專利名稱：一種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的脫氧核酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類靶向腫瘤細(xì)胞凋亡基因家族的脫氧核酶，具體地說涉及一類可抑 制bcl家族基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的脫氧核酶。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是一種機(jī)體發(fā)育、應(yīng)急和清除變異細(xì)胞等的重要生理過程。這一過程的 異?？蓪?dǎo)致機(jī)體發(fā)生許多病理改變，包括腫瘤、病毒感染、神經(jīng)性疾病等。細(xì)胞凋亡的途徑 主要有兩條，一條是通過胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶(caspase)，一條是通過線粒體釋放 凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì) 胞凋亡。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因產(chǎn)物，包括ICE、Apaf-l、BCl-2、Fas/AP0-l、C-myC、 p53、ATM 等。bcl-2為凋亡抑制基因，編碼膜整合蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少19個(gè)同源物，統(tǒng)稱為 bcl-2家族，它們?cè)诰€粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細(xì)胞色素C等 凋亡因子的釋放。Bcl-2家族成員都含有1-4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(BH1-4)，并且通常有 一個(gè)羧端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region, TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié) 構(gòu)域，BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2家族分為兩類一 類是抗凋亡的(anti-apoptotic)，如:Bcl_2、Bcl-xl、Bcl_w、Mcl-I ；一類是促進(jìn)凋亡的 (pro-apoptotic)，如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu)域 的，如Bid、Bad。雖然Bcl-2蛋白存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，但主要定位于 線粒體外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多數(shù)促凋亡蛋白則主要定位于細(xì)胞質(zhì)，一旦細(xì) 胞受到凋亡因子的誘導(dǎo)，它們可以向線粒體轉(zhuǎn)位，通過寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道， 或者開啟線粒體的PT孔，從而導(dǎo)致線粒體中的細(xì)胞色素C的釋放，激活caspases，導(dǎo)致細(xì)胞 凋亡。研究表明，許多腫瘤均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的失調(diào)，并伴隨著抗凋亡基因的高表達(dá)，導(dǎo)致腫 瘤細(xì)胞過度生長(zhǎng)。特異性地抑制抗凋亡基因表達(dá)可達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。脫氧核酶(deoxyribozyme，又稱DNAzyme)是利用體外分子進(jìn)化技術(shù)獲得的一種 具有催化功能的短片段單鏈DNA，具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力。脫氧核酶將高效 的催化降解能力與反義的靶向識(shí)別能力結(jié)合，能夠特異地針對(duì)靶標(biāo)從mRNA水平關(guān)閉靶基 因，從而調(diào)控目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，是一種高效特異的靶向基因治療的新策略。脫氧核酶獨(dú)特 的化學(xué)本質(zhì)為脫氧寡核苷酸，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定；分子量小，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)底物的趨近性好； 催化效率及特異性高，副作用低；靶位點(diǎn)選擇的限制更少；易于合成，價(jià)格低廉。研究表明， 與其他幾種從mRNA水平關(guān)閉致病基因的方法相比，脫氧核酶能夠特異地針對(duì)靶標(biāo)從mRNA 水平關(guān)閉靶基因，是一種高效的靶向基因治療的新的策略，并已在抗病毒及抗腫瘤等領(lǐng)域 廣泛應(yīng)用。利用脫氧核酶抑制疾病相關(guān)基因，例如，癌基因和抗細(xì)胞凋亡基因，是一種新型 的靶向治療腫瘤的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類有效的通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡治療腫瘤的靶向藥物。本發(fā)明的脫氧核酶是通過下調(diào)bcl-2家族中細(xì)胞凋亡抑制基因的表達(dá)以促進(jìn)腫 瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。脫氧核酶是一種新型的基因抑制劑，其具有反義寡核 苷酸的化學(xué)穩(wěn)定性，同時(shí)又具有核酶的催化切割RNA的功能，且其合成費(fèi)用很低?；谶@些 獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已被廣泛用于體內(nèi)和體外的基因調(diào)控(Sim等Pharmacol. Rev. 52 (3) 325-347)。本發(fā)明的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的脫氧核酶，特征是包含一催化功能序列，為脫氧核苷酸序列5，-GGCTAGCTACAACGA-3，；連接催化功能序列5’端的第一結(jié)合序列，由7-12個(gè)核苷酸組成，互補(bǔ)于bcl-2家 族中細(xì)胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位點(diǎn)的3’端序列，其中*代表切割點(diǎn)， R代表A或G，Y代表U或C ；和連接催化功能序列3’端的第二結(jié)合序列，由7-12個(gè)核苷酸組成，互補(bǔ)于bcl-2家 族中細(xì)胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位點(diǎn)的5’端序列。所述脫氧核酶是一種DNA分子，可特異性地識(shí)別并切割靶mRNA或pre-mRNA中任 一嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的連接鍵，其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制如圖1所示。其中N = G，U，C或 A ；R*Y為切割位點(diǎn)；R = A或G ;Y = U或C ；5’端結(jié)合序列(即上述第一結(jié)合序列)互補(bǔ)于 包括所述Y在內(nèi)的切割位點(diǎn)的3’端序列；3’端結(jié)合序列(即上述第二結(jié)合序列)互補(bǔ)于 不包括所述R在內(nèi)的切割位點(diǎn)的5’端序列。本發(fā)明脫氧核酶靶向的bcl-2家族基因包括Bcl-2，Bcl-xL, Bcl-w, Bf 1-1， brag-1, Mcl-I，Al等細(xì)胞凋亡抑制基因。Bcl_2家族基因的異常表達(dá)可引起細(xì)胞高度增殖 和凋亡受阻。對(duì)Bcl-2家族基因表達(dá)的抑制可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。首選的靶基因?yàn)锽cl-2 和Bcl-xL。代表性的脫氧核酶序列如表1和表2所列。本發(fā)明的脫氧核酶一般由29 39核苷酸組成，自5’到3’的方向由磷酸二酯鍵連 接。為增強(qiáng)脫氧核酶的穩(wěn)定性，可對(duì)其結(jié)合序列中的磷酸二酯鍵進(jìn)行化學(xué)修飾以提高脫氧 核酶的抗酸和抗酶降解的能力，例如采用硫代磷酸二酯鍵，使所述第一結(jié)合序列和/或第 二結(jié)合序列各含有1-6個(gè)硫代磷酸二酯鍵。采用鎖核酸(Locked nucleic acids, LNA)和 肽核酸(P印tide nucleic acids, PNA)形式的修飾也能夠提高脫氧核酶的穩(wěn)定性。此外， 脫氧核酶穩(wěn)定性的增強(qiáng)還可以通過對(duì)結(jié)合序列進(jìn)行其他化學(xué)修飾實(shí)現(xiàn)，包括1)對(duì)堿基、糖基的修飾和主干結(jié)構(gòu)的修飾。對(duì)堿基的修飾，例如甲基化堿基、羥 甲基化堿基等。對(duì)糖基的修飾，例如2’位、3’位取代的核糖核酸或脫氧核糖核酸。核糖基和 單核苷酸之間的連接鍵稱為核酸的主干結(jié)構(gòu)。對(duì)主干結(jié)構(gòu)的修飾包括連接鍵以及其它可以 增強(qiáng)穩(wěn)定性和親和性的修飾，例如，對(duì)糖基結(jié)構(gòu)的修飾。具體的例子有，在堿基相對(duì)于天然 右旋異構(gòu)體糖為反向時(shí)，可使用左旋(L-)異構(gòu)體脫氧核糖；或?qū)⑻腔?’-羥基用2’-鹵 素元素，’ -0-烷基，2’ -0-烷基-η (0-烷基)取代；或者使用下列連接鍵2’ -0-甲基磷酸 二酯鍵。本發(fā)明的脫氧核酶可具有部分修飾，或全部修飾，或是不同修飾的組合。優(yōu)選的是 2’ -0-甲基修飾。2)末端保護(hù)在分子的末端加入保護(hù)基因，以防止分子的降解。這種保護(hù)可以是 5’端，也可以是3’端，或是兩端均被保護(hù)。例如，在末端反向連接核苷酸殘基；末端核苷酸為雙脫氧核苷酸；末端肽鍵連接；在末端核苷酸的糖基2’或3’位添加甲磷酸基、烷基、 芳基，蟲草素(cordyc印in)、阿糖胞苷(cytosine arabanoside)、烷氧基(如甲氧基、乙氧 基等)、熒光素、二氮苯基、膽固醇、生物素、吖啶(acridine)、羅丹明補(bǔ)骨脂素(rhodamine psoralen)、甘油基(glyceryl)、丁醇基、丁基或已醇基。優(yōu)選的是在3’端3’_3’反向連接。靶向bcl-2家族基因的脫氧核酶的設(shè)計(jì)方法是通過分析靶基因的mRNA序列，篩 選出AU和⑶位點(diǎn)，進(jìn)一步分析位點(diǎn)區(qū)域的自由能水平，選出-AG° -25kCal/mol的靶向位 點(diǎn)。針對(duì)這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的脫氧核酶。應(yīng)用DNA合成儀器，合成所設(shè)計(jì)的脫氧核酶，并 進(jìn)行體外切割實(shí)驗(yàn)，獲得具有高切割活性的脫氧核酶。脫氧核酶的生物學(xué)活性可以利用腫瘤細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)包括， Western blots分析驗(yàn)證對(duì)靶基因表達(dá)的抑制；采用流式細(xì)胞儀分析脫氧核酶對(duì)腫瘤細(xì)胞 凋亡的促進(jìn)；Westernblots分析驗(yàn)證脫氧核酶對(duì)細(xì)胞色素C釋放的促進(jìn)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā) 明的脫氧核酶能特異性識(shí)別和抑制靶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而能夠應(yīng)用于制 備治療腫瘤的靶向藥物。


圖1是脫氧核酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制示意圖。圖2顯示了靶向Bcl-2的脫氧核酶在前列腺癌細(xì)胞PC3 (A)和膀胱癌細(xì)胞T24(B) 中對(duì)Bcl-2表達(dá)的抑制作用。圖3顯示了靶向Bcl-xL的脫氧核酶在前列腺癌細(xì)胞PC3 (A)、膀胱癌細(xì)胞T24(B)、 肺癌細(xì)胞A549 (C)、結(jié)腸癌細(xì)胞HCTl 16 (D)中對(duì)Bcl_xL表達(dá)的抑制作用，其中=Cells指 未對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的情況；TMP指只用轉(zhuǎn)染試劑TMP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的情況；ctrl指無(wú)關(guān)對(duì)照； DT882等指利用轉(zhuǎn)染試劑TMP用2mM濃度的脫氧核酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞的情況。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。如 表1、表2中所列的脫氧核酶序列為代表性的分子，任何其它靶向bcl-2家族中細(xì)胞凋亡抑 制基因的脫氧核酶，均可用于制備治療腫瘤的靶向藥物。實(shí)施例1 靶向bcl-2和bcl-xL mRNA脫氧核酶切割位點(diǎn)的分析與篩選Bcl-2和Bcl-xL在許多腫瘤中均為高表達(dá)，抑制Bcl-2或Bcl-xL表達(dá)可促進(jìn)腫瘤 細(xì)胞凋亡。本實(shí)施例中，用于脫氧核酶設(shè)計(jì)的Bcl-2的cDNA克隆包含31bp的5’ UTR，720bp 的0RF，2. 2kb的3，UTR序列。通過對(duì)bcl_2mRNA的掃描，鑒定出141潛在的AU和GU切割位 點(diǎn)。在這些切割位點(diǎn)5’端取9個(gè)核苷酸(不包括切割位點(diǎn)R*Y處的R)和3’端取9個(gè)核苷 酸(包括切割位點(diǎn)R*Y處的Y)組成序列，對(duì)該序列進(jìn)行酶-底物復(fù)合物熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性分析 (-AG0 kcal/mol)，獲得每個(gè)位點(diǎn)處序列的雜交自由能。進(jìn)一步分析獲得了 Tm值，以確保脫 氧核酶不形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)。通過以上分析，基于-25kcal/m0l為篩選參數(shù)，共產(chǎn)生55個(gè)靶向 位點(diǎn)。針對(duì)這些位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了 55個(gè)脫氧核酶，并對(duì)脫氧核酶的活性進(jìn)行體外切割能力的評(píng)價(jià)。 根據(jù)體外活性，挑選出26個(gè)脫氧核酶，并對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)修飾(在最5’端和最3’端，分別引 入3個(gè)硫代磷酸二酯鍵；3’端引入一個(gè)反向連接的T)。將26個(gè)靶向bcl-2的脫氧核酶分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，利用Western blot分析脫氧核酶對(duì)bcl_2表達(dá)的抑制效應(yīng)。結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，26個(gè)脫氧核酶中有8個(gè)具有顯著的抑制靶基因表達(dá)的活性。以上結(jié)果總結(jié)于表1。表1.靶向bcl-2的脫氧核酶的設(shè)計(jì)分析結(jié)果 本實(shí)施例中，用于脫氧核酶設(shè)計(jì)的Bcl-xL的cDNA克隆包含926bp核苷酸。通過 對(duì)bcl-xL mRNA的掃描，鑒定出81個(gè)潛在的AU和⑶切割位點(diǎn)。在這些切割位點(diǎn)5’端取 9個(gè)核苷酸(不包括切割位點(diǎn)R*Y處的R)和3’端取9個(gè)核苷酸(包括切割位點(diǎn)R*Y處的 Y)組成序列，對(duì)該序列進(jìn)行酶-底物復(fù)合物熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性分析kcal/mol)，獲得 每個(gè)位點(diǎn)處序列的雜交自由能。進(jìn)一步分析獲得了 Tm值，以確保脫氧核酶不形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)。通過以上分析，基于-25kCal/mol為篩選參數(shù)，共產(chǎn)生26個(gè)靶向位點(diǎn)。針對(duì)這些位點(diǎn)， 設(shè)計(jì)了 26個(gè)脫氧核酶，并對(duì)脫氧核酶的活性進(jìn)行體外切割能力的評(píng)價(jià)。根據(jù)體外活性，挑 選出11個(gè)脫氧核酶，并對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)修飾(在最5’端和最3’端，分別引入3個(gè)硫代磷 酸二酯鍵；3’端引入一個(gè)反向連接的T)。將11個(gè)靶向bcl-2的脫氧核酶分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞， 提取細(xì)胞蛋白，利用Western blot分析脫氧核酶對(duì)bcl_2表達(dá)的抑制效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11 個(gè)脫氧核酶中有4個(gè)具有顯著的抑制靶基因表達(dá)的活性。以上結(jié)果總結(jié)于表2。表2.靶向bcl-xL的脫氧核酶的設(shè)計(jì)分析結(jié)果 實(shí)施例2 脫氧核酶對(duì)腫瘤細(xì)胞bcl-2表達(dá)的抑制作用Bcl-2和Bcl-xL在許多腫瘤中均表現(xiàn)為高表達(dá)。為了驗(yàn)證體外篩選出的脫氧核酶 在細(xì)胞中的活性，我們選擇了體外活性較高的靶向Bcl-2的脫氧核酶，利用轉(zhuǎn)染試劑TMP， 以2mM脫氧核酶的濃度轉(zhuǎn)染不同的腫瘤細(xì)胞。24小時(shí)后，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western Blot 分析。圖2顯示結(jié)果表明，靶向Bcl-2的脫氧核酶DT895、DT899、DT908、DT910、DT912均可 抑制Bcl-2在前列腺癌細(xì)胞PC3和膀胱癌細(xì)胞T24中的表達(dá)。實(shí)施例3 脫氧核酶對(duì)腫瘤細(xì)胞bcl-xL表達(dá)的抑制作用對(duì)靶向Bcl-xL的脫氧核酶進(jìn)行相同分析結(jié)果顯示(圖3)，DT888，DT884，DT883， DT882在前列腺癌細(xì)胞PC3中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制效果。進(jìn)一步選用DT882在膀胱癌細(xì)胞系 T24，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中進(jìn)行了分析，結(jié)果表明DT882在這些細(xì)胞中 均可有效抑制Bcl-xL的表達(dá)。實(shí)施例4 靶向Bcl-2和Bcl-xL的脫氧核酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)在確認(rèn)了靶向Bcl-2和Bcl-xL的脫氧核酶在細(xì)胞內(nèi)可特異性地抑制靶基因的表 達(dá)后，我們分別選擇了 DT895(靶向Bcl-2)和DT882(靶向Bcl-xL)脫氧核酶，以2mM的濃 度轉(zhuǎn)染進(jìn)入一系列腫瘤細(xì)胞，以無(wú)關(guān)序列為對(duì)照，觀察脫氧核酶對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。細(xì) 胞凋亡分析采用流式細(xì)胞儀，以PI染色方法測(cè)定sub-Gl細(xì)胞群(凋亡細(xì)胞群)的比例。 同時(shí)，應(yīng)用Western blots方法分析了處理細(xì)胞中線粒體細(xì)胞色素C的相對(duì)釋放，進(jìn)一步證
7實(shí)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如表3所示，靶向Bcl-2和Bcl-xL脫氧核酶均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。表3.靶向Bcl-2和Bcl-xL的脫氧核酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡
權(quán)利要求
一種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶包含一催化功能序列，為脫氧核苷酸序列5’ GGCTAGCTACAACGA 3’；連接催化功能序列5’端的第一結(jié)合序列，由7 12個(gè)核苷酸組成，互補(bǔ)于bcl 2家族中細(xì)胞凋亡抑制基因mRNA或pre mRNA的R*Y切割位點(diǎn)的3’端序列；和連接催化功能序列3’端的第二結(jié)合序列，由7 12個(gè)核苷酸組成，互補(bǔ)于bcl 2家族中細(xì)胞凋亡抑制基因mRNA或pre mRNA的R*Y切割位點(diǎn)的5’端序列；在R*Y中，*代表切割點(diǎn)，R代表A或G，Y代表U或C。
2.如權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶是由29-39個(gè)核苷酸連接 而成的寡核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述細(xì)胞凋亡抑制基因是Bcl-2， Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, brag-1, Mcl-I 或 Al。
4.如權(quán)利要求3所述的脫氧核酶，其特征在于，所述細(xì)胞凋亡抑制基因是Bcl-2，所述 脫氧核酶選自序列表中SEQ ID No. 1 26所示的任一核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的脫氧核酶，其特征在于，所述細(xì)胞凋亡抑制基因是Bcl-xL，所述 脫氧核酶選自序列表中SEQ ID No. 27 37所示的任一核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其特征在于，所述脫氧核酶在第一和第二結(jié)合序列 中至少具有一種化學(xué)修飾。
7.如權(quán)利要求6所述的脫氧核酶，其特征在于，在所述第一結(jié)合序列和/或第二結(jié)合序 列中各含有1-6個(gè)硫代磷酸二酯鍵。
8.如權(quán)利要求6所述的脫氧核酶，其特征在于，所述化學(xué)修飾選自末端反向連接，核 糖基2’ -0-甲基，鎖核酸和肽核酸。
9.一種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物組合物，含有權(quán)利要求1 8中任一權(quán)利要求所述脫 氧核酶中的一種或多種。
10.權(quán)利要求1 8任一所述脫氧核酶在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的脫氧核酶，包含一具有催化功能的脫氧核苷酸序列5’-GGCTAGCTACAACGA-3’；分別連接催化功能序列5’端和3’端的第一和第二結(jié)合序列，分別由7-12個(gè)核苷酸組成，互補(bǔ)于bcl-2家族中細(xì)胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位點(diǎn)的3’端和5’端序列。本發(fā)明的脫氧核酶通過特異性識(shí)別并切割凋亡抑制基因的mRNA或pre-mRNA，降低凋亡抑制基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101914538SQ20101024603
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者孫侖泉 申請(qǐng)人:孫侖泉