專利名稱：對(duì)植物病害具有防除能力的微生物和使用該微生物的植物病害防除劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)植物病害具有防除能力的微生物、含有該微生物的菌體的植物病害防除劑、以及使用該微生物的植物病害防除方法。

背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求基于2006年11月8日申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)第2006-302263號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
一直以來，對(duì)于各種農(nóng)園藝作物的細(xì)菌性病害，使用無機(jī)和有機(jī)銅劑、春雷霉素、鏈霉素、土霉素等抗生素。此外，作為合成抗細(xì)菌劑在1989年注冊(cè)了噁喹酸，對(duì)作物增產(chǎn)帶來很大幫助。然而，無機(jī)和有機(jī)銅劑容易對(duì)農(nóng)園藝作物產(chǎn)生藥害，在使用時(shí)期、使用作物方面有限制。此外，持續(xù)使用抗生素時(shí)，具有病原菌對(duì)該抗生素產(chǎn)生耐藥性等問題。對(duì)于噁喹酸，近年也發(fā)現(xiàn)耐藥性菌，從而設(shè)有使用限制。
因此，為了克服藥害、耐藥性菌的問題，作為代替以往的合成殺菌劑、或者進(jìn)行合用的方法，對(duì)生物農(nóng)藥的關(guān)心提高。生物農(nóng)藥與以往的合成殺菌劑相比，具有環(huán)境污染極少、與生態(tài)體系和諧而且防除效果也優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)。作為用于防除農(nóng)園藝作物的細(xì)菌性病害的微生物農(nóng)藥，已知例如特別用于葉菜類、根菜類的軟腐病防除的非病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、特別用于作為稻種子傳染性的細(xì)菌性病害的細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病防除的假單胞菌(Pseudomonassp.)CAB-02、深綠木霉(Trichoderma atroviride)等，含有該微生物的農(nóng)園藝用殺菌劑組合物已經(jīng)開發(fā)上市。此外，在專利文獻(xiàn)1中記載了對(duì)于作為萵苣的腐敗病菌的菊苣假單胞桿菌(Pseudomonas cichorii)具有防除效果的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)G7090株。
然而，一般地說，微生物農(nóng)藥的對(duì)象植物病害有限，大多無法期待對(duì)其他植物病害也具有效果。例如，非病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌的對(duì)象病害限于葉菜或根菜類的軟腐病，假單胞菌CAB-02或深綠木霉的對(duì)象病害限于稻病害，熒光假單胞菌的對(duì)象病害限于萵苣的腐敗病，對(duì)其他細(xì)菌性病害幾乎無法期待效果。此外，非病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌是通過非病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌產(chǎn)生的稱為細(xì)菌素的抗菌性蛋白質(zhì)來防除病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌的，因此擔(dān)心會(huì)出現(xiàn)對(duì)該抗菌性蛋白質(zhì)的抵抗性(例如非專利文獻(xiàn)1)。
專利文獻(xiàn)1特開2001-247423號(hào)公報(bào) 非專利文獻(xiàn)1拮抗微生物所致的作物病害的生物防除III-5非病原Erwinia carotovora所致的蔬菜軟腐病的防除、Kumiai Chemical Industry公司、65-762003

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于所述情況而完成的，本發(fā)明的課題在于提供對(duì)環(huán)境負(fù)荷少、抵抗性病原菌產(chǎn)生的可能性極低、并且對(duì)多種植物病害(特別是葉菜或根菜類的軟腐病、腐敗病、柑橘的潰瘍病、桃的細(xì)菌性穿孔病等)具有優(yōu)異防除能力的微生物，含有該微生物菌體的植物病害防除劑，將該植物病害防除劑施用于植物和/或該植物的栽培土壤的植物病害防除方法。
本發(fā)明人等為了解決上述課題，著眼于在萵苣中常有的微生物，進(jìn)行了對(duì)植物病害具有防除能力的微生物的檢索。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了對(duì)萵苣軟腐病具有高防除效果的微生物。研究該微生物的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)和16SrDNA基因的堿基序列，推定是羅氏假單胞菌(Pseudomonasrhodesiae)的新株。本發(fā)明是基于上述見解而完成的。
即，本發(fā)明涉及(1)對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌(Pseudomonas rhodesiae)；(2)對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌FERM BP-10912；(3)為羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株、并且對(duì)植物病害具有防除能力的變異株；(4)如(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的羅氏假單胞菌、羅氏假單胞菌FERM BP-10912、或羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株，其中，植物病害是選自潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病和黑腐病中的1種或2種以上的植物病害；(5)如(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的羅氏假單胞菌、羅氏假單胞菌BP-10912或羅氏假單胞菌BP-10912的變異株，其中，植物病害是由于如下病原菌所致的植物病害，即選自黃單胞菌(Xanthomonas)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、勞爾氏菌(Ralstonia)屬和伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)屬中的1種或2種以上的病原菌。
此外，本發(fā)明涉及(6)含有對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌的菌體的植物病害防除劑；(7)如上述(6)所述的植物病害防除劑，其中，羅氏假單胞菌的菌體是選自上述(2)所述的羅氏假單胞菌FERM BP-10912的菌體、和上述(3)所述的羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株的菌體的1種或2種以上的菌體；(8)如上述(6)所述的植物病害防除劑，其中，植物病害是選自潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病和黑腐病中的1種或2種以上的植物病害。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及(9)植物病害的防除方法，其特征在于，將上述(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的羅氏假單胞菌、羅氏假單胞菌FERM BP-10912或羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株施用于植物和/或該植物的栽培土壤。
本發(fā)明的植物病害的防除劑和防除方法對(duì)環(huán)境負(fù)荷少、抵抗性病原菌產(chǎn)生的可能性極低、并且對(duì)多種植物病害具有更長(zhǎng)期的優(yōu)異防除能力。此外，在植物病害中，特別是對(duì)葉菜或根菜類的軟腐病、腐敗病、黑腐病、柑橘的潰瘍病、桃的細(xì)菌性穿孔病等發(fā)揮優(yōu)異效果，在這一點(diǎn)上與以往的微生物農(nóng)藥相比尤為顯著有利。



圖1是表示基于16SrDNA基因的核苷酸序列制作的、本發(fā)明的羅氏假單胞菌050572I9株(羅氏假單胞菌FERM BP-10912株)的系統(tǒng)樹的圖。

具體實(shí)施例方式 <1>本發(fā)明的微生物 本發(fā)明的微生物只要是對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌(Pseudomonas rhodesiae)就沒有特別限制。在此，所謂“對(duì)植物病害具有防除能力”，是指對(duì)任意植物病害的病原菌具有拮抗作用。本發(fā)明的微生物通過對(duì)植物病害的病原菌發(fā)揮拮抗作用，預(yù)防或治愈由該病原菌引起的植物病害，尤其對(duì)預(yù)防植物病害的效果優(yōu)異。
在此所說的“預(yù)防植物病害”，是指除了將本發(fā)明的微生物施用于沒有被植物病害病原菌感染或病癥沒有出現(xiàn)的植物或者其栽培土壤這一點(diǎn)不同以外、其他都是在同樣適合的條件下進(jìn)行栽培的情況下，施用了本發(fā)明微生物的植物的病害程度比未施用本發(fā)明微生物的植物低。此外，上述的“治愈植物病害”，是指除了將本發(fā)明的微生物施用于被植物病害病原菌感染而出現(xiàn)病癥的植物這一點(diǎn)不同以外、其他都是在同樣適合的條件下進(jìn)行栽培的情況下，施用了本發(fā)明微生物的植物的病害程度比未施用本發(fā)明微生物的植物低。
所謂“病害程度低”，是指例如發(fā)病度(或率)低、防除價(jià)(preventivevalue)大于0。防除價(jià)優(yōu)選更大的值，若在30以上則是優(yōu)異的，若在50以上則更優(yōu)異，若60或70以上則特別優(yōu)異。
作為本發(fā)明的微生物，可優(yōu)選列舉羅氏假單胞菌050572I9株、羅氏假單胞菌JCM11940株和這些菌株的變異株，其中，從作為植物病害防除劑而具有更優(yōu)異性質(zhì)出發(fā)，可更優(yōu)選列舉羅氏假單胞菌050572I9株和該菌株的變異株。另外，羅氏假單胞菌050572I9株是由本申請(qǐng)人在2006年9月12日在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1號(hào)1中央第6)作為保藏號(hào)FERM P-21025進(jìn)行日本國(guó)內(nèi)保藏，然后在2007年9月25日作為國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-10912進(jìn)行國(guó)際保藏。此外，羅氏假單胞菌JCM11940株在獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所筑波研究所BioResource Center(日本國(guó)茨城縣筑波市高野臺(tái)3丁目1號(hào)-1)作為JCM11940進(jìn)行保藏。
本說明書中的“某菌株X的變異株”只要是具有與該菌株X同樣的菌學(xué)性質(zhì)、并且對(duì)植物病害具有防除能力的菌株即可，也包括由該菌株X誘導(dǎo)的任意變異株。變異包括利用化學(xué)變異劑、紫外線等的人工變異、以及自然變異。作為某菌株X的變異株，可優(yōu)選列舉關(guān)于后述表1中記載的菌學(xué)性質(zhì)具有與菌株X相同的菌學(xué)性質(zhì)、并且對(duì)植物病害具有防除能力的變異株。
在本發(fā)明的微生物中，作為優(yōu)選微生物的羅氏假單胞菌050572I9株(FERM BP-10912株)的菌學(xué)性質(zhì)如下。
為革蘭氏陰性桿菌，不形成芽孢，細(xì)胞全長(zhǎng)為2.0～2.5μm、全寬為0.7～0.8μm，看到運(yùn)動(dòng)性。在肉汁瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)平滑圓形的菌落，在King’s B培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光性色素。在41℃沒有看到生長(zhǎng)，過氧化氫酶活性為陽(yáng)性，OF培養(yǎng)基試驗(yàn)氧化，硝酸鹽的還原為陰性，吲哚產(chǎn)生為陰性，尿素酶活性為陰性，明膠的分解為陽(yáng)性，β-半乳糖苷酶活性為陰性，β-葡萄糖苷酶活性為陰性。此外，在LOPAT試驗(yàn)中，果聚糖產(chǎn)生為陽(yáng)性，土豆塊莖腐敗為陰性，煙草過敏性反應(yīng)為陰性，氧化酶活性為陽(yáng)性，精氨酸的分解為陽(yáng)性。淀粉同化性為陰性，關(guān)于糖、有機(jī)酸等碳化合物的同化性，D-葡萄糖為陽(yáng)性，L-阿拉伯糖為陽(yáng)性，D-甘露糖為陽(yáng)性，D-甘露醇為陽(yáng)性，N-乙酰基-D-葡糖胺為陽(yáng)性，麥芽糖為陰性、葡糖酸鉀為陽(yáng)性，正癸酸為陽(yáng)性，己二酸為陰性，dL-蘋果酸為陽(yáng)性，檸檬酸鈉為陽(yáng)性，乙酸苯酯為陰性，蔗糖為陽(yáng)性，海藻糖為陽(yáng)性，阿東糖醇為陰性，山梨醇為陽(yáng)性，丁酸為陽(yáng)性，丙酸為陽(yáng)性，丙二醇為陽(yáng)性。各項(xiàng)目的測(cè)定方法等如后述實(shí)施例所記載。
本發(fā)明的微生物只要對(duì)至少1種植物病害具有防除能力即可，但是優(yōu)選對(duì)選自潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病、和黑腐病中的1種以上、優(yōu)選2種以上、更優(yōu)選對(duì)上述所有的植物病害都具有防除能力。此外，本發(fā)明的微生物特別優(yōu)選至少對(duì)軟腐病、腐敗病、黑腐病、潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病中的任一種以上、優(yōu)選2種以上、更優(yōu)選對(duì)所有病害都具有防除能力。
作為這些植物病害的病原菌，可以列舉屬于Xanthomonas屬、Erwinia屬、Pseudomonas屬、Ralstonia屬、Burkholderia屬等的1種或2種以上的病原菌等。更詳細(xì)地說，雖然在表1中示出，但是與本發(fā)明相關(guān)的病原菌并不限于這些病原菌等。
表1
此外，作為成為本發(fā)明微生物適用對(duì)象的植物，只要是本發(fā)明的微生物能夠發(fā)揮防除能力的植物就沒有特別限制。例如，可以列舉屬于十字花科、茄科、葫蘆科、百合科、豆科、菊科、藜科、禾本科、薔薇科、石竹科、報(bào)春花科、蕓香科、葡萄科、獼猴桃科、柿科、傘形科、旋花科、或天南星科的植物，其中可優(yōu)選列舉白菜等屬于十字花科的植物、萵苣等屬于菊科的植物、土豆等屬于茄科的植物、檸檬、臍橙等屬于蕓香科的植物、桃等屬于薔薇科的植物等。
<2>本發(fā)明的植物病害防除劑 本發(fā)明的植物病害防除劑只要含有本發(fā)明的羅氏假單胞菌的菌體就沒有特別限制。本發(fā)明的植物病害防除劑中含有的本發(fā)明的羅氏假單胞菌的菌株種類可以是1種，也可以是2種以上。
本發(fā)明的植物病害防除劑，通過其中所含的本發(fā)明的羅氏假單胞菌的菌體對(duì)植物病害的病原菌發(fā)揮拮抗作用，預(yù)防或治愈由該病原菌引起的植物病害。本發(fā)明的植物病害防除劑可以作為植物病害的預(yù)防劑或植物病害的治療劑使用，作為植物病害的預(yù)防劑的效果特別優(yōu)異。
羅氏假單胞菌主要呈現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，但本發(fā)明的羅氏假單胞菌的菌體可以是以羅氏假單胞菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為代表的、羅氏假單胞菌的活菌所示出的任意形態(tài)(例如休眠細(xì)胞)的菌體。此外，本發(fā)明的植物病害防除劑中使用的羅氏假單胞菌的菌體的形態(tài)種類可以是1種，也可以是2種以上。
本發(fā)明的植物病害防除劑中使用的羅氏假單胞菌的菌體可以通過如下方式得到，例如以羅氏假單胞菌050572I9株(FERM BP-10912株)的16SrDNA基因的序列(參照序列號(hào)1)和/或該菌株的上述菌學(xué)性質(zhì)為指標(biāo)進(jìn)行分離、將所獲得的羅氏假單胞菌等本發(fā)明的羅氏假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng)而得到。作為本發(fā)明的羅氏假單胞菌的培養(yǎng)方法，只要是羅氏假單胞菌的菌體增殖的方法，無論培養(yǎng)基的種類或培養(yǎng)條件等如何，可以是任意的方法，例如，固體培養(yǎng)時(shí)，可以列舉使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等在20～35℃下進(jìn)行靜置培養(yǎng)的方法，液體培養(yǎng)時(shí)，可以列舉使用從上述瓊脂培養(yǎng)基中除去瓊脂而得到的各種液體培養(yǎng)基等在20～35℃下振蕩并進(jìn)行攪拌培養(yǎng)的方法。
作為羅氏假單胞菌的菌體，即使是羅氏假單胞菌的菌體自身、含有該菌體的懸浮液、含有該菌體的培養(yǎng)液、或它們的濃縮物、糊狀物、干燥物、稀釋物(以下，有時(shí)稱為“羅氏假單胞菌的菌體等”)等任意形態(tài)，也都可以用于本發(fā)明的植物病害防除劑。
本發(fā)明的植物病害防除劑中所含的羅氏假單胞菌的菌體濃度，只要無損本發(fā)明的效果就沒有特別限制，例如可以優(yōu)選列舉將本發(fā)明的植物病害防除劑稀釋到1000～2000倍時(shí)，換算成菌體濃度為1×102～1×1011cfu/ml、優(yōu)選1×104～1×109cfu/ml的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的植物病害防除劑只要無損本發(fā)明的效果，除了本發(fā)明的羅氏假單胞菌的菌體等以外，還可以含有任意成分。作為任意成分，只要無損本發(fā)明的效果就沒有特別限制，可以列舉載體、表面活性劑、分散劑、輔助劑等。此外，根據(jù)需要，可以添加抗氧化劑、著色劑、潤(rùn)滑劑、紫外線吸收劑、防靜電劑、防腐劑等。
作為上述的載體，可以列舉碳酸鈣、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鈣、硫酸銨等無機(jī)鹽類；檸檬酸、蘋果酸、硬脂酸等有機(jī)酸以及它們的鹽；葡萄糖、乳糖、蔗糖等糖類；氧化鋁粉、硅膠、沸石、羥基磷灰石、磷酸鋯、磷酸鈦、氧化鈦、氧化鋅、水滑石、高嶺石、蒙脫石、滑石、粘土、硅藻土、膨潤(rùn)土、白碳、高嶺土、蛭石等固體載體。
此外，作為上述表面活性劑(可以作為分散劑使用)，只要是能夠在通常的農(nóng)園藝用制劑中使用的表面活性劑就沒有特別限定，具體地說，有以下的非離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽(yáng)離子性表面活性劑、兩性表面活性劑。
作為非離子性表面活性劑，可以列舉山梨糖醇酐脂肪酸酯(C12～18)、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯(C12～18)、蔗糖脂肪酸酯等糖酯型表面活性劑；POE脂肪酸酯(C12～18)、POE樹脂酸酯、POE脂肪酸二酯(C12～18)等脂肪酸酯型表面活性劑；POE烷基醚(C12～18)等醇型表面活性劑；POE烷基(C8～12)苯基醚、POE二烷基(C8～12)苯基醚、POE烷基(C8～12)苯基醚甲醛縮聚物等烷基苯酚型表面活性劑；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物；烷基(C12～18)聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物醚等聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物型表面活性劑；POE烷基胺(C12～18)、POE脂肪酰胺(C12～18)等烷基胺型表面活性劑；POE脂肪酸雙苯基醚等雙苯酚型表面活性劑；POA芐基苯基(或苯基苯基)醚、POA苯乙烯基苯基(或苯基苯基)醚等多芳香環(huán)型表面活性劑；POE醚和酯型硅和氟系表面活性劑等硅系、氟系表面活性劑；POE蓖麻油、POE硬化蓖麻油等植物油型表面活性劑；等。
作為陰離子性表面活性劑，可以列舉烷基硫酸鹽(C12～18、Na、NH4、烷醇胺)、POE烷基醚硫酸鹽(C12～18、Na、NH4、烷醇胺)、POE烷基苯基醚硫酸鹽(C12～18、NH4、烷醇胺)、POE芐基(或苯乙烯)苯基(或苯基苯基)醚硫酸鹽(Na、NH4、烷醇胺)、聚氧乙烯、聚氧丙烯嵌段聚合物硫酸鹽(Na、NH4、烷醇胺)等硫酸鹽型表面活性劑；烯烴(烷烴)磺酸鹽(C12～22、Na、Ca、烷醇胺)、AOS(C14～16、Na、烷醇胺)、二烷基磺基丁二酸鹽(C8～12、Na、Ca、Mg)、烷基苯磺酸鹽(C12、Na、Ca、Mg、NH4、烷基胺、烷醇、胺、環(huán)己烷基胺)、單或二烷基(C3～6)萘磺酸鹽(Na、NH4、烷醇胺、Ca、Mg)、萘磺酸鹽-甲醛縮聚物(Na、NH4)、烷基(C8～12)二苯基醚二磺酸鹽(Na、NH4)、木質(zhì)素磺酸鹽(Na、Ca)、POE烷基(C8～12)苯基醚磺酸鹽(Na)、POE烷基(C12～18)醚磺基琥珀酸半酯(Na)等磺酸鹽型表面活性劑；羧酸型脂肪酸鹽(C12～18、Na、K、NH4、烷醇胺)、N-甲基-脂肪酸肌氨酸鹽(C12～18、Na)、樹脂酸鹽(Na、K)等POE烷基(C12～18)醚磷酸酯(Na、烷醇胺)、POE單或二烷基(C8～12)苯基醚磷酸酯(Na、烷醇胺)、POE芐基(或苯乙烯)化苯基(或苯基苯基)醚磷酸酯(Na、烷醇胺)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物(Na、烷醇胺)、磷脂酰膽堿-磷脂酰乙醇亞胺(卵磷脂)、烷基(C8～12)磷酸酯等磷酸酯型表面活性劑；等。
作為陽(yáng)離子性表面活性劑，可以列舉烷基三甲基氯化銨(C12～18)、甲基-聚氧乙烯-烷基氯化銨(C12～18)、烷基-N-甲基吡啶鎓溴化物(C12～18)、單或二烷基(C12～18)甲基化氯化銨、烷基(C12～18)五甲基丙二胺二氯化物等銨型表面活性劑；烷基二甲基苯扎氯銨(C12～18)、芐索氯銨(辛基苯氧乙氧基乙基二甲基芐基氯化銨)等芐烷銨型表面活性劑；等。
作為兩性表面活性劑，可以列舉二烷基(C8～12)二氨基乙基甜菜堿、烷基(C12～18)二甲基芐基甜菜堿等甜菜堿型表面活性劑；二烷基(C8～12)二氨基乙基甘氨酸、烷基(C12～18)二甲基芐基甘氨酸等甘氨酸型表面活性劑；等。
表面活性劑和/或分散劑可以單獨(dú)使用1種或?qū)?種以上混合使用。
作為上述的輔助劑，可以列舉例如羧甲基纖維素、聚乙二醇、阿拉伯膠、淀粉等。
本發(fā)明的植物病害防除劑的形態(tài)沒有特別限制，可以采用通常的農(nóng)園藝用藥能夠采用的形態(tài)，例如粉劑、可濕性粉劑、乳劑、懸浮(flowable)劑、粒劑等形態(tài)。
作為本發(fā)明的植物病害防除劑所適用的植物病害，只要是本發(fā)明的羅氏假單胞菌顯示防除能力的病原菌感染植物所引起的植物病害就沒有特別限制?？梢粤信e例如潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病和黑腐病等。
此外，作為本發(fā)明的植物病害防除劑所適用的植物病害，可以列舉選自潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病和黑腐病中的一種以上、優(yōu)選2種以上、更優(yōu)選全部的植物病害。尤其是至少軟腐病、腐敗病、黑腐病、潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病中的任何一種以上、優(yōu)選2種以上、更優(yōu)選全部的病害。
<3>本發(fā)明的植物病害的防除方法 本發(fā)明的植物病害的防除方法只要是將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于植物和/或該植物的栽培土壤的方法就沒有特別限制，與使用通常的化學(xué)農(nóng)藥的情況相同，可以根據(jù)植物病害的種類或適用植物的種類等而適當(dāng)選擇。例如，通過將本發(fā)明的植物病害防除劑直接涂布或散布于植物等，可以將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于植物，或者通過將本發(fā)明的植物病害防除劑混合、散布或灌注于栽培植物的土壤(植物的栽培土壤)等，可以將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于植物的栽培土壤。其中，將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于植物的栽培土壤時(shí)，可以將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于土壤后種植植物，此外，還可以將植物種植于土壤中后將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于該土壤。此外，也可以如特開2001-302407號(hào)公報(bào)記載的那樣，在向設(shè)施內(nèi)送風(fēng)的送風(fēng)裝置的送風(fēng)口附近設(shè)置本發(fā)明的植物病害防除劑，與從送風(fēng)口送出的空氣一起散布農(nóng)藥。
將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于植物和/或該植物的栽培土壤時(shí)，可以將本發(fā)明的植物病害防除劑用適當(dāng)量的水等稀釋后使用。作為將本發(fā)明的植物病害防除劑施用于植物和/或該植物的栽培土壤的量，可以根據(jù)植物病害的種類、適用植物的種類等的不同而不同，因此無法一概而定，但向土壤中散布處理時(shí)，換算成羅氏假單胞菌的菌體濃度，通?？梢栽O(shè)為1×102～1×1011cfu/ml、優(yōu)選1×104～1×109cfu/ml的范圍。
此外，散布次數(shù)可以根據(jù)植物病害的種類或適用植物的種類、病害程度等適當(dāng)選擇。
以下，通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于這些例示。
實(shí)施例 〔實(shí)施例1〕菌的鑒定和植物病害防除可濕性粉劑組合物的制備 1.對(duì)萵苣軟腐病具有防除能力的菌株的篩選 將田地中采取的萵苣葉在少量的滅菌水中均質(zhì)化，將得到的懸浮液涂抹于標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(酪蛋白制胨0.5％(w/v)、酵母提取物0.25％(w/v)、葡萄糖0.1％(w/v)、瓊脂1.5％(w/v)、滅菌后的pH為6.9～7.1)(日水制藥社制)上，在25℃培養(yǎng)2天，采取生長(zhǎng)的微生物菌落，進(jìn)而以成為單一菌落的方式進(jìn)行分離、獲取。對(duì)于所獲取的多個(gè)微生物菌株，進(jìn)行后述實(shí)施例中記載的萵苣軟腐病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn))，篩選對(duì)萵苣軟腐病的病原菌(胡蘿卜軟腐歐文氏菌)具有防除效果的微生物菌株。對(duì)于所篩選的菌株，進(jìn)而實(shí)施與后述的白菜軟腐病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn))同樣的萵苣軟腐病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn))，在田地試驗(yàn)中也篩選了對(duì)萵苣軟腐病具有防除效果的050572I9株。
2.16SrDNA基因的解析 對(duì)于050572I9株，為了解析16SrDNA基因的核苷酸序列，由050572I9株嘗試16SrDNA的分離。具體地說，首先，按照常法由050572I9株分離基因組DNA。將得到的基因組DNA為模板，使用在16SrDNA的分離中經(jīng)常使用的27F引物(序列號(hào)2)和1544R引物(序列號(hào)3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過使用瓊脂糖凝膠的電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的有無后，分別對(duì)含有多種聚核苷酸的該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，從而確定多種核苷酸序列?；谒玫亩喾N核苷酸序列信息進(jìn)行匯編，確定16SrDNA的全長(zhǎng)的核苷酸序列。以序列號(hào)1表示050572I9株的16SrDNA基因的核苷酸序列。
基于050572I9株的16SrDNA基因的核苷酸序列，使用BLAST進(jìn)行同源性檢索。此外，使用ClustalW解析050572I9株的16SrDNA基因的核苷酸序列，將得到的解析結(jié)果用Tree View進(jìn)行處理，由此制作與050572I9株相關(guān)的系統(tǒng)樹(圖1)。通過該系統(tǒng)樹，可知050572I9株的分類學(xué)上所處位置。其結(jié)果強(qiáng)烈提示050572I9株是羅氏假單胞菌的可能性。
3.菌學(xué)性質(zhì)的解析 由上述2.的16SrDNA基因的序列解析結(jié)果認(rèn)為，050572I9株是假單胞菌屬的微生物、其中特別是羅氏假單胞菌或熒光假單胞菌的可能性很高。為了確定050572I9株的種類，按照后述規(guī)定的方法研究050572I9株的菌學(xué)性質(zhì)。050572I9株的菌學(xué)性質(zhì)如下。為革蘭氏陰性桿菌，沒有形成芽孢，細(xì)胞全長(zhǎng)為2.0～2.5μm，全寬為0.7～0.8μm，看到了運(yùn)動(dòng)性。在肉汁瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)平滑圓形菌落，在King’s B培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光性色素。在41℃沒有看到生長(zhǎng)，過氧化氫酶活性為陽(yáng)性，OF培養(yǎng)基試驗(yàn)為氧化，硝酸鹽的還原為陰性，吲哚產(chǎn)生為陰性，尿素酶活性為陰性，明膠的分解為陽(yáng)性，β-半乳糖苷酶活性為陰性，β-葡萄糖苷酶活性為陰性。此外，在LOPAT試驗(yàn)中，果聚糖產(chǎn)生為陽(yáng)性，土豆塊莖腐敗為陰性，煙草過敏性反應(yīng)為陰性，氧化酶活性為陽(yáng)性，精氨酸的分解為陽(yáng)性。淀粉同化性為陰性，關(guān)于糖、有機(jī)酸等碳化合物的同化性，D-葡萄糖為陽(yáng)性，L-阿拉伯糖為陽(yáng)性，D-甘露糖為陽(yáng)性，D-甘露醇為陽(yáng)性，N-乙?；?D-葡糖胺為陽(yáng)性，麥芽糖為陰性，葡糖酸鉀為陽(yáng)性，正癸酸為陽(yáng)性，己二酸為陰性，dL-蘋果酸為陽(yáng)性，檸檬酸鈉為陽(yáng)性，乙酸苯酯為陰性，蔗糖為陽(yáng)性，海藻糖為陽(yáng)性，阿東糖醇為陰性，山梨醇為陽(yáng)性，丁酸為陽(yáng)性，丙酸為陽(yáng)性，丙二醇為陽(yáng)性。將其綜合在表中如下所示。
表2

上述表2的項(xiàng)目中，對(duì)于硝酸鹽的還原、吲哚產(chǎn)生、OF試驗(yàn)、精氨酸的分解、尿素酶活性、明膠的分解、β-半乳糖苷酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、D-葡萄糖的同化性、L-阿拉伯糖的同化性、D-甘露糖的同化性、D-甘露醇的同化性、N-乙酰基-D-葡糖胺的同化性、麥芽糖的同化性、葡糖酸鉀的同化性、正癸酸的同化性、己二酸的同化性、dL-蘋果酸的同化性、檸檬酸鈉的同化性、乙酸苯酯的同化性，使用API20NE(BioMerieux Japan公司制)，按照所附的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)。氧化酶活性使用Oxidase Reagent(BioMerieux Japan公司制)進(jìn)行試驗(yàn)，過氧化氫酶活性使用ID color Catalase(BioMerieux Japan公司制)進(jìn)行試驗(yàn)。此外，對(duì)于King’s B培養(yǎng)基試驗(yàn)中使用的King’s B培養(yǎng)基，使用榮研化學(xué)株式會(huì)社制的King’s B培養(yǎng)基來進(jìn)行。對(duì)于革蘭氏染色，使用Color Gram2(BioMerieux Japan公司制)來進(jìn)行。對(duì)于果聚糖產(chǎn)生試驗(yàn)，在添加5％蔗糖的普通瓊脂培養(yǎng)基的平板上畫線移植菌株，在25℃培養(yǎng)3天，將形成白色并具有粘性的大大隆起為圓屋頂狀的菌落判斷為陽(yáng)性。
對(duì)于土豆塊莖腐敗試驗(yàn)，如下進(jìn)行。
將剝皮后以7～8mm的厚度切成圓片的土豆水洗后浸于醇中立即進(jìn)行火焰消毒，然后裝入培養(yǎng)皿中，保持在過濕狀態(tài)。在切成圓片的土豆切片上涂布濃菌液，在25℃培養(yǎng)2天。將在接種菌后的切片的大部分中觀察到腐敗的評(píng)價(jià)為陽(yáng)性，將接種地方稍微腐敗程度的評(píng)價(jià)為陰性。這次，作為土豆使用“とかちこがね”。
對(duì)于煙草過敏性反應(yīng)試驗(yàn)如下進(jìn)行。
用注射器向煙草(White Burley或Bright Yellow)的葉肉內(nèi)注入菌液。菌液使用菌濃度為1×108cells/ml的和菌濃度為1×109cells/ml的兩種。將注入有各種菌液的煙草栽培5天，將菌液的浸潤(rùn)部發(fā)生脫水癥狀、呈現(xiàn)褐色或暗綠色的判定為陽(yáng)性。將即使注入任何菌液，也不發(fā)生變化或黃化的程度的判斷為陰性。
淀粉的同化性試驗(yàn)如下進(jìn)行。首先，在普通瓊脂培養(yǎng)基(在水1L中含有瓊脂35g和可溶性淀粉10g)上畫線移植菌株，在30℃培養(yǎng)2～3天。培養(yǎng)后，將Lugol的碘溶液(在水30ml中含有碘0.1g和碘化鉀0.2g)注到上述的瓊脂培養(yǎng)基上，將在菌的菌落周圍看到透明部分的情況判定為陽(yáng)性。
糖或有機(jī)酸等碳化合物的同化性是在后述組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基5ml中添加碳化合物(D-葡萄糖、蔗糖、海藻糖、阿東糖醇、山梨醇、丁酸、丙酸、丙二醇中的任意之一)0.1重量％或0.2重量％(對(duì)于D-葡萄糖、蔗糖、海藻糖、阿東糖醇、山梨醇為0.2重量％；對(duì)于丁酸、丙酸、丙二醇為0.1重量％)來制作培養(yǎng)基，在所制作的培養(yǎng)基上種植菌體，在30℃培養(yǎng)2～3天(對(duì)于丁酸為5天)后，將看到菌增殖的判定為陽(yáng)性。
·基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1L)的組成 ·Hutner的無機(jī)鹽溶液(1L)的組成 將次氮基三乙酸溶于蒸餾水，用氫氧化鉀中和后，添加其余的鹽類。
·鹽類原液(100ml的組成) 為了明確050572I9株是羅氏假單胞菌、熒光假單胞菌中的哪一種，對(duì)于作為公知菌株的羅氏假單胞菌JCM11940株、熒光假單胞菌NBRC14160株，與上述同樣地進(jìn)行上述表2的項(xiàng)目試驗(yàn)。將其結(jié)果示于表2。
此外，已知熒光假單胞菌對(duì)西紅柿表現(xiàn)病原性而使西紅柿細(xì)菌性莖壞疽病發(fā)病，但為了研究050572I9株對(duì)西紅柿是否具有這樣的病原性，進(jìn)行以下那樣的試驗(yàn)。
將050572I9株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至A600(波長(zhǎng)600nm的吸光度)達(dá)到1.0，將該培養(yǎng)液散布接種于以西紅柿苗的葉柄基部為中心的主莖和葉柄部分。栽培7天后，觀察苗，結(jié)果沒有看到西紅柿細(xì)菌性莖壞疽病的病癥。栽培14天后和栽培21天后觀察苗，但同樣沒有看到西紅柿細(xì)菌性莖壞疽病的病癥。此外，使西紅柿苗帶傷后，在該部分接種050572I9株的上述培養(yǎng)液并進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，但是同樣沒有看到西紅柿細(xì)菌性莖壞疽病的病癥。進(jìn)而，用注射器向西紅柿苗的內(nèi)部注入接種050572I9株的上述培養(yǎng)液，進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，同樣沒有看到西紅柿細(xì)菌性莖壞疽病的病癥。
由表2的結(jié)果可知，050572I9株與熒光假單胞菌NBRC14160株的不同點(diǎn)是有無明膠的分解力、精氨酸的分解力、蔗糖的同化性、阿東糖醇的同化性、丙酸的同化性和丙二醇的同化性。另一方面，050572I9株與羅氏假單胞菌JCM11940株的不同點(diǎn)僅是有無硝酸鹽的還原能力。
此外，進(jìn)行菌體的形狀觀察，結(jié)果050572I9株(細(xì)胞全長(zhǎng)2.0～2.5μm、細(xì)胞寬幅0.7～0.8μm)與羅氏假單胞菌JCM11940株(細(xì)胞全長(zhǎng)2.0～2.5μm、細(xì)胞寬幅0.7～0.8μm)為大致相同的大小，與此相對(duì)，熒光假單胞菌NBRC14160株(細(xì)胞全長(zhǎng)2.2～2.7μm、細(xì)胞寬幅0.8～1.0μm)的全長(zhǎng)和寬幅比050572I9株稍大。
進(jìn)而，050572I9株與熒光假單胞菌不同，不會(huì)使西紅柿細(xì)菌性莖壞疽病發(fā)病。
將以上結(jié)果綜合考慮，考慮到050572I9株與羅氏假單胞菌的同源性高于熒光假單胞菌，因此將050572I9株鑒定為羅氏假單胞菌。本發(fā)明人等將該050572I9株命名為羅氏假單胞菌050572I9株。羅氏假單胞菌是生物安全第1級(jí)的微生物。
另外，用農(nóng)業(yè)環(huán)境技術(shù)研究所的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索050572I9株的API20NE的解析結(jié)果，雖然是極低的幾率，為9％，但是由于提示050572I9株是邊緣假單胞菌邊緣致病變種的可能性，因此為了驗(yàn)證該可能性，通過以下的試驗(yàn)研究050572I9株是否對(duì)已知邊緣假單胞菌邊緣致病變種發(fā)揮病原性的白菜和萵苣顯示病原性。
將對(duì)050572I9株進(jìn)行液體培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，回收菌體。將回收的菌體用水懸浮，添加水進(jìn)行調(diào)整，使得該菌體懸浮液的A600達(dá)到1.0。在該菌體懸浮液中浸漬白菜中脈部的切片。從菌體懸浮液中取出切片，在28℃溫育4天。其后，觀察該白菜切片，結(jié)果完全不顯示邊緣假單胞菌邊緣致病變種成為病原菌的白菜腐敗病的病癥(產(chǎn)生水浸狀的綠褐色斑點(diǎn))。
使用萵苣代替白菜進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，但同樣完全不顯示邊緣假單胞菌邊緣致病變種成為病原菌的萵苣腐敗病的病癥(產(chǎn)生水浸狀的病斑、葉脈褐變并擴(kuò)大)。此外，如上述表2所示，050572I9株也不會(huì)引起土豆的塊莖腐敗。由這些可以確認(rèn)，050572I9株不是邊緣假單胞菌邊緣致病變種。
4.菌體懸浮液的制備 在300ml容量的三角燒瓶中裝入標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基(酵母提取物0.25％，胨0.5％，葡萄糖0.1％，pH7.0)150ml，進(jìn)行加熱滅菌。接種羅氏假單胞菌050572I9株(FERM BP-10912株)的前培養(yǎng)物0.1ml，在往復(fù)振蕩機(jī)中于30℃、以100rpm培養(yǎng)3天。將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離并取出上清，將沉淀用水清洗，再次離心后取出上清并用水清洗沉淀。如此制備羅氏假單胞菌050572I9株的菌體懸浮液。
5.植物病害防除可濕性粉劑組合物的制造 將上述4.中制備的菌體懸浮液冷凍干燥。該干燥物的活菌數(shù)是1.0×1011cfu/g。將菌體干燥物10重量份與萘磺酸(鈉)甲醛縮聚物9重量份、硫酸鈣及其水合物81重量份混合均勻，得到可濕性粉劑組合物?？蓾裥苑蹌┙M合物是以羅氏假單胞菌050572I9株為有效成分的藥劑。
〔試驗(yàn)例1〕 萵苣軟腐病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.1)。將處理液散布于萵苣中脈部切取葉的切取口。作為比較例，將Biokeeper(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑(中央硝子株式會(huì)社制)的1000倍稀釋液同樣地散布處理。將散布處理的各種萵苣在加濕條件下于28℃溫育5小時(shí)后，將萵苣軟腐病的病原菌(胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora)的水懸浮液(A600＝0.5)接種于各個(gè)萵苣的切取口。接種處理后在28℃溫育4天后，按以下的基準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病程度，基于以下的式1和式2算出發(fā)病度和防除價(jià)。
基準(zhǔn)0無病變 基準(zhǔn)1病變小于中脈部的10％ 基準(zhǔn)2病變?yōu)橹忻}部的10～50％ 基準(zhǔn)3病變?yōu)橹忻}部的50～75％ 基準(zhǔn)4病變超過中脈部的75％
n1～n4是對(duì)應(yīng)于各個(gè)基準(zhǔn)1～4的葉數(shù) 防除價(jià)＝(1-(處理區(qū)的發(fā)病度/無處理區(qū)的發(fā)病度))×100 將萵苣軟腐病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn))的結(jié)果示于表3。
表3

由表3可知，確認(rèn)羅氏假單胞菌050572I9株的防除價(jià)為72.4以及對(duì)萵苣軟腐病具有高防除效果。此外，羅氏假單胞菌050572I9株顯示出比使用非病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌的Biokeeper(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑更優(yōu)異的防除價(jià)。
〔試驗(yàn)例2〕 白菜軟腐病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.1)。將處理液散布處理于定植在田地的白菜。作為比較例，將Biokeeper(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑(中央硝子株式會(huì)社制)的1000倍稀釋液、或Coppersin(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑(明治制果株式會(huì)社制)的1000倍稀釋液同樣地散布處理。散布處理隔1周實(shí)施2次。此外，白菜軟腐病的病源菌(胡蘿卜軟腐歐文氏菌)在第1次散布處理的當(dāng)天，散布接種其水懸浮液(A600＝0.1)。自第2次散布1周后，用以下的基準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病程度，基于以下的式3、式4和式5算出發(fā)病度、發(fā)病株率和防除價(jià)。
基準(zhǔn)0無發(fā)病 基準(zhǔn)1在外葉的一部分看到發(fā)病 基準(zhǔn)2在外葉和結(jié)球葉的一部分看到發(fā)病 基準(zhǔn)3在結(jié)球葉的大部分看到發(fā)病
n1～n3是分別對(duì)應(yīng)于基準(zhǔn)1～3的株數(shù) 發(fā)病株率＝(發(fā)病株數(shù)/全部調(diào)查株數(shù))×100
將白菜軟腐病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn))的結(jié)果示于表4。
表4

由表4可知，確認(rèn)羅氏假單胞菌050572I9株對(duì)發(fā)病度的防除價(jià)為72.2、對(duì)發(fā)病株率的防除價(jià)為72.3、對(duì)白菜軟腐病具有高防除效果。此外，羅氏假單胞菌050572I9株的防除價(jià)是與作為以堿性氯化銅為主要成分的化學(xué)系防除劑的Coppersin(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑同等的防除價(jià)，是比使用非病原性胡蘿卜軟腐歐文氏菌的Biokeeper(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑更高的防除價(jià)。
〔試驗(yàn)例3〕 柑橘潰瘍病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.1)。將處理液散布于用手術(shù)刀劃傷的柑橘(檸檬)葉。作為比較例，將Agrept(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑(明治制果株式會(huì)社)的1000倍稀釋液同樣地散布處理。其后，在加濕條件下于28℃溫育5小時(shí)，然后在傷口上接種柑橘潰瘍病菌(野油菜黃單胞菌柑橘病原變種Xanthomonascampestris pv.citri)的水懸浮液(A600＝0.5)。接種處理后在28℃溫育7天，按以下的基準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病程度，基于以下的式6和式7算出發(fā)病度和防除價(jià)。
基準(zhǔn)0未見病斑 基準(zhǔn)1稍見病斑 基準(zhǔn)2看到病斑 基準(zhǔn)3看到顯著病斑
n1～n3是對(duì)應(yīng)于各個(gè)基準(zhǔn)1～3的病斑數(shù) 防除價(jià)＝(1-(處理區(qū)的發(fā)病度/無處理區(qū)的發(fā)病度))×100 將柑橘潰瘍病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn))的結(jié)果示于表5。
表5

由表5可知，確認(rèn)羅氏假單胞菌050572I9株的防除價(jià)為81.8，對(duì)柑橘潰瘍病具有高防除效果。羅氏假單胞菌050572I9株的防除價(jià)比作為以鏈霉素硫酸鹽為主要成分的化學(xué)系防除劑的Agrept(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑的防除價(jià)更高。
〔試驗(yàn)例4〕 柑橘潰瘍病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn)) 將上述4.中得到的的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.05)。將處理液對(duì)臍橙樹木整體進(jìn)行散布處理。作為比較例，將Coppersin(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑(明治制果株式會(huì)社制)的1000倍稀釋液同樣地散布處理。散布處理自落花10天后和其后每2～3周1次，實(shí)施共計(jì)3次。自最終散布7天后，按以下的基準(zhǔn)調(diào)查臍橙的葉和果實(shí)的發(fā)病程度，基于以下的式8、式9、式10和式11算出發(fā)病度、發(fā)病葉率、發(fā)病幼果率和防除價(jià)。
基準(zhǔn)0無病斑 基準(zhǔn)1病斑數(shù)為1～3個(gè) 基準(zhǔn)2病斑數(shù)為4～10個(gè) 基準(zhǔn)3病斑數(shù)為11～20個(gè) 基準(zhǔn)4病斑數(shù)為21個(gè)以上
n1～n4是對(duì)應(yīng)于各個(gè)基準(zhǔn)1～4的葉和幼果數(shù) 發(fā)病葉率＝(發(fā)病葉數(shù)/全部調(diào)查葉數(shù))×100 發(fā)病幼果率＝(發(fā)病幼果數(shù)/全部調(diào)查幼果數(shù))×100
對(duì)于發(fā)病葉率、發(fā)病幼果率的防除價(jià)也同樣地計(jì)算。
將柑橘潰瘍病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn))的結(jié)果示于表6(柑橘葉)和表7(柑橘幼果)。
表6

表7

由表6和表7可知，羅氏假單胞菌050572I9株顯示出對(duì)葉子發(fā)病度的防除價(jià)為72.5、對(duì)發(fā)病葉率的防除價(jià)為67.5的高防除價(jià)。此外，對(duì)幼果發(fā)病度的防除價(jià)為77.5、對(duì)發(fā)病幼果率的防除價(jià)為60.7的高防除價(jià)。
〔試驗(yàn)例5〕 萵苣軟腐病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.05)。此外，將對(duì)與上述4.同樣培養(yǎng)和制備羅氏假單胞菌JCM11940的菌體懸浮液和與上述5.同樣進(jìn)行制劑制備的可濕性粉劑用水稀釋來制備處理液(A600＝0.05)。進(jìn)而，將與上述4.同樣地培養(yǎng)和制備熒光假單胞菌NBRC14160的菌體懸浮液用水稀釋而制備處理液(A600＝0.05)。
將對(duì)4.中得到的菌體懸浮液稀釋而成的上述處理液散布于萵苣中脈部切取葉的切取口。此外，將對(duì)含有羅氏假單胞菌JCM11940的菌體懸浮液稀釋而成的上述處理液同樣地散布于萵苣中脈部切取葉的切取口。進(jìn)而，作為比較例，將對(duì)含有熒光假單胞菌NBRC14160的菌體懸浮液稀釋而成的上述處理液同樣地散布于萵苣中脈部切取葉的切取口。
將經(jīng)散布處理的各個(gè)萵苣在加濕條件下于25℃溫育5小時(shí)后，將萵苣軟腐病菌(胡蘿卜軟腐歐文氏菌)的水懸浮液(A600＝0.5)接種于傷口。接種處理后在25℃溫育5天后，按以下的基準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病度，基于以下的式12和式13算出發(fā)病度和防除價(jià)。
基準(zhǔn)0無病變 基準(zhǔn)1病變小于中脈部的10％ 基準(zhǔn)2病變?yōu)橹忻}部的10～50％ 基準(zhǔn)3病變?yōu)橹忻}部的50～75％ 基準(zhǔn)4病變超過中脈部的75％
n1～n4是對(duì)應(yīng)于各個(gè)基準(zhǔn)1～4的葉數(shù) 防除價(jià)＝(1-(處理區(qū)的發(fā)病度/無處理區(qū)的發(fā)病度))×100 將萵苣軟腐病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn))的結(jié)果示于表8。
表8

由表8可知，雖然羅氏假單胞菌JCM11940株比050572I9株差，但是防除價(jià)為57.1且對(duì)萵苣軟腐病具有防除效果。然而，確認(rèn)與羅氏假單胞菌為近緣種的熒光假單胞菌的防除價(jià)為0.0且對(duì)萵苣軟腐病沒有防除效果。
〔試驗(yàn)例6〕 萵苣腐敗病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.05)。在處理液中將以萵苣中脈部為中心的切取葉片浸漬處理10分鐘。作為比較例，將Vegikeeper〔注冊(cè)商標(biāo)〕可濕性粉劑(中央硝子株式會(huì)社制)的1000倍稀釋液同樣地浸漬處理。將經(jīng)藥劑處理的各個(gè)萵苣葉在加濕條件下于25℃溫育5小時(shí)后，將萵苣腐敗病菌(菊苣假單胞菌PCL2001)的水懸浮液(A600＝0.01)在切片的斷面兩側(cè)各接種20μl。處理后，在25℃溫育5天，按下述的基準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病度。
基準(zhǔn)0無病變 基準(zhǔn)1病癥小于中脈部的10％ 基準(zhǔn)2病癥為中脈部的10～50％ 基準(zhǔn)3病癥為中脈部的50～75％ 基準(zhǔn)4病癥超過中脈部的75％
n1～n4是對(duì)應(yīng)于各個(gè)基準(zhǔn)1～4的葉數(shù) 防除價(jià)＝(1-(處理區(qū)的發(fā)病度/無處理區(qū)的發(fā)病度))×100 表9

由表9可知，確認(rèn)羅氏假單胞菌(Pseudomonas rhodesiae)050572I9株的防除價(jià)為87.5且對(duì)萵苣腐敗病具有高防除效果。此外，羅氏假單胞菌(Pseudomonas rhodesiae)050572I9株顯示出比Vegikeeper〔注冊(cè)商標(biāo)〕可濕性粉劑優(yōu)異的防除價(jià)。
〔試驗(yàn)例7〕 甘藍(lán)黑腐病防除效果試驗(yàn)(室內(nèi)試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.05)。將以甘藍(lán)葉的葉脈為中心而切取得到的葉片在處理液中進(jìn)行10分鐘浸漬處理。作為比較例，將Vegikeeper(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑(中央硝子株式會(huì)社制)的1000倍稀釋液同樣地進(jìn)行浸漬處理。將經(jīng)藥劑處理的各個(gè)甘藍(lán)葉在加濕條件下于25℃溫育5小時(shí)后，將甘藍(lán)黑腐病菌(野油菜黃單胞菌野油菜致病變種CAX303)的水懸浮液(A600＝1.0)在切片的斷面兩側(cè)各接種20μl。處理后，在25℃溫育8天，按下述的基準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病度。
基準(zhǔn)0無病變 基準(zhǔn)1病癥僅在切口的一部分產(chǎn)生 基準(zhǔn)2病癥產(chǎn)生到葉脈的一部分 基準(zhǔn)3病癥在葉脈整體產(chǎn)生 基準(zhǔn)4病癥在葉脈整體產(chǎn)生且產(chǎn)生到葉面
n1～n4是對(duì)應(yīng)于各個(gè)基準(zhǔn)1～4的葉數(shù) 防除價(jià)＝(1-(處理區(qū)的發(fā)病度/無處理區(qū)的發(fā)病度))×100 表10

由表10可知，明確羅氏假單胞菌050572I9株的防除價(jià)為60.0且對(duì)甘藍(lán)黑腐病具有高防除效果。此外，羅氏假單胞菌050572I9株顯示出比Vegikeeper(注冊(cè)商標(biāo))可濕性粉劑優(yōu)異的防除價(jià)。
〔試驗(yàn)例8〕 桃細(xì)菌性穿孔病防除效果試驗(yàn)(田地試驗(yàn)) 將上述4.中得到的菌體懸浮液用水稀釋來制備處理液(A600＝0.1)。將處理液對(duì)桃樹木整體進(jìn)行散布處理。散布處理在落花后立即進(jìn)行第1次，在其7天后、22天后、34天后、49天后進(jìn)行處理，實(shí)施共計(jì)5次。自第2次散布15天后、第4次散布6天后、自最終散布8天后對(duì)GL1m周邊的樹周圍的新梢葉調(diào)查健全葉數(shù)和患病葉數(shù)，算出防除價(jià)。
表11

由表11明確，羅氏假單胞菌050572I9株對(duì)生長(zhǎng)期的桃顯示出防除價(jià)達(dá)50～65左右之高的桃細(xì)菌性穿孔病防除效果。
序列表
<110>日本曹達(dá)株式會(huì)社
<120>對(duì)植物病害具有防除能力的微生物和使用該微生物的植物病害防除劑
<130>Case775
<150>JP 2006-302263
<151>2006-11-8
<160>3
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1422
<212>DNA
<213>羅氏假單胞菌
<400>1
ggcctaacac atgcaagtcg agcggtagag agaagcttgc ttctcttgag agcggcggac 60
gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggat aacgttcgga aacggacgct120
aataccgcat acgtcctacg ggagaaagca ggggaccttc gggccttgcg ctatcagatg180
agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac gatccgtaac240
tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag300
gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg360
aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg aagggccatt acctaatacg420
tgatggtttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa ctctgtgcca gcagccgcgg480
taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc gtaggtggtt 540
tgttaagttg gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcaa aactgactga 600
ctagagtatg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatagg 660
aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac tgacactgag gtgcgaaagc 720
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcaactagc 780
cgttgggagc cttgagctct tagtggcgca gctaacgcat taagttgacc gcctggggag 840
tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900
gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggcc ttgacatcca atgaactttc 960
tagagataga ttggtgcctt cgggaacatt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca acccttgtcc ttagttacca1080
gcacgttatg gtgggcactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat1140
gacgtcaagt catcatggcc cttacggcct gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac1200
aaagggttgc caagccgcga ggtggagcta atcccataaa accgatcgta gtccggatcg1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgcgaatc agaatgtcgc1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgcac1380
cagaagtagc tagtctaacc ttcgggggga cggttaccac gg 1422
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>16S 27F引物
<400>2
agagtttgat cctggctcag20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>16S 1544R引物
<400>3
agaaaggagg tgatccagcc20
權(quán)利要求
1、一種對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌。
2、一種對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌FERMBP-10912。
3、一種變異株，其是羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株，而且對(duì)植物病害具有防除能力。
4、如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的羅氏假單胞菌、羅氏假單胞菌FERM BP-10912或羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株，其中，植物病害是選自潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病和黑腐病中的1種或2種以上的植物病害。
5、如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的羅氏假單胞菌、羅氏假單胞菌FERM BP-10912或羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株，其中，植物病害是由于如下病原菌所致病的植物病害，即選自黃單胞菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、雷爾氏菌屬和伯克霍爾德氏菌屬中的1種或2種以上的病原菌。
6、一種植物病害防除劑，其含有對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌的菌體。
7、如權(quán)利要求6所述的植物病害防除劑，其中，羅氏假單胞菌的菌體是選自權(quán)利要求2所述的羅氏假單胞菌FERM BP-10912的菌體和權(quán)利要求3所述的羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株的菌體中的一種或兩種以上的菌體。
8、如權(quán)利要求6所述的植物病害防除劑，其中，植物病害是選自潰瘍病、細(xì)菌性穿孔病、軟腐病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、細(xì)菌性黑斑病、青枯病、細(xì)菌性褐斑病、細(xì)菌性莖壞疽病、細(xì)菌性稻谷枯病、細(xì)菌性苗立枯病、白葉枯病、腐敗病和黑腐病中的1種或2種以上的植物病害。
9、一種植物病害的防除方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的羅氏假單胞菌、羅氏假單胞菌FERM BP-10912或羅氏假單胞菌FERM BP-10912的變異株施用于植物和/或該植物的栽培土壤。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供對(duì)環(huán)境負(fù)荷少、抵抗性病原菌產(chǎn)生的可能性極低、并且對(duì)多種植物病害(特別是葉菜、根菜類的軟腐病、潰瘍病)具有優(yōu)異防除能的微生物，含有該微生物的植物病害防除劑，將該植物病害防除劑施用于植物和/或該植物的栽培土壤的植物病害防除方法。使用含有對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌(Pseudomonas rhodesiae)、優(yōu)選對(duì)植物病害具有防除能力的羅氏假單胞菌FERM BP-10912或其變異株的菌體的植物病害防除劑。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101541948SQ20078004030
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者前田光紀(jì) 申請(qǐng)人:日本曹達(dá)株式會(huì)社