專利名稱：一種玻璃化冷凍承載器及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種保存生物物質(zhì)的冷凍承載器及其使用方法，具體涉及一種保存生物物質(zhì)的玻璃化冷凍承載器及其^f吏用方法。
背景技術(shù)：
目前，用于保存生物物質(zhì)的玻璃化冷凍承載器有多種，如Cryoloop，Cryoleaf, Cryotip, electron microscopic grid等，其應(yīng)用效果相似,{旦是都有一個(gè)共同的缺點(diǎn)，就是不能隔離液氮。將細(xì)胞裝入承載器后，細(xì)胞直接與液氮接觸，容易造成液氮污染以及液氮與樣品之間的交叉污染。目前，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)玻璃化承載器作了很多嘗試，如用拉長(zhǎng)的脈管或玻璃毛細(xì)管用作細(xì)胞或胚胎的承載器，雖然取得了一定的成功，但還是不能完全解決冷凍速率以及液氮污染等問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上技術(shù)缺陷，本發(fā)明涉及一種新的保存生物物質(zhì)的玻璃化冷凍承載器，所述玻璃化冷凍承載器包括內(nèi)微管3、內(nèi)帽1、內(nèi)環(huán)4、薄膜2、外管7、外管孔6和外帽5;其中，所述內(nèi)微管3其上端開口與內(nèi)帽1相連并穿過內(nèi)帽1使其開口與外界相通且由外帽5封閉，內(nèi)微管3下端開口與內(nèi)環(huán)4相連。
本發(fā)明玻璃化冷凍承載器，所述薄膜2密閉內(nèi)環(huán)4或密閉內(nèi)微管3和內(nèi)環(huán)4，或者與內(nèi)環(huán)4為統(tǒng)一整體，其中本發(fā)明優(yōu)選薄膜2密閉內(nèi)微管3和內(nèi)環(huán)4; 薄膜2與內(nèi)帽1可以相連也可以不相連。
其中，所述薄膜2為透明、高韌性、高熱傳導(dǎo)性的薄膜，具體如聚乙烯、聚丙烯薄膜，聚氟乙烯薄膜。本發(fā)明玻璃化冷凍承載器中，所
4述內(nèi)微管3的內(nèi)徑為140_450|im,內(nèi)微管3的長(zhǎng)度為2cm-4cm。
本發(fā)明玻璃化冷凍承載器中，所述內(nèi)環(huán)4的形狀為密閉型的圓形、密閉型的橢圓形、密閉型的水滴形或者半開口弓形。密閉型內(nèi)環(huán)即內(nèi)環(huán)正好與內(nèi)管形成統(tǒng)一的整體，沒有斷口；半開口弓形即其中一端與內(nèi)管相連，另外一端與內(nèi)管不相連，利用弓形材料的韌性使薄膜撐開。
本發(fā)明玻璃化冷凍承載器中，所述內(nèi)帽1的直徑大于外管7的內(nèi)徑且小于外管7的外徑。
本發(fā)明玻璃化冷凍承載器中，所述外管7上端開有外管孔6，用以滲入液氮。
本發(fā)明玻璃化冷凍承載器中，所述內(nèi)微管3、內(nèi)帽1、外管7及外帽5由透明、耐超低溫或具有高熱傳導(dǎo)性的材料制成，如聚氟管、聚碳酸酯管。
內(nèi)環(huán)4由金屬絲制成，例如銅絲、鋼絲或者鉑金絲等；本發(fā)明內(nèi)環(huán)4也可以由其它的具有 一定強(qiáng)度的絲狀材料諸如塑料絲或者尼龍絲等制成。
本發(fā)明還提供一種玻璃化冷凍承載器的使用方法，所述方法包括如下步驟
1 )用拉細(xì)的巴斯德滴管或毛細(xì)管將生物物質(zhì)8連帶少量冷凍液通過內(nèi)微管3放置于內(nèi)環(huán)4內(nèi)，然后用蓋上內(nèi)帽l;
2)將帶有生物物質(zhì)的內(nèi)微管3、內(nèi)環(huán)4、內(nèi)帽1浸入液氮容器中的液氮中，其中內(nèi)帽1的上端部分不完全浸入液氮，之后將外管7也浸入該液氮中，在該液氮中將帶有生物物質(zhì)的內(nèi)微管3、內(nèi)環(huán)4、內(nèi)帽l裝入外管7中，蓋上外帽5，并于液氮中保存。
本發(fā)明中，所述生物物質(zhì)為各種類型的細(xì)胞或者胚胎，或者直徑大小為100-300(xm的組織塊。
本發(fā)明方法中，由于液體和薄膜之間的表面張力使得生物物質(zhì)被緊夾于兩層薄膜之間，并使得生物物質(zhì)周圍所含的液體量達(dá)到最少。
本發(fā)明玻璃化冷凍承載器避免了生物物質(zhì)與液氮直接接觸，減少了液氮污染，且操作迅速、安全和便捷；另外，采用本發(fā)明方法保存生物物質(zhì)，由于液體與膜之間的表面張力，使得玻璃化冷凍時(shí)生物物質(zhì)周圍含有最少量的冷凍液，無需精確控制置于環(huán)上液體的量，提高了冷凍效果。


圖1為玻璃化冷凍承載器的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為玻璃化冷凍承載器的局部示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn) 一 步的說明，但本發(fā)明并不僅受其限制
如圖1和圖2所示的一種玻璃化冷凍承載器，圖2為玻璃化冷凍承載器的局部結(jié)構(gòu)示意圖。該承載器包括內(nèi)微管3、內(nèi)帽1、內(nèi)環(huán)4、薄膜2、外管7及外帽5。其中，內(nèi)微管3上端開口與內(nèi)帽1相連并穿過內(nèi)帽1使其開口與外界相通且由外帽5封閉，內(nèi)微管3下端開口與內(nèi)環(huán)4相連，環(huán)內(nèi)中央為生物物質(zhì)8;薄膜2封閉內(nèi)微管3和內(nèi)環(huán)4，外管7中充滿液氮9,并在外管7的上部開有外管孔6。
實(shí)施例1:將人卵母細(xì)胞置于玻璃化承載器中的冷凍
(1) 將2 - 3枚人卵母細(xì)胞在成分為改良人輸卵管液(mHTF ) +20%血清替代物(sss) +7.5%乙二醇(EG) +7.5%二曱基亞砜(DMSO )的液體中處理4-5分鐘后，轉(zhuǎn)移至最終冷凍液(mHTF+20%sss+15 % EG +15%DMSO+0.5M蔗糖(Sucrose)中；
(2) 將卵母細(xì)胞連帶少量的冷凍液一起吸入外徑180士20jxm、內(nèi)徑160±20|im的巴斯德滴管內(nèi)；
(3) 將拉細(xì)的巴斯德滴管頭部沿著內(nèi)徑為220pm內(nèi)微管3插入密閉內(nèi)環(huán)4內(nèi)，并將卵母細(xì)胞及少量的冷凍液置于環(huán)內(nèi)聚乙烯薄膜2上;
6(4)將帶有卵母細(xì)胞的內(nèi)環(huán)4、內(nèi)微管3及內(nèi)帽1部分浸入液氮 容器中的液氮中，其中內(nèi)帽1的上端部分不完全浸入液氮，之后將外管7 也浸入該液氮中，在該液氮中將帶有生物物質(zhì)的內(nèi)^f斂管3、內(nèi)環(huán)4、 內(nèi)帽1裝入外管7中，蓋上外帽5，液氮中進(jìn)行保存。
實(shí)施例2:人8-細(xì)胞胚胎半開口弓形內(nèi)環(huán)內(nèi)玻璃化冷凍 (1)將2-3枚人8-細(xì)胞胚胎在成分為mHTF+20%sss+7.5%EG + 7.5%PROH (1,2丙二醇)的液體中處理4-5分鐘后，轉(zhuǎn)移至最終 冷凍液(mHTF+20%sss+15Q/。EG + 15%PROH+0.5M Sucrose)中；
(2 )將胚胎連帶少量的冷凍液 一 起吸入外徑180±20|im 、 內(nèi)徑160土20(im的巴斯德滴管內(nèi)；
(3) 將拉細(xì)的巴斯德滴管頭部沿著內(nèi)徑為220pm的內(nèi)微管3插入 半開口弓形內(nèi)環(huán)4內(nèi)，并將胚胎及少量的冷凍液置于環(huán)內(nèi)聚丙烯薄膜2 上；
(4) 將帶有胚胎的內(nèi)環(huán)4、內(nèi)微管3及內(nèi)帽1部分浸入液氮容器中的 液氮中，之后將外管7也浸入該液氮中，在該液氮中將帶有生物物質(zhì)的 內(nèi)孩i管3、內(nèi)環(huán)4、內(nèi)帽1裝入外管7中，蓋上外帽5，液氮中進(jìn)行保存。
權(quán)利要求
1.一種玻璃化冷凍承載器，其特征在于，所述承載器包括內(nèi)微管(3)、內(nèi)帽(1)、內(nèi)環(huán)(4)、薄膜(2)、外管(7)、外管孔(6)和外帽(5)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的承載器，其特征在于，所述內(nèi)微管(3)上端開口與內(nèi)帽(i )相連并穿過內(nèi)帽(1 )使其開口與外界相通且由外帽(5)封閉，內(nèi)微管(3)下端開口與內(nèi)環(huán)(4)相連。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的承載器，其特征在于，所述薄膜(2)密閉內(nèi)環(huán)(4)、或密閉內(nèi)微管(3)和內(nèi)環(huán)(4),或者與內(nèi)環(huán)(4)為統(tǒng)一整體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的承載器，其特征在于，所述內(nèi)微管(3)的長(zhǎng)度為2 - 4cm;內(nèi)微管(3 )的內(nèi)徑為140 - 450(im。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的承載器，其特征在于，所述內(nèi)環(huán)(4)的形狀為密閉型的圓形、密閉型的橢圓形、密閉型的水滴形或者半開口弓形。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的承載器，其特征在于，所述內(nèi)帽(1)的直徑大于外管(7)的內(nèi)徑且小于外管(7)的外徑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的承載器，其特征在于，所述外管(7)上端開有外管孔(6)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的承載器，其特征在于，所述薄膜(2)為具有透明、高韌性、高熱傳導(dǎo)性的薄膜。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的承載器，其特征在于，所述內(nèi)微管(3)、內(nèi)帽(1)、外管(7)及外帽(5)由透明、耐超低溫或具有高熱傳導(dǎo)性的材料制成；內(nèi)環(huán)(4)由金屬絲、塑料絲或者尼龍絲制成。
10. 權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述玻璃化冷凍承載器的使用方法，其特征在于，包括如下步驟1) 用拉細(xì)的巴斯德滴管或毛細(xì)管將生物物質(zhì)連帶少量冷凍液通過內(nèi)微管(3)放置于內(nèi)環(huán)(4)內(nèi)，然后用蓋上內(nèi)帽Q);2) 將帶有生物物質(zhì)的內(nèi)微管(3)、內(nèi)環(huán)(4)、內(nèi)帽(1)浸入液氮，之后將外管(7)浸入液氮中，在液氮中將帶有生物物質(zhì)的內(nèi)微管(3)、內(nèi)環(huán)(4)、內(nèi)帽(1)裝入外管(7)中，蓋上外帽(5),并于液氮中保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種保存生物物質(zhì)的玻璃化冷凍承載器及其使用方法，所述玻璃化冷凍承載器包括內(nèi)微管(3)、內(nèi)帽(1)、內(nèi)環(huán)(4)、薄膜(2)、外管(7)、外管孔(6)和外帽(5)，其中，所述內(nèi)微管(3)上端開口與內(nèi)帽(1)相連并穿過內(nèi)帽(1)使其開口與外界相通且由外帽(5)封閉，內(nèi)微管(3)下端開口與內(nèi)環(huán)(4)相連。本發(fā)明承載器避免了生物物質(zhì)與液氮的直接接觸，減少液氮污染；且操作迅速、安全和便捷。
文檔編號(hào)C12M1/24GK101671627SQ20081021568
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者吳克良, 媛 李, 陳子江 申請(qǐng)人:陳子江