專利名稱：：Abo血型基因檢測(cè)試劑及定型方法ABO血型基因檢測(cè)試劑及定型方法[
技術(shù)領(lǐng)域：
]本發(fā)明涉及一種新的分子生物學(xué)檢測(cè)試劑及方法；尤其涉及一種用于ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的檢測(cè)試劑及定型方法。[
背景技術(shù)：
]ABO血型系是人類血型系中抗原免疫原性最強(qiáng)的一個(gè)血型系統(tǒng)。人類的ABO血型系統(tǒng)是由由第9號(hào)染色體(9q34.1q34.2)上的A、B和O三個(gè)等位基因來控制的，基因通過決定生成的轉(zhuǎn)糖基酶的種類而決定催化何種糖基連接在前驅(qū)物質(zhì)的哪個(gè)位置上。A、B抗原都是在H抗原(前驅(qū)物質(zhì)半乳糖末端連接巖藻糖)的基礎(chǔ)上形成的，細(xì)胞合成的A酶能使一個(gè)乙酰半乳糖胺基連接到H抗原上，形成A抗原；B抗原是一個(gè)半乳糖基連接到H抗原上。根據(jù)人類紅細(xì)胞表面有無(wú)抗原A、B和H，可分為A型、B型、AB型和O型四型，組成ABO血型系統(tǒng)。A型紅細(xì)胞上有A抗原，B型者有B抗原，AB型者有A和B兩種抗原，而O型者兩種抗原均無(wú)但有H抗原。目前人類ABO血型檢測(cè)方法有二種一是經(jīng)典的血清學(xué)方法，二是基因方法。血清學(xué)方法的缺點(diǎn)是需要新鮮紅細(xì)胞，需要抽血檢驗(yàn)；而基因方法可以彌補(bǔ)這方面的缺陷，因此基因定型方法已逐步運(yùn)用于臨床血型檢測(cè)中。ABO基因定型方法原理如下鑒于ABO基因產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶，這些酶控制ABO血型抗原的生物合成。ABO抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)是糖蛋白，其血清學(xué)特異性取決于糖鏈末端3個(gè)糖基的結(jié)構(gòu)。ABO基因包含長(zhǎng)度大小從28-688bp不等的7個(gè)外顯子和長(zhǎng)度約為19514bp的6個(gè)內(nèi)含子,它大約總長(zhǎng)為18-20Kb。多數(shù)編碼序列(1062bp中823bp)位于第6和第7外顯子上，它們編碼了糖基轉(zhuǎn)移酶的催化區(qū)域。ABO血型的其它等位基因的DNA序列高度保守，與A101—致序列的DNA序列緊密相關(guān)，僅有幾個(gè)堿基替換或單個(gè)堿基缺失。A102等位基因與A101等位基因相比只是在467位的單個(gè)堿基替換(C/T，Pro/Leu)，兩者翻譯的糖基轉(zhuǎn)移酶活力沒有顯著性差異。B1基因僅在297、526、657、703、796、803、930和1096位堿基8個(gè)位置與A101基因有改變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈上有4個(gè)氨基酸替代C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A(Leu/Met)、G803C(Gly/Ala)。01基因與A101的差異是第261位核苷酸G缺失，引起了閱讀框移動(dòng)，在351至354位置產(chǎn)生終止密碼子，肽鏈合成在117位氨基酸終止，產(chǎn)生一條無(wú)催化能力的短肽鏈。ABO基因定型方法克服了以往血型血清學(xué)方法的限制，可作為一種獨(dú)立的鑒定手段，為臨床解決ABO亞型的鑒定、血型抗原減弱反應(yīng)、Cis-AB(順式AB型)、類孟買型、血型嵌合體、正反定型不符等疑難問題，在臨床輸血醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用。但鑒于不同民族不同人種的基因構(gòu)成存在明顯差異，采用什么樣的檢測(cè)試劑進(jìn)行基因檢測(cè)，有不同的檢測(cè)效果。研究表明(喻瓊,吳國(guó)光，鄧志輝，等.中國(guó)漢族人群A2亞型分子遺傳背景的研究.中國(guó)輸血雜志，2004,17(2):83~86):中國(guó)漢族人群與別的人種ABO血型基因分布相比有著自己的特點(diǎn)，中國(guó)人群中Al、B、01基因較常見，其中A102基因頻率高達(dá)0.2231，A101基因頻率僅為0.0096，無(wú)02基因；中國(guó)人群A2等位基因存在多樣性并有其自身特點(diǎn)，與國(guó)際報(bào)道的基因構(gòu)成存在明顯差異，A2等位基因中除ntl061C缺失外，還存在nt4670T、ntl009A〉G等點(diǎn)突變，中國(guó)漢族人群A2亞型中以A205等位基因(nt467T、ntl009G)為主。有多個(gè)課題組的研究支持中國(guó)人群ABO常見血型基因的分布情況(YanL,ZhuF,FuQ,HeJ.ABO,Rh,廳S，Duffy,Kidd,Yt，Scianna,andColtonbloodgroupsystemsinindigenousChinese.Immunohematol.2005;21(1):4-10)Al等位基因(0.1890);A2等位基因(0.0045)，B等位基因(0.2340)，0-l等位基因(0.6380)，未檢出O02基因。當(dāng)前，使用國(guó)外設(shè)計(jì)的ABO常規(guī)分型試劑盒并不適合中國(guó)人群ABO基因的鑒定。有研究表明(喻瓊,吳國(guó)光，鄧志輝，等.中國(guó)漢族人群A2亞型分子遺傳背景的研究.中國(guó)輸血雜志,2004,17(2):83~86)使用以國(guó)際報(bào)道的ABO基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為基礎(chǔ)、美國(guó)G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型試劑盒，對(duì)260例中國(guó)漢族的隨機(jī)個(gè)體進(jìn)行了基因定型，但未檢出A2基因且對(duì)20例血清學(xué)檢出為"A2"亞型的樣本，使用美國(guó)G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型試劑盒，僅有5例能定為A2型，而絕大部分標(biāo)本不能正確定型，只能定為Al型。表1國(guó)外試劑盒中ABO基因分型參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>目前國(guó)內(nèi)沒有適合中國(guó)人群常見ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的試劑盒。如果在基因檢測(cè)中沒有針對(duì)中國(guó)人A2亞型基因特異性的引物，會(huì)造成不正確定型，可能會(huì)誤定為A1型。A2亞型是ABO血型中常見的變異型，隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展,人們對(duì)它的重要性認(rèn)識(shí)越來越深刻。譬如近十年來，發(fā)現(xiàn)A2亞型的器官(心臟、肝、腎臟等)供者捐給非A型(包括B型、O型)的受者顯著延長(zhǎng)存活率、加大了供體庫(kù)的數(shù)量；A2亞型的成分(血小板)血液可稱為"萬(wàn)能"成分血。準(zhǔn)確的定型具有重要的實(shí)際意義。[
發(fā)明內(nèi)容]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明構(gòu)思了一種新的用于ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的檢測(cè)試劑及定型方法，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種ABO血型基因檢測(cè)試劑，可以對(duì)中國(guó)人群常見的ABO血型抗原的血型基因進(jìn)行同步擴(kuò)增，包括2條內(nèi)對(duì)照寡核苷酸引物HGH-A鏈序列5'-tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序列5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，其特征在于，還至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-A5'陽(yáng)ggaaggatgtectegaggtg-3.5，-tgaggatgtggatgttgaat-3，(2)Mix-A1025，-acgtggctttectgatgctg-3，5，-gcggggcaccgcggcca-3，(3)Mix-B5，-ctgteagtgctggacgtgg-3，5，-tecacgcacaccaggtaatc-3，(4)Mix-05，-ggaaggatgtectectggta-3，5，-cttgatggcaaacacagttaac-3又一種ABO血型基因檢測(cè)試劑，可以對(duì)中國(guó)人群常見的ABO血型特異性A2亞型抗原的血型基因進(jìn)行同步擴(kuò)增，包括2條內(nèi)對(duì)照寡核苷酸引物-HGH-A鏈序列5，-tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序列5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，其特征在于，還至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-15'陽(yáng)acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3，(2)Mix-25，-caggecaacggcategag-3，5，-ctggcagecgetcacggt-3'(3)Mix-35，-caggecaacggcategag-3"5，-agecgcteaegggttcca-3，(4)Mix-45'隱caggecaacggcategag-3，5，國(guó)agccgcteaegggttccc-3，(5)Mix-55，-gggggteggtgcaagaga-35;，-cgcagtgaacctcagcttc-35(6)Mix-6:，隱cagctgteagtgctggagg-3，國(guó)agaaatcgccctcgtgetta-3，(7)Mix-7'陽(yáng)cagctgteagtgctggagg-3，，-ggctgcttccgtagaaget-3，(8)Mix-8，-caggecaacggcategag-3，，國(guó)gcagtgaacetcagettccc-3(9)Mix-9，國(guó)acgtggctttectgaagetg-3，，-gcggagcagcgcggccg-3，一種ABO血型基因檢測(cè)方法，其特征在于包括2條內(nèi)對(duì)照寡核苷酸引物:HGH-A鏈序列5'陽(yáng)tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序歹U:5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，以及至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-A5，-ggaaggatgtectegaggtg-3，5，-tgaggatgtggatgttgaat-3，(2)Mix-A1025'墨acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3，(3)Mix-B5，-ctgteagtgctggacgtgg-3'5'-tecacgcacaccaggtaatc-3'(4)Mix-05，-ggaaggatgtectectggta-3，5'-cttgatggcaaacacagttaac-3其反應(yīng)體系中還包括0.2mMDNTP2-20%1.5mMMgC124-25%進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。又一種ABO血型基因檢測(cè)方法，其特征在于包括2條內(nèi)對(duì)照寡核苷酸引物HGH國(guó)A鏈序列5'陽(yáng)tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B鏈序歹!j:5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，以及至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix隱l5，-acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3'(2)Mix-25，-caggeeaacggcategag隱3，5，-ctggcagecgetcacggt陽(yáng)3，(3)Mix-35，-caggecaacggcategag-3，5，-agecgcteaegggttcca-3，(4)Mix-45，-caggecaacggcategag-3，5，-agecgcteaegggttccc-3，(5)Mix-55，-gggggteggtgcaagaga-3，5，-cgcagtgaacctcagcttc-3，(6)Mix-65,-cagctgteagtgctggagg-3，5，-agaaatcgccctcgtgetta隱3，(7)Mix-75，-cagctgteagtgctggagg-3，5'-ggctgcttccgtagaaget-3'(8)Mix-85'-caggccaacggcatcgag-3，5'-gcagtgaacetcagettccc隱3'(9)Mix-95'-acgtggctttcctgaagctg-3'5，-gcggagcagcgcggccg-3，其反應(yīng)體系中還包括0.2rnMDNTP2-20%1.5mMMgC124-25%進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。通過采用本發(fā)明的技術(shù)方案，基于中國(guó)人群ABO血型基因和A2亞型遺傳學(xué)基礎(chǔ)，根據(jù)A2亞型的突變位點(diǎn)特異性，設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測(cè)試劑盒，通過設(shè)計(jì)ABO血型基因各自的特異性引物、摸索最佳退火溫度及調(diào)節(jié)Mg2+離子和引物濃度等條件，可以對(duì)中國(guó)人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進(jìn)行同步擴(kuò)增。基于這些引物的本發(fā)明的試劑盒及分型方法，可以對(duì)中國(guó)人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進(jìn)行同步擴(kuò)增。具有先進(jìn)性，特異性和高準(zhǔn)確性，而且該法簡(jiǎn)便、直觀，適合中國(guó)漢族人ABO血型基因的鑒定以及用于人類ABO血型的研究。[]圖1為本發(fā)明檢測(cè)A102/B101、B101/001、A102/001、001/0014種基因型的電泳圖；圖2為本發(fā)明檢測(cè)A102、A201、A205基因型電泳結(jié)果圖。[具體實(shí)施方式]本發(fā)明基于中國(guó)人群ABO血型基因和A2亞型遺傳學(xué)基礎(chǔ)，根據(jù)己有的研究成果及所有已報(bào)道的A2亞型的突變位點(diǎn)特異性，發(fā)明人設(shè)計(jì)了聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測(cè)試劑盒，通過設(shè)計(jì)ABO血型基因各自的特異性引物、摸索最佳退火溫度及調(diào)節(jié)Mg2+離子和引物濃度等條件，可以對(duì)中國(guó)人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進(jìn)行同步擴(kuò)增。ABO特異性血型基因與X7W—致序列的DNA序列緊密相關(guān)，僅有幾個(gè)堿基替換或單個(gè)堿基缺失。^7M等位基因與等位基因相比只是在467位的單個(gè)堿基替換(C/T，Pro/Leu)，兩者翻譯的糖基轉(zhuǎn)移酶活力沒有顯著性差異。577基因僅在297、526、657、703、796、803、930和1096位堿基8個(gè)位置與爿"基因有改變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈上有4個(gè)氨基酸替代C526G(Arg/Gly),G703A(Gly/Ser)，C796A(Leu/Met)，G803C(Gly/Ala)。W基因與J7W的差異是第261位核苷酸G缺失，引起了閱讀框移動(dòng)，在351至354位置產(chǎn)生終止密碼。」207基因與J70/相比是在467位的單個(gè)堿基替換(C/T)和1059位1061位有一個(gè)C缺失，導(dǎo)致閱讀框增加了64個(gè)核苷酸，A2型糖基轉(zhuǎn)移酶在C端增加了21個(gè)氨基酸。是在的基礎(chǔ)上多了個(gè)1054OT,^20是在基礎(chǔ)上多了個(gè)1054OG突變，」204是B基因與O02的雜合，在基礎(chǔ)上多了297A>G、526C>G、657C>T、730G>A、771C>T、829G>]，占中國(guó)漢族人群大多數(shù)的A205基因與A101相比有467位的單個(gè)堿基替換和1009位的錯(cuò)義突變(A>G)?；谏鲜鯝BO常見血型和A2亞型遺傳學(xué)基礎(chǔ)，發(fā)明人發(fā)明了PCR-SSP(Sequence-specificprimerPCR)檢測(cè)試劑盒，可檢測(cè)出ABO常見基因及所有已報(bào)道的A2等位基因，且是同步條件擴(kuò)增，同步條件電泳、一次性就可獲得受檢者ABO血型的基因型。同步分型的關(guān)鍵在于摸索一個(gè)合適的退火溫度，可通過調(diào)節(jié)Mg2+濃度和序列特異性引物等來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例一對(duì)于ABO系統(tǒng)常見基因與A2亞型基因檢測(cè)與鑒定發(fā)明的DNA序列共設(shè)計(jì)特異性引物共13對(duì)，委托上海生工公司合成(見表l，2)，每個(gè)ABO血型基因檢測(cè)試劑，含4條引物，其中2條為序列特異性引物亞型基因與常見基因，另2條為內(nèi)對(duì)照引物，內(nèi)對(duì)照引物為人類生長(zhǎng)激素(HGH)基因特異性引物，HGH-A鏈序列5，-tgccttcccaaccatteccctta-3，,HGH-B鏈序列5，-ccactcacggatttctgttgtgtttc-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度434bp。本試劑盒可檢測(cè)中國(guó)人群最為常見的AlOl、A102、BlOl、0014種等位基因與A201、A202、A203、A204、A205、A2066個(gè)所有的A2等位基因。表l常見ABO基因特異性引物序列及所檢測(cè)的等位基因l物名稱檢測(cè)的等位基因引物序列5'-3'受檢核苷酸位置產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)Mix—AMix一A102Mix一BMix-0雄/,扁《j風(fēng)掘么齒6譜《，？柳7,柳《A似5飾/歸/,婦《腳7,您似gg33gg3tgtcctcgaggtgtgaggatgtggatgttgaatacgtggctttcctgatgctggcggggcaccgcggccactgteagtgctggacgtggtccacgcacaccaggtaatcggaaggstgtcctcctggcttgatggcaaacacagttaacnt261G及nt297Ant396G,nt467T，nt526G及nt613Gnt261G缺失及nt351G75107125131表2A2亞型基因特異性引物序列引物名稱引物序列5'-3，引物所處位置受檢核苷酸位置產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)Mix-l3CgtggctttcctgatgctgE7nt377-nt396nt467T107gcggggcaccgcggccaE7nt467-nt483Mix-2C3ggccaacggcategagE7nt874-nt891nt腿Gdel203CtggcagccgetC3CggtE7ntl059-nt翻Mix-3caggccaacggcateE7nt874-nt891ntl054T1983gCcgcteaegggttCC3E7ntl054-ntl071Mix-4caggccaacggcategagE7nt874-nt891ntl054G198cgcteaegggttcccE7ntl054-ntl071Mix-5gggggteggtgc卿agaE7nt812-nt829nt829A218<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注E7表示ABO基因的第7外顯子，nt表示核苷酸序列位置，從ABO基因cDNA的第1個(gè)核苷酸數(shù)起。ABO系統(tǒng)常見基因與A2亞型基因同步PCR擴(kuò)增操作方法如下:(1)采用25-50yL反應(yīng)體系，包括IOXPCR緩沖液2.5-5.0^10.2mMdNTP2-5^11.5mMMgCl23-6^1l.OnMABO序列特異性引物0.2mM內(nèi)對(duì)照引物0,3UDNATaq酶0.1,1100ngDNA3-10|al加水至25-50pl采用Enpendorf基因擴(kuò)增儀(德國(guó))，多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件:95°C5min預(yù)變性95°C0.5min變性，60-65°C50S退火72°C1.5min鏈延伸，共反應(yīng)30個(gè)循環(huán)72°C5min延伸降溫至4。C，結(jié)束整個(gè)反應(yīng)IOXPCR緩沖液配制100mmol/LTris-HCl(PH9.0)500mmol/LKC11%TritonX1000.1%明膠15mraol/LMgCl210%DMS02%Tween20取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于含0.5Ug/mL溴乙淀2%瓊脂糖凝膠中電泳25min后，置紫外檢測(cè)儀上觀察特異性條帶，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1為本發(fā)明檢測(cè)A102/B101、B101細(xì)、A102/001、001/0014種基因型的電泳圖;圖2為本發(fā)明檢測(cè)A102、A201、A205基因型電泳結(jié)果圖。和傳統(tǒng)的鑒別技術(shù)相比，本發(fā)明實(shí)施例中用于中國(guó)人群常見ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的引物及試劑盒及定型方法，可以正確定出所有常見的中國(guó)人群的ABO血型基因和包括A205等位基因在內(nèi)的所有A2亞型血型基因。并且此技術(shù)能夠使ABO系統(tǒng)等位基因在同一條件下進(jìn)行同步擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物在同一凝膠中進(jìn)行同步電泳；ABO基因分型方法適合中國(guó)人ABO基因常規(guī)鑒定與研究。此試劑盒可解決ABO疑難血型鑒定問題，保障了臨床血液的安全輸注。權(quán)利要求1、一種ABO血型基因檢測(cè)試劑，包括2條內(nèi)對(duì)照寡核苷酸引物HGH-A鏈序列5’-tgccttcccaaccattcccctta-3’，HGH-B鏈序列5’-ccactcacggatttctgttgtgtttc-3’，其特征在于，還至少包括下述任意一組2條基因特異性寡核苷酸引物(1)Mix-A5’-ggaaggatgtcctcgaggtg-3’5’-tgaggatgtggatgttgaat-3’(2)Mix-A1025’-acgtggctttcctgatgctg-3’5’-gcggggcaccgcggcca-3’(3)Mix-B5’-ctgtcagtgctggacgtgg-3’5’-tccacgcacaccaggtaatc-3’(4)Mix-O5’-ggaaggatgtcctcctggta-3’5’-cttgatggcaaacacagttaac-3。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于ABO血型抗原和特異性A2抗原同步基因分型的檢測(cè)試劑及定型方法，含4條引物，其中2條為序列特異性引物，另2條為內(nèi)對(duì)照引物，可以對(duì)中國(guó)人群常見的ABO血型抗原及特異性A2亞型抗原的血型基因進(jìn)行同步擴(kuò)增。檢測(cè)中國(guó)人群最為常見的A101、A102、B101、O014種等位基因與A201、A202、A203、A204、A205、A2066個(gè)所有的A2等位基因。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，本發(fā)明是一種快速、簡(jiǎn)單、實(shí)用、特異和敏感的檢測(cè)方法。適合中國(guó)漢族人ABO血型基因的鑒定以及用于人類ABO血型的研究。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101403007SQ20081021716公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月3日優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日發(fā)明者瓊喻,鄧志輝申請(qǐng)人:深圳市血液中心