咕噸、7-羥基香豆素、吩惡嗪、水楊酸鹽、烏本甙元、卟啉、三芳基甲垸、黃素、咕噸染料(例如熒光素和羅丹明染色劑)；花青染料；4,4-二氟-4-硼-3a，4a-氮雜-s-引達省染料以及熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白、藻膽蛋白)。其它有用的染料是化學發(fā)光染料，包括但不限于生物素綴合的RNA核苷酸。對RNAs的標記可以利用本領域公知的任何方法實現(xiàn)，例如，CyScribeTM第一鏈cDNA標記試齊U盒(弁RPN6200，AmershamBiosciences公司，Piscataway，NJ)。通過將分子貨物添加到包含RNA的分子上可以使包含RNA的分子與分子貨物共同內化。例如，siRNA及其他核酸序列可以直接合成在選定的RNA上，與選定的RNA雜交，或者利用本領域公知的方法通過化學方式連接。示范性的分子貨物包括、但不限于siRNA和微小RNA。在本發(fā)明的特別方面，能夠成功使分子貨物內化到細胞里面的包含RNA的分子被鑒定出來。在某些實施方式中，包含RNA的分子是通過功能分析而鑒定出來的。例如，一種能夠輸送抑制某一特定通路的siRNA的包含RNA的分子可通過觀測受該通路影響的表型而鑒定出來。或者，siRNA目標的表達水平可以在蛋白質或RNA水平進行分析。因此，這些方法可用于傳遞分子貨物到細胞內的特定通路。當"一個"或"一種"與權利要求和/或說明書中的術語"包括"連接時，可以指"一個"，但也同樣具有"一個或更多"、"至少一個"，以及"一個或比一個更多"的意思。權利要求中的術語"或"意思是"和/或"，除非明確指出意思是任取其一的，或者任取其一的各項是互斥的，即使范圍只支持任取其一以及"和/或"。在整個申請中，術語"大約"指代一個包括固有誤差變化的值，例如±10%。在說明書和權利要求中，"由'…"組成"(以及該詞的任何形式)，"具有"(以及該詞的任何形式)、"包括"(以及該詞的任何形式)或"包含"(以及該詞的任何形式)是封閉式的，或者是開放式的，不排除附加的、沒有提及的要素或方法步驟。本申請中的術語"或它們的聯(lián)合"指的是該術語前面所列的項目所有的排列與組合。例如，"A，B，C或它們的組合"至少包括A，B，C，AB，AC，BC，或ABC，如果在特定的場合中順序也是重要的話，還包括BA，CA，CB，CBA，BCA，ACB，BAC，或者CAB。繼續(xù)這個例子，明確包括的還有包含一個或更多項目或術語的重復的組合，例如BB，AAA，MB，BBC，AAABCCCC，CBBAAA，CABABB等等。本領域技術人員可以理解任何組合中的項目或術語的數(shù)目沒有限制，除非上下文明顯不同。實施例本發(fā)明通過下列實施例進一步說明，其不應被視為限制發(fā)明范圍。實施例1序列和引物被用來篩選的N30分子池具有下列序列5，GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC麗麗麗蘭麗NN麗N麗麗N麗N麗NNNNNTTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT3，(SEQIDNO.:1);其中N是四種堿基中的任何一種。分子池按照如下所述的方法合成和純化。N30分子池的擴增引物如下(正向引物)41.30:5'GATAATACGACTCACTATAGGGAATGGATCCACATCTACGA3，(SEQIDNO.:2);(反向引物)24.30:5，AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA3，(SEQIDNO.:3);用于這些試驗的抗PSMA適體A9的模板具有下列序列15GUUCCCAGACGACUCGCCCGA3，，(SEQIDNO.:4);其中帶下劃線的序列代表用于擴增適體的恒定區(qū)。A9的擴增引物如下(正向引物)5，TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG3，(SEQIDNO.:5);(反向引物)5，TCGGGCGAGTCGTCTG3，(SEQIDNO.:6);所有的引物和A9模板購自IDT公司(Coralville，IA)。分子池的合成和純化用于篩選的分子池包括30個隨機殘基，側面與恒定區(qū)相連。在ABI快速8909合成儀(FosterCity，CA)上合成分子池。將A、C、G和T的亞磷酰胺以3:3:2:2.4的摩爾比混合，這樣使得每種堿基的偶聯(lián)效率近似相等以產(chǎn)生隨機化的位點，并且最終一個隨機位點具有25。/。的機率是A、C、G或T。合成的固相樹脂懸浮在lmL30%NH40H中，在55'C過夜，對DNA脫保護。反應過程是離心使樹脂沉淀，包含DNA的NH4OH層用10mL正丁醇在4。C下以13,000rpm沉淀45分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀，然后干燥。如果長序列中經(jīng)常含有中斷合成產(chǎn)物，可將DNA在10n/。丙烯酰胺/7M尿素凝膠上進行凝膠純化。從凝膠上切下對應于全長產(chǎn)物的條帶，切成碎片并且用dH20洗脫過夜。洗脫的DNA用100。/。乙醇與作為沉淀載體的糖原進行沉淀，用70%乙醇洗滌，然后干燥。接著進行脫保護和純化，利用引物41.30和24.30進行延伸和大規(guī)模PCR，使單鏈的DNA分子池轉變?yōu)閐sDNA。引物41.30也用于向分子池添加一種T7啟動子序列，以利于后面的轉錄步驟。大約2.8nmol單鏈的分子池DNA與115nmol24.30引物和0.2mM各種核苷酸(dATP、dCTP、dGTP禾口dTTP,GEHealthcare公司，Piscataway，NJ)在總體積43mL中進行混合。樣品在65'C變性5分鐘，然后冷卻到4t:。向變性的分子池中加入總體積為43.3毫升的標準混合液，其中含有50mMKCl，100mLTris-Cl(pH=8.3)、1.5mMMgCl2、1，440UTaq聚合酶(NEB公司，Ipswich，MA)，然后以72°保溫1小時。在延伸反應的最后，在總體積28.7mL中加入115nmo141.30，反應在94。C30秒、50'C30秒以及72。C1分鐘循環(huán)8到9次，然后在72。C保溫2分鐘。PCR產(chǎn)物在2.5X體積的100。/。乙醇于4。C沉淀45分鐘，然后用70%乙醇洗滌并干燥^執(zhí)行大規(guī)模轉錄程序以得到起始輪次O的分子池，在該程序中，將75ng分子池PCR產(chǎn)物加入1.5mL轉錄混合液中，混合液中含有40mMTris(pH-8.0)、26mMMgCl2、5mMDTT、5mMATP、5mMGTP、5mM2，-氟代-CTP、2，-氟代-UTP、0.01U焦磷酸酶以及75U的Y639FT7聚合酶。據(jù)估計，N30分子池有大約10"序列的復雜度。因此，這些投入量表現(xiàn)了大約1.5倍基因組值的序列。這種規(guī)模足以說明各種可能的合成序列，因此表現(xiàn)出了最大的多樣性。轉錄反應可以在37。C下運行過夜。保溫后，向反應液中加入75U的DNAsel(Epicentre公司，Madison，WI)，然后使反應液再保溫30分鐘。在反應液進行凝膠純化前向反應液中加入相當于2X體積的變性染料(7M尿素、'90mM三羥甲基氨基甲烷、卯mM硼酸、0.5mMEDTA以及O.P/。溴酚藍)，使反應液在7(TC變性3分鐘，如上所述。細胞系和培養(yǎng)HeLa-CD4細胞得自美國國立衛(wèi)生研究院AIDS試劑計劃(Germantown,MD)。LnCap細胞通過ATCC(Manassas,VA)購買。這兩種細胞系都利用補充有10%胎牛血清(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的RPMI-1640(ATCC公司，Manassas，VA)在37。C和含有5%(:02空氣的條件下培養(yǎng)。進行胰酶消化時，將細胞用1倍培養(yǎng)體積的DPBS洗滌，然后向細胞添加l/10體積的0.05。/。胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen公司，Carlsbad,CA)。細胞在37'C下保溫2分鐘直到細胞離壁。加入培養(yǎng)基使胰蛋白酶失活。所有的細胞洗滌步驟都使用室溫的PBS。所有的細胞離心作用步驟都是在4'C，并且以1500rpm離心5分鐘。核酸酶試驗為了保證修飾的RNAs和細胞能夠在消化和篩選方案后繼續(xù)存在，將dsDNA分子池按如上所述的方法以按比例縮小的反應進行轉錄。將01-32-標記-GTP(PerkinElmer公司，Shelton,CT)引入到反應中以產(chǎn)生主體標記的放射性轉錄產(chǎn)物。在本試驗中，每管中加入大約4x106HeLa-CD4細胞，4'C以1500rpm慢速旋轉5分鐘。用500iiLPBS洗滌一次后，每個管中的細胞重懸浮在85pL的RNA中，并在室溫下保溫15分鐘。向細胞中加入不同量的Riboshredder或核糖核酸酶Tl另外保溫30分鐘。將細胞沉淀，回收的IiNA在含有l(wèi)XTBE和7M尿素的8。/。丙烯酰胺凝膠上跑膠。凝膠在濾紙(Whatman公司，F(xiàn)lorhamPark,NJ)上晾干，并在磷屏下曝光過夜進行掃描。為了確定細胞沒有受到洗滌、保溫、或核酸酶處理步驟的不利影響，重復進行核酸酶消化試驗，然后對細胞進行計數(shù)，再將其等份加入單獨的管。在不同的間隔時間，將每個管中的細胞進行混合然后重新計數(shù)。沒有發(fā)現(xiàn)顯著的細胞健康后果。內化試驗內化試驗中利用一種細與表面適體，即抗-PSMA適體A9(Lupold等人，(2002)CancerRes.62(14):4029-33)。A9是利用一種如上面"分子池合成和純化"所述的分子池的縮小型從一種寡聚模板轉錄而成。在本試驗三天前，將lxl()SLnCap細胞接種在24孔板中。當細胞著壁后，洗滌細胞并添加新鮮的培養(yǎng)基。在37'C和5。/。C02環(huán)境下平衡一小時后，將細胞進行四種條件之一的處理在"RNA"樣品中，將50nM的A9直接添加到細胞的培養(yǎng)基中45分鐘。在"az-dG"樣品中，細胞先用IOmM疊氮化鈉和50mM脫氧葡萄糖處理10分鐘以防止內吞作用，然后在用250nL的DPBS洗滌后向培養(yǎng)基中添加RNA。在"Rb"樣品中，RNA與細胞進行保溫，然后用250nL的DPBS洗滌細胞15分鐘以消化結合劑，然后用0.02U/uL的Riboshredder(Epicentre公司，Madison，WI)進行核酸酶處理。最后，在"az-dG/Rb"樣品中，細胞用az-dG進行處理，然后加入RNA，在RNA消化后對細胞用核酸酶進行處理。接著添加RNA，那些用az-dG處理的樣品也在冰冷的保溫塊上保溫，以抑制其它的內化機制。每種處理做三份。處理以后，所有的樣品用500nLDPBS洗滌，利用相位鎖定管按照廠家的方案(Eppendorf公司，Westbury，NY)用Trizol試劑(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)從每個樣品中提取總細胞RNA。對RNAs的定量顯示回收的RNA量接近(數(shù)據(jù)未顯示)，說明處理過程并未使含量發(fā)生顯著變化。全部提取的RNA以適體特異性引物進行按比例縮小的逆轉錄反應，反應過程類似于在"分子池合成和純化"中所述的，并進行實時PCR試驗。在實時PCR中，將600nM的psma5和psma3與12.5pL的2XSybrMix和lOpL1:10的逆轉錄反應稀釋液混合。樣品上到ABI7300實時反應儀上并按如下循環(huán)95'C10分鐘，然后進行以下40個循環(huán)95。C30秒、50°C30秒和72°C1分鐘。循環(huán)后，進行一個如下的解離步驟以驗證產(chǎn)物的完整性95'C15秒、60°C30秒和95°C15秒。計算出△CT以比較每個樣品相對于未處理的細胞對照的CT值。內化篩選在篩選輪次開始前一天，將4x105HeLa-CD4細胞接種在60mm組織培養(yǎng)平板中。在每一輪的篩選前一小時，將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基。在第一輪篩選中，向兩個平板中的一個加入54ng的修飾的分子池RNA(1.2mM)，其代表了分子池基因組大約1倍的值。保溫大約3天后，將細胞用胰蛋白酶處理，用D-PBS(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)洗滌兩次，利用1mLTrizol試劑(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)和相位鎖定管按照廠家說明(Eppendorf公司，Westbury，NY)將兩個平板中的總細胞RNA提取出來?；厥盏目偧毎鸕NA按照如下程序進行逆轉錄含有84pg總RNA和在IXRT緩沖液(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)中含有的lOpM24.30反向引物的反應液在70°C變性5分鐘，然后緩慢地冷卻到室溫。向混合液中加入一種標準混合液，其中含有10mMDTT，每種dNTP各lmM以及28U的SuperscriptIII逆轉錄酶(Invitrogen公司，Carlsbad,CA)并在5(TC保溫1小時。少量沒有進行逆轉錄的兩種(曝光的和非曝光的)分子池對照也進行同樣的操作，以確認沒有任何回收的產(chǎn)物加入分子池RNA以及沒有細胞產(chǎn)生或攜帶DNA模板。'逆轉錄反應的一半作為下一輪大規(guī)模PCR的種子。每一輪的分子池按照"分子池的合成和純化"中所列的方案以修飾調整進行更新以適應每一輪減小規(guī)模的核酸。在后面的輪次中，我們發(fā)現(xiàn)被用于最初的分子池擴增的引物濃度過量，所以將每種PCR引物的濃度降至0.4mM。隨篩選輪次的進行，加入的RNA逐漸減少，保溫時間縮短，而洗滌步驟增加。篩選的過程通過評估在擴增產(chǎn)物能夠看到之前所需的PCR循環(huán)數(shù)而確定。這經(jīng)常與加料量直接相關，在該情況下，在每一輪的篩選中能回收多少分子池RNA。在第3輪(第一輪大幅減少了添加到細胞的分子池的量)和第5輪當使用了一種新鮮保存的細胞后，循環(huán)數(shù)發(fā)生了劇列的減少。9輪以后，PCRs似乎在循環(huán)數(shù)上已不再提高，可認為篩選結束。實施例21、包含RNA的分子的鑒定一種內化RNA序列，抗PSMA適體A9被用于測試本發(fā)明公開的新條件，并用于鑒定18包含RNA的分子以及確保內化序列的存留。圖1顯示核酸酶條件的有效性。大約1(^LnCap細胞用下述四種條件之一進行處理將抗PSMA適體直接添加到細胞培養(yǎng)基中(RNA);首先用10mM疊氮化鈉和50mM脫氧葡萄糖處理細胞10分鐘以防止內吞作用，然后在洗滌后向培養(yǎng)基中添加RNA(az-dG);向細胞中添加RNA，然后將細胞用0.02U/uLRiboshredder(Epicentre)進行核酸酶處理以消化結合劑(Rb);或者細胞在添加RNA前先以az-dG處理，然后在經(jīng)RNA消化后進行核酸酶處理。每種處理都做三份樣品。從每個處理的樣品中提取出的總細胞RNA以適體特異性引物進行逆轉錄，實時PCR循環(huán)數(shù)由GAPDH水平?jīng)Q定。以az-dG處理使ACT信號輕微地減少，而以Rb進行處理則顯著地減少了該信號，這說明多數(shù)的適體停留在細胞外，但有一些得到保護。同時以az-dG和Rb進行處理完全消除了信號；Rb處理的信號是由于適體的內化。2、篩選一種摻入型的、基于A9適體的2'-氟代修飾的RNA分子池，其中適體的每個堿基位點摻入率大約30%，被用于測試本發(fā)明所提出的篩選方案。向T25玻璃瓶匯合率在70-80%的LnCap細胞中添加3到5微克摻入型PSMA分子池，將細胞保溫過夜。然后用PBS洗滌細胞，并用在PBS中含有0.01U/nLRiboshredder處理10分鐘。然后將細胞洗滌三遍，并用1mLTrizol試劑提取出總細胞RNA?；厥盏腞NA進行逆轉錄并通過PCR進行擴增以生成下一輪轉錄所需的模板。經(jīng)過五輪的篩選后，測試這些輪次中內化負載有抗-laminA/CsiRNA的抗生物素蛋白鏈菌素/生物素綴合物的能力，方法如以前針對A9適體本身的一樣(Chu等人，(2006)NucleicAcidsRes.34(10):e73)。一種抗-eGFPsiRNA作為陰性對照(圖3)。第5輪分子池中的五個克隆進行了擴增、測序并檢測laminA/CsiRNA的內化。全部5個克隆(pl、p2、p6-8)以GAPDH和細胞對照為標準都表現(xiàn)出laminA/C的表達降低，說明其進入細胞的能力不依賴于任何轉染方法。沒有A9的siRNA綴合物或克隆沒有表現(xiàn)出laminA/C剔除。五個克隆中的三個(pl、p7、p8)相對于野生型A9適體顯示出稍好一些的剔除laminA/C的效果。從核酸隨機分子池中篩選內化子。在最初的篩選中，用一種帶有30個堿基隨機區(qū)域的2'-氟代修飾的RNA分子池篩選那些內化進入HeLa-CD4細胞的序列。在最初的兩輪中不包括核酸酶步驟。在第l-6輪中，RNA分子池與細胞保溫時間為1天。周期性地，分子池處理的細胞用Trizol試劑提取總RNA并進行逆轉錄和實時PCR反應擴增以檢査細胞內分子池RNA的存在。6輪以后，擴增信號達到峰值(參見圖5)。多進行一輪保溫1天的試驗，接下來的一輪細胞保溫時間只有1小時。第9輪沒有明顯的提高。將第9輪的克隆分離并測試其運輸siRNA進入細胞的能力。表l總結了各輪的篩選。表1輪<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*第一輪和1仁輪PCRs"13加入更多的RNA實施例31、鑒定包含RNA的分子一種內化RNA序列，抗PSMA適體A9，被用于測試本發(fā)明反復降低細胞與包含RNA的分子接觸時間的方法。反應條件與試劑與如上所述的相同。2、鵬篩選條件大體上類似于上面所公開的方法。簡單來說，一種摻入型的、基于A9適體的2'-氟代修飾的RNA分子池，其中適體的各堿基位點摻入大約30%，這種分子池被用于測試本發(fā)明提出的篩選方案。在一個T25玻璃瓶中，向匯合度為70-80%的LnCap細胞中加入3到5微克摻入型PSMA分子池，將細胞保溫過夜。然后用PBS洗滌細胞并用含有0.01U/uLRiboshredder的PBS處理10分鐘。然后將細胞洗滌三遍，并用1mLTrizol試劑提取出總細胞RNA?；厥盏腞NA進行逆轉錄并通過PCR進行擴增以生成下一輪轉錄所需的模板。然后將回收的RNA按如上所述的流程進行保溫，只是保溫時間縮短為12小時。第二輪篩選回收的RNA保溫10小日t，其它的洗滌方法和條件與第一輪相同。第四輪的保溫時間為8小時，第五輪保溫時間為4小時，第六輪保溫時間為2小時，第七輪至第九輪保溫時間為1小時。經(jīng)過頭五輪的篩選后，測試這些輪次中內化負載有抗-laminA/CsiRNA的抗生物素蛋白鏈菌素/生物素綴合物的能力，方法如以前針對A9適體本身的一樣(Chu等人，(2006)NucleicAcidsRes.34(10):e73)。一種抗eGFPsiRNA作為陰性對照。第9輪分子池的克隆進行擴增、測序并檢測laminA/CsiRNA的內化。以GAPDH和沒有與siRNA接觸的對照為標準，這些克隆顯示出laminA/C表達水平的降低。這說明其進入細胞的能力不依賴于任何轉染方法。沒有A9的siRNA綴合物或克隆沒有表現(xiàn)出laminA/C剔除。后幾輪的保溫試驗中鑒定出的克隆顯示出比第1輪鑒定的克隆更快的內化，這說明后幾輪篩選的克隆更快地內化。等同替換本領域技術人員可以認識到、或僅根據(jù)常規(guī)實驗能夠確定本發(fā)明所描述的特定組分和流程的許多等同替換。這種等同替換應視為在本發(fā)明的范圍之內，或者被權利要求所覆蓋。本發(fā)明所公開和要求保護的所有組合物和/或方法都可以按照公開的內容不需過度的試驗而實現(xiàn)。由于本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)通過最優(yōu)方案得到描述，對本領域技術人員顯而易見的是，可能有多種變化被應用于本發(fā)明的組合物和/或方法以及步驟或者步驟的順序而不脫離本發(fā)明的構思、精神及范圍。所有這些對于本領域技術人員顯而易見的類似的替代和改變被視為如所附的權利要求中所定義的本發(fā)明的精神、范圍和構思之內。權利要求1、一種篩選有核酸酶抗性的包含RNA的分子的方法，包括a)使細胞與一種包含RNA的分子的隨機文庫接觸；b)使被接觸的細胞暴露于一種或多種核酸酶；c)從被接觸的細胞中提取總RNA；和d)擴增從細胞中分離出的總RNA中的包含RNA的分子，其中內化的、核酸酶抗性的包含RNA的分子中選。2、權利要求1的方法，其中利用一輪篩選出的包含RNA的分子進行篩選方法的重復。3、權利要求1的方法，其中內化的包含RNA的分子是利用兩輪或更多輪的篩選方法選出的。4、權利要求3的方法，其中在每一個后續(xù)的篩選輪次中，可內化的包含RNA的分子與一種或多種細胞接觸的時間遞減。5、權利要求l的方法，其中一種或多種細胞與可內化的包含RNA的分子接觸的時間小于24小時，小于10小時，小于5小時，小于2小時，小于1小時，小于30分鐘，小于20分鐘，小于10分鐘，小于5分鐘，小于2分鐘，小于1分鐘，或小于30秒。6、權利要求1的方法，進一步包括通過多輪的篩選來分離可內化的、包含RNA的分子，其中每個后一輪的篩選包括使前一輪獲得的可內化的包含RNA的分子與細胞接觸的時間與該前一輪處理的時間相比減少。7、權利要求l的方法，其中文庫包含一種隨機化序列分子池中的功能性RNAs。8、權利要求l的方法，其中RNA包括至少一個隨機序列和至少一個恒定序列。9、權利要求l的方法，其中RNA包括兩個或更多恒定序列。10、權利要求l的方法，其中隨機序列包括至少IO個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、至少70個核苷酸、至少80個核苷酸、至少90個核苷酸，或超過100個核苷酸。11、權利要求l的方法，其中隨機文庫包括穩(wěn)定的RNAs。12、權利要求l的方法，其中一種或多種核酸酶是RNases或核糖核酸酶。13、權利要求l的方法，其中一種或多種核酸酶是脫氧核糖核酸酶。14、權利要求1的方法，其中篩選的包含RNA的分子內化進入表達CD4受體的細胞。15、權利要求14的方法，其中篩選的包含RNA的分子與siRNAs、毒素、miRNAs、適體、或小分子連接。16、權利要求l的方法，進一步包括處理細胞以防止有活性的內吞作用的步驟。17、權利要求l的方法，其中包含RNA的分子被可檢測地標記。18、權利要求l的方法，其中細胞在與包含RNA的分子的文庫接觸前被固定。19、一種篩選穩(wěn)定的、可內化的包含RNA的分子的方法，包括a)使一種或多種細胞與一種包含RNA的分子的隨機核酸文庫接觸，其中包含RNA的分子包括穩(wěn)定的核酸并包含恒定序列區(qū)域；b)洗滌細胞；c)使細胞暴露于一種或多種核酸酶；d)從細胞中提取總核糖核酸；e)擴增內化的核糖核酸；和f)重復篩選步驟a)-e)，其中每個后一輪的篩選包括使細胞與擴增的核酸分子池接觸的時間反復遞減。20、權利要求19的方法，其中包含RNA的分子至少具有部分的核酸酶抗性。21、權利要求19的方法，其中一種或多種核酸酶是RNases或核糖核酸酶。22、權利要求19的方法，其中一種或多種核酸酶是脫氧核糖核酸酶。23、權利要求19的方法，進一步包括處理細胞以防止有活性的內吞作用的步驟。24、權利要求19的方法，其中包含RNA的分子的核酸被可檢測地標記。25、權利要求19的方法，進一步包括在與核酸文庫接觸前固定細胞的步驟。26、權利要求19的方法，其中包含RNA的分子與siRNAs、miRNAs、小分子、毒素、或適體連接。27、權利要求19的方法，其中包含RNA的分子包括兩個或更多恒定序列。28、權利要求19的方法，其中文庫中包含RNA的分子的隨機序列包括至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、至少70個核苷酸、至少80個核苷酸、至少卯個核苷酸，或超過IOO個核苷酸。29、一種用于篩選可內化的、包含RNA的分子的試劑盒，包括a)—種隨機核酸文庫；b)—種或多種核酸酶，其數(shù)量足以降解所有非內化的核酸；c)一種逆轉錄酶、一種DNA聚合酶、或一種RNA轉錄酶；d)—種或多種緩沖液；和e)根據(jù)權利要求1的方法的說明書。全文摘要本發(fā)明包括組合物和方法，用于使一種或多種細胞與一種包含RNA的隨機文庫接觸，用變性劑或一種或多種核酸酶消化處理被接觸的細胞，以及從細胞中提取出對核酸酶或變性劑有抗性的一種或多種內化的核酸。文檔編號C12Q1/68GK101680037SQ200880019111公開日2010年3月24日申請日期2008年4月9日優(yōu)先權日2007年4月9日發(fā)明者安德魯·D·埃林頓,楚池泰,閆艾米,馬修·萊維申請人:德克薩斯州大學系統(tǒng)董事會