專利名稱：一種核酸等溫擴增檢測巨細胞病毒的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及巨細胞病毒核酸擴增檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
巨細胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)作為一種屬于人類皰疹病毒科的DNA病毒，可通過胎盤感染胎兒，引起早產(chǎn)、胎兒發(fā)育遲緩、新生兒畸形、黃疸、肝脾腫大、溶血性貧血、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎等疾病癥狀，新生兒死亡率高；在免疫功能受損者如艾滋病、癌癥、器官移植等病人中CMV感染很常見，感染CMV后，可發(fā)生進行性間質(zhì)肺炎、肝炎、腦炎、心包炎及播散性CMV感染等，常威脅病人的生命，影響器官移植的存活。 CMV感染在人類非常普遍，大多無臨床癥狀呈潛伏狀態(tài)、不會被消除，后天感染有以尿、唾液、乳汁、精液、宮頸分泌物、血液為感染原的接觸感染和由于輸血或器官移植引起的醫(yī)源性感染。CMV的特征是在整個生命周期內(nèi)都潛伏在生物宿主體內(nèi)，并依據(jù)宿主的生理變化和免疫狀況由潛伏感染狀態(tài)活化或再活化，反復(fù)周期性發(fā)病。在免疫功能受損者如艾滋病、癌癥、器官移植等病人中，免疫缺陷是CMV再活化的起因，特別是盡管器官移植成功了，但移植后由于間質(zhì)肺炎等喪命成了很大問題。因此，對于成為致命原因的CMV感染再活化，確立快速準確的診斷方法對于CMV早期治療非常重要。 常規(guī)的巨細胞病毒病原學檢測有病毒分離培養(yǎng)、血清學診斷、抗原檢測方法等，其中分離培養(yǎng)需2 3周時間，不能滿足早期診斷的需要。血清學檢測方法也需等病毒感染后2 3周出現(xiàn)抗體時才有效，并且存在抗體的非特異性反應(yīng)等問題，存在難以獲得滿意的靈敏度等缺點。目前外周血白細胞中CMVpp65抗原是公認的出現(xiàn)活化病毒感染的標志，可在出現(xiàn)癥狀幾天至一周內(nèi)出現(xiàn)陽性，檢測靈敏度和特異性均較高，但操作較繁瑣、對操作人員要求較高，同時器官移植等免疫受損患者白細胞往往過少，難以進行外周血抗原檢測。
近年來，已經(jīng)可以利用實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)技術(shù)檢測CMV DNA，雖然檢測靈敏度很高，但檢測DNA難以區(qū)分病毒的活化和潛伏狀態(tài)；即使采用實時熒光RT-PCR檢測病毒活化時出現(xiàn)的mRNA，但存在核酸提取時殘留DNA而mRNA不存在時導致mRNA檢測假陽性的危險。目前，國內(nèi)外研究中采用的CMV mRNA檢測耙基因主要是其晚期基因pp67和即刻早期基因IE ;對于前者，法國生物梅里埃公司已推出采用基于核酸序列的擴增技術(shù)(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA)檢測pp67mRNA的產(chǎn)品，臨床使用后認為pp67mRNA檢測對器官移植患者活化病毒診斷具有較高的特異性，由于PP67屬于CMV生命周期中的晚期結(jié)構(gòu)基因，它的轉(zhuǎn)錄表示病毒復(fù)制已趨完成，因此pp67mRNA陽性患者CMV疾病多已侵及內(nèi)臟，代表了 CMV病已經(jīng)到了嚴重程度，這將不利于疾病早期治療，但對判斷CMV疾病預(yù)后具有一定的意義；對于后者，IE mRNA是病毒調(diào)節(jié)基因，研究表明在病毒感染后1小時即能被檢測到，或當病毒轉(zhuǎn)入活化期時IE mRNA出現(xiàn)表達，而在潛伏期幾乎無表達，它是CMV病毒復(fù)制活躍的標志，IE mRNA的表達與活動性感染關(guān)系密切，由于其出現(xiàn)比pp67mRNA早，可以作為病毒活動性感染的早期特異診斷指標，在臨床移植病人中便于啟動先發(fā)制人抗病毒方案進行治療。
RNA核酸等溫轉(zhuǎn)錄擴增和納米金探針檢測方法(Nucleic Acid IsothermalandTranscriptional Amplification with Gold Nano—particle Probes, NITAG)是——禾中利用納米金探針快速檢測恒溫擴增產(chǎn)物的新型核酸檢測技術(shù)(原理參見附圖1)。具體說來，NITAG技術(shù)首先利用一種多酶復(fù)合體所具有的逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和依賴DNA的RNA聚合酶活性，在體外等溫擴增核酸模板獲得大量RNA擴增子，然后納米金標記的寡核苷酸探針和這些RNA中的靶序列雜交形成伸展的納米金顆粒-多核苷酸的多聚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由此引發(fā)納米金粒子光學性質(zhì)的變化，產(chǎn)生雜交信號以雜交液/板/試紙顏色變化顯示，存在相互作用的雜交液/板/試紙顯示為藍色，沒有作用的顯示為紅色。利用該技術(shù)，微量RNA模板可通過等溫擴增的模板拷貝數(shù)和納米金探針檢測的顯色信號雙級放大而得到檢測，該檢測技術(shù)具有無需特殊昂貴設(shè)備、檢測靈敏快速、結(jié)果直觀可見等優(yōu)點。目前采用NITAG技術(shù)檢測CMV mRNA的應(yīng)用尚無公開報道，通過檢測可以反映病毒在生物宿主內(nèi)的活化狀態(tài)，具有現(xiàn)實的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于NATAG技術(shù)的巨細胞病毒mRNA檢測方法和試劑盒，對來自CMV的mRNA進行等溫擴增和納米金探針檢測。
技術(shù)方案 本發(fā)明提供一種基于NITAG技術(shù)擴增巨細胞病毒即刻早期IE耙基因mRNA的寡聚核苷酸引物對和探針，其中引物對具有SEQ ID N0:1和SEQID N0:2的序列(SEQ ID NO :25，端含有能被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列)；檢測探針具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO:4的序列(前者5'端和后者3'端分別經(jīng)過己烷巰基化處理)，捕獲探針具有SEQ ID NO :5的序列(5'端生物素Biotin標記)。 SEQ ID N01 :5， -AggATgTTTgCAgAATgCCTTA-3， 22bp SEQ ID N02 :5，AATTCTAATACgACTCACTATAggg AgACTTAATACAAgCCATCCACA—3，48bp SEQ ID N03 :5， HS-(CH2)6-[gAgATgAAgTgTATTgggCT]20bp SEQ ID N04:5， [AgAACTACATTgTACCTgAggA]-(CH2)6_SH3， 22bp SEQ ID N05 :5， BI0TIN—TAgATAAggTTCATgAgCCTT-3， 21bp 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85 %的序列； 或者上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。 在實施方案中，本發(fā)明提供一種基于NITAG技術(shù)的擴增檢測CMV mRNA的方法和試劑盒，所述方法包括步驟 (l)mRNA模板在60 70。C下解鏈后降溫； (2)加入逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和RNA聚合酶，在引物的引導下于37 42。C進行等溫擴增，獲得RNA擴增子； (3)利用納米金顆粒標記的寡核苷酸檢測探針和生物素標記的寡核苷酸捕獲探針檢測RNA擴增子，通過在層析膜的顯色反應(yīng)獲得檢測結(jié)果，顯色條帶的存在是樣品中巨細
4胞病毒mRNA的指示。 本發(fā)明提供一種利用上述檢測方法進行CMV mRNA等溫擴增的檢測試劑盒，其組成 為NITAG反應(yīng)緩沖液、納米金顆粒標記的寡核苷酸檢測探針、生物素(或地高辛)標記的 寡核苷酸捕獲探針、以及固定有親和素(或抗地高辛抗體)標記的層析膜。組裝形成的試
劑盒在-2(rc下保存。 具體而言，本發(fā)明是通過以下方式實現(xiàn)的 本發(fā)明的巨細胞病毒mRNANITAG檢測技術(shù)包括樣本處理、mRNA等溫擴增以及納米 金探針檢測三個步驟。樣本處理步驟是從巨細胞病毒細胞培養(yǎng)物樣本中提取mRNA模板的 過程，擴增檢測對象是從樣本中提取獲得的mRNA模板。利用提取獲得的巨細胞病毒mRNA 模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H(RNase H)、RNA聚合酶(RNA Pol)等溫擴增出的大量RNA 擴增子，并結(jié)合烷巰基化寡核苷酸標記的納米金探針檢測，通過層析膜顯色反應(yīng)實現(xiàn)對RNA 模板的檢測。 本發(fā)明的等溫擴增體系包括RNA模板、引物及緩沖液等組成，檢測體系包括納米 金探針、捕獲探針及緩沖液等組成，其具體操作為將待測標本提取的RNA置入反應(yīng)緩沖 液，在60 70 (最優(yōu)選65) t:和37 42 (最優(yōu)選41) 。C下先后處理5min，加入混合酶，在 37 42(最優(yōu)選41) t:下反應(yīng)90 120min ;然后再將RNA擴增產(chǎn)物與納米金檢測探針以 及生物素標記捕獲探針緩沖液混合檢測，在37 65t:處理5min冷卻后在膜上層析顯色。
本發(fā)明的等溫擴增反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為20 60mM Tris-HCl (pH8. 0 9. 0)、30 90mM KCl、10 20mM MgCl2、0. 5 5mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 、 1 10mM 核糖核苷三磷酸(NTPs)、4 20mM二硫蘇糖醇(DTT)、10 20% (v/v) 二甲基亞砜(DMSO); 所說的兩種引物(包括帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的引物I和第二鏈cDNA合成引物 II)終濃度各為0. 1 1 ii mol/L ;所說的混合酶液各組分在20 P L反應(yīng)體系中的量為4 75U逆轉(zhuǎn)錄酶、8 3000U RNA聚合酶(識別特異啟動子序列的T3RNA聚合酶或T7RNA聚 合酶)、0. 05 0. 3U RNase H酶、10 50U RNA酶抑制劑(RNasin Inhibitor)和0. 05 5iig小牛血清白蛋白(BSA)。所說的檢測反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為0.3mol/L NaCl， lOmM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，5iimol/L納米金探針、liimol/L生物素標記捕獲探針。層析 膜為固定有親和素的硝酸纖維膜或尼龍膜(保存于干燥環(huán)境)。 本發(fā)明所用的納米金顆粒大小為1 100nm，按照粒徑不同可以采用檸檬酸三鈉 還原法、白磷還原法或者抗壞血酸還原法。 本發(fā)明所述納米金寡核苷酸檢測探針的制備過程為 (1)納米金顆粒的制備在煮沸攪拌HAuCl4溶液(lmM，500mL)回流的情況下，迅速 加入50mL 38. 8mM檸檬酸三鈉溶液，溶液的顏色將由灰黃變?yōu)樯罴t，繼續(xù)回流15min，然后 冷卻至室溫，最后用0.45yM的膜進行過濾，即得到約13nm粒徑的金顆粒。這種納米金溶 液具有518 520nm處的特征表面等離子體吸收峰。納米金顆粒上的寡核苷酸探針長度為 10 100bp，連接前需要先經(jīng)過巰基化或烷巰基化處理并純化。 (2) 3'或5'烷巰基標記的寡核苷酸在納米金顆粒上的修飾取納米金溶液5mL(約 17nm)2. 50D烷基寡核苷酸探針(由上海生工合成，稀釋終濃度3.61ymol/L)混合并孵育 16小時左右，然后將混合溶液置于0. lmol/L NaCl， lOmM磷酸鹽緩沖液中并保持40小時，接 下來在1400r/min至少離心25min以除去未反應(yīng)的試劑。除去上清液，剩余的紅色油狀沉淀再用緩沖液清洗，離心后保存在O. 3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，探針終 濃度為10iimol/L。通過紅外光譜的測定證明，每個金顆粒表面被修飾了許多探針，因此才 有可能在多核苷酸檢測過程中形成聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 (3)層析膜的制備將2mg/ml親和素以2iU/cm的量加到纖維膜或尼龍膜上，在 濕度40^、溫度4(TC的環(huán)境內(nèi)自然干燥3小時；然后將膜貼于撕去不干膠的硬紙板上，上端 用濾紙覆蓋層析膜、壓緊貼上不干膠固定，最后用割膜機切割成4mm寬的試紙條狀備用(保 存于干燥環(huán)境)。 本發(fā)明檢測過程中的層析膜顯色反應(yīng)為溶液雜交后層析顯色過程。溶液雜交顯色 法即將等溫擴增產(chǎn)物10 ii L(約lOpmol)加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸檢 測探針、10ii L生物素化捕獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然后將混合溶液置于 恒溫水浴槽中并將其加熱到65t:，將混合物平衡5min，最后放入層析膜試紙條、經(jīng)過5 10min后進行觀察，如果納米金探針與擴增產(chǎn)物靶序列雜交，會在膜上形成藍紫色的條帶， 表示RNA檢測陽性，從而顯示巨細胞病毒的存在，否則將不會出現(xiàn)條帶。
有益效果 本發(fā)明建立了利用NITAG技術(shù)檢測巨細胞病毒mRNA的方法，從原理上分析，等溫
擴增和納米金探針均能放大檢測信號，等溫擴增放大的是RNA分子的拷貝數(shù)，納米金探針
放大的是顯色信號，加上層析步驟使顯色的雜交復(fù)合物聚集為一個窄小條帶，結(jié)果觀察更
為簡便和直觀，所以比NASBA擴增后的電化學發(fā)光檢測技術(shù)更靈敏，使實際應(yīng)用于CMV微量
表達的IE mRNA檢測成為可能；由于NITAG技術(shù)只能擴增RNA模板，這可以避免熒光RT-PCR
檢測CMV mRNA時核酸提取物中殘留DNA的影響、以及假陽性檢測結(jié)果的發(fā)生。 采用本發(fā)明技術(shù)，巨細胞病毒的mRNA擴增效率、檢測靈敏度和特異性大大的提
高，并降低了 PCR擴增檢測的假陽性率。本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計合理，樣本實驗?zāi)茉诜肿?br> 水平上證明巨細胞病毒mRNA的存在，表明該方法切實可行?；贜ATAG技術(shù)的巨細胞病毒
mRNA檢測方法和試劑盒，可以作為評價病毒活化狀態(tài)的輔助實驗手段，具有現(xiàn)實的臨床意
義和應(yīng)用價值。


圖1為NITAG擴增檢測巨細胞病毒mRNA技術(shù)原理示意圖
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作 手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上?；瘜W試劑廠， Trizol試劑購自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶購自上海申能博彩生物公司，逆轉(zhuǎn)錄AMV 酶、T7RNA聚合酶、RNase H、 RNase Inhibitor和BSA均購自美國Promega公司，引物和探 針均由上海生工公司合成。
實施例1 巨細胞病毒培養(yǎng)物的CMV mRNA NITAG檢測 以下通過介紹巨細胞病毒培養(yǎng)物提取的mRNANITAG檢測來舉例說明本發(fā)明的實 施。 RNA提取:樣本為在人胚肺成纖維細胞生長的CMVAD169標準株培養(yǎng)物，經(jīng)生理鹽 水稀釋后，取250iU加入500 ill Trizol提取試劑，用移液器反復(fù)吹打混勻，室溫放置5 分鐘，加入200ii1氯仿，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4t: 12， OOOrpm離心 15分鐘，將上清移入新的離心管，加入200 異丙醇，旋渦振蕩5秒，冰浴沉淀10分鐘， 4°C 12， OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入500 y 1預(yù)冷的DEPC水配制的75%乙醇洗滌，上下 顛倒10次，4°C 10， OOOrpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入10 y IDEPC 處理的水稀釋混勻，立即使用或-7(TC保存(使用前可加入10iU DEPC處理的水稀釋混 勻)。然后加入3iU lOXDNase I緩沖液、7iU RNase inhibitor,DNasel 10iU，37。C溫 育15分鐘后加入1 y 1 10mM EDTA 65°C 15分鐘滅活DNaseI，短暫離心后直接用于NITAG 等溫擴增。 NITAG擴增柃測:取5 y L的提取處理后的RNA模板置入10 y L2x等溫擴增反應(yīng)體 系緩沖液，在65"和4rC下先后處理5min，加入5 y L混合酶液，在41。C下反應(yīng)120min ;取 10 L等溫擴增產(chǎn)物加入至含有20 L納米金-烷巰基化寡核苷酸探針、10 P L生物素化捕 獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然后將混合溶液置于恒溫水浴槽中并將其加熱 到65t:，將混合物平衡5min，最后放入層析膜試紙條、經(jīng)過5 10min后進行觀察，層析膜 上形成藍紫色的條帶，說明巨細胞病毒mRNA檢測陽性。
實施例2 器官移植患者樣本CMV mRNA NITAG檢測 前處理方法:樣本為臨床經(jīng)過器官移植(腎、肝和骨髓)并正在接受免疫抑制治療 中的患者抗凝全血，每個樣本各取1ml用紅細胞裂解液反復(fù)清洗，分離出白細胞重懸于1ml 生理鹽水，準備用于RNA提取。 Mi&:取上述分離的250ii1白細胞，加入500ii1 Trizol提取試劑，用移液器 反復(fù)吹打混勻，室溫放置5分鐘，加入200 ii 1氯仿，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5分 鐘，4°C 12， OOOrpm離心15分鐘，將上清移入新的離心管，加入200 yl異丙醇，旋渦振蕩5 秒，冰浴沉淀10分鐘，4°C 12， OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入500 y 1預(yù)冷的DEPC水配 制的75%乙醇洗滌，上下顛倒10次，4" 10， 000rpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干燥 10-20分鐘，加入lOiil DEPC處理的水稀釋混勻。然后加入3iillOXDNase I緩沖液、7iU RNaseinhibitor，DNaseI 10 ii 1，37。C溫育15分鐘后加入1 P 1 10mM EDTA 65°C 15分鐘滅 活DNaseI，短暫離心后直接用于NITAG等溫擴增。 NITAG擴增檢測:取5 ii L的提取處理后的RNA模板置入10 y L2x等溫擴增反應(yīng)體 系緩沖液，在65"和4rC下先后處理5min，加入5 y L混合酶液，在41。C下反應(yīng)120min ;取 10 ii L等溫擴增產(chǎn)物加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸探針、10 P L生物素化捕 獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然后將混合溶液置于恒溫水浴槽中并將其加熱 到65t:，將混合物平衡5min，最后放入層析膜試紙條、經(jīng)過5 10min后進行觀察，層析膜 上形成藍紫色的條帶，說明巨細胞病毒mRNA檢測陽性。
核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING <110>上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司
上海復(fù)星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司
吳大治，夏懿 〈120〉 一種核酸等溫擴增檢測巨細胞病毒的方法及試劑盒 〈130〉Cytomegalovirus mRNA <140>CN 〈141>2008-10-10 〈160〉5 〈170〉Patentln version 3. 3 〈210>1 <211>22 〈212>DNA 〈213〉Human Herpesvirus 5(Cytomegalovirus) 〈400〉 1 aggatgtttg cagaatgcct ta 22 <210>2 〈211>48 〈212〉DNA 〈213〉Human Herpesvirus 5(Cytomegalovirus) 〈400>2 aattctaata cgactcacta tagggagact taatacaagc catccaca 48 〈210>3 〈211 〉21 〈212〉DNA 〈213>Human Herpesvirus 5 (Cytomegalovirus) <220> 〈221〉己烷巰基 〈222〉 (1) (19) 〈223〉y = HS- (CH2) 6- 〈400>3 ygagatgaag tgtattgggc t 21 〈210>4 〈211 〉23 〈212〉DNA 〈213>Human Herpesvirus 5 (Cytomegalovirus) <220> 〈221〉己烷巰基
〈222〉 (1) (20) 〈223〉y = _(CH2)6-SH 〈400>4 agaactacat tgtacctgag gay 23 〈210〉5 〈211〉22 〈212>DNA 〈213〉H咖an Herpesvirus 5 (Cytomegalovirus) 〈220〉 〈221〉生物素 〈222〉 (1) . (21) <223〉y = biotin- 〈400>5 ytagataagg ttcatgagcc tt 22
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權(quán)利要求
一種巨細胞病毒(CMV)核酸等溫擴增檢測方法，采用逆轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄和納米金探針檢測層析雜交原理，其擴增對象為從CMV中提取的mRNA模板；其特征在于，RNA模板通過采用逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H以及RNA聚合酶等溫擴增，產(chǎn)生的大量RNA擴增子和納米金顆粒標記的檢測探針、生物素(或地高辛)標記的捕獲探針結(jié)合形成雜交復(fù)合物引起光學性質(zhì)變化，最后該復(fù)合物和固定在層析膜上親和素(或抗地高辛抗體)結(jié)合形成顯色檢測條帶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，采用了擴增CMV靶基因mRNA的寡聚核苷酸引物和探針引物具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列，其中SEQ ID NO :25'端含有RNA聚合酶識別的啟動子序列；檢測探針具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4序列；捕獲探針具有SEQ ID N0:5序列。這些引物和探針或者是包含有上述序列的向5'端或和3'端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其步驟依次包括(1) RNA模板在60 7(TC下解鏈后降溫；(2) 加入逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶，在引物的引導下于37 42。C進行等溫擴增，獲得RNA擴增子；(3) 利用納米金顆粒標記的寡核苷酸探針檢測擴增子，并被生物素標記寡核苷酸探針結(jié)合捕獲，通過層析膜上的條帶顯色反應(yīng)獲得檢測結(jié)果。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所說的逆轉(zhuǎn)錄酶為鳥成髓細胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶；所說的RNA聚合酶為T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1和5所說的檢測方法，其特征在于，所說的T3RNA聚合酶所識別特異性啟動子序列為5'AAT TCAATT AAC CCT CAC TAAAGGG3';所說的T7RNA聚合酶所識別特異性啟動子序列為5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG G3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征在于，所用的納米金顆粒直徑為1 100nm，納米金顆粒上的寡核苷酸探針SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4長度為10 lOObp，且連接前經(jīng)過巰基化或烷巰基化處理；所用的捕獲探針SEQ ID NO :5長度為10 50bp，其5'端可為生物素或地高辛標記。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所用的固定有親和素或抗地高辛抗體(對應(yīng)于捕獲探針5'端標記生物素或地高辛)的層析膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所說的顯色反應(yīng)為雜交后在層析膜上出現(xiàn)藍紫色顯色條帶。
9. 一種利用權(quán)利要求l所述檢測方法組裝的試劑盒，其組成為包含有引物I和II、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、 RNA聚合酶的反應(yīng)緩沖液、納米金顆粒標記的寡核苷酸檢測探針、生物素(或地高辛)標記的寡核苷酸捕獲探針、帶有親和素(或抗地高辛抗體)標記的層析膜。
10. —種利用權(quán)利要求1所述檢測方法組裝的巨細胞病毒核酸等溫擴增檢測試劑盒，可以用于巨細胞病毒中分離的mRNA檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸等溫擴增檢測巨細胞病毒(CMV)的方法及其試劑盒，檢測步驟依次包括巨細胞病毒mRNA模板在60～70℃下解鏈后降溫；加入逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引導下于37～42℃進行等溫擴增，獲得RNA擴增子；然后利用納米金探針和捕獲探針檢測擴增子，通過層析雜交顯色反應(yīng)獲得檢測結(jié)果。雜交膜出現(xiàn)顯色條帶為mRNA陽性，無條帶為陰性。采用本方法的試劑盒可快速準確地檢測巨細胞病毒mRNA。
文檔編號G01N21/76GK101760564SQ20081020168
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者吳大治, 夏懿 申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司