專利名稱：：產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的方法，該方法包括在所述植物中提供至少一種核^f列，其編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有A6-延伸酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽；和至少一種核酸序列，其編碼具有A5-延伸酶活性的多肽，其中編碼具有A5-延伸酶活性的多肽的核酸序列與該序列的來源生物中的核酸序列相比較受到修飾，因?yàn)樗m應(yīng)于一種或更多種植物種中的密碼子選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，還提供了其它的核酸序列，其編碼在植物中具有co3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶活性的多肽。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了其它核酸序列，其在植物中編碼?；o酶A脫氫酶、?；?ACP(?；d體蛋白)去飽和酶、?；?ACP硫酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、?；o酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸炔屬酶(acetylenase)、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶(alleneoxidesynthases)、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。本發(fā)明此外涉及重組核酸分子，所述重組核酸分子包含至少一種核酸序列，其編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有A6-延伸酶活性的多肽；和至少一種核酸序列，其編碼具有A5-延伸酶活性的多肽，并且其與該序列來源的生物中的核酸序列相比較受到j(luò)務(wù)飾，因?yàn)樗m應(yīng)于一種或更多種植物種中的密碼子選擇。本發(fā)明的另一部分涉及已經(jīng)通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的油、脂類和/或脂肪酸及它們的用途。最后，本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因植物，其已經(jīng)通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生或其包含本發(fā)明的重組核酸分子，并涉及其作為食品或飼料的用途。脂類合成可以分成兩部分脂肪酸的合成和它們與sn-甘油-3-磷酸的結(jié)合，和極性首基的加入或者修飾。用于膜的有用的脂類包括磷脂、糖脂、鞘脂和磷酸甘油酯。脂肪酸合成以乙酰輔酶羧化酶A催化的乙酰輔酶基-ACP的轉(zhuǎn)化開始?？s合反應(yīng)后，這兩種產(chǎn)物分子一起形成乙酰乙?；?ACP，其通過一系列縮合、還原和脫水反應(yīng)轉(zhuǎn)化，從而得到具有所需要的鏈長的飽和的脂肪酸分子。特定去飽和酶通過分子氧有氧或者無氧地催化從這些分子產(chǎn)生不飽和脂肪酸(關(guān)于微生物中脂肪酸合成，見F.C.Neidhardt等人(1996)E.coliandSalmonella.ASMPress:Washington,D.C.，p.612-636和其中引用的參考文獻(xiàn)；Lengder等人(Ed.)(1999)BiologyofProcaryotes.Thieme:Stuttgart,NewYork,和其中引用的參考文獻(xiàn)，和Magnuson，K.，等人(1993)MicrobiologicalReviews57:522-542和其中引用的參考文獻(xiàn))。為了經(jīng)歷進(jìn)一步延長步驟，所得磷脂結(jié)合的脂肪酸必須返回到脂肪酸CoA酯庫。這通過酰基輔酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶變成可能。而且，這些酶能夠?qū)⒀娱L的脂肪酸從輔酶A酯轉(zhuǎn)移回到磷脂。如果合適，該反應(yīng)順序可以重復(fù)進(jìn)行。此外，脂肪酸必須隨后轉(zhuǎn)運(yùn)到多種修飾位點(diǎn)并摻入三酰甘油貯藏脂類。脂類合成中另一重要的步驟是例如，通過甘油脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶將脂肪酸轉(zhuǎn)移到極性首基(見Frentzen，1998，Lipid,100(4-5):161-166)。植物中脂肪酸的生物合成、去飽和、脂類代謝和脂類化合物的膜轉(zhuǎn)運(yùn)、P氧化、脂肪酸和輔因子的修飾和三酰甘油的貯藏和裝配的綜述，包括其參考文獻(xiàn)，由如下給出Kinney，1997,GeneticEngineering,Ed.:JKSetlow，19:149-166;Ohlrogge和Browse,1995，PlantCell7:957-970;Shanklin和Cahoon，1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641;Vodker，1996，GeneticEngineering,Ed.:JKSetlow，18:111-13'，Gerhardt，1992，Prog.LipidR.31:397-417;Giihnemann-Sch3fer&Kindl,1995,Biochim.BiophysActa1256:181-186;Kunau等人，1995，Prog.LipidRes.34:267-342;Stymne等人，1993，in:BiochemistryandMolecularBiologyofMembraneandStorageLipidsofPlants,Eds.:MurataandSomerville，Rockville，AmericanSocietyofPlantPhysiologists,150-158，Murphy&Ross1998，PlantJournal.13(1):1-16。根據(jù)去飽和作用的類型，可以將多不飽和脂肪酸的兩大類，co6和co3脂肪酸區(qū)別開，所述co6和co3脂肪酸在它們的代謝和它們的功能上不同。在下面的文本中，將多不飽和脂肪酸稱作PUFA、PUFAs、LCPUFA或者LCPUFAs(多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids)，PUFA，長鏈多不飽和脂肪酸(longchainpolyunsaturatedfattyacids)，LCPUFA)。脂肪酸亞油酸(18:2A9，12)充當(dāng)co6代謝途徑的原料，而co3途徑通過亞麻酸(18:3A9，12，15)進(jìn)行。亞麻酸由亞油酸通過co3-去飽和酶活性形成(Tocher等人(1998)Prog.LipidRes.37:73-117;Domergue等人(2002)Eur.J.Biochem.269:4105-4113)。哺乳動(dòng)物，從而人，沒有對應(yīng)的去飽和酶活性012-和o3-去飽和酶)用于形成所述原料并且必須通過食物攝入這些脂肪酸(必需脂肪酸)。以這些前體開始，生理上重要的多不飽和的脂肪酸花生四烯酸(-ARA，20:4A5，8，"，")、一種co6-脂肪酸和兩種co3-脂肪酸二十碳五烯酸(=EPA，20:5A5'8，n，"，")和二十二碳六烯酸(DHA，22#4，7，1()，13，17，19)通過去飽和酶和延伸酶反應(yīng)順序合成。通過延伸酶脂肪酸延伸2個(gè)或4個(gè)碳原子分別對C加-和C22-PUFAs的產(chǎn)生起至關(guān)重要的作用。該方法通過4個(gè)步驟來進(jìn)行。第一步是丙二酰單酰輔酶A通過酮脂酰輔酶A合酶(KCS，下文中稱作延伸酶)縮合到脂肪酸?；o酶A上。接著是還原步驟(酮脂酰輔酶A還原酶，KCR)、脫水步驟(脫水酶)和最后的還原步驟(烯酰輔酶A還原酶)。已經(jīng)假定延伸酶活性影響整個(gè)過程的特異性和速率(Millar和Kunst(l卯7)PlantJournal12:121-131)。脂肪酸和三酰甘油酯在食品工業(yè)、動(dòng)物營養(yǎng)、化妝品和藥物領(lǐng)域具有大量的應(yīng)用。根據(jù)它們是游離的飽和或不飽和脂肪酸還是其它具有升高含量飽和或不飽和脂肪酸的三酰甘油酯，它們適合于非常不同的應(yīng)用。因此，例如，人類營養(yǎng)中優(yōu)選具有不飽和脂肪酸，尤其具有多不飽和脂肪酸的脂類。多不飽和co3-脂肪酸應(yīng)該對血液中的膽固醇水平具有積極作用，并因此對心臟病的預(yù)防有積極作用。通過向食物中加入這些w3-脂肪酸可以顯著降低心臟病、中風(fēng)或高血壓的風(fēng)險(xiǎn)(Shimikawa(2001)WorldRev.Nutr.Diet.88:100-108)。co3-脂肪酸對與免疫學(xué)疾病有關(guān)的炎癥過程，特別對慢性炎癥過程，如對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有積極作用(Calder2002，Proc.Nutr.Soc.61，345-358;CIelandandJames2000，J.Rheumatol.27，2305-2307)。因此將它們加入食品，特別加入々欠食食品，或者用于藥物中。c)6-脂肪酸，如花生四烯酸傾向于對這些風(fēng)濕性疾病有消極作用。co3-和co6-脂肪酸是稱作類二十烷酸的組織激素(如前列腺素)的前體，所述組織激素衍生自二高-，亞麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，co3-和to6-脂肪酸也是血栓烷和白三烯的前體，血栓烷和白三烯衍生自花生四烯酸和二十碳五烯酸。從co6-脂肪酸形成的類二十烷酸(稱作PG2系列)通常促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而來自co3-脂肪酸的類二十烷酸(稱作PG3系列)有很小或者沒有促炎效果。多不飽和的長鏈0>3-脂肪酸如二十碳五烯酸(=EPA，C20:5A5，s，"，"，")或者二十二碳六烯酸(=DHA，〔22:6"，7，1()，13，16，19)由于它們在健康方面的多種作用而是人類營養(yǎng)的重要組分，所述作用包括兒童腦的發(fā)育、眼的功能性、激素和其他信號物質(zhì)的合成，和心血管疾病、癌癥和糖尿病的預(yù)防(Poulos，A(1995)Lipids30:1-14;Horrocks，LA和YeoYK(1999)PharmacolRes40:211-225)。由于當(dāng)前人類食物的組成，向食物中加入多不飽和co3脂肪酸是尤其重要的，所述多不飽和(o3脂肪酸優(yōu)先在魚油中發(fā)現(xiàn)。從而，例如，將多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸(-DHA，C22:6A4，7，1。，13，16，19)或者二十碳五烯酸(=EPA，C20:5AS，s，"，"，")加入嬰兒配方中以提高營養(yǎng)價(jià)值。因此，需要生產(chǎn)多不飽和的長鏈脂肪酸。多種脂肪酸和甘油三酯主要從微生物如被孢霉屬(Mortierella)或者Schizochytrium或者從產(chǎn)油植物,如大豆、油菜(oilseedrape)、藻類,如隱甲藻屬(Crypthecodinium)或褐指藻屬(Phaeodactylum)和其它生物中獲得，通常以它們的三酰甘油酯(=甘油三酯=三甘油)的形式得到。然而，它們還可以從動(dòng)物，例如從魚得到。有利地通過水解甘油三酯制備游離脂肪酸。然而，極長鏈多不飽和脂肪酸如DHA、EPA、花生四烯酸(ARA，C2o:4A5，8，"，")、二高個(gè)亞麻酸(DHGL，C20:3A8，"，")或者二十二碳五烯酸(DPA，C22:5A，"，"，")不在油料作物如油菜、大豆、向日葵和紅花中合成。這些脂肪酸的常規(guī)天然來源為魚，如紳魚、鮭魚、沙丁魚、雄鮭、鰻鱺、鯉魚、鱒魚、大比目魚、鯖魚、梭妒或金槍魚或藻類。由于它們的積極特征，過去已經(jīng)嘗試?yán)蒙婕斑@些脂肪酸或者甘油三酯的合成的基因在多種生物中產(chǎn)生改變含量的不飽和脂肪酸。從而，WO91/13972和其美國同族專利描述了A9-去飽和酶。WO93/11245要求保護(hù)A15去飽和酶，WO94/11516要求保護(hù)A12去飽和酶。其他去飽和酶在例如EP—A—0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、衡95/18222、EP-A—0794250、Stukey等人(19卯)J.Biol.Chem"265:20144—20149、Wada等人(1990)Nature347:200—203或Huang等人(1999)Lipids34:649-659中描述。然而，多種去飽和酶的生物化學(xué)表征迄今還不充分，因?yàn)檫@些酶是膜結(jié)合的蛋白質(zhì)，對它們的分離和表征造成了巨大困難(McKeon等人(1981)MethodsinEnzymol.71:12141-12147，Wang等人(1988)PlantPhysiol.Biochem.，26:777—792)。通常，通過導(dǎo)入合適的生物并隨后通過分析起始材料和產(chǎn)物而分析酶活性來表征膜結(jié)合的去飽和酶。A"去飽和酶在WO93/06712、US5,614,393、WO96/21022、WO00/21557和WO99/27111中描述。該酶在轉(zhuǎn)基因生物中生產(chǎn)脂肪酸的應(yīng)用描述于WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765。多種去飽和酶的表達(dá)和多不飽和脂肪酸的形成也在WO99/64616或者WO98/46776中描述和要求保護(hù)。關(guān)于去飽和酶的表達(dá)效力和它對多不飽和脂肪酸形成的影響，必須注意到迄今描述的一種去飽和酶的表達(dá)僅僅導(dǎo)致低含量的不飽和脂肪^/脂類，如，亞麻酸和十八碳四烯酸。在過去已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試以期得到延伸酶基因。Millar和Kunst，1997(PlantJournal12:121-131)和Millar等人，1999(PlantCell11:825-838)描述了植物延伸酶的表征，所述延伸酶用于在植物中合成單不飽和的長鏈脂肪酸(C22:l)和合成極長鏈脂肪酸以形成蠟(<:28-<:32)?；ㄉ南┧岷虴PA的合成描述于例如WO01/59128、WO00/12720、WO02/077213和WO02/08401中。多不飽和C24-脂肪酸的合成描述于例如Tvrdik等人2000，J.CellBiol.149:707-718或WO02/44320中。用于產(chǎn)生PUFA的特別適宜的是^t藻，如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、Porphiridium某些種、破囊壺菌屬(Thraustochytri腿)某些種、Schizochytrium種或隱甲藻屬某些種、纖毛蟲例如棘尾蟲屬(Stylonychia)或豆形蟲屬(Colpidium)、真菌如被孢霉、蟲霉菌屬(Entomophthora)或毛霉屬(Mucor)和/或蘚類如劍葉蘚屬(Physcomitrella)、角齒蘚屬(Ceratodon)和地錢屬(Marchantia)(R.Vazhappilly和F.Chen(1998)BotanicaMarina41:553-558;K.Totani和K.Oba(1987)Lipids22:1060-1062;M.Akimoto等，(1998)Appl.BiochemistryandBiotechnology73:269-278)。菌抹選擇已經(jīng)導(dǎo)致開發(fā)了所述微生物的許多突變林，它們產(chǎn)生一系列所希望的化合物，包括PUFA。然而，改良產(chǎn)生特定分子如多不飽和脂肪酸的林系的突變和選擇是費(fèi)時(shí)且困難的方法。此外，借助上述微生物，僅可以產(chǎn)生有限量的所希望的多不飽和脂肪酸，如DPA、EPA或者ARA;而且，它們通常作為脂肪酸混合物得到。這是為什么一旦可能就優(yōu)選重組方法的原因。高等植物包含多不飽和脂肪酸如亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)。ARA、EPA和DHA在高等植物的種子油中根本沒有發(fā)現(xiàn)或者以僅僅以極小量存在(E.Ucciani:NouveauDictionnairedesHuilesV6g6tales[NewDictionaryoftheVegetableOilsj。然而，在高等植物，優(yōu)選在油料作物如油菜(oilseedrape)、亞麻子、向日葵和大豆中產(chǎn)生LCPUFA將是有利的，因?yàn)槭称饭I(yè)、動(dòng)物營養(yǎng)和制藥目的所需的較大量的高質(zhì)量LCPUFA可以經(jīng)濟(jì)地得到。為此，有利地是通過重組方法向油料種子中導(dǎo)入編碼LCPUFA生物合成的酶的基因并在其中表達(dá)它們。這些基因編碼例如，A6去飽和酶、A6延伸酶、A5去飽和酶、或A4去飽和酶。這些基因可以有利地從產(chǎn)生LCPUFA并將它們摻入膜或者三酰甘油酯的微生物和低等植物分離。從而，因此已有可能從蘚類植物展葉劍葉蘚(Physcomitrdlapatens)中分離A6去飽和酶基因并且從展葉劍葉蘚和秀麗線蟲(C.elegans)中分離A6延伸酶基因。例如在DE-A-10219203(在植物中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法)中已描述了轉(zhuǎn)基因植物，其包含并表達(dá)編碼LCPUFA生物合成酶的基因并且因而產(chǎn)生LCPUFAs。然而，這些植物以需要進(jìn)一步優(yōu)化的量產(chǎn)生LCPUFAs，所述優(yōu)化用于處理植物中存在的油。因此，在每種情況下基于植物的總脂類含量，DE-A-10219203中描述的植物中的ARA含量僅有0.4至2%,并且EPA含量僅有0.5至1%。為了使利用多不飽和長鏈脂肪酸強(qiáng)化食物和飼料變成可能，因此非常需要簡單廉價(jià)的方法用于尤其是在植物系統(tǒng)中產(chǎn)生多不飽和長鏈脂肪酸。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)因此是提供方法，利用所述方法可以在轉(zhuǎn)基因植物中大量并廉價(jià)地產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸?，F(xiàn)在已驚奇地發(fā)現(xiàn)可以通過在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)優(yōu)化的A5-延伸酶序列來增加長鏈多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的產(chǎn)量。由本發(fā)明方法產(chǎn)生的PUFAs包含高等動(dòng)物不能合成因此必須消耗的或者高等動(dòng)物不能夠產(chǎn)生足夠量并因此必須消耗其額外量的一組分子，雖然它們可以通過其它生物如細(xì)菌輕易地合成。因此，通過本發(fā)明方法在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目標(biāo)，包含在植物中提供至少一種核酸序列，其編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有A6-延伸酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽；和至少一種核酸序列，其編碼具有A5-延伸酶活性的多肽，中的核酸序列相比較受到修飾，因?yàn)樗m應(yīng)于一種或更多植物種中的密碼子選擇。為了產(chǎn)生DHA，額外需要提供至少一種核酸序列，其在植物中編碼具有A4-去飽和酶活性的多肽。"植物中提供"在本發(fā)明上下文中指采取措施使得編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽、具有A6-延伸酶活性的多肽、具有A5-去飽和酶活性的多肽和具有A5-延伸酶活性的多肽的核酸序列共同存在于一個(gè)植物中。"植物中提供"因此包含通過用包含所述核酸序列的一種或更多重組核酸分子進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化和通過包含一種或更多所述核酸序列的合適的親本植株雜交將核^列引入植物中。根據(jù)本發(fā)明，編碼具有A5-延伸酶活性的多肽的核酸序列與所述序列來源的生物中的核^列相比較受到修飾，因?yàn)樗m應(yīng)于一種或更多植物種中的密碼子選擇。這表示為了本發(fā)明目的，已經(jīng)將所述核酸序列進(jìn)行了特異優(yōu)化，但是不由此改變該核酸序列編碼的氨基酸序列。遺傳密碼是冗余的，因?yàn)樗褂?1種密碼子來定義20種氨基酸。因此，大部分的20種蛋白質(zhì)生成氨基酸因此由多個(gè)三聯(lián)體(密碼子)編碼。然而在特定生物中不以相同頻率使用定義單個(gè)氨基酸的同義密碼子；相反地是經(jīng)常使用的優(yōu)選密碼子，和很少使用的密碼子。密碼子選擇上的這些不同歸因于選擇性進(jìn)化壓力和尤其是翻譯效率。很少出現(xiàn)的密碼子的翻譯效率較低的一個(gè)原因可能是相應(yīng)的氨酰tRNA庫耗盡了并因此不再可被用于蛋白質(zhì)合成。此外，不同的生物優(yōu)選不同的密碼子。為此，例如，來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA的表達(dá)經(jīng)常在大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中次優(yōu)地進(jìn)行。因此在某些情況下用經(jīng)常使用的密碼子代替很少使用的密碼子來提高表達(dá)是可能的。不希望被一種理論束繂，假設(shè)密碼子優(yōu)化的DNA序列使更有效的翻譯變成可能，并且由此形成的mRNAs可能在細(xì)胞中具有更長的半衰期并因此可以更經(jīng)常地用于翻譯。由上面已經(jīng)敘述的，可以得到只有當(dāng)生物(其中將表達(dá)核酸序列)不同于該核酸序列最初來源的生物時(shí)，密碼子優(yōu)化才是必需的。對于相對大量基因的DNA序列已知的許多生物，可以從表中獲得各生物中特定密碼子的使用頻率。在這些表的幫助下以相對高的準(zhǔn)確度將蛋白質(zhì)序列回譯成DNA序列是可能的，所述DNA序列包含在各生物中對于蛋白質(zhì)的多種氨基酸優(yōu)選的密碼子。尤其在以下互聯(lián)網(wǎng)地址中可以找到密碼子選擇表http:〃www.kazusa.or.ip/Kodon/E.html。此外，多個(gè)公司提供了用于基因優(yōu)化的軟件，例如，Entelechon(SoftwareLeto)或Geneart(SoftwareGeneOptimizer)。特定生物中序列對密碼子選擇的適應(yīng)可以在多種標(biāo)準(zhǔn)的幫助下進(jìn)行。一方面，對特定氨基酸使用所選生物中最經(jīng)常出現(xiàn)的密碼子是可能的，但是另一方面，也考慮多種密碼子的固有頻率，使得將特定氨基酸的所有密碼子根據(jù)它們的固有頻率摻入到優(yōu)化序列中。使用特定堿基三聯(lián)體的位置的選擇在這種情況下可以隨機(jī)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，考慮各個(gè)密碼子的固有頻率來調(diào)整DNA序列，使用在所選生物中最經(jīng)常出現(xiàn)的密碼子也是合適的。來自O(shè)streococcustauri的核酸序列(其編碼具有A5-延伸酶活性的多肽，例如在SEQIDNo.110中描述的多肽)，特別優(yōu)選至少適應(yīng)油菜、大豆和/或亞麻中的密碼子選擇。最初來自O(shè)streococcustauri的核酸序列優(yōu)選是在SEQIDNo.109中描述的序列。編碼A5-延伸酶的DNA序列在至少20%的位置，優(yōu)選至少30%的位置，特別優(yōu)選至少40%的位置并最優(yōu)選至少50%的位置被調(diào)整來適應(yīng)油菜、大豆和/或亞麻中的密碼子選擇。使用的核酸序列最優(yōu)選是在SEQIDNo.64中描述的序列。將理解本發(fā)明也包含那些密碼子優(yōu)化的DNA序列，其編碼具有A5-延伸酶活性的多肽并且通過與野生型序列比較，它們的氨基酸序列在一個(gè)或更多位置上被修飾，但是其仍然具有與野生型蛋白質(zhì)基本上相同的活性。編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽的核酸序列優(yōu)選選自a)核,列，其具有SEQIDNo.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41中描述的序列，優(yōu)選具有SEQIDNo.1中描述的序列，b)核^^列，其編碼SEQIDNo.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42中，優(yōu)選SEQIDNo.2中指出的氨基#列，c)核酸序列，其與上面a)或b)指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.1中指出的核酸序列的互#卜鏈在嚴(yán)格條件下雜交，d)核酸序列，其與上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其與SEQIDNo.1中指出的序列有至少60%、65%、70%、75%或80%，優(yōu)選至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或卯％，特別優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97%、98%或99%的同一性，和e)核酸序列，其編碼氨基酸序列并且該氨基酸序列具有SEQIDNo.43、44、45、46、47、48、49或50中指出的至少一種，例如2、3、4、5、6、7或8種，優(yōu)選所有的氨基酸模式。氨基酸模式是指短氨基酸序列，其優(yōu)選包含少于50個(gè)，特別優(yōu)選少于40個(gè)并尤其是10至40個(gè)，并甚至更優(yōu)選10至30個(gè)氨基酸。對于本發(fā)明，同一性是優(yōu)選在本發(fā)明核苷酸或氨基酸序列全長上確定的，例如對于SEQIDNO:64中指出的核酸序列，是在903個(gè)核苷酸全長上確定的。編碼具有A6-延伸酶活性的多肽的核酸序列優(yōu)選選自a)具有SEQIDNo.171、173、175、177、179、181或183中描述的序列，尤其具有SEQIDNo.171中描述的序列的核酸序列，b)核絲列，其編碼SEQIDNo.172、174、176、178、180、182或184中指出的氨基*列，尤其編碼SEQIDNo.172中指出的氨基斷列，c)核酸序列，其與上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.1中指出的核酸序列的互#卜鏈在嚴(yán)格條件下雜交，d)核酸序列，其與上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其與SEQIDNo.171中指出的序列有至少60%、65%、70°/。、75%或80%，優(yōu)選至少81%、82%、83%、84°/。、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特別優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97°/。、98%或99%的同一性，和e)核酸序列，其編碼氨基酸序列并且該氨基酸序列具有SEQIDNo.185、186、187、188、189、l卯、191或192中指出的至少一種，例如2、3、4、5、6、7或8種，優(yōu)選所有的氨基酸模式。編碼具有A6-延伸酶活性的多肽的核酸序列尤其也是本發(fā)明密碼子優(yōu)化的序列，優(yōu)選在SEQIDNO:122中描述的核酸序列中。編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽的核酸序列優(yōu)選選自a)核酸序列，其具有在SEQIDNo.51、53或55中描述的序列，優(yōu)選具有在SEQIDNo.51中描述的序列，b)核酸序列，其編碼SEQIDNo,52、54或56中指出的氨基酸序列，優(yōu)選編碼SEQIDNo.52中指出的氨基*列，c)核酸序列，其與上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.51中指出的核列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，d)核酸序列，其與上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其與SEQIDNo.51中指出的序列有至少60%、65%、70%、75%或80%，優(yōu)選至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特別優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96°/。、97。/。、980/?；?9%的同一性，和e)核酸序列，其編碼氨基酸序列并且該氨基酸序列具有SEQIDNo.57、58、59、60、61、62或63中指出的至少一種，例如2、3、4、5、6或7種，優(yōu)選所有的氨基酸模式。http:Vwww.ncbi.iilm.nih.gov中發(fā)現(xiàn)。在本方法進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，此外將編碼具有co-3-去飽和酶活性和/或A4-去飽和酶活性的多肽的一種或更多核^列引入植物中。編碼具有o-3-去飽和酶活性的多肽的核酸序列優(yōu)選選自a)具有SEQIDNo.193或195中描述的序列，優(yōu)選SEQIDNo.193中描述的序列的核酸序列，b)核^列，其編碼SEQIDNo.194中指出的氨基#列，c)核酸序列，其與SEQIDNo.193或195中描述的核酸序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，和d)核酸序列，其與SEQIDNo.193或195中指出的序列有至少60%、65%、70%、75%或80%，優(yōu)選至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特別優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97%、98%或99%的同一性。有利地用于本發(fā)明方法中的co-3-去飽和酶使co-6生物合成途徑偏移到(0-3生物合成途徑變?yōu)榭赡埽瑢?dǎo)致Cis:2向C化3脂肪酸的偏移。C0-3-去飽和酶轉(zhuǎn)化寬范圍的磷脂，如磷脂酰膽堿(-PC)、磷脂酰肌醇(=PIS)或磷脂酰乙醇胺(=PE)是更有益的。最后，也可以在中性脂類(=NL)，即甘油三酯中發(fā)現(xiàn)去飽和作用產(chǎn)物。編碼具有A4-去飽和酶活性的多肽的核酸序列優(yōu)選選自a)具有SEQIDNo.77、79、81、83、85、87、89、91或93中描述的序列，優(yōu)選具有SEQIDNo.77中描述的序列的核酸序列，b)核^列，其編碼SEQIDNo.78、80、82、84、86、88、卯、92或94中指出的氨基^列，優(yōu)選編碼SEQIDNo.78中指出的氨基絲列，c)核酸序列，其與上面a)或b)中指出的核酸序列，尤其是SEQIDNo.77中指出的核酸序列的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交，d)核酸序列，其與SEQIDNo.77中指出的序列有至少60。/。、65%、70%、75%或80%,優(yōu)選至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，特別優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%或95%并且尤其至少96%、97%、98%或99%的同一性，和e)核酸序列，其編碼氨基酸序列，該氨基酸序列具有SEQIDNo.95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107或108中指出的至少一種，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14種，優(yōu)選所有的氨基酸模式。有利地用于本發(fā)明方法中的A4-去飽和酶催化雙鍵引入脂肪酸二十二碳五烯酸中，導(dǎo)致二十二碳六烯酸的形成。除了編碼具有A6-去飽和酶活性、A6-延伸酶活性、A5-去飽和酶活性和A5-延伸酶活性的多肽的核,列，和適當(dāng)時(shí)引入的并編碼具有co-3-去飽和酶活性和/或A4-去飽和酶活性的多肽的核酸序列之外，本發(fā)明描述的方法額外地將編碼脂肪酸或脂類代謝酶的其它核酸引入植物中是有益的。原則上使用脂肪酸或脂類代謝的所有基因與本發(fā)明方法中使用的核酸序列的組合是可能的；優(yōu)選使用選自?；o酶A脫氫酶、?；?ACP(酰基載體蛋白)去飽和酶、?；?ACP硫酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、?；o酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸炔屬酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶的脂肪酸或脂類代謝的基因與A-6-延伸酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶和A-5-延伸酶，并且適當(dāng)時(shí)與oj-3-去飽和酶和/或A-4-去飽和酶組合，使用單個(gè)基因或多種基因的組合是可能的。本發(fā)明方法中使用的核酸在營養(yǎng)組織(體細(xì)胞組織)中有利地表達(dá)。營養(yǎng)組織在本發(fā)明上下文中指通過有絲分裂繁殖的組織。該類型的組織也通過無性生殖(無融合生殖)和繁殖產(chǎn)生。繁殖是當(dāng)個(gè)體數(shù)目以連續(xù)世代增長時(shí)使用的術(shù)語。通過無性繁殖產(chǎn)生的這些個(gè)體與它們的親本基本上相同。此類組織的實(shí)例是葉、花、根、莖、地面上或下的纖旬枝(側(cè)枝、匍匐莖)、根莖、芽、塊莖如塊根或塊莖、鱗莖、繁殖體、繁殖芽、鱗莖或具鱗根出條。此類組織也可以通過假胎萌、真胎萌或由人類引起的胎萌產(chǎn)生。然而，通過無配子種子生殖產(chǎn)生的種子(如典型的紫菀科(Asteraceae)、禾本科(Poaceae)或薔薇科(Rosaceae))也包括在有利地發(fā)生表達(dá)的營養(yǎng)組織中。本發(fā)明方法中使用的核酸在生殖組織(種系組織)中很小程度地表達(dá)或根本不表達(dá)。此類組織的實(shí)例是通過有性生殖，即減數(shù)細(xì)胞分裂產(chǎn)生的組織，例如通過有性過程產(chǎn)生的種子。很小程度指，與營養(yǎng)組織相比，RNA和/或蛋白質(zhì)水平上測定的表達(dá)低于5%,有利地低于3%,特別有利地低于2%，最優(yōu)選地低于l、0.5、0.25或0.125%。核酸序列特別優(yōu)選地在轉(zhuǎn)基因植物的葉中表達(dá)。這具有根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的LCPUFAs可以被動(dòng)物或人直接通過消化葉來吸收，并且不需要植物材料的前期加工的優(yōu)勢。實(shí)現(xiàn)。"組成型啟動(dòng)子"是使得可能在植物發(fā)育的基本階段，優(yōu)選整個(gè)植物發(fā)育過程中在多種組織，優(yōu)選所有組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選使用來自植物或來自植物病毒的啟動(dòng)子。CaMV(花椰菜花葉病毒)35S轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子(Franck等人(1980)Cell21:285-294)、19SCaMV啟動(dòng)子(US5,352,605)、來自稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等人(1990)PlantCell2:163-171)、豆球蛋白B啟動(dòng)子(GenBankAcc，No.X03677)、農(nóng)桿菌胭脂堿合酶啟動(dòng)子、TR二元啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌章魚堿合酶啟動(dòng)子、泛蛋白啟動(dòng)子(Holtorf等人(1995)PlantMol.Biol.29:637-649)、Smas啟動(dòng)子、肉桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(US5,683,439)、液泡ATP酶亞基的啟動(dòng)子、pEMU啟動(dòng)子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)、MAS啟動(dòng)子(Vdten等人(1984)EMBOJ.3(12):2723-2730)、來自玉米的組蛋白H3啟動(dòng)子(Lepetit等人(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285)、來自擬南芥的腈水解酶l基因啟動(dòng)子(GenBankAcc.No.U38846,核苷酸3862-5325)和來自小麥的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子(WO91/13991)，及介導(dǎo)組成型基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。特別優(yōu)選CaMV35S轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子。成型啟動(dòng)子用于新方法是可能的。然而，額外或單獨(dú)使用合成的啟動(dòng)子也是可能的。"葉特異性啟動(dòng)子"是在葉中顯示高活性并在其它組織中沒有活性或僅有低活性的啟動(dòng)子。"低活性"在本發(fā)明上下文中指在其它組織中活性低于在葉中活性的20%，優(yōu)選低于IO%，特別優(yōu)選低于5%且最優(yōu)選j氐于3、2或1%。合適的葉特異性啟動(dòng)子的實(shí)例是核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亞基的啟動(dòng)子(Timko等人(1985)Nature318:579-582)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子(Simpson等人(1985)EMBOJ.4:2723-2729)。技術(shù)人員知道其它的葉特異性啟動(dòng)子，或者他可以用已知的方法分離其它合適的啟動(dòng)子。因此，在分子生物學(xué)常規(guī)方法，例如雜交實(shí)驗(yàn)或DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合研究的幫助下，技術(shù)人員能夠鑒定葉特異性調(diào)節(jié)核酸元件。這需要例如第一步從想要的生物(將從所述生物中分離調(diào)節(jié)序列)的葉組織中分離總的多聚(厶)+RNA，并建立cDNA文庫。第二步，使用來自非葉組織的基于多聚(A廣RNA分子的cDNA克隆，通過雜交來鑒定來自第一個(gè)文庫的那些克隆，所述克隆對應(yīng)的多聚(A戶RNA分子只在葉組織中積累。隨后，以該方式鑒定的這些cDNA用于分離具有葉特異性調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)子。技術(shù)人員此外可使用分離合適的葉特異性啟動(dòng)子的其它基于PCR的方法。當(dāng)然，通過使用在胚和/或胚乳中有活性的種子特異性啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因植物的種子中表達(dá)本發(fā)明的核列也是可能的。原則上種子特異性啟動(dòng)子可以從雙子葉和單子葉植物中分離。優(yōu)選的啟動(dòng)子在下文中列出USP(未知種子蛋白)和豌豆球蛋白(豌豆((Viciafaba)(Baumleinetal.(1991)Mol.GenGenet.225(3):459-467)、油菜籽蛋白(油菜)[US5,608,152、conlinin(亞麻子)[WO02/102970]、?；d體蛋白(油菜)(US5，315，001和WO92/18634)、油質(zhì)蛋白(擬南芥)[WO98/45461和WO93/20216、菜豆蛋白(菜豆)[US5,504,200、Bce4[WO91/13980、豆球蛋白B4(LegB4啟動(dòng)子)[Ba腿lein等，Plant丄，2，2，1992,Lpt2和lptl(大麥)[WO95/15389和W095/23230]、來自稻、玉米和小麥的種子特異性啟動(dòng)子[WO99/168901、Amy32b、Amy6-6和aleurain[US5，677，474j、Bce4(油菜)[US5,530,1491、大豆球蛋白(大豆)[EP571741、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870、ADR12-2(大豆)[WO98/08962、異檸檬酸裂合酶(油茱)[US5，689，040或a淀粉酶(大麥)EP781849。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的核酸序列，尤其是編碼A5-延伸酶并通過適合于一種或更多植物種中的密碼子選擇與其序列來源的生物中的核酸序列比較受到修飾的核酸序列，優(yōu)選在SEQIDNO:64中描述的核酸序列在生殖組織，尤其在種子中表達(dá)。種子中的特異性表達(dá)通過使用一種上面提及的種子特異性啟動(dòng)子，尤其是使用油菜籽蛋白啟動(dòng)子有利地進(jìn)行。在該特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的LCPUFAs的含量，尤其是C22脂肪酸的含量在種子油中以重量計(jì)占種子油含量的至少5。/。，有利地以重量計(jì)占至少6、7、8、9或10%，優(yōu)選以重量計(jì)至少ll、12、13、14或15%，特別優(yōu)選地以重量計(jì)至少16、17、18、19或20%，十分特別優(yōu)選地以重量計(jì)至少25、30、35或40%。在有SEQIDNO:63中描述的核酸序列的進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子油中C22脂肪酸的含量以重量計(jì)占種子油含量的至少8%。在本發(fā)明進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的核酸序列，尤其是編碼A5-延伸酶并通過適應(yīng)一種或更多植物種中的密碼子選擇與其序列來源的生物中的核酸序列比較受到修飾的核酸序列，優(yōu)選在SEQIDNO:64中描述的核酸序列在生殖組織，尤其在種子中表達(dá)。種子中特異性表達(dá)通過使用一種上面提及的種子特異性啟動(dòng)子，尤其是使用油菜籽蛋白啟動(dòng)子有利地進(jìn)行。在該特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子油中的二十二碳六烯酸的含量以重量計(jì)占種子油含量的至少1%，優(yōu)選以重量計(jì)至少l.l、1.2、1.3、1.4或1.5%,特別優(yōu)選以重量計(jì)至少1.6、1.7、1.8或1.9%,尤其以重量計(jì)至少2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9%，進(jìn)一步優(yōu)選以重量計(jì)至少3、3.5或4%。在有SEQIDNO:63描述的核酸序列的進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子油中二十二碳六烯酸含量以重量計(jì)占種子油含量的至少1.9%。在這方面技術(shù)人員已知的是為了產(chǎn)生二十二碳六烯酸，需要額外一種或更多核酸序列，其編碼具有A4-去飽和酶活性的多肽。編碼具有A4-去飽和酶活性的多肽的核酸序列有利地選自具有SEQIDNo,77、79、81、83、85、87、89、91或93中描述的序列，優(yōu)選具有SEQIDNo.77中描述的序列的核^列。在本發(fā)明進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的核酸序列，尤其是編碼A5-延伸酶并通過適合于一種或更多植物種中的密碼子選擇，與其序列來源的生物中的核酸序列比較受到修飾的核酸序列，優(yōu)選在SEQIDNO:64中描述的核酸序列在生殖組織，尤其在種子中表達(dá)。在種子中的特異性表達(dá)通過使用一種上面提及的種子特異性啟動(dòng)子，尤其是使用油菜籽蛋白啟動(dòng)子有利地進(jìn)行。在該特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子油中的二十二碳六烯酸的含量以重量計(jì)是種子油含量的至少1%,優(yōu)選以重量計(jì)至少l.l、1.2、1.3、1.4或1.5%，特別優(yōu)選以重量計(jì)至少1.6、1.7、1.8或1.9%，尤其以重量計(jì)至少2、2.1、2.2、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9%，進(jìn)一步優(yōu)選以重量計(jì)至少3、3.5或4%。在該情況下，產(chǎn)生的LCPUFAs，尤其是C22脂肪酸的含量在種子油中以重量計(jì)是種子油含量的至少5%，以重量計(jì)有利地至少6、7、8、9或10%，以重量計(jì)優(yōu)選至少ll、12、13、14或15%，以重量計(jì)特別優(yōu)選地至少16、17、18、19或20%，以重量計(jì)十分特別優(yōu)選地至少25、30、35或40%。在具有SEQIDNO:63中描述的核酸序列的進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子油中二十二碳六烯酸的含量以重量計(jì)是種子油含量的至少1.9%，種子油中C22脂肪酸的含量以重量計(jì)是種子油含量的至少8。/。。植物基因表達(dá)也可以通過化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)(見Gatz(1997)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Bio1.，48:89-108中的綜述)。當(dāng)期望基因表達(dá)以時(shí)間特異的方式發(fā)生的時(shí)候，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特別合適。此類啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等人(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。響應(yīng)生物或非生物脅迫條件的啟動(dòng)子也是合適的，例如，病原體誘導(dǎo)的PRP1基因啟動(dòng)子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、熱誘導(dǎo)型番茄hsp80啟動(dòng)子(US5,187,267)、冷誘導(dǎo)型馬鈴薯a-淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(EP-A-0375091)。也特別合適的其它啟動(dòng)子是那些引起質(zhì)粒特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，因?yàn)橘|(zhì)粒構(gòu)成了區(qū)室，在其中合成脂類生物合成的前體和一些終產(chǎn)物。合適的啟動(dòng)子，如病毒RNA聚合酶啟動(dòng)子在WO95/16783和WO97/06250中有所描述，并且擬南芥clpP啟動(dòng)子在WO99/46394中有描述。將理解根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸不僅可以在完整轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生，也可以在植物細(xì)胞培養(yǎng)物或在愈傷組織培養(yǎng)物(callouscultures)中產(chǎn)生。在本方法中產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸有利地結(jié)合在磷脂和/或三酰甘油酯中，但是在生物中也可以作為游離脂肪酸出現(xiàn)或還可以結(jié)合成其它脂肪酸酯的形式。它們在該方面可以作為"純產(chǎn)物，，存在，或還可以有利地以多種脂肪酸混合物的形式或不同磷脂如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰絲氨酸和/或三酰甘油酯、單?；视王ズ?或二?；视王サ幕旌衔锏男问酱嬖?。本方法中產(chǎn)生的LCPUFAs、EPA、DPA和DHA有利地存在于磷脂酰膽堿和/或磷脂酰乙醇胺和/或三酰甘油酯中。三酰甘油酯此外也可以包含其它脂肪酸，如具有4到6個(gè)C原子的短鏈脂肪酸、具有8到12個(gè)C原子的中鏈脂肪酸或具有14到24個(gè)C原子的長鏈脂肪酸。它們優(yōu)選包含長鏈脂肪酸，特別優(yōu)選C2Q或Qt2脂肪酸。術(shù)語"甘油酯"可以理解為指用一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)羧基基團(tuán)酯化的甘油(甘油單、二或三酯)。"甘油酯"也可以理解為指多種甘油酯的混合物。甘油酯優(yōu)選為甘油三酯。甘油酯或甘油酯混合物可以包含其它添加物，例如游離脂肪酸、抗氧化劑、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和/或其它物質(zhì)。對于根據(jù)本發(fā)明方法的目的，"甘油酯"因此理解為指來自甘油的衍生物。除了上面描述的脂肪酸甘油酯，還包括甘油磷脂和甘油糖脂。此處可以提及的優(yōu)選實(shí)例是甘油磷脂，如卵磷脂(磷脂酰膽堿)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸和烷基?；视土字?。對于本發(fā)明目的，磷脂將理解為指磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇。具有多不飽和dr、c2。-和/或<:22-脂肪酸分子的脂肪酸酯可以以油或脂類的形式分離，例如以化合物，如鞘脂、磷酸甘油酯、脂類、糖脂如糖鞘脂、磷脂如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、單?；视王?、二?；视王?、三酰甘油酯或其它脂肪酸酯如乙酰輔酶A酯(其包含具有至少兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)，優(yōu)選四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸)的形式分離從用于制備脂肪酸酯的植物分離；有利地是，它們以它們的二酰基甘油酯、三酰甘油酯的形式和/或以磷脂酰酯的形式，尤其優(yōu)選地以三酰甘油酯、磷脂酰膽堿和/或磷脂酰乙醇胺的形式分離。除了這些酯，多不飽和脂肪酸也作為游離脂肪酸或結(jié)合在其它化合物中的形式存在于植物中。通常，多種上述化合物(脂肪酸酯和游離脂肪酸)存在于生物中，其大概分布為以甘油三酯重量計(jì)為80到90%，以甘油二酯重量計(jì)為2到5%，以甘油一酯重量計(jì)為5到10%，以游離脂肪酸重量計(jì)為1到5%,以磷脂重量計(jì)為2到8%，總的多種化合物以重量計(jì)總計(jì)100%。在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的LCPUFAs的含量基于轉(zhuǎn)基因植物中總的脂肪酸以重量計(jì)至少4%,以重量計(jì)有利地至少5、6、7、8、9或10%，以重量計(jì)優(yōu)選至少11、12、13、14或15%，以重量計(jì)特別優(yōu)選至少16、17、18、19或20%,以重量計(jì)十分特別優(yōu)選至少25、30、35或40%。本發(fā)明的方法中產(chǎn)生的脂肪酸EPA、DPA和/或DHA基于轉(zhuǎn)基因植物中總的脂肪酸的含量在每一種情況下以重量計(jì)至少5%，每一種情況下以重量計(jì)優(yōu)選至少6、7、8或9%，每一種情況下以重量計(jì)特別優(yōu)選至少10、11或12%,每一種情況下以重量計(jì)最優(yōu)選至少13、14、15、16、17、18、19或20%。脂肪酸有利地以結(jié)合形式產(chǎn)生。在本發(fā)明方法所用核酸的幫助下，將這些不飽和脂肪酸置于有利產(chǎn)生的三酰甘油酯的snl、sn2和/或sn3位置上是可能的。有利地是，至少11%的三酰甘油酯是被雙取代的(指在snl和sn2或sn2和sn3位置上)。三取代的三酰甘油酯也是能檢測到的。因?yàn)榇罅康姆磻?yīng)步驟是從初始化合物亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)發(fā)生的，所述方法的終產(chǎn)物例如，花生四烯酸(ARA)或二十碳五烯酸(EPA)不以完全純的產(chǎn)物產(chǎn)生；痕量或較大量的前體也總是存在于終產(chǎn)物中。例如，如果亞油酸和亞麻酸都存在于初始植物中，終產(chǎn)物如ARA或EPA和/或DPA和/或DHA也作為混合物存在。前體基于各自終產(chǎn)物的量，以重量計(jì)應(yīng)有利地總計(jì)不高于20%，以重量計(jì)優(yōu)選不高于15%，以重量計(jì)特別優(yōu)選不如10%，以重量計(jì)十分特別優(yōu)選不高于5%。有利地是，只有ARA或EPA和/或DPA和/或DHA以結(jié)合的或游離酸的形式在本發(fā)明方法中產(chǎn)生，作為轉(zhuǎn)基因植物中的終產(chǎn)物。通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物在每種情況下基于100%并基于生物的總脂肪酸含量，有利地包含6到15%的棕櫚酸，l到6%的硬脂酸，7-85%的油酸，0.5到8%的11-十八碳烯酸，0.1到1%的花生酸，7到25%的飽和脂肪酸，8到85%的單不飽和脂肪酸和60到85%的多不飽和脂肪酸?？傊舅岷恐袃?yōu)選至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1%的花生四烯酸作為有益的多不飽和脂肪酸存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合物中。通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物進(jìn)一步有利地包含脂肪酸，所述脂肪酸選自脂肪酸芥酸(13-二十二碳烯酸)、蘋婆酸(9，10-亞甲基十八碳-9-烯酸)、錦葵酸(8，9-亞甲基十七碳-8-烯酸)、大風(fēng)子油酸(環(huán)戊蟑十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-環(huán)氧十八碳-9,ll-二烯酸)、斑鳩菊酸(9，10-環(huán)氧十八碳-12-烯酸)、果脂酸(6-十八碳炔酸)、6-十九碳炔酸、santalbicacid(反ll-十八碳烯-9-炔酸)、6，9-十八碳烯炔酸、pyrulicacid(反10-十七締-8-炔酸)、cr印enyninicacid(9-十八烯-12-炔酸)、13，14-二氬oropheicacid、十八碳-13-烯-9，ll-二炔酸、傘形花子油酸(順-6-十八烯酸)、9順，12反-十八碳二烯酸、金盞花素酸(calendulicacid)(8反10反12順-十八碳三烯酸)、梓戒酸(catalpicacid)(9反11反13順-十八碳三烯酸)、桐酸(9順11反13反-十八碳三烯酸)、jacaricacid(8順10反12順-十八碳三蹄酸)、石榴酸(9順11反13順-十八碳三烯酸)、麥餅樹酸(9順11反13反15順-十八碳四烯酸)、皮諾斂酸(pinolenicacid)(全-順-5，9，12-十八碳三烯酸)、laballenicacid(5，6-十八碳二烯丙二烯酸)、蓖麻油酸(12-羥油酸)和/或革蓋菌素酸(coriolicacid)(13-羥-9順，11反-十八碳二烯酸)的脂肪酸。通常，上述脂肪酸只以痕量有利存在于通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物中，意思是基于總脂肪酸含量，它們的出現(xiàn)低于30%，優(yōu)選低于25%、24°/。、23%、22%或21%，特別優(yōu)選低于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%，十分特別優(yōu)選低于4%、3%、2%或1%。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的形式中，基于總脂肪酸含量，這些上述脂肪酸的出現(xiàn)低于0.9%、0.8%、0.7%、0.6%或0.5%,特別優(yōu)選低于0.4%、0.3%、0.2%、0.1%?；诳傊舅?，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含低于0.1%和/或沒有丁酸、膽固醇和尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6"，8，12，15，18，21)。通過本發(fā)明方法中所用的核*列實(shí)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中LCPUFAs產(chǎn)量增加至少50%，有利地至少80%，特別有利地至少100%，十分特別有利地至少150%是可能的。也可以通過上面描述的方法合成化學(xué)純的多不飽和脂肪酸或脂肪酸組合物。為此，以已知方式例如通過萃取、蒸餾、結(jié)晶、色譜或這些方法的組合來分離脂肪酸或脂肪酸組合物。這些化學(xué)純的脂肪酸或脂肪酸組合物對于食品工業(yè)部門、化妝品部門和尤其是藥理學(xué)工業(yè)部門中的應(yīng)用是有益的。原則上，所有雙子葉或單子葉的有用植物對本發(fā)明方法是合適的。有用植物指可為人和動(dòng)物產(chǎn)生食物，產(chǎn)生其它消耗品、纖維和藥物的植物，如谷類，例如玉米、水稻、小麥、大麥、小米、燕麥、黑麥、蕎麥；如塊莖，例如馬鈴薯、木薯、甘薯、薯蕷等等；如含糖植物，例如甘蔗或甜菜;如豆類，例如菜豆、豌豆、蠶豆等等；如油脂作物，例如大豆、油菜、向曰葵、紅花、亞麻、camolina等等。有利的植物選自如下的植物科槭樹科(Aceraceae)、稱猴桃科(Actinidiaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、傘形科(Apiaceae)、檳榔科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、、樺木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、鳳梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、美人蕉、科(Cannaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫,科(Cucurbitaceae)、薯蕷科(Dioscoreaceae)、胡頹子科(Elaeagnaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)、大戟科(E叩horbiaceae)、豆科(Fabaceae)、山毛櫸科(Fagaceae)、醋栗科(Grossulariaceae)、胡杉匕科(Juglandaceae)、掉科(Lauraceae)、百合科(Liliaceae)、亞麻科(Linaceae)、錦葵科(Malvaceae)、?？?Moraceae)、芭蕉科(Musaceae)、木犀科(Oleaceae)、酢漿草科(Oxalidaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、禾本科(Poaceae)、蓼科(Polygonaceae)、石榴科(Punicaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、蕓香科(Rutaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、癡科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)和敗醬科(Valerianaceae)。可以提及的實(shí)例是下面的植物，其選自漆樹科如黃連木屬(Pistacia)、芒果屬(Mangifera)、腰果屬(Anacardium)例如阿月混子(Pistaciavera(阿月混子實(shí)))、芒果(Mangiferindica(芒果))或腰果(Anacardiumoccidentale(腰果))的屬和種、菊科如金盞花屬(Calendula)、紅藍(lán)花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Centaurea)、菊苣屬(Cichorium)、菜薊屬(Cynara)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、Locusta、萬壽菊屬、纈草屬(Valeriana)例如金盞花(Calendulaofficinalis(普通金盞花))、紅花(Carthamustinctorius(紅花))、矢車菊(Centaureacyanus(矢車菊))、菊苣(Cichoriumintybus(菊苣))、洋薊(Cynarascolymus(朝鮮薊))、向日葵(Helianthusannus(向曰葵))、萵苣(Lactucasativa)、鈹葉萵苣(Lactucacrispa)、芋(Lactucaesculenta)、毒萵苣的某些種(LactucascariolaL.ssp.Sativa)、LactusscariolaL.var.integrata、LactucascariolaL.var.integrifolia、萵苣romana亞種(Lactucasativasubsp.Romana)、Locustacommunis、萵苣纈草(Valerianalocusta(沙拉蔬菜))、香葉萬壽菊(TagetesIucida)、萬壽菊(Tageteserecta)或細(xì)葉萬壽菊(Tagetestenuifolia)(法國金盞花)的屬和種、傘形科如胡蘿卜屬(Daucus)例如胡蘿卜(Daucuscarota(胡蘿卜))的屬和種、樺木科如榛屬(Corylus)例如歐洲榛(Corylusavellana)或榛子(Coryluscolurna(榛子))的屬和種、紫草科如Borago，例如，如下的屬和種Boragoofficinalis(琉璃苣)，十字花科如蕓苔屬(Brassica)、亞麻齊屬(Camelina)、Melanosinapis、白芥屬(Sinapis)、擬南芥屬(Arabadopsis)例:ft口歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪青屬某些種(Brassicarapassp.(油菜))、野生歐白芥(Sinapisarvensis)、芥菜(Brassicajuncea)、Brassicajunceavar.juncea、鈹葉芥菜(Brassicajunceavar.crispifolia)、大葉芥菜(Brassicajunceavar.foliosa)、黑齊(Brassicanigra)、Brassicasinapioides、亞麻齊(Camelinasativa)、芥菜(Melanosinapiscommunis(芥菜))、甘藍(lán)(Brassicaoleracea(飼用甜菜))或擬南芥(Arabidopsisthaliana)的屬和種、鳳梨科如鳳梨屬(Anana)、Bromelia(菠蘿)例如菠蘿(Ananacomosus)、Aimimsananas或Bromdiacomosa(菠蘿)的屬和種、番木瓜科如番木瓜屬(Carica)例如番木瓜(Caricapapaya(番木瓜))的屬和種、大麻科如大麻屬(Cannabis)例如大麻(Cannabissativa(大麻))的屬和種、旋花科i口番薯屬(Ipomea)、^走花屬(Convolvulus)例ft口甘薯(Ipomoeabatatus)、提琴葉牽?；?Ipomoeapandurata)、Convolvulusbatatas、Convolvulustiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoeatiliacea、三裂葉薯(Ipomoeatriloba)或Convolvuluspanduratus(甜薯、番薯)的屬和種、藜科如甜菜屬(Betavulgaris)例如甜菜(Betavulgaris)、Betavulgarisvar*altissima、甜菜普通變種(Betavulgarisvar.vulgaris)、Betamaritima、甜菜宿根變種Betavulgarisvar.perennis、Betavulgarisvar.Conditiva或Betavulgarisvar.esculenta(甜菜)的屬和種、葫蘆科如南瓜屬(Cucurbita)例如畀瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南瓜(Cucurbitamixta)、西葫蘆(Cucurbitapepo)或南瓜(Cucurbitamoschata(西葫蘆))的屬和種、胡頹子科如胡頹子屬(Elaeagnus)例如油橄欖(Oleaeuropaea(橄欖))的屬和種、杜鵑花科如山月桂屬(Kalmia)例如闊葉山月桂(Kalmialatifolia)、狹葉山月才圭(Kalmiaangustifolia)、小葉山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼澤山月才圭(Kalmiapolifolia)、西洋山月才圭(Kalmiaoccidentalis)、Cistuschamaerhodendros或山月桂(Kahnialucida(山月才圭))的屬和種、大戟科3口木薯屬(Manihot)、Janipha、麻風(fēng)樹屬(Jatropha)、蓖麻屬(Ricinus)例如木薯(Manihotutilissima)、Janiphamanihot、Jatrophamanihot、Manihotaipil、甜木薯(Manihotdulcis)、Manihotmanihot、Manihotmelanobasis、木薯(Manihotesculenta(木薯))或荒麻(Ricimiscommunis(蓖麻))的屬和種、豆科如豌豆屬(Pisum)、合歡屬(Albizia)、Cathormion、Feuillea、Inga、Pithecolobium、金合歡屬(Acacia)、含羞草屬(Mimosa)、Medicajo、大豆屬(Glycine)、扁豆屬(Dolichos)、菜豆屬Phaseolus、大豆屬(Soybean)例如豌豆(Pisumsativum)、飼料豌豆(Pisumarvense)、Pisumhumile(豌豆)、Albiziaberteriana、合歡(Albiziajulibrissin)、闊莢合歡(Albizialebbeck)、Acaciaberteriana、Acacialittoralis、Albiziaberteriana、Albizziaberteriana、Cathormionberteriana、Feuilleaberteriana、Ingafragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobiumberterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acaciajulibrissin、Acacianemu、Albizianemu、Feuilleeajulibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosaspedosa、Sericanrdajulibrissin、闊莢金合3欠(Acacialebbeck)、Acaciamacrophylla、大葉合歡(Albizialebbeck)、Feuilleealebbeck、大葉含羞草(Mimosalebbeck)、Mimosaspeciosa(金合歡)、紫苜精(Medicagosativa)、野苜蓿(Medicagofalcata)、雜交苜蓿(Medicagovaria)(紫花苜蓿)、大豆(Glycinemax)、鐮扁豆(Dolichossoja)、寬葉蔓豆(Glycinegracilis),大豆(Glycinehispida)、大菜豆(Phaseolusmax)、Sojahispida或Sojamax(大豆)的屬和種、櫳牛兒苗科(Geraniaceae)如天竺葵屬(Pelargonium)、椰子屬(Cocos)、Oleum例如椰子(Cocosnucifera)、茶麋子天竺葵(Pelargoniumgrossularioides)或椰子油(Oleumcocois(4耶子))的屬和種、禾本科如甘蔗屬(Saccharum)例如甘蔗(Saccharumofficinarum)的屬和種、胡桃科如胡桃屬(Juglans)、Wallia例如胡桃(Juglansregia)、Juglansailanthifolia、山核(Juglanssieboldiana)、灰核杉匕(Juglanscinerea)、Walliacinerea、Juglansbixbyi、力口州黑、核*匕(Juglanscalifornica)、印度黑核桃(Juglanshindsii)、Juglansintermedia,Juglansjamaicensis、大氺亥*匕(Juglansmajor)、Juglansmicrocarpa、黑核書^(Juglansnigra)或胡桃(Wallianigra)(胡桃)的屬和種、樟科如lf梨屬(Persea)、月才圭屬(Laurus)例i口月才圭(Laurusnobilis(bay))、垮梨(Perseaamericana)、鱘梨油(Perseagratissima)或Perseapersea(avocado)的屬和種、豆科如落花生屬(Arachis)例如落花生(Arachishypogaea(花生))的屬和種、亞麻牙牛如亞麻屬(Linum)、AdenoUnum屬例如亞麻(Lmumusitatissimum)、Linumhumile、奧地利亞麻(Linumaustriacum)、Linumbienne、窄葉亞麻(Linumangustifolium)、瀉亞麻(Linumcatharticum)、金黃亞麻(Linumflavum)、大花亞麻(Linumgrandiflorum)、Adenolin腿grandiflorum、劉易斯亞麻(Linumlewisii)、那旁亞麻(Linumnarbonense)、宿才艮亞麻(Linumperenne)、宿根亞麻劉易斯變種(Linumperennevar.lewisii)、Linumpratense或亞麻子(Linumtrigynum(亞麻子))的屬和種、Lythrarieae吵口石才留屬(Punica)例i口石榴(Punicagranatum(pomegranate))的屬和種、錦葵科(Malvaceae)如棉屬(Gossypium)例如陸地棉(Gossypiumhirsutum)、樹棉(Gossypiumarboreum)、海島棉(Gossypiumbarbadense)、草沖帛(Gossypiumherbaceum)或瑟伯沖帛(Gossypiumthurberi(棉))的屬和種、芭蕉科(Musaceae)如芭蕉屬(Musa)例如香蕉(Musanana)、小果野蕉(Musaacuminata)、大蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉屬的某些種(Musaspp.(banana))的屬和種、柳葉菜科(Onagraceae)如Camissonia屬、月見草屬(Oenothera)例如月見草(Oenotherabieimis)或夜來香(Camissoniabrevipes(月見草))的屬和種、棕櫚科(Palmae)如油棕屬(Elaeis)，例如以下的屬和種油棕(Elaeisguineensis(油棕櫚))、罌栗科(Papaveraceae)如罌粟屬(Papaver)，例如以下的屬和種東方罌粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、長莢罌栗(Papaverdubium(罌粟))、胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻屬(Sesamum)例如胡麻(Sesamumindicum(sesame))的屬和種、胡#1科(Piperaceae)如胡椒屬(Piper)、Artanthe、草胡椒屬(Peperomia)、Steffensia例如樹胡椒(Piperaduneum)、Piperamalago、狹葉胡椒(Piperangustifolium)、大胡椒(Piperauritum)、萎葉(Piperbetel)、蓽澄癡(Pipercubeba)、蓽獲(Piperlongum)、胡椒(Pipernigrum)、假蓽拔(Piperretrofractum)、Artantheadunca、Artantheelongata、長胡椒(Peperomiaelongata)、Piperelongatum、Steffensiaelongata(cayennepepper)的屬和種、禾本科(Poaceae)如大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、燕麥屬(Avena)、高梁屬(Sorghum)、須芒草屬(Andropogon)、絨毛草屬(Holcus)、黍?qū)?Panicum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea(maize))、小麥屬(Triticum)例如大麥(Hordeumvulgare)、芒穎大麥草(Hordeumjubatum)、鼠大麥草(Hordeummurinum)、短芒大麥草(Hordeumsecalinum)、栽培二棱大麥(Hordeumdistichon)、Hordeumaegiceras、六歹U大麥(Hordeumhexastichon)、六棱大麥(Hordeumhexastich腿)、不規(guī)貝'J大麥(Hordeumirregulare)、大麥(Hordeumsativum)、#豆芒大麥草(Hordeumsecalinum)(大麥)、黑麥(Secalecereale(黑麥))、燕麥(Avenasativa)、野燕麥(Avenafatua)、地中海紅燕麥(Avenabyzantina)、Avenafatuavar.sativa、雜種燕麥(Avenahybrida(燕麥))、二色高梁(Sorghumbicolor)、石茅高梁(Sorghumhalepense)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、高梁(Sorghumvulgare)、Andropogondrummondii、二色絨毛草(HoIcusbicolor)、Holcussorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghumarundinaceum、Sorgh腿caffromm、垂穗高梁草(Sorghumcernuum)、工藝高梁(Sorghumdochna)、Sorghumdrummondii、硬高粱草(Sorghumdurra)、Sorghumguineense、Sorghumlanceolatum、多脈高粱草(Sorghumnervosum)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、Sorghumsubglabrescens、垂葉高梁草(Sorghumverticilliflorum)、高梁(Sorghumvulgare)、石茅高梁(Holcushalepensis)、Sorghummiliaceum、黍粟(Panicummilitaceum(millet))、稻(Oryzasativa)、Oryzalatifolia(稻)、玉米(Zeamays(maize))、小麥(Triticumaestiv腿)、硬粒小麥(Triticumdurum)、圓柱小麥(Triticumturgidum)、Triticumhybermim、馬卡小麥(Triticummacha)、普通小麥(Triticumsativum或Triticumvulgare)(小麥)、紫球藻科(Porphyridiaceae)如Chroothece屬、Flintiella屬、Petrovanella屬、紫球藻屬(Porphyridium)、Rhodella、Rhodosorus、Vanhoeffenia例3口紫5求藻(Porphyridiumcruentum)的屬和種、山龍目艮科(Proteaceae)如澳洲堅(jiān)果屬(Macadamia)例如全緣葉澳洲堅(jiān)果(Macadamiaintergrifolia(macadamia))的屬和種，萏草科(Rubiaceae)如咖啡屬(Coffea)例如咖啡屬(Coffea)某些種、小果咖啡(Coffeaarabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffealiberica(coffee))、玄參科(Scrophulariaceae)如毛蕊花屬(Verbascum)例如以下的屬和種毛瓣毛蕊花(Verbascumblattaria)、東方毛遂花(Verbascumchaixii)、密葉毛,露花(Verbascumdensiflorum)、Verbascumlagurus、長葉毛,露花(Verbascumlongifolium)、Verbascumlychnitis、Verbascumnigrum、奧林匹克毛蔬花(Verbascumolympicum)、Verbascumphlomoides、紫毛，露花(Verbascumphoenicum)、Verbascumpulverulentum或毛，統(tǒng)花(Verbascumthapsus(mullein))、癡科(Solanaceae)如辣椒屬(Capsicum)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、番茄屬(Lycopersicon)例如以下的屬和種辣椒(Capsicumaimuum)、Capsicumaimuumvar.glabriusculum、五色椒(Capsicumfrutescens(pepper))、紅椒(Capsicumannuum(paprika))、煙草(Nicotianatabacum)、花煙草(Nicotianaalata)、長頭煙草(Nicotianaattenuata)、光煙草(Nicotianaglauca)、Nicotianalangsdorffii、Nicotianaobtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、Nicotianarepanda、黃花煙草(Nicotianarustica)、Nicotianasylvestris(煙草)、馬鈴薯(Solanumtuberosum(番癡))、癡(Solanummelongena(eggplant))、番癡(Lycopersiconesculentum)、Lycopersiconlycopersicum、梨形番癡(Lycopersiconpyriforme)、紅癡(Solanumintegrifolium)或番茄(Solan腿lycopersicum)(番茄)、梧桐科(Sterculiaceae)力口可可樹屬(Theobroma)例i口可可樹(Theobromacacao(可可))的屬和種或山茶科(Theaceae)如山茶屬(Camellia)例如大葉茶(Camelliasinensis(茶))的屬和種。在該方面的有利的實(shí)施方案中，使用的有用的植物是包含大量脂類化合物的油料植物，如花生、油菜、卡諾拉油菜、向日葵、紅花(Carthamustinctoria)、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、芝麻、金盞花、石榴、月見草、毛蕊花、大薊、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲堅(jiān)果、歸梨、月桂、西葫蘆/南瓜、亞麻子、大豆、阿月混子、琉璃苣、樹(油棕櫚樹、椰子樹或胡桃樹)或作物例如玉米、小麥、黑麥、燕麥、小黑麥、稻、大麥、棉、木薯(cassava)、胡椒、萬壽菊、茄科植物例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄、蠶豆屬的種、豌豆、紫花苜?；蚬嗄局参?咖啡、可可、茶)、柳屬的種和多年生牧草及飼料作物。有利的植物根據(jù)本發(fā)明是油料植物如花生、油菜、蕓苜、向日葵、紅花、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、金盞花、石榴、月見草、西葫,/南瓜、亞麻子、大豆、琉璃苣、樹(油棕櫚樹、可可樹)。尤其優(yōu)選富含C18:2和/或C18:3脂肪酸的植物，如向日葵、紅花、煙草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫蘆/南瓜、罌栗、月見草、胡桃、亞麻子、大麻或大薊。非常尤其優(yōu)選紅花、向日葵、罌粟、月見草、胡桃、亞麻子或大麻。在飼料或食品植物中表達(dá)本發(fā)明的核酸序列并因此增加葉子中二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的含量也是有利的。優(yōu)選的飼料植物是，例如，三葉草種如紅三葉草(Trifoliumpratense)、白三葉草(Trifolium)、瑞士三葉草(Trifoliumhybridum)、驢食草(Onobrychisviccifolia)、埃及三葉草(Trifolhimalexandrinium)和波斯三葉草(Trifoliumresupinatum)。優(yōu)選的食用植物是例如萵苣種，如萵苣(Lactucasativa)、鈹葉萬苣(Lactucacrispa)、芋(Lactucaesculenta)、毒萵苣的某些種(LactucascariolaLssp.Sativa)、LactucascariolaLvar.integrata、LactucascariolaL.var.integrifolia、萵苣romana亞種、Locustacommunis和萵苣纈草(Valerianalocusta)。通過核酸序列的酶活性在本發(fā)明方法中產(chǎn)生多種多不飽和脂肪酸是可能的，所述核酸序列為本發(fā)明方法所用并編碼具有A-6-延伸酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶和/或A-5-延伸酶活性的多肽的核酸序列，有利地與編碼具有co-3-去飽和酶和/或A-4-去飽和酶活性的多肽的核酸序列，及編碼脂肪酸或脂類代謝的多肽(如具有A-5-、A-6-、A-8-、A-12-去飽和酶或A-5-、A-6-或A-9-延伸酶活性的其它多肽)的其它核酸序列組合。根據(jù)所選用于本發(fā)明方法的有用植物，多種多不飽和脂肪酸的混合物或單個(gè)多不飽和脂肪酸如EPA、DPA或DHA可以以游離或結(jié)合形式產(chǎn)生。根據(jù)初始植物中的優(yōu)勢脂肪酸組成(C18:2或C18:3脂肪酸)，得到的脂肪酸來自C18:2月旨肪酸，如GLA、DGLA或ARA或來自C18:3脂肪酸，如EPA、DPA或DHA。如果存在于植物中用于本方法的唯一不飽和脂肪酸是亞油酸(LA，C18:2A9，12)，那么所述方法的唯一可能產(chǎn)物是GLA、DGLA和ARA，其可以以游離脂肪酸或結(jié)合脂肪酸存在。如果本方法中使用的植物中存在的唯一不飽和脂肪酸是a-亞麻酸(ALA,C18:3A9，12，1S)(例如在亞麻中)，那么所述方法的唯一可能產(chǎn)物是SDA、ETA、EPA、DPA和/或DHA,其可以如上述以游離脂肪酸或結(jié)合脂肪酸存在。通過改變本方法中所用的并參與A-6-延伸酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶和/或A-6-延伸酶合成的酶的活性，有利地與脂類或脂肪酸代謝的其它基因的組合來以定向方式在植物中產(chǎn)生唯一個(gè)別產(chǎn)物是可能的。有利地是，只合成EPA、DPA或DHA或其混合物。因?yàn)橹舅嵩谏锖铣涉溨泻铣?，各自的終產(chǎn)物不作為純的物質(zhì)存在于生物中。少量的前體化合物總是也存在于終產(chǎn)物中。這些少量基于終產(chǎn)物EPA、DPA或DHA或其混合物，以重量計(jì)低于20%，以重量計(jì)有利地低于15%,以重量計(jì)特別有利地低于100/。，以重量計(jì)十分特別有利地低于5、4、3、2或1%。為了增加本發(fā)明方法中產(chǎn)生具有多不飽和脂肪酸(其含量有利地增加了)的油和/或甘油三酯的產(chǎn)量，增加用于合成脂肪酸的初始產(chǎn)物的量是有益的。這例如可以通過將編碼具有A12-去飽和酶的多肽的核酸引入生物中來實(shí)現(xiàn)。這在有用的植物中特別有益，如產(chǎn)油植物如十字花科(Brassicaceae)的植物，如蕓苔屬(Brassica),例如油菜；胡頹子科如胡頹子屬，例如油橄欖的屬和種或豆科如大豆屬，例如具有高的油酸的大豆的屬和種。因?yàn)檫@些生物具有僅有的低亞油酸含量(Mikoklajczak等人(1961)JournaloftheAmericanOilChemicalSociety38:678畫681)，使用所述A1L去飽和酶從油酸產(chǎn)生原料亞麻酸是有益的。此外從外界提供初始脂肪酸也是可能的，但是因?yàn)橘M(fèi)用的原因較不優(yōu)選該方法。蘚類和藻類是已知產(chǎn)生大量多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的唯一的植物系統(tǒng)。蘚類在膜脂中包含PUFAs，然而藻類，與藻類相關(guān)的生物和一些真菌在三?；视筒糠种幸卜e累大量的PUFAs。從也在三?；视筒糠种蟹e累PUFAs的菌林中分離的核酸分子因此對本發(fā)明方法特別有益，并因此對改變植物中的脂類和PUFA產(chǎn)生體系特別有益，所述植物如有用的植物如油料作物植物，例如油菜、卡諾拉油菜、亞麻、大麻、大豆、向日葵、琉璃苣。它們因此可以有利地用于本發(fā)明方法。本發(fā)明方法中所用的核酸有利地來自植物如藻類，例如草綠藻科的藻類i口異毛藻屬(Heteromastix)、Mammella、Mantoniella、孩i單藻屬(Micromonas)、腎藻屬、Ostreococcus、綠枝藻屬(Prasinocladus)、Prasinococcus、Pseudoscourfielda、Pycnococcus、塔胞藻屬(Pyramimonas)、Scherffelia、扁藻屬例如Heteromastixlongiflllis、Mamiellagilva、Mantoniellasquamata、Micromonaspusilla、綠腎藻(Nephroselmisolivacea)、Nephroselmispyriformis、圓形腎藻(Nephroselmisrotunda)、Ostreococcustauri、Ostreococcussp,、Prasinocladusascus、Prasinocladuslubricus、Pycnococcusprovasolii、Pyramimonasamylifera、Pyramimonasdisomata、Pyramimonasobovata、Pyramimonasorientalis、Pyramimonasparkeae、Pyramimonasspinifera、Pyramimonassp.、Tetraselmisapiculata、Tetraselmiscarteriaformis、周氏扁藻(Tetraselmischui)、鈹葉扁藻(Tetraselmisconvolutae)、Tetraselmisdesikacharyi、纖細(xì)扁藻(Tetraselmisgracilis)、Tetraselmishazeni、Tetraselmisimpellucida、Tetraselmisinconspicua、Tetraselmislevis、有斑扁藻(Tetraselmismaculata)、Tetraselmismarina、Tetraselmisstriata、Tetraselmissubcordiformis、Tetraselmissuecica、Tetraselmistetrabrachia、Tetraselmistetrathele、Tetraselmisverrucosa、Tetraselmisverrucosafo.Rubens或Tetraselmissp.的屬和種或選自棵藻科的藻類如嚢胞藻屬(Ascogkna)、變胞藻屬(Astasia)、膠柄藻屬、Cyclidiopsis、棵藻屬、擬棵藻屬(Euglenopsis)、Hyalophacus、克氏藻屬(Khawkinea)、鱗孔藻屬、扁棵藻屬、陀螺藻屬(Strombomonas)或囊棵藻屬例如梭形棵藻(Euglenaacus)、膝曲棵藻(Euglenageniculata)、細(xì)小棵藻、Euglenamixocylindracea、味狀棵藻(Euglenarostrifera)、綠色棵藻(Euglenaviridis)、Colaciumstentorium、圓柱嚢棵藻(Trachelomonascylindrica)或旋轉(zhuǎn)嚢棵藻(Trachelomonasvolvocina)的屬和種。其他有利的植物是藻類如等鞭金藻屬(Isochrysis)或隱曱藻屬、藻類/硅藻如海鏈藻屬或褐指藻屬、蘚類如劍葉蘚屬或角齒蘚屬、或者高等植物如報(bào)春花科(Primulaceae)例如AIeuritia、Calendulastdlata、刺狀骨籽菊(Osteospermumspinescens)或Osteospermumhyoseroides、微生物如真菌例如曲霉屬(Aspergillus)、破嚢壺菌屬、疫霉屬、蟲霉屬、毛霉屬或被孢霉屬，細(xì)菌如希瓦氏菌，酵母或動(dòng)物如線蟲例如隱桿線蟲、昆蟲、蛙、海參或魚。本發(fā)明經(jīng)分離的核酸序列有利地源自脊推動(dòng)物目的動(dòng)物。所述核酸序列優(yōu)選地源自下面的綱脊推動(dòng)物綱；Euteleostomi,輻鰭魚綱(Actinopterygii);新鰭魚亞綱(Neopterygii);硬骨魚類(Teleostei);Euteleostei、原鰭魚總目(Protacanthopterygii)、鮭形目(Salmoniformes);鮭科(Salmonidae)或大馬p合魚屬(Oncorhynchus)或脊推動(dòng)物(Vertebrata)、兩棲綱(Amphibia)、無尾兩棲目(Anura)、負(fù)子蟾科(Pipidae)、非洲爪蟾屬或無脊推動(dòng)物(Evertebrata)例如原索動(dòng)物門(Protochordata)、被嚢亞門(Tunicata)、海參纟岡(Holothuroidea)、海l^科(Cionidae)侈寸3口Amarouciumconstellatum、Botryllusschlosseri、玻璃海革肖、Molgulacitrina、Molgulamanhattensis、Perophoraviridis或Styelapartita。戶斤述核酸尤其有禾'J地源自真菌、動(dòng)物、或源自植物如藻類或蘚類，優(yōu)選地源自鮭形目如鮭科，如鮭屬，例如來自虹鱒、Truttatrutta或亞東鮭(Salmotruttafario)的屬和種，源自藻類如Mantoniella或Ostreococcus，或源自珪藻如海鏈藻屬或褐指藻屬或者源自藻類如隱曱藻屬。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法還包括得到細(xì)胞或者全植物的步驟，所述細(xì)胞或者全植物包含用于所述方法中的核酸序列，其編碼A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶和/或A-5-延伸酶的核酸序列，和適當(dāng)時(shí)編碼①-3-去飽和酶和/或A-4-去飽和酶的核酸序列，其中所述細(xì)胞和/或有用的植物還可以包含脂類或者脂肪酸代謝的其他核酸序列。優(yōu)選用于該方法的這些核酸序列有利地單獨(dú)或者與編碼脂肪酸或者脂類代謝蛋白質(zhì)的其他核酸序列組合摻入到至少一種基因構(gòu)建體和/或載體中用于表達(dá)，并且最后轉(zhuǎn)化到細(xì)胞或者植物中。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法還包括從有用的植物得到油、脂類或者游離脂肪酸的步驟。以這種方式產(chǎn)生的細(xì)胞或者以這種方式產(chǎn)生的有用植物有利地是產(chǎn)油植物、蔬菜植物、萵苣植物或觀賞植物的細(xì)胞，或者植物自身，如上文解釋。生長指植物細(xì)胞、組織或器官在培養(yǎng)基上或在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，或者整株植物在基質(zhì)中或在基質(zhì)上，例如在培養(yǎng)液、花盆土中或在耕地上的培養(yǎng)。對于本發(fā)明目的，"轉(zhuǎn)基因的，，或"重組的"指關(guān)于例如含有本發(fā)明方法中使用的核酸序列的核酸序列、表達(dá)盒(=基因構(gòu)建體)或載體，或用本發(fā)明方法中使用的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的植物，所有那些構(gòu)建通過重組方法產(chǎn)生，其中a)所述核酸序列，或b)與所述核酸序列有效連接的遺傳控制序列，例如啟動(dòng)子，或c)(a)和(b)中的任何一個(gè)都不定位在它們自然遺傳環(huán)境中或已通過重組方法被改變，改變可能是例如一個(gè)或更多核苷酸殘基的替代、添加、缺失、倒位或插入。自然遺傳環(huán)境指基源生物中的天然基因組或染色體位點(diǎn)或基因組文庫中的存在。在基因組文庫的情況下，優(yōu)選至少部分保持核酸序列的自然遺傳環(huán)境。所述環(huán)境至少在一面?zhèn)纫戆鼑怂嵝蛄胁⒕哂兄辽?0bp,優(yōu)選至少500bp，特別優(yōu)選至少1000bp，十分特別優(yōu)選至少5000bp的序列長度。當(dāng)如下表達(dá)盒通過非天然、合成("人工的，，)方法，例如誘變處理被改變時(shí)，天然存在的表達(dá)盒-例如本發(fā)明方法中使用的核酸序列的天然啟動(dòng)子與編碼蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)具有相應(yīng)的A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶和A5-延伸酶活性)的核酸序列的天然存在的組合，有利地與編碼具有w3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)的核酸序列組合，成為轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。例如在US5,565,350或WO00/15815中描述了合適的方法。如上述，用于本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)基因植物意指方法中所用的核酸不處于它們在所述植物的基因組中的天然位點(diǎn)處，對這類核酸而言可同源或異源性地表達(dá)。然而如上述，轉(zhuǎn)基因也意指即便本發(fā)明的核酸處于植物基因組中它們的天然位置上，這種序列相對于天然序列已經(jīng)過了修飾，和/或天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)過了修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選指本發(fā)明方法中使用的核酸在基因組內(nèi)非天然位點(diǎn)處的表達(dá)，即發(fā)生了這種核酸的同源表達(dá)，或優(yōu)選地異源表達(dá)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因生物是有用的植物，如產(chǎn)油植物、蔬菜植物、生菜植物或觀賞植物，它們都有利地選自植物科，其選自下面的科槭樹科(Aceraceae)、稱猴杉匕科(Actinidiaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、傘形科(Apiaceae)、檳榔科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、檳榔科、樺木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、鳳梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、美人蕉科(Cannaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫，科(Cucurbitaceae)、薯蕷科(Dioscoreaceae)、胡頹子科(Elaeagnaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、山毛櫸科(Fagaceae)、醋栗科(Grossulariaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、百合科(Liliaceae)、亞麻科(Linaceae)、錦葵科(Malvaceae)、?？?Moraceae)、芭蕉科(Musaceae)、木犀科(Oleaceae)、酢漿草科(Oxalidaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、禾本科(Poaceae)、蓼科(Polygonaceae)、石榴科(Punicaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、蕓香科(Rutaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、癡科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)和敗普科(Valerianaceae)。用于本發(fā)明方法的核酸、表達(dá)盒或者載體的合適的宿主植物原則上并且有利地是能夠合成脂肪酸、特別是不飽和脂肪酸，或者適于表達(dá)重組基因的任何有用的植物?？梢蕴岬降膶?shí)例是植物如擬南芥屬、菊科，如金盞花屬，或者有用的植物如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉、亞麻、油籽油菜、椰子、油椰、紅花或可可豆。其他有利的植物在本申請的別處列出。^t生物通常用作產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有用植物的中間宿主。此類可利用的中間宿主在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(19卯)中有詳細(xì)敘述?？梢杂欣赜糜谠撃康牡谋磉_(dá)菌林是例如那些具有較低蛋白酶活性的菌林。例如在Gottesman,S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)119-128中描述了它們。包含本發(fā)明方法合成的多不飽和、長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)基因植物可以有利地直接出售，不需要分離合成的油、脂類或脂肪酸。該形式的出售特別有利。對于本發(fā)明目的，"植物"是完整的植物和所有植物部分、植物器官或植物部分如葉、莖、種子、根、塊莖、花藥、纖維、根毛、莖、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收獲的材料、植物組織、生殖組織和來自實(shí)際轉(zhuǎn)基因植物和/或可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞培養(yǎng)物。在該上下文中，所述種子包含種子的所有部分，如種皮、表皮細(xì)胞、種子細(xì)胞、胚乳或胚組織。然而，本發(fā)明方法中產(chǎn)生的化合物也可以以它們油、脂肪、脂類和/或游離脂肪酸的形式從植物中分離。可以通過從它們生長的培養(yǎng)物或田地中收獲植物或植物細(xì)胞來獲得本發(fā)明方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。這可以通過壓榨或提取植物部分，優(yōu)選植物種子來進(jìn)行。在該文中通過所謂的冷拔或冷壓在無熱輸入的情況下獲得油、脂肪、脂類和/或游離脂肪酸是可能的。為了使打開植物部分，尤其是種子更容易些，先將它們壓碎、蒸汽處理或烘烤。然后可以用溶劑如加熱的己烷來壓榨或提取以該方式預(yù)處理的種子。然后再次除去所述溶劑。以該方式分離高于96%的本發(fā)明方法產(chǎn)生的化合物是可能的。然后進(jìn)一步處理以該方式獲得的產(chǎn)物，即精煉。這使得一開始就除去例如植物黏液和懸浮物。所謂的脫泥可以經(jīng)酶促發(fā)生或例如，通過加入酸如磷酸化學(xué)/物理地發(fā)生。然后通過用堿，例如氬氧化鈉溶液處理除去游離脂肪酸。用水徹底清洗得到的產(chǎn)物來去除殘留在產(chǎn)物中的堿，并將其千燥。為了去除仍然存在于產(chǎn)物中的著色物質(zhì)，可以用例如漂白土或活性炭來漂白產(chǎn)物。最后，也例如用蒸汽將產(chǎn)物除臭。通過該方法產(chǎn)生的PUFAs或LCPUFAs優(yōu)選為C加和/或<:22脂肪酸分子，所述分子在脂肪酸分子中具有至少4個(gè)雙鍵，優(yōu)選5或6個(gè)雙鍵。這些C2o和/或C22脂肪酸分子可以以油、脂類或游離脂肪酸的形式從植物中分離。合適的轉(zhuǎn)基因植物例如為上面提及的那些。在每種情況下基于100%和植物總脂肪酸含量，本發(fā)明的這些油、脂類或脂肪酸有利地包含如上述，6到15%的棕櫚酸，1到6%的硬脂酸；7到85%的油酸；0.5到8o/。的11-十八碳烯酸，0.1到1%的花生酸，7到25%的飽和脂肪酸，8到85%的單不飽和脂肪酸和60到85%的多不飽和脂肪酸。存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合物如磷脂酰脂肪酸酯或三酰甘油酯中的有益多不飽和長鏈脂肪酸基于總脂肪酸含量優(yōu)選為按重量計(jì)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20%二十碳五烯酸，和/或基于總脂肪酸含量，以重量計(jì)至少1、2、3、4、5或6%的二十二碳五烯酸，和/或基于總脂肪酸含量，以重量計(jì)至少l、2、3;優(yōu)選至少4、5、6;特別優(yōu)選至少7或8并最優(yōu)選至少9或10%的二十二碳六烯酸。已通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物還包含脂肪酸，所述脂肪酸選自芥酸(二十二碳烯-13酸)、蘋婆酸(9，10-亞甲基十八碳-9-烯酸)、錦葵酸(8，9-亞曱基十七碳-8-烯酸)、大風(fēng)子油酸(環(huán)戊烯十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-環(huán)氧十八碳-9，ll-二烯酸)、斑鳩菊酸(9，10-環(huán)氧十/\碳-12-烯酸)、果脂酸(6-十八碳炔酸)、6-十九碳炔酸、santalbicacid(反ll-十八碳烯-9-炔酸)、6，9-十八碳烯炔酸、pyrulicacid(反10-十七烯-8-炔酸)、crepenyninicacid(9畫十八締-12-炔酸)、13，14-二氬oropheicacid、十八碳-13-烯-9，11-二炔酸、傘形花子油酸(順-6-十八烯酸)、9順，12反-十八碳二烯酸、金盞花素酸(8反10反12順-十八碳三烯酸)、梓戒酸(9反11反13順-十八碳三烯酸)、石榴酸(9順11反13順-十八碳三烯酸)、jacaricacid(8順10反12順-十八碳三烯酸)、石榴酸(9順11反13順-十八碳三烯酸)、麥餅樹酸(9順11反13反15順-十八碳四烯酸)、皮諾斂酸(全-順-5,9，12-十八碳三烯酸)、laballenicacid(5，6-十八碳二烯丙二烯酸)、蓖麻油酸(12-羥油酸)和/或革蓋菌素酸(13-羥-9順，ll反-十八碳二烯酸)。通常，上述脂肪酸只以痕量有利地存在于本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物中，意思是，基于總脂肪酸含量，它們的存在低于30%，優(yōu)選低于25%、24%、23%、22%或21%，特別優(yōu)選低于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%，十分特別優(yōu)選低于4%、3%、2%或1%。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的形式中，這些上述脂肪酸的存在基于總脂肪酸低于0.9%、0.8%0.7%、0.6%或0.5%,特別優(yōu)選寸氐于0.4%、0.3%、0.2%、0.1%?；诳傊舅?，本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含低于0.1%和/或無丁酸、膽固醇和尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6"，8，12，15，18，21)。本發(fā)明的其它實(shí)施方案是本發(fā)明方法產(chǎn)生的油、脂類、脂肪酸和/或脂肪酸組合物在飼料、食品、化妝品或藥物中的用途。在本發(fā)明方法中獲得的油、脂類、脂肪酸或脂肪酸混合物可以用于與動(dòng)物來源的其它油、脂類、脂肪酸或脂肪酸混合物例如魚油以技術(shù)人員熟悉的方式混合。以該方式產(chǎn)生并由植物和動(dòng)物組分組成的這些油、脂類、脂肪酸或脂肪酸混合物也可以用于銅料、食品、化妝品或藥物的制備。將術(shù)語"油"、"脂類"或"脂肪"理解為指包含不飽和和/或飽和，優(yōu)選酯化脂肪酸的脂肪酸混合物。優(yōu)選地，所述油、脂肪或脂類在多不飽和游離或有利地酯化脂肪酸中，特別在亞油酸、，亞麻酸、二高-，亞麻酸、花生四烯酸、a-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸中含量很高。優(yōu)選地，不飽和酯化脂肪酸的量為約30%，尤其優(yōu)選具有50%的量，并最優(yōu)選具有60%、70%、80%或更高的量。可以在脂肪酸通過轉(zhuǎn)酯作用轉(zhuǎn)化為甲酯后通過氣相色鐠來測定脂肪酸的量。油、脂類或脂肪可以包含多種其它飽和或不飽和脂肪酸，例如金盞花素酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸等。特別是，多種脂肪酸的量才艮據(jù)初始植物可以變化。如上描述，有利地具有3、4、5或6個(gè)，特別有利地具有5或6個(gè)雙鍵并已在本方法中制備的多不飽和脂肪酸酯有利地采取脂肪酸酯的形式，例如，鞘脂類、磷酸甘油酯、脂類酯、糖脂、磷脂酯、單酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其它脂肪酸酯，優(yōu)選磷脂酯和/或三酰甘油酯。從多不飽和脂肪酸酯開始(所述多不飽和脂肪酸酯在本發(fā)明方法中產(chǎn)生并有利地具有至少3、4、5或6個(gè)雙鍵)，所存在的多不飽和脂肪酸經(jīng)堿例如KOH或NaOH水溶液處理，或者有利地于存在醇例如曱醇或乙醇時(shí)經(jīng)酸水解，或者經(jīng)酶切割釋放并且通過例如相分離及隨后例如H2S04的酸化作用而分離。這類脂肪酸也可無需以上描述的處理步驟直接釋放。本方法中所用核酸序列(所述核酸序列編碼具有A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶和/或A5-延伸酶活性的多肽)，和任選地編碼具有co3-去飽和酶和/或A4-去飽和酶活性的多肽的核酸序列，和/或所用的其它核酸序列(如編碼脂肪酸或脂類代謝的多肽的核酸序列)的底物是C16-、C『或C20-脂肪酸，所述脂肪酸或脂類代謝的多肽選自酰基-輔酶A脫氫酶、?；鵄CP—?；d體蛋白去飽和酶、?；鵄CP硫酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、?；?輔酶A:溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙?；o酶A羧化酶、?；o酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸炔屬酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。。優(yōu)選地，本方法中轉(zhuǎn)化的脂肪酸作為底物以它們?；o酶A酯的形式和/或以它們的磷脂酯的形式被轉(zhuǎn)化。為了產(chǎn)生本發(fā)明的長鏈PUFAs，根據(jù)底物，首先必須將飽和、單不飽和C『脂肪酸和/或多不飽和dr脂肪酸通過去飽和酶和/或延伸酶的酶促活性去飽和和/或延伸，或僅去飽和并隨后通過延伸酶延伸至少2個(gè)碳原子。一個(gè)延伸循環(huán)后，該酶活性導(dǎo)致從dr脂肪酸開始至ds-脂肪酸或從C18-脂肪酸開始至C2(T脂肪酸，并且在兩個(gè)延伸循環(huán)后從<:16-脂肪酸開始導(dǎo)致(:20-脂肪酸。本發(fā)明方法中使用的去飽和酶或延伸酶的活性優(yōu)選地導(dǎo)致<:20-和/或Qj2-脂肪酸，在脂肪酸分子中有利地具有至少2個(gè)或3個(gè)雙鍵，優(yōu)選具有4、5或6個(gè)雙鍵，尤其優(yōu)選地導(dǎo)致脂肪酸分子中具有至少5個(gè)雙鍵的<:22-脂肪酸。本發(fā)明方法的特別優(yōu)選產(chǎn)物是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。脂肪酸中具有至少2個(gè)雙鍵的ds-脂肪酸可以通過本發(fā)明的酶促活性以游離脂肪酸的形式或以酯，如磷脂、糖脂、鞘脂、磷酸甘油酯、單?；视?、二?；视突蛘呷８视偷男问絹硌由?。脂肪酸、油、脂類或脂肪在有利使用的植物中優(yōu)選的生物合成部位例如通常是種子或種子的細(xì)胞層，因此對方法中所用的核酸進(jìn)行種子特異性表達(dá)是有意義的。然而，顯然脂肪酸、油或脂類的生物合成不必限定于種子組織，而是也可在植物的所有其它部分例如在表皮細(xì)胞或在塊莖中以組織特異性方式進(jìn)行。有利地，通過本發(fā)明方法的合成在營養(yǎng)(體細(xì)胞)組織中發(fā)生。由于本發(fā)明的方法，產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸原則上可以在本方法所用的植物中以兩種方式增加。有利地，可以增加通過本方法產(chǎn)生的游離多不飽和脂肪酸的庫和/或酯化多不飽和脂肪酸的量。有利地，通過本發(fā)明的方法有利地以磷脂酰酯和/或三?；サ男问絹碓黾愚D(zhuǎn)基因植物中酯化多不飽和脂肪酸的庫。將本發(fā)明方法中所用的序列單獨(dú)地克隆到表達(dá)構(gòu)建體中或?qū)⑵涮峁┑竭B接的重組核酸分子上并用于引入和在生物中表達(dá)。這些表達(dá)構(gòu)建體使最佳地合成本發(fā)明方法中產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸變成可能。本方法中所用的核酸在引入植物或植物細(xì)胞后，可以定位在單獨(dú)的質(zhì)粒上或有利地整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在整合到基因組中的情況下，整合可以是隨機(jī)的或通過重組來發(fā)生，使得天然基因被引入的拷貝代替，因此通過細(xì)胞調(diào)節(jié)想要的化合物的產(chǎn)生，或通過反向基因的使用，使得所述基因在功能上連接到功能表達(dá)單位上，所述功能表達(dá)單位包含保證基因表達(dá)的至少一種序列和保證功能轉(zhuǎn)錄基因多腺苷酸化的至少一種序列。通過多表達(dá)盒或構(gòu)建體將核酸序列有利地引入到植物中用于多平行表達(dá)，即核酸序列存在于連接的表達(dá)單位中。核酸序列構(gòu)建體可以包含多于一種核酸序列，其編碼具有A-12-去飽和酶、A-4-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-6-延伸酶和/或(o-3-去飽和酶酶促活性的多肽。存在多個(gè)拷貝的核酸序列也是可能的，所述核酸序列編碼具有A-12-去飽和酶、A-4-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-6-延伸酶和/或co-3-去飽和酶酶促活性的多肽。對于引入，以已知的方式有利地?cái)U(kuò)增并連接本方法中所用的核酸。優(yōu)選地，接著是遵循PfuDNA聚合酶或Pfu/TaqDNA聚合酶混合物方案的方法。根據(jù)待擴(kuò)增的序列來選擇引物。引物應(yīng)該方便地以這樣的方式來選擇擴(kuò)增子包含從起始密碼子到終止密碼子的整個(gè)編碼序列。擴(kuò)增后，方便地分析所述擴(kuò)增子。例如，可以通過凝膠電泳分離來進(jìn)行質(zhì)量和數(shù)量的分析。此后，可以才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(例如Qiagen)來純化擴(kuò)增子。純化的擴(kuò)增子的等分試樣然后可用于隨后的克隆步驟。適宜的克隆載體通常是技術(shù)人員已知的。這些具體包括能夠在微生物系統(tǒng)中復(fù)制的載體，也就是說主要是確保在酵母或者真菌中有效克隆并且使得可能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的載體。必須提及的載體是適于T-DNA-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的多種雙元的和共整合的載體系統(tǒng)。此類載體系統(tǒng)通常的特征在于它們至少包含農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需的vir基因和T-DNA-定界序列(T-DNA邊界)。這類載體系統(tǒng)還有利地包含其它順式調(diào)節(jié)區(qū)域，如啟動(dòng)子和終止子序列和/或選擇標(biāo)記，通過這些順式調(diào)節(jié)區(qū)域，已合適轉(zhuǎn)化的生物通過選擇標(biāo)記可以鑒定。在共整合載體系統(tǒng)的情況下，vir基因和T-DNA序列在相同載體中排列，而雙元系統(tǒng)至少以兩種載體為^S^出，其中一種載體攜帶了vir基因但沒有T-DNA，同時(shí)第二種載體攜帶了T-DNA而無vir基因。因此所提及的后一種載體相對較小，容易操作和在大腸桿菌(E.coli)中和農(nóng)桿菌中復(fù)制。這類雙元載體包括來自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的載體。根據(jù)本發(fā)明，Binl9、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA優(yōu)選使用。雙元載體和它們的用途的綜述可在Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446-451中找到。為了制備載體，載體首先以限制性核酸內(nèi)切酶線性化并且然后按照合適的方式進(jìn)行酶修飾。此后純化載體并且將一份純化的載體用于克隆步驟。在克隆步驟中，使用連接酶將已經(jīng)酶切割并且根據(jù)需要已純化的擴(kuò)增物與已按類似方式制備的載體片段克隆。在本上下文中，具體的核酸構(gòu)建體、或載體或質(zhì)粒構(gòu)建體可具有一個(gè)或超過一個(gè)的編碼性基因片段。將編碼性基因片段在這些構(gòu)建體中優(yōu)選地與調(diào)節(jié)性序列有效連接。調(diào)節(jié)性序列尤其包括植物序列，如啟動(dòng)子和終止子。這類構(gòu)建體可在微生物，特別在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中于選擇性條件下穩(wěn)定增殖并且有可能向植物或微生物中轉(zhuǎn)移異源DNA?？梢杂欣厥褂每寺≥d體將本發(fā)明方法中使用的核酸序列和核酸構(gòu)建體引入微生物中然后引入植物中，并因此用于植物轉(zhuǎn)化，如在PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida),章6/7，頁71-119(1993);F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;inTransgenicPlants,巻1,EngineeringandUtilization,編輯Kung和R.Wu，AcademicPress,1993，15-38;B.Jenes等人TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,巻1,EngineeringandUtilization,編輯Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-143;Potrykus，A國.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.(1991)42:205-225中公布并在其中引用的那些。因此，本方法中使用的核酸、核酸構(gòu)建體和/或載體可以用于廣泛類型植物的重組修飾，使得后者變得更好和/或變成更有效的LCPUFA產(chǎn)生者。因?yàn)閷6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶和A5-延伸酶基因單獨(dú)或與其它基因組合引入到植物中，不僅可能增加向終產(chǎn)物的生物合成流量，也可能增加或從頭(denovo)產(chǎn)生對應(yīng)的三?；视秃?或磷脂酰酯組合物。同樣，可以增加參與營養(yǎng)物輸入的其它基因的數(shù)量或活性，所述營養(yǎng)物為一種或更多脂肪酸、油、極性和/或中性脂類的生物合成所需要，使得細(xì)胞中或貯藏區(qū)中這些前體、輔助因子或中間體的濃度升高，由此如下描述，細(xì)胞產(chǎn)生PUFAs的能力進(jìn)一步增強(qiáng)。通過優(yōu)化參與這些化合物生物合成的一種或更多A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶和/或A5-延伸酶基因的活性或增加其數(shù)量，或者通過破壞參與降解這些化合物的一種或更多基因的活性來提高來自生物并有利地來自植物的脂肪酸和脂類分子中的產(chǎn)量、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率是可能的。本發(fā)明方法中使用的核酸分子編碼蛋白質(zhì)或其部分，然而所述蛋白質(zhì)或單個(gè)蛋白質(zhì)或其部分包含氨基酸序列，其與在序列SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172或SEQIDNO.52和適當(dāng)時(shí)SEQIDNO.194或SEQIDNO.78中描述的氨基酸序列具有足夠的同源性，使得蛋白質(zhì)或其部分仍然具有A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶和/或A5-延伸酶活性，和適當(dāng)時(shí)具有A-4-去飽和酶和/或co-3-去飽和酶活性。由核酸分子/多個(gè)核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其部分優(yōu)選地仍然具有它的/它們的基本酶促活性和參與生物中，有利地植物中對構(gòu)建細(xì)胞膜或脂質(zhì)體必需的化合物代謝或參與跨這些膜進(jìn)行分子運(yùn)輸?shù)哪芰?。由所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與在SEQIDN0.65、SEQIDNO,2、SEQIDNO.172、SEQIDNO,52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78中描述的氨基酸序列具有至少約60%并優(yōu)選至少約70%、80%或卯％,并特別優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。同源性或同源的在本發(fā)明的上下文中指同一性或同一的。在整個(gè)氨基酸或者核酸序列區(qū)上計(jì)算同源性。為了比較不同序列，利用基于多種算法的一系列程序。在該上下文中，Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法給出尤其可靠的結(jié)果。為了進(jìn)行序列比對，使用程序PileUp(J.MoLEvolution.,25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS,51989:151-153)或者程序Gap和BestFit[Needleman和Wunsch(丄Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981)]，其是GCG軟件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)的部分。使用程序GAP使用下面的設(shè)置在整個(gè)序列區(qū)上確定上面給出的序列同源性數(shù)據(jù)(以％表示)缺口權(quán)重50，長度權(quán)重3，平均匹配10.000和平均錯(cuò)配0.000。除非另外指出，這些設(shè)置總是還用作序列比較的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。本發(fā)明的方法中使用的ro-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-6-延伸酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶和/或A-5-去飽和酶的基本酶促活性指，與由具有SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDN0.171、SEQIDNO,51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77的序列編碼的蛋白質(zhì)/酶相比，它們?nèi)匀痪哂兄辽?0%，優(yōu)選至少200/。，特別優(yōu)選至少30%并最優(yōu)選至少40、50或60%的酶促活性，并因此能夠參與植物或植物細(xì)胞中合成脂肪酸，有利地脂肪酸酯如砩脂酰酯和/或三酰甘油酯所必需的化合物代謝或參與分子跨膜運(yùn)輸。有利地用于方法的核酸可源自細(xì)菌、真菌、硅藻、動(dòng)物如隱桿線蟲或大馬哈魚屬或者植物，如藻類或者蘚類，如希瓦氏菌屬(Shewanella)、劍葉蘚屬、破嚢壺菌屬、鐮孢屬(Fusarium)、疫霉屬、角齒蘚屬、畸雌腐霉(Pytiumirregulare)、Mantoniella、Ostreococcus、等鞭金藻屬、Aleurita、Muscarioides、被孢霉屬、琉璃苣屬、褐指藻屬、隱甲藻屬，尤其來自畸雌腐霉、虹鱒、非洲爪蟾、玻璃海鞘、假矮海鏈藻、Mantoniellasquamata、Ostreococcussp.、Ostreococcustauri、細(xì)小棵藻、展葉劍葉蘚、致病疫霉、Fusariumgraminaeum、寇氏隱甲藻、角齒蘚(Ceratodonpurpureus)、球等鞭金藻(Isocrydidgalbana)、Aleuritafarinosa、破嚢壺菌屬的種、Muscarioidesviallii、高山#支孢霉、玻璃萵苣、三角褐指藻、秀麗線蟲的屬和種或尤其有利地來自畸雌腐霉、破嚢壺菌(Thraustochytriumsp.)和/或Ostreococcustauri。此外在本發(fā)明方法中使用編碼A-12-去飽和酶、A-9-延伸酶或A-8-去飽和酶的核苷酸序列是可能的。將本方法中使用的核酸序列有利地引入表達(dá)盒中，所述表達(dá)盒使核酸在植物中的表達(dá)成為可能。將編碼A-12-去飽和酶、(D-3-去飽和酶、A-9-延伸酶、A-6-去飽和酶、A-8-去飽和酶、A-6-延伸酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶或A-4-去飽和酶的核酸序列有效連接到一種或更多調(diào)節(jié)信號中來提高基因表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列旨在使基因的定向表達(dá)成為可能。這可以指例如，根據(jù)植物的不同，基因只在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過表達(dá)，或立即表達(dá)和/或過表達(dá)。有利地用于表達(dá)的序列使組成型表達(dá)成為可能，如CaMV35S、CaMV36S、CaMV35Smas、nos、mas、ubi、stpt、lea或Super啟動(dòng)子。表達(dá)優(yōu)選發(fā)生在如上描述的營養(yǎng)組織中。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)發(fā)生在種子中。這些調(diào)節(jié)序列是例如誘導(dǎo)物或阻抑物結(jié)合的序列并因此調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)。除了不在它們天然基因座連接到核酸序列上的調(diào)節(jié)序列，或代替這些序列，這些序列的天然調(diào)節(jié)也可以在實(shí)際結(jié)構(gòu)基因前存在，并且適當(dāng)時(shí)已經(jīng)被遺傳々務(wù)飾，使得天然調(diào)節(jié)被關(guān)閉并提高基因表達(dá)。基因構(gòu)建體可以額外有利地也包含一種或更多功能連接到啟動(dòng)子上的所謂"增強(qiáng)子序列"，其使核酸序列的增強(qiáng)表達(dá)成為可能。額外有利的序列也可以插入到DNA序列的3，末端，如其它調(diào)節(jié)元件或終止子。有利的終止子為例如病毒終止子，如35S終止子或其它。本發(fā)明方法中使用的核酸序列可以存在于一個(gè)或更多拷貝的表達(dá)盒(=基因構(gòu)建體)中。優(yōu)選地，只有一個(gè)拷貝的基因存在于每一個(gè)表達(dá)盒中。該基因構(gòu)建體或多個(gè)基因構(gòu)建體可以同時(shí)或連續(xù)引入植物中并在宿主生物中一同表達(dá)。在該上下文中，基因構(gòu)建體可以插入到一個(gè)或更多栽體中并在細(xì)胞中以游離形式存在，或也可以插入到基因組中。當(dāng)待表達(dá)的基因共同存在于一個(gè)基因構(gòu)建體中時(shí)，在植物中插入其它基因是有益的。然而，在每種情況下將含有核^f列的基因構(gòu)建體引入到植物中并將得到的植物相互雜交以獲得共同含有所有基因構(gòu)建體的后代也是可能的。在該上下文中，調(diào)節(jié)序列或因子可以，如上描述優(yōu)選地對引入基因的基因表達(dá)具有積極作用，因此加強(qiáng)它的表達(dá)。因此，調(diào)節(jié)元件有利地在轉(zhuǎn)錄水平上的增強(qiáng)可以通過使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子來發(fā)生。此外，然而，例如通過提高mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)翻譯也是可能的。為了保證生物合成基因在數(shù)代間穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因植物中，編碼A6-去飽和酶、A6-延伸酶、A5-去飽和酶或A5-延伸酶和適當(dāng)時(shí)co3-去飽和酶或下表達(dá)。這對于每種序列可以是相同的或不同的。在該上下文中，有利地以這種方式構(gòu)建表達(dá)盒啟動(dòng)子后接著是合適的剪切位點(diǎn)用于待表達(dá)的核酸插入，所述剪切位點(diǎn)有利地位于多位點(diǎn)接頭中。適當(dāng)時(shí)，終止子可以位于多位點(diǎn)接頭的后面。該序列重復(fù)多次，優(yōu)選3、4、5或6次，使得高達(dá)6個(gè)基因可以組合在一個(gè)構(gòu)建體中并因此引入到轉(zhuǎn)基因植物中以便表達(dá)。為了表達(dá)核酸序列，核酸序列通過例如多位點(diǎn)接頭中的合適切割位點(diǎn)在啟動(dòng)子后面插入。每種核酸序列有利地具有自身的啟動(dòng)子并且根據(jù)需要具有自身的終止子。然而仍然可在啟動(dòng)子后面并且根據(jù)需要在終止子前插入多個(gè)核*列。這里表達(dá)盒中所插入核酸的插入位點(diǎn)或其序列并不特別重要，也就是說核酸序列可在表達(dá)盒中最先的位置或最末的位置插入而該位置不顯著地影響這種核酸序列的表達(dá)。在有利的實(shí)施方案中，不同的啟動(dòng)子例如USP、LegB4或DC3啟動(dòng)子和不同的終止子可有利地在表達(dá)盒中使用。在進(jìn)一步有利的實(shí)施方案中，也可以使用相同的啟動(dòng)子如CaMV35S啟動(dòng)子。如以上所述，已導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄應(yīng)當(dāng)通過位于已導(dǎo)入的生物合成基因3，端的合適終止子有利地終止(在終止密碼子之后)。在本上下文中，可使用序列的例子是OCSl或35SCaMV終止子。如同啟動(dòng)子的情況，對每種基因應(yīng)該使用不同的終止子序列。如以上所述，基因構(gòu)建體還可包含欲導(dǎo)入生物中的其它基因。向宿主扭物中導(dǎo)入并且因此在其中表達(dá)調(diào)節(jié)基因如誘導(dǎo)物、阻抑物或酶基因是可能并且有利的，其中這些誘導(dǎo)物、阻抑物或酶因其活性參與了生物合成途徑中一種或多種基因的調(diào)節(jié)。這類調(diào)節(jié)基因可為異源或同源。而且脂肪酸或脂類代謝中的其它生物合成基因可在核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體中有利地存在；備選地，這些基因還可以存在于一種或多種其它核酸構(gòu)建體中。優(yōu)迭選擇的脂肪酸或脂類代謝中的生物合成基因是選自?；o酶A脫氫酶、?；鵄CP[-?；d體蛋白1去飽和酶、?；鵄CP硫酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、?；o酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羥化酶、乙?；o酶A羧化酶、?；o酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸炔屬酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、氧化丙二烯合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶或它們組合的一種或多種基因。尤其有利的核酸序列是脂肪酸或脂類代謝中的生物合成基因，這些生物合成基因選自?；o酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、A8-去飽和酶、A9-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或A9-延伸酶。在本上下文中，以上提到的核酸或基因可與其它延伸酶和去飽和酶組合在以上提及的表達(dá)盒中克隆并在農(nóng)桿菌屬協(xié)助下轉(zhuǎn)化植物。在該說明書中使用的術(shù)語"載體，，指這樣的核酸分子，其能夠運(yùn)輸與這種核酸分子所結(jié)合的其它核酸。載體的一個(gè)類型是"質(zhì)粒"，即可連接額外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的另一個(gè)類型是病毒載體，對額外的DNA片段而言有可能向這種病毒的基因組內(nèi)連接。某些載體能夠在已導(dǎo)入這些載體的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其它載體當(dāng)向宿主細(xì)胞導(dǎo)入時(shí)有利地在宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)整合并JL因此隨宿主基因組一起復(fù)制。而且某些載體能夠控制與這些栽體有效連接的基因的表達(dá)。這些載體在本上下文中稱為"表達(dá)載體"。通常適用于DNA重組技術(shù)的表達(dá)載體采用了質(zhì)粒的形式。在本說明書中由于質(zhì)粒是最常用的載體形式，故"質(zhì)粒，，和"載體"可交換使用。然而本發(fā)明還將覆蓋具有類似功能的其它形式的表達(dá)載體如病毒載體。而且術(shù)語"載體"還將包含技術(shù)人員熟知的其它載體如噬菌體、病毒如SV40、CMV、TMV、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、線形或環(huán)形DNA。有利地在方法中使用的重組表達(dá)栽體包含具有宿主細(xì)胞中適于所用核酸表達(dá)的形式的根據(jù)本方法使用的核酸序列或者所述基因構(gòu)建體，即所述重組表達(dá)載體包含基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所選擇的一種或多種調(diào)節(jié)序列，其中這種(類)調(diào)節(jié)序列與將要表達(dá)的核酸序列有效連接。在重組表達(dá)載體中，"有效連接，，意指將目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以如此方式連接，即有可能使這種核苷酸序列表達(dá)并且它們彼此連接而使這兩類序列(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或如果栽體導(dǎo)入了宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中)都執(zhí)行了屬于該序列的預(yù)期功能。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"旨在包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。這些調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel:GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)—書中或參見Gruber和Crosby,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida,Glick和Thompson編著，Chapter7，89-108,包括其中引用的參考文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包含那些在多種類型的宿主細(xì)胞中控制核苷酸中于特定條件下直接表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。技術(shù)人員知道表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可依賴多種因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)的目的表達(dá)程度及其它因素?？梢砸赃@種方式設(shè)計(jì)所用的重組表達(dá)載體用于表達(dá)本方法中所用的核^列可以將它們轉(zhuǎn)化到原核中間宿主中并最后引入植物后使基因在其中的表達(dá)成為可能。因?yàn)楹唵?，這是有利的，栽體構(gòu)建中的中間步驟經(jīng)常在孩史生物中進(jìn)行。例如，A-6-去飽和酶、A-6-延伸酶、A-S-去飽和酶和/或A-5-延伸酶基因可以在細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞和其它真菌細(xì)胞(見Romanos，M.A.，等人(1992)Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.J"等人(1991)"Heterologousgeneexpressionin打lamentousfungi",in:MoreGeneManipulationsinFungi，J.W.Bennet&L丄.Lasure，編輯，頁396-428:AcademicPress:SanDiego;和vandenHondd，C.A.M.J.J.，&Punt，P.J.(1992)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi,in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy，J.F.，等人，編豐卑，頁1-28，CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻類(Falciatore等人(1999)MarineBiotechnology.l:(3):239-251)、纖毛蟲中使用載體根據(jù)WO98/01572中描述的轉(zhuǎn)化方法表達(dá)，并優(yōu)選地在多細(xì)胞植物的細(xì)胞中表達(dá)(見Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)"HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants'，PlantCellRep.:538-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton，F(xiàn)lorida,章6/7，頁71-119(1993);F.F.White,B.Jenes等人，TechniquesforGeneTransferinTransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,編輯Kung和R.Wu,AcademicPress(1993)，128-43;Potrykus(1991)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42:205-225(和其中引用的參考文獻(xiàn)))。合適的宿主是在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中進(jìn)一步討論的宿主。重組表達(dá)載體可以或者在體外例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)通常利用栽體進(jìn)行，所述載體包含控制融合或非融合蛋白質(zhì)表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。典型的融合表達(dá)載體尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E-結(jié)合蛋白和A蛋白分別融合到重組靶蛋白質(zhì)上。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的例子尤其為pTrc(Amann等(1988)Gene69:301-315)和pETlid(1990年加利福尼亞圣迭哥AcademicPress出版牙土《MethodsinEnzymology》185的Studier等《GeneExpressionTechnology》第60-89頁)。耙基因自pTrc載體的表達(dá)是基于宿主RNA聚合酶自雜合trp-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。耙基因自pETlid載體的表達(dá)是基于經(jīng)共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7-gnl)所介導(dǎo)的T7-gnl0-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。這種病毒RNA聚合酶由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)的定居k-原噬菌體提供，其中所述定居k-原噬菌體攜帶了受lacUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制的T7gnl基因。適合于原核生物的其它載體為技術(shù)人員已知，這些栽體是例如在大腸桿菌中pLG338、pACYC184，pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系歹'、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN國III113-Bl、kgtll或pBdCI,在鏈霉菌屬中pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢桿菌中為pUB110、pC194或pBD214中，在棒狀桿菌中為pSA77或pAJ667。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于釀酒酵母中表達(dá)的載體的例子包含pYeDesaturasecl(Baldari等.(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cdl30:933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。用于構(gòu)建適用于其它真菌如絲狀真菌的載體和構(gòu)建方法包含在1991年劍橋大學(xué)的劍橋大學(xué)出版社丄F.Peberdy等編輯的《AppliedMolecularGeneticsoffungi》第1-28頁，vandenHondel、C.A.M,J.J;和Pun，P.J.的"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi"中或在《MoreGeneManipulationsinFungi》圣迭哥AcademicPress出版社J.W.Bennet和L.L.Lasure編輯，第396-428頁中所詳細(xì)描述的那些載體和方法。其它合適的酵母載體為例如pAG-l、YEp6、YEpl3和pEMBLYe23。或者，本發(fā)明方法中使用的核酸序列可以使用棒狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的棒狀病毒栽體包括pAc系歹'J(Smith等人(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。以上提到的載體僅概略回顧了可能適合的載體。其它的質(zhì)粒為技術(shù)人員所知并且在例如《Cloningvector》(1985年阿姆斯特旦-紐約-牛津Elsevier出版社，Pouwels，P.H.等編輯，ISBN0444卯4018)中描述。對于其它合適用于原核及真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，見1989年紐約冷泉港ColdSpringHarborLaboratory出版社，Sambrook，J.、Fritsch,E.F.和Maniatis，T.的((MolecularCloning:ALaboratoryManual》第二版第16和第17章中的描述。本方法中使用的基因也可以在單細(xì)胞植物細(xì)胞(如藻類)中表達(dá)，見Falciatore等人(1999)MarineBiotechnology1(3):239-251和其中引用的參考文獻(xiàn)，和在來自高等植物(例如種子植物如耕種作物)的植物細(xì)胞中表達(dá)。植物表達(dá)載體的實(shí)例包含在Becker,D.、Kemper,E.、Schell，J.和Masterson，R.(1992)PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan，M.W.(1984)Nucl.AcidsRes.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants;in:TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,編輯Kung和R.Wu，AcademicPress,1993,頁15-38中詳細(xì)描述的那些載體。植物表達(dá)盒優(yōu)選包含調(diào)節(jié)序列，其能夠控制植物細(xì)胞中的基因表達(dá)并有效連接使得每種序列可以實(shí)現(xiàn)它的功能如轉(zhuǎn)錄終止，例如多腺苷酸化信號。優(yōu)選的多腺苷酸化信號是來自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的那些，如Ti質(zhì)粒pTiACH5的基因3(Gielen等人，(1984)EMBOJ.3835etseq.),其已知為章魚堿合成酶，或其功能等價(jià)物，但是在植物中功能活性的所有其它終止子也是適合的。因?yàn)橹参锘虮磉_(dá)調(diào)節(jié)經(jīng)常地不局限于轉(zhuǎn)錄水平，植物表達(dá)盒優(yōu)選包含有效連接的其它序列如翻譯增強(qiáng)子，例如超驅(qū)動(dòng)序列，其增強(qiáng)煙草花葉病毒5，-非翻譯前導(dǎo)序列，其增加蛋白質(zhì)/RNA比率(Gallie等人(1987)Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。如上描述，植物基因表達(dá)必須與控制基因表達(dá)的合適的啟動(dòng)子有效連接。有利地可利用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子(Benfey等人，EMBOJ.(1989)8:2195-2202)，如來自植物病毒的那些，如35SCaMV(Franck等人(1980)Cell21:285-294)、19SCaMV(也見US5352605和WO84/02913),或者植物啟動(dòng)子，如US4，962，028中描述的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亞基的啟動(dòng)子。植物基因表達(dá)盒中用于功能聯(lián)系的其它優(yōu)選序列是靶定序列，其對引導(dǎo)基因產(chǎn)物進(jìn)入它的合適的細(xì)胞區(qū)室，例如進(jìn)入液泡、細(xì)胞核、所有類型的質(zhì)體如造粉體、葉綠體、色質(zhì)體、細(xì)胞外間隙、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油體、過氧化物酶體或植物細(xì)胞的其它區(qū)室是必要的；(見Kermode(1996)Crit.Rev.PlantSci.15(4):284-423中的綜述和其中引用的參考文獻(xiàn))。載體DNA可通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)向原核和真核細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入。術(shù)語"轉(zhuǎn)化，，和"轉(zhuǎn)染"、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)如在本上下文中所用，旨在包含本領(lǐng)域眾知的用于向宿主細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入異源核酸(如DNA)的多種方法，包括磷酸鉤或氯化釣共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔或粒子轟擊。適用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染包括植物細(xì)胞在內(nèi)的宿主細(xì)胞的方法可在Sambrook等(1989年紐約冷泉港ColdSpringHarborLaboratory出版社《MolecularCloning:ALaboratoryManual》第二版)和其它的實(shí)驗(yàn)室手冊如1995年新澤西Totowa的HumanaPress出版社《MethodsinMolecularBiology》第44巻Gartland和Davey編輯的《Agrobacteriumprotocols》中找到。如此處所用的術(shù)語"核酸(分子)，，在有利的實(shí)施方案中額外包含位于編碼基因區(qū)3，末端和5，末端的非翻譯序列編碼區(qū)5，末端的序列上游至少500，優(yōu)選200,特別優(yōu)選100個(gè)核苷酸和編碼基因區(qū)3，末端的序列下游至少100，優(yōu)選50，特別優(yōu)選20個(gè)核苷酸。"分離的"核酸分子與該核酸天然來源中存在的其它核酸分子相分離。"分離的"核酸優(yōu)選不具有在該核酸來源的生物的基因組DNA中在所述核酸天然側(cè)翼的序列(例如定位于核酸5，和3，末端的序列)。在多種實(shí)施方案中，本方法中使用的分離的A-6-去飽和酶、A-6-延伸酶或A-5-去飽和酶和，適當(dāng)時(shí)co-3-去飽和酶或A-4-去飽和酶分子可以例如包含少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在核酸來源的細(xì)胞基因組DNA中所述核酸分子的天然側(cè)翼。本方法中使用的核酸分子可以通過使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和此處提供的序列信息來分離。例如在比較算法的幫助下在DNA或氨基酸水平上鑒定同源序列或同源、保守序列區(qū)也是可能的。這些在標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)中可以用作雜交探針(例如在Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中描述)用于分離可用于本方法中的其它核酸序列。本方法中使用的核酸分子或其部分此外可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來分離，在該情況下使用基于該序列或其部分的寡核苷酸引物(例如包含全部序列或其部分的核酸分子可以使用寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來分離，已基于該相同序列構(gòu)建了所述引物)。例如，可以從細(xì)胞中分離mRNA(例如通過Chirgwin等人(1979)Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸胍提取法)并且可以在反轉(zhuǎn)錄酶(例如從Gibco/BRL，Bethesda獲得的莫洛尼MLV反轉(zhuǎn)錄酶、從SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL獲得的MD或AMV反轉(zhuǎn)錄酶)的幫助下制備cDNA?？梢栽赟EQIDNO,64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中顯示的序列之一的^出上或在SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172、SEQIDNO.52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78描述的^J^酸序列的幫助下構(gòu)建合成的寡核苷酸引物用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增?？梢允褂胏DNA或者基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)來擴(kuò)增本發(fā)明的核酸?？梢詫⒁栽摲绞綌U(kuò)增的核酸克隆到合適載體中并通過DNA序列分析對其進(jìn)行表征?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的合成方法，例如使用自動(dòng)DNA合成儀來制備寡核苷酸。所用的具有序列SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77的A-5-延伸酶、co-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-6-延伸酶、A-4-去飽和酶或A-5-去飽和酶核酸序列的同源物是指例如等位變體，其與SEQIDNO.64、66、68或70中顯示的核苷紗列之一，與SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41中顯示的核苷餅列之一，與SEQIDNO.171、173、175、177、179、181或183中顯示的核苷酸序列之一，與SEQIDNO,51、53或55中顯示的核苷酸序列之一，與SEQIDNO.193或195中顯示的核苷,列之一或與SEQIDNO.77、79、81、83、85、87、89、91或93中顯示的核苷酸序列之一，尤其是SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中顯示的核苷酸序列或它們的同源物、《汙生物或類似物或其部分具有至少約40、50或60%，優(yōu)選至少約60或70%，更優(yōu)選至少約70或80%、90%或95%并且甚至更優(yōu)選至少85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性或同源性。同樣包括的是核苷^f列的分離的核酸分子，所述核酸分子例如在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中顯示的核苷酸序列之一或其部分雜交。部分在本發(fā)明該方面指至少25個(gè)堿基對(=bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp，優(yōu)選至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp,特另)J優(yōu)選350bp、400bp、450bp、500bp或更多堿基對用于雜交。使用完整序列也可能是有益的。等位變體包含特定功能變體中，其可以通過SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77中描述的序列的核苷酸的缺失、插入或替代而獲得，但是對于插入，基本上保留了由此編碼的蛋白質(zhì)的酶活性?？梢曰谒鼈兣c此處公開的co-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶和/或A-6-延伸酶核酸序列的同源性，通離有利于本發(fā)明方法的核酸分子。在該方面例如使用至少15個(gè)核苷酸長的分離的核酸分子并在嚴(yán)格條件下與包含SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77核苷酸序列的核酸分子雜交是可能的。使用具有至少25、50、100、250或更多核苷酸的核酸分子也是可能的。如此處使用的術(shù)語"在嚴(yán)格條件下雜交"旨在描述雜交和洗滌條件，在所述條件下至少60%互相同源的核酸序列通常保持雜交在一起。所述條件優(yōu)選為使得至少約65%,優(yōu)選至少約70%并特別優(yōu)選至少約75%或更高互相同源的序列通常保持雜交在一起的條件。這些嚴(yán)格條件為技術(shù)人員已知并可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中發(fā)現(xiàn)。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的非限制性實(shí)例是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(=SSC)中約45。C的條件雜交，接著在0.2xSSC,0.1%SDS中50至65。C的一個(gè)和更多個(gè)洗滌步驟。技術(shù)人員知道這些雜交條件根據(jù)核酸的類型和例如存在有機(jī)溶劑而不同，與溫度和緩沖液的濃度有關(guān)。例如在"標(biāo)準(zhǔn)雜交條件"下的溫度根據(jù)核酸的類型在濃度為0.1到5xSSC(pH7.2)的水性緩沖液中為42°C到58°C之間。如果有機(jī)溶劑，例如50%曱酰胺存在于上述緩沖液中，那么標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度為約42。C。DNA:DNA雜交分子的雜交條件優(yōu)選為例如0.1xSSC和20。C至45。C,優(yōu)選30。C至45。C。DNA:RNA雜交分子的雜交條件優(yōu)選為例如0.1xSSC和30°C至55°C，優(yōu)選45。C至55。C。例如對于具有約100bp(=堿基對)長度和5(T/。的G+C含量的核酸，在沒有甲酰胺的條件下確定上述雜交溫度。技術(shù)人員知道可以基于教科書如上述的教科書或從以下教科書Sambrook等人，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989;Hames和Higgins(編輯)1985,"NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(編輯)1991，"EssentialMolecularBiology:APracticalApproach",IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford中怎樣確定必須的雜交條件。為了確定兩種氨基酸序列(例如SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172、SEQIDNO.52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78的序列之一)或兩種核酸(例如SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77)的同源性(=同一性)百分比，將所述序列寫在另一序列的下面以能夠最佳地比較它們(例如，可以將空位引入蛋白質(zhì)或核酸的序列中以產(chǎn)生與另一蛋白質(zhì)或核酸的最佳比對)。然后，比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸基團(tuán)或核苷酸。如果序列中的位置與另一序列中的對應(yīng)位置被相同的氨基酸基團(tuán)或相同的核苷酸占據(jù)，那么分子在該位置上是同源的(即如本上下文中所用的氨基酸或核酸"同源性，，對應(yīng)了氨基酸或核酸"同一性")。兩種序列間同源性的百分比M列共有的同一位置數(shù)目的函數(shù)(即同源性=同一位置的數(shù)目/位置的總數(shù)x100)。在上面描述了用于確定同源性的程序和算法。可以通過向SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77的核苷酸序列中引入一個(gè)或更多核苷酸替代、添加或缺失產(chǎn)生編碼w-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶和/或A-6-延伸酶的分離的核酸分子，所述co-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶和/或A-6-延伸酶用于本方法中并與SEQIDNO.65、SEQIDNO.2、SEQIDNO.172、SEQIDNO.52、SEQIDNO.194或SEQIDNO.78的蛋白質(zhì)序列同源，使得一個(gè)或更多氨基酸替代、添加或缺失被引入到編碼的蛋白質(zhì)中。突變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如位點(diǎn)特異性誘變和PCR介導(dǎo)的誘變而引入SEQIDNO.64、SEQIDNO.1、SEQIDNO.171、SEQIDNO.51、SEQIDNO.193或SEQIDNO.77序列之一中。保守的^J^酸替代優(yōu)選在一個(gè)或更多預(yù)測的非必需氨基酸殘基處產(chǎn)生。在"保守的M酸替代"中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替。已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、p-分枝側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。在co-3-去飽和酶、去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶和/或A-6-延伸酶中的預(yù)測非必需氨基酸殘基因此優(yōu)選被來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基代替。在另一實(shí)施方案中另一可能是在整個(gè)或部分的co-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶和/或A-6-延伸酶編碼序列范圍內(nèi)例如通過飽和誘變隨機(jī)引入突變，并且可以對所得突變體篩選此處描述的co-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶或A-6-延伸酶活性以鑒定突變體，該突變體已保持了co-3-去飽和酶、A-6-去飽和酶、A-5-去飽和酶、A-5-延伸酶、A-4-去飽和酶或A-6-延伸酶活性。編碼的蛋白質(zhì)可以在誘變后重組表達(dá)，并且蛋白質(zhì)的活性可以例如通過^f吏用此處描述的測定法來確定。本發(fā)明由以下實(shí)施例更詳盡地闡述，其不被理解為限定。將專利申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利申請、專利和公布的專利申請的內(nèi)容引用作為參考o(jì)下面的表顯示了如在2006年2月21的優(yōu)先權(quán)申請(具有德國申請?zhí)?02006008030.0)中4吏用的序列標(biāo)識符和在該后續(xù)申請中的對應(yīng)序列標(biāo)識符。由優(yōu)先權(quán)申請的SEQIDNO:1標(biāo)識的核酸序列對應(yīng)例如由后續(xù)申請的SEQIDNO:64標(biāo)識的核酸序列。優(yōu)先權(quán)申請的序列標(biāo)識符和后續(xù)申請中序列標(biāo)識符索引表:<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實(shí)施例實(shí)施例1:通用的克隆方法克隆方法例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、純化DNA片段、核酸轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜和尼龍膜、連接DNA片段、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)和重組DNA的序列分析按照Sambrook等(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)所描述實(shí)施。實(shí)施例2:重組DNA的序列分析重組DNA分子以ABI激光熒光DNA測序4義按照Sanger(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463-5467)的方法測序。通過聚合酶鏈反應(yīng)獲得的片段經(jīng)過測序和驗(yàn)證以避免待表達(dá)的構(gòu)建體中的聚合酶偏差。實(shí)施例3:從Ostreococcustauri中克隆基因序列保守區(qū)是可能的，所述序列編碼具有A-5-延伸酶活性或A-6-延伸酶活性的蛋白質(zhì)。這些是以下序列<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>OtElo2.1與來自斑馬魚(Daniorerio)的延伸酵(GenBankAAN77156;約26%同一性)具有最高相似性，而OtElol.l與來自劍葉蘚屬(Physcomitrella)(PSE)的延伸酶(約36%同一性)具有最高相似性(用tBLASTn算法進(jìn)行比對(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410))。延伸酶的克隆如下進(jìn)行將40ml處于穩(wěn)定期的Ostreococcustauri培養(yǎng)物離心并在100pi雙蒸水中重懸浮并保存于-20。C。用PCR方法擴(kuò)增相應(yīng)的基因組DNA。選擇相應(yīng)引物對使得它們在起始密碼子旁具有用于高效翻譯的酵母共有序列(Kozak(1986)Cell44:283-292)。在每種情況下，在含1pi解凍的細(xì)胞、200pMdNTPs、2.5UTaq聚合酶和100pmol每種引物的50pl總體積內(nèi)進(jìn)行OtEloDNA的擴(kuò)增。用于PCR的條件如下在95°C第一次變性5分鐘，隨后是94。C30秒、55。C1分鐘和72°C2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，和72。C10分鐘的最后延伸步驟。實(shí)施例4:來自O(shè)streococcustauri延伸酶基因的優(yōu)化如實(shí)施例3中描述的分離來自生物Ostreococcustauri的延伸酶。為實(shí)現(xiàn)C22脂肪酸含量的增加，使序列SEQIDNo.143(A6-延伸酶)和SEQIDNo.109(編碼由SEQIDNo.110鑒定的蛋白質(zhì))(A5-延伸酶)適應(yīng)于油菜、亞麻和大豆中的密碼子選擇。為此目的，將A6-延伸酶和A5-延伸酶的氨基酸序列(A6-延伸酶為SEQIDNO.144;A5-延伸酶為SEQIDNO.65)反向翻譯以獲得簡并DNA序列?？紤]到單個(gè)密碼子的固有頻率，通過GeneOptimizer程序(來自Geneart，Regensburg)4吏這些DNA序列適應(yīng)于油菜、大豆和亞麻中的密碼子選擇。在體外合成以該方法獲得的優(yōu)化序列，其在SEQIDNO.64(A5-延伸酶)和SEQIDNO.122(編碼SEQIDN0.123鑒定的蛋白質(zhì))(A6-延伸酶)中指出。實(shí)施例5:克隆表達(dá)質(zhì)粒用于在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)為表征經(jīng)優(yōu)化核酸序列的功能，將各DNA的可讀框克隆到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖誘導(dǎo)型GAL1啟動(dòng)子下游，獲得質(zhì)粒pOTEl.2(包含A6-延伸酶序列)和pOTE2.2(包含A5-延伸酶序列)?？寺〉浇湍篙d體pYES2.1/V5-His-TOPO中的延伸酶序列概述:基因名稱SEQID氨基酸pOTEl.l，(A-6-延伸酶)SEQIDNO.143292pOTE1.2，(A隱6-延伸酶)SEQIDNO.122292，優(yōu)化的密碼子pOTE2.1，(A-5畫延伸酶)SEQIDNO.109300pOTE2.2，(A-5畫延SEQIDNO.64300，優(yōu)化的密碼伸酶)子通過電穿孔法(1500V)用載體pOTE1.2和pOTE2.2及分別包含編碼A6-延伸酶和A5-延伸酶的天然核酸序列的比較構(gòu)建體pOTEl.l和pOTE2.1對釀酒酵母菌抹(Saccharomycescerevisiae)334進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化了空載體pYES2的酵母用作對照。在含2%葡萄糖但無尿嘧啶的完全基本培養(yǎng)基(CMdum)瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化的酵母。選擇后，在每種情況下糸L選三個(gè)轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一步的功能表達(dá)。為表達(dá)Ot延伸酶，首先，在每種情況下用篩選的轉(zhuǎn)化體接種含2%(w/v)棉子糖但無尿嘧啶的5mlCMdum液體培養(yǎng)基組成的預(yù)培養(yǎng)物并在30°C，200rpm下培養(yǎng)2天。然后用預(yù)培養(yǎng)物接種含2%棉子糖的5mlCMdum液體培養(yǎng)基(無尿嘧啶)至OD6。。為0.05。此外，在每種情況下，向pOTEl.l和pOTE1.2轉(zhuǎn)化的酵母培養(yǎng)物中加入0.2mMy-亞麻酸(GLA)?；贠tELOl.l的活性，期望Y-亞麻酸延伸為20:3脂肪酸。在花生四烯酸和二十碳五烯酸。對應(yīng)OtEL02.1的活性，期望脂肪酸ARA和EPA分別延伸為22:4和22:5脂肪酸。通過加入2%(w/v)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)物在20。C繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)。實(shí)施例6:酵母中OtEL02.2(如SEQIDNO:64中描述)和OtELOl.2(如SEQIDNO:122中)的表達(dá)以如下方式分析如在實(shí)施例5中用質(zhì)粒pYES2、pOTE1.2和pOTE2.1轉(zhuǎn)化的酵母為除去殘留培養(yǎng)基和脂肪酸，通過離心(100xg，5分鐘，20。C)從主要培養(yǎng)物中收集酵母細(xì)胞并用100mMNaHC03，pH8.0進(jìn)行洗滌。通過酸性甲醇分解從酵母細(xì)胞沉淀中制備脂肪酸甲脂(FAMEs)。為此目的，用2ml1N硫酸的甲醇溶液(methanolicsulfuricacid)和2%(v/v)二甲氧基丙烷在80。C溫育細(xì)胞沉淀1小時(shí)。通過用石油醚(PE)萃取兩次來萃取FAMEs。為除去未衍生的脂肪酸，用2ml100mMNaHC03，pH8.0和2ml蒸餾水洗滌有機(jī)相各一次。然后用Na2S04干燥PE相、在氬氣下蒸發(fā)并在100plPE中吸收。在帶有火焰電離檢測器的Hewlett-Packard6850氣相色譜儀的DB-23毛細(xì)管柱(30m，0.25mm,0.25fim，Agilent)上分離樣品。GLC分析條件如下爐溫設(shè)定為以5。C/分鐘速率從50。C至250°C并最終在250°C(保持)10分鐘。通過利用適當(dāng)?shù)闹舅針?biāo)準(zhǔn)品(Sigma)比較滯留時(shí)間來鑒定信號。例如在Napier和Michaelson(2001)Lipids36(8):761-766;Sayanova等人(2001)JournalofExperimentalBotany52(360):1581-1585，Sperling等人(2001)Arch.Biochem.Biophys.388(2):293-298和Michaelson等人(1998)FEBSLetters439(3):215-218中描述了該方法。在表1中描述了分析結(jié)果。確定pOTEl.l/pOTEl.2和pOTE2.1/2.2的適當(dāng)活性是可能的。優(yōu)化序列(分別pOTEl.2和pOTE2.2)在兩種情況下都顯示活性。相比于野生型序列，？01￡1.2只能輕微地提高？亞麻酸的合成。相反，對于pOTE2,2可能令人驚訝地觀察到活性的增加和特異性的改變(表l)。在該方面，EPA延伸的活性已經(jīng)幾乎加倍，而ARA的延伸已經(jīng)超過四倍。因此在酵母中等量底物的情況下，用來自O(shè)streococcustauri的A5-延伸酶的序列的優(yōu)化增加DHA前體產(chǎn)量6倍是可能的。實(shí)施例7:克隆表達(dá)質(zhì)粒用于植物中的種子特異性表達(dá)除非另有說明，以下描述的一般條件應(yīng)用于所有的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明，pBinl9、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA或pSUN優(yōu)選用于下面的實(shí)施例。雙元載體及它們用途的綜述可在Hellens等人，TrendsinPlantScience(2000)5:446—451中找到。使用如DE10205607中描述的pGPTV衍生物。該載體與pGPTV的不同之處是額外插入的Ascl限制酶切割位點(diǎn)?？寺》椒ǖ钠瘘c(diǎn)為克隆載體pUC19(Maniatis等人)。在第一步中，用如下引物擴(kuò)增conlinin啟動(dòng)子片段CnllC5，gaattcggcgcgccgagctcctcgagcaacggttccggcggtatagagttgggtaattcgaCnllC3，cccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgatPCR混合物的組成(50nl):5.00jil模板cDNA5.00jil10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl5.00jil2mMdNTP1.25jil每種引物(lOpmol/fil)0.50Advantage聚合酶(CIontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶EcoRI在37。C溫育2小時(shí)，并然后與限制性內(nèi)切酶Smal在25°C溫育12小時(shí)。用同樣方式溫育克隆載體pUC19。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和2668bp切割的載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒(QiagenGelPurificationKit)按制造商的說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒(RapidLigationKit)用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19畫Cnll畫C。在下一步中，使用如下引物從載體pGPVT-USP/OCS(DE10205607)擴(kuò)增OCS終止子(GenbankAccessionV00088;DeGreve，H.，等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1(6):499-511):OCS—C5，aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgccOCS_C3，cccgggccggacaatcagtaaattgaacggagPCR混合物的組成(50jil):5.00pi模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl5.00jil2mMdNTP1.25jil每種引物(lOpmol/jil)0.50piAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶Stul在37°C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶Smal在25°C溫育12小時(shí)。載體pUC19-Cnll-C與限制性內(nèi)切酶Smal在25。C溫育12小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后的載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll-C—OCS。在下一步中，用如下引物通過PCR擴(kuò)增Cnll-B啟動(dòng)子Cnll-B5，aggcctcaacggttccggcggtatagCnll-B3，cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttctPCR混合物的組成(50fil):5.00pi模板cDNA5.00nl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00pi2mMdNTP1.25pi每種引物(10pmol/pl)0.50ftlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶Stul在37°C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶Smal在25。C溫育12小時(shí)。載體pUC19-Cnll-C與限制性內(nèi)切酶Smal在25°C溫育12小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后的載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商i兌明書純化DNA。隨后，連接栽體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll-C_CnllB_OCS。在下一步中，插入CnllB的OCS終止子。為此，用如下引物進(jìn)行PCR:OCS25，aggcctcctgctttaatgagatatgcgagacOCS23，cccgggcggacaatcagtaaattgaacggagPCR混合物的組成(50jil):5.00pi模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00pi2mMdNTP1.25nl每種引物(lOpmol/fil)0.50nlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶Stul在370C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶Smal在25°C溫育12小時(shí)。載體pUC19-CnllC—CnllB_OCS與限制性內(nèi)切酶Smal在25。C溫育12小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll-C—CnllB—OCS2。在下一步中，用如下引物通過PCR擴(kuò)增Cnll-A啟動(dòng)子Cnll-B5，aggcctcaacggttccggcggtatagagCnll-B3，aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggtPCR混合物的組成(50jU):5.00jil模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00fil2mMdNTP1.25nl每種引物(10pmol/jil)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶Stul在37。C溫育2小時(shí)。載體pUC19-Cnll-C與限制性內(nèi)切酶Smal在25。C溫育12小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-CnllC_CnllB—CnllA—OCS2。在下一步中，插入CnllA的OCS終止子。為此，用如下引物進(jìn)行PCR:OCS25，ggcctcctgctttaatgagatatgcgaOCS23，aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggagaPCR混合物的組成(50^1):5.00fil模板cDNA5.00nl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00pi2mMdNTP1.25fil每種引物(10pmol/nl)0.50nlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶Stul在37。C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶HindlII在370C溫育2小時(shí)。載體pUC19-CnllCj:iillBj:nllA—OCS2與限制性內(nèi)切酶Stul在37°C溫育2小時(shí)并與限制性內(nèi)切酶HindIII在37°C溫育2小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后的載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll-C—CnllB—CnllA—OCS3。在下一步中，質(zhì)粒pUC19-CnllC—CnllB—CnllA—OCS3用于克隆A6畫、A5-去飽和酶和A6-延伸酶。為此，用如下PCR引物擴(kuò)增PhytiumirregulareA6-去飽和酶(WO02/26946):D6Des(Pir)5，agatctatggtggacctcaagcctggagtgD6Des(Pir)3，ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgatPCR混合物的組成(50nl):5.00nl模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00fil2mMdNTP1.25jil每種引物(lOpmol/jil)0.50Advantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶BglII在37°C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶Ncol在37°C溫育2小時(shí)。載體pUC19-CnllC_CnllB_CnllA_OCS3與限制性內(nèi)切酶BglII在37。C溫育2小時(shí)并與限制性內(nèi)切酶NcoI在3"C溫育2小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后載體并切除對應(yīng)的DNA片段用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll—d6Des(Pir)。在下一步中，質(zhì)粒pUC19-Cnll—d6Des(Pir)用于克隆Thraustochytriumssp.A5-去飽和酶(WO02/26946)。為此，用如下PCR引物擴(kuò)增破嚢壺菌(Thraustochytriumssp.)A5-去飽和酶D5Des(Tc)5，gggatccatgggcaagggcagcgagggccgD5Des(Tc)3,:ggcgcegacaccaagaagcaggactgagatatcPCR混合物的組成(50jd):5.00pi模板cDNA5.00fil10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00jil2mMdNTP1.25nl每種引物(10pmol/nl)0.50nlAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶BamHI在37°C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶EcoRV在37°C溫育2小時(shí)。載體pUC19-Cnll—d6Des(Pir)與限制性內(nèi)切酶BamHI在37°C溫育2小時(shí)并與限制性內(nèi)切酶EcoRV在37°C溫育2小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cn11—d6Des(Pir)_d5Des(Tc)。在下一步中，質(zhì)粒pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)用于克隆展葉劍葉蘚(Physcomitrellapatens)A6-延伸酶(WO01/59128)，為此目的，用如下PCR引物擴(kuò)增后者D6Elo(Pp)5，gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtgD6Elo(Pp)3，gcaaaagggagctaaaactgagtgatctagaPCR混合物的纟且成(50nl):5.00pi模板cDNA5.00jil10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00jil2mMdNTP1.25fil每種引物(10pmol/nl)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94。C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物先與限制性內(nèi)切酶Notl在37°C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶Xbal在37°C溫育2小時(shí)。載體pUC19-Cnll—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)與限制性內(nèi)切酶Notl在37°C溫育2小時(shí)并與限制性內(nèi)切酶Xbal在37°C溫育2小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物和切割后栽體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cn11—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)。由pUC19-CnU—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)JD6Elo(Pp)開始制備用于植物轉(zhuǎn)化的雙元載體。為此，pUC19-Cnlld6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)與限制性內(nèi)切酶AscI在37。C溫育2小時(shí)。用同樣方式處理載體pGPTV。隨后，來自pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6EIo(Pp)的片段和切割后的pGPTV載體用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接栽體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pGPTV-Cnll—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)。使用進(jìn)一步的構(gòu)建體pGPTV-Cnll—d6Des(Pir)d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)。為此，由pUC19-CnIlC_OCS開始用如下引物進(jìn)行擴(kuò)增Cnll一OCS5，gtcgatcaacggttccggcggtatagagttgCnll一OCS3，gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggagaPCR混合物的組成(50nl):5.00jil模板cDNA5.00nl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00nl2mMdNTP1.25jil每種引物(lOpmoI/pl)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55°C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶Sail在37。C溫育2小時(shí)。載體pUC19與限制性內(nèi)切酶Sail在37°C溫育2小時(shí)。隨后，PCR產(chǎn)物和切割后載體用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll—OCS。在下一步中，將金盞花(Calendulaofficinalis)A12-去飽和酶基因(WO01/85968)克隆至pUC19-Cnll—OCS中。為此，用如下引物擴(kuò)增dl2Des(Co):D12Des(Co)5，agatctatgggtgcaggcggtcgaatgcD12Des(Co)3，ccatggttaaatcttattacgataccPCR混合物的組成(50jil):5.00fil模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00jil2mMdNTP1.25pi每種引物(lOpmol/jil)0.50jilAdvantage聚合酶(Clontech)PCR反應(yīng)條件退火溫度1分鐘55。C變性溫度1分鐘94°C延伸溫度2分鐘72。C循環(huán)數(shù)35PCR產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶BglII在37°C溫育2小時(shí)然后與限制性內(nèi)切酶NcoI在37。C溫育2小時(shí)。用同樣方式溫育載體pUC19-Cnll—OCS。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR片段和切割后載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接栽體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序^ii獲得的質(zhì)粒pUC19-Cnll—D12Des(Co)。質(zhì)粒pUC19-Cnll_D12Des(Co)和質(zhì)粒pUC19Cnlld6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)與限制性內(nèi)切酶Sail在37。C溫育2小時(shí)。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離載體片段和切割后載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和和載體片段。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pUC19-Cn11d6Des(Pir)—d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co)。由pUC19-Cnll_d6Des(Pir)—d5Des(Tc)D6Elo(Pp)一D12Des(Co)開始制備用于植物轉(zhuǎn)化的雙元載體。為此，pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)與限制性內(nèi)切酶AscI在37。C溫育2小時(shí)。用同樣方式處理載體pGPTV。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳分離來自pUC19畫Cn11—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)的片段和切割后的pGPTV載體并切除對應(yīng)的DNA片段。用Qiagen凝膠純化試劑盒按制造商說明書純化DNA。隨后，連接載體和PCR產(chǎn)物。Roche的快速連接試劑盒用于此目的。通過測序驗(yàn)證獲得的質(zhì)粒pGPTV-Cnlld6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)D12Des(Co)。種子特異性表達(dá)構(gòu)建體用途的其它實(shí)施例是Napin啟動(dòng)子。在Wu等人(2005)Nat.Biotech.23:1013-1017中描述了用載體pGPTV或pSUN制備這些表達(dá)構(gòu)建體。適合植物轉(zhuǎn)化的另一載體是pSUN2。為使載體內(nèi)存在的表達(dá)盒數(shù)目增力口至多于四個(gè)，該載體與Gateway系統(tǒng)(Invitrogen，Karlsruhe)組合4吏用。為此，如下描迷按照制造商的說明書將GatewayA盒插入載體pSUN2:pSUN2載體(1jig)與限制性內(nèi)切酶EcoRV在37。C溫育1小時(shí)。然后使用來自Roche,Mannheim的快速連接試劑盒將GatewayA盒(Invitrogen，Karlsruhe)連接到切割后的載體中。將獲得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DB3.1細(xì)胞(Invitrogen)中。然后通過測序驗(yàn)證分離的質(zhì)粒pS跳GW。在第二步中，用Ascl從pUC19畫Cnll—d6Des(Pir)—d5Des(Tc)—D6Elo(Pp)—D12Des(Co)切下表達(dá)盒并連接到同樣處理的載體pSUN-GW中。以該方式獲得的質(zhì)粒pSUN-4G用于其它基因構(gòu)建體。為此目的，首先按照制造商說明書(Invitrogen)修飾pENTR克隆。質(zhì)粒pENTRlA(Invitrogen)與限制性內(nèi)切酶EcoRI在37°C溫育1小時(shí)然后用Klenow酶和1pMdNTP混合物處理30分鐘，并隨后將Ascl接頭(5，-ggcgcgcc;5，端磷酸化，雙鏈)連接到pENTRlA載體中。如上描述將基因逐步插入在這些修飾的Cnl盒并通過Ascl轉(zhuǎn)移進(jìn)入pENTR載體，獲得pENTR-Cnl載體。在下一步中，制備pSUN-8G構(gòu)建體。為此目的，產(chǎn)生具有SEQIDNOs:1、3、5和7的基因的5，和3，引物(其含有如上描述的限制性切割位點(diǎn)及可讀框的前20個(gè)和在每種情況下最后20個(gè)核苷酸)，并用標(biāo)準(zhǔn)條件(見上)擴(kuò)增并連接到pENTR-Cnl載體中，其隨后按照制造商說明書與pSUN-4G載體進(jìn)4亍重組反應(yīng)。以該方式制備構(gòu)建體pSUN-8G并轉(zhuǎn)化到芥菜(Brassicajuncea)和歐洲油菜(Brassicanapus)中。通過氣相色譜分析轉(zhuǎn)基因植物的種子。用于芥菜和歐洲油菜轉(zhuǎn)化的另一構(gòu)建體是構(gòu)建體pSUN-9G。用油菜籽蛋白(napin)啟動(dòng)子根據(jù)Wu等人(2005)Nat.Biotech.23:1013-1017制備該構(gòu)建體。在Wu等人2005的修改方法中，用所述方式插入0促L02,2的編碼序列代替基因OmELO。然后將獲得的構(gòu)建體pSUN-9G轉(zhuǎn)化到芥菜和歐洲油菜中。實(shí)施例8:從植物材料中提取脂類通過在合適條件(例如上面所描述)下生長經(jīng)修飾的植物并分析用于提高目的產(chǎn)物(即脂類或脂肪酸)產(chǎn)量的培養(yǎng)基和/或細(xì)胞成分可確定植物中遺傳修飾對目的化合物(如脂肪酸)產(chǎn)量的影響。這些分析技術(shù)為技術(shù)人員已知并包括光譜學(xué)、薄層層析法、多種類型的染色方法、酶學(xué)及微生物學(xué)方法和分析型層析例如高效液相色譜法(見，例如，Ullman，EncyclopediaofIndustrialChemistry,巻A2，頁89-90和頁443-613,VCH:Weinheim(1985);FallonA.等人(1987)"ApplicationsofHPLCinBiochemistry"in:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,巻17;Rehm等人(1993)Biotechnology,巻3，章III:"Productrecoveryandpurification",頁469-714，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人(1988)Bioseparations:downstreamprocessingforBiotechnology,JohnWiley和Sons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)RecoveryprocessesforbiologicalMaterials,JohnWiley和Sons;Shaeiwitz，J.A.和Henry,J.D.(1988)BiochemicalSeparations,in:Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,巻B3;章11，頁1-27，VCH:Weinheim;和Dechow，F(xiàn).J.(1989)Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications)除了上面提及的方法，如Cahoon等人(1999)Proc.Natl.Acad，Sci.USA96(22):12935-12940和Browse等人(1986)AnalyticBiochemistry152:141-145描述的從植物材料中提取植物脂類。Christie,WilliamW.，AdvancesinLipidMethodology,Ayr/Scotland:OilyPress(OilyPressLipidLibrary;2);Christie,WilliamW.，GasChromatographyandLipids.APracticalGuide-Ayr,Scotland:OilyPress,1989，Repr.1992,IX，307pp.(OilyPressLipidLibrary;1);"ProgressinLipidResearch,Oxford:PergamonPress,1(1952)-16(1977)underthetitle:ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN描述了脂類或脂肪酸的定性及定量分析。除了測量發(fā)酵的終產(chǎn)物以外，還可分析用于產(chǎn)生目的化合物的代謝途徑中的其它成分例如中間體和副產(chǎn)物以測定該化合物的總生產(chǎn)效率。分析方法包括測量培養(yǎng)基中營養(yǎng)物(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸鹽和其它離子)的量，測量生物量的組成和生長，分析生物合成途徑中的常規(guī)代謝物的產(chǎn)生和測量發(fā)酵期間所產(chǎn)生的氣體。用于這些測量的標(biāo)準(zhǔn)方法在IRLPress出版社P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編輯的《AppliedMicrobialPhysiology;APracticalApproach》(ISBN:0199635773)的第103-129頁、第131-163頁和第165-192頁以及其中所引用的參考文獻(xiàn)中描述。一個(gè)分析的例子是脂肪酸的分析(縮略語FAME,脂肪酸甲酯；GC-MS，氣液色鐠/質(zhì)譜；TAG,三酰甘油；TLC,薄層層析)?？扇鏑hristie及其中的參考文獻(xiàn)(1997年Dundee的OilyPress出版社Christie的《AdvancesonLipidMethodology》第四版中第119-169頁；1998年Gaschromatographie-Massenspektrometrie畫Verfahren[GasChromatography/massspectrometricmethods],Lipide33:343-353)數(shù)次描述的那樣^^用分析性標(biāo)準(zhǔn)方法GC、GC-MS或TLC通過分析重組生物清楚無誤地檢測脂肪酸產(chǎn)物的存在。欲分析的材料可通過超聲處理、玻璃磨中研磨、液氮和研磨或者通過其它可利用的方法加以破碎。這種材料在破碎后必須離心。在蒸餾水中重懸沉淀，10(TC加熱10分鐘，水上冷卻并且再次離心，然后在含0.5M硫酸和2%二曱氧基丙烷的甲醇溶液中卯。C提取1小時(shí)，由此產(chǎn)生了已水解的油和脂類化合物，產(chǎn)生了已轉(zhuǎn)曱基化的脂類。這些脂肪酸甲酯在石油醚中提取并且最后通過使用毛細(xì)管柱(Chrompack，WCOTFusedSilica,CP-Wax-52CB，25pm,0.32mm)經(jīng)20分鐘的170。C至240。C之間的溫度梯度并且在240。C維持5分鐘進(jìn)行GC分析。得到的脂肪酸甲酯的身份必須使用可從商業(yè)來源獲得的標(biāo)準(zhǔn)品(即Sigma)確定。首先通過往返于研桿和研缽之間機(jī)械地勻漿植物材料以使其更便于提取。隨后100。c加熱io分鐘并且在;水上冷卻后再次離心。細(xì)胞沉淀以iM硫酸的曱醇溶液(methanolicsulfuricacid)和2%二甲氧基丙烷卯。C水解一小時(shí)并且將脂類轉(zhuǎn)曱基化。得到的脂肪酸曱酯(FAME)在石油醚中抽提。所提取的FAME通過使用毛細(xì)管柱(Chrompack,WCOTFusedSilica,CP-Wax-52CB，25pm，0.32mm)的氣液色i普經(jīng)20分鐘的170oC至240°C之間的溫度梯度并且在240°C維持5分鐘進(jìn)行分析。脂肪酸甲酯的身份通過與相應(yīng)FAME標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)的比較確認(rèn)。雙鍵的身份和位置通過使FAME混合物適當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)衍生以產(chǎn)生例如4,4-二甲氧5悉唑啉衍生物(Christie,1998)經(jīng)GC-MS進(jìn)一步分析。實(shí)施例9:來自O(shè)streococcustauri的優(yōu)化的A5-延伸酶(如SEQIDNO:64中描迷)用于組成型表達(dá)構(gòu)建體的用途產(chǎn)生基于pGPTV-35S的轉(zhuǎn)化栽體和基于pBIN19-35S(BevanM.(1984)Nucl.AcidsRes.18:203)的質(zhì)粒用于植物轉(zhuǎn)化。為此目的，首先將由啟動(dòng)子元件CaMV35S(SEQIDNo.161)和35S終止子(SEQIDNO.162;Franck，A.等人(1980)Cell21(1):285-294)組成的表達(dá)盒裝配到pUC載體中。這需要經(jīng)Sall/Xbal限制性切割位點(diǎn)插入的啟動(dòng)子和經(jīng)BamHI/Smal限制性切割位點(diǎn)插入的終止子。此外，帶有Xhol切割位點(diǎn)的多接頭連接到終止子上(三重連接)。得到的質(zhì)粒pUC19-35S然后用于克隆PUFA基因。平行地，A6-去飽和酶(SEQIDNO.1)、A5-去飽和酶(SEQIDNO.51)和A6-延伸酶(SEQIDNO.171)序列的可讀框經(jīng)EcoRV切割位點(diǎn)插入到pUC19-35S載體。得到的質(zhì)粒pUC-D6、pUC-D5、pUC-E6(Tc)用于構(gòu)建雙元載體pGPTV-35S—D6D5E6(Tc)。為此目的，用酶Sail消化載體pGPTV,用Sall/Xhol消化質(zhì)粒pUC-D6,并連接正確的片段。隨后用Sail消化得到的質(zhì)粒pGPTV-D6，用Sall/Xhol消化質(zhì)粒pUC-D5，并連接正確的片段。然后再用SalI消化所獲質(zhì)粒pGPTV-D6-D5一次，用SalI/XhoI消化質(zhì)粒pUC-E6(Tc)，并連接正確的片段。這些連續(xù)的克隆步驟生成雙元載體pGPTV-D6D5E6(Tc)，其用于轉(zhuǎn)化。在下一步中，d6Elo(Tp)(SEQIDNO.163)的序列代替d6Elo(Tc)序列插入到載體pUC19-35S中。所獲質(zhì)粒pUC-E6(Tp)用于制備雙元載體pGPTV-35S一D6D5E6(Tp)。在下一步中，將co3Des(SEQIDNO.193)的可讀框克隆到pUC19-35S中。所獲質(zhì)粒pUC-co3Pi經(jīng)Sall/Xhol轉(zhuǎn)移至雙元載體pGPTV-D6D5E6(Tc)和pGPTV-D6D5E6(Tp)。所獲載體pGPTV-D6D5E6(Tc)co3Pi和pGPTV-D6D5E6(Tp)o3Pi用于植物轉(zhuǎn)化。在下一步中，將來自O(shè)streococcustauri的優(yōu)化A5-延伸酶的可讀框(SEQIDNo.64)和來自破嚢壺菌的A4-去飽和酶的可讀框(SEQIDNo.77)克隆到pUC19-35S中。按照上面的敘述通過Sall/Xhol將所獲質(zhì)粒pUC-E5和pUC-D4轉(zhuǎn)移至載體pGPTV-D6D5E6(Tp)o3Pi中。所獲栽體pGPTV畫D6D5E6(Tp)co3PiE5D4用于植物轉(zhuǎn)化。按照生產(chǎn)商說明書將所有雙元載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細(xì)胞(Invitrogen)中。通過PCR鑒定陽性克隆并分離質(zhì)粒DNA(QiagenDneasy)。實(shí)施例10:組成型雙元載體向植物的轉(zhuǎn)化a)轉(zhuǎn)基因植物歐洲油菜和芥菜的產(chǎn)生。使用油菜植物轉(zhuǎn)化方案(Moloney等人(1992)PlantCellReports8:238-242的改進(jìn)方法)。將雙元載體pGPTV-D6D5E6(Tp)co3PiE5D4轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌C58Cl:pGV2260中(Deblaere等人(1984)Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)。陽性轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌落的過夜培養(yǎng)物在添加有3%蔗糖的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)(3MS培養(yǎng)基)中1:50稀釋后用于轉(zhuǎn)化諸葛菜(Orychophragmusviolaceus)。新萌發(fā)的無菌植物的葉柄或下胚軸(在每種情況下約1cm2)在培養(yǎng)jDL內(nèi)與1:50的農(nóng)桿菌稀釋物溫育5-10分鐘。隨后在添加有0.8%Bacto瓊脂的3MS培養(yǎng)基上在25。C黑暗中共培育3天。隨后，在添加有500mg/1頭孢參將(頭孢蓉將鈉)、50mg/1卡那霉素、20千基氨基噪呤(BAP)和1.6g/l葡萄糖的MS培養(yǎng)基上以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗及每周節(jié)律繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移長出的苗至添加有2%蔗糖、250mg/1頭孢噻肟和0.8%Bacto瓊脂的MS培養(yǎng)基上。如果三周后根未發(fā)育，那么向培養(yǎng)基添加2-吲咮丁酸作為生根用生長激素。在含卡那霉素和頭孢噻肟的2MS培養(yǎng)基上獲得再生苗，然后在生根后，轉(zhuǎn)移至土壤并，栽培后，在受控環(huán)境箱或溫室內(nèi)生長兩周，允許開花，收獲成熟種子并通過脂類分析來分析延伸酶的表達(dá)如A6-延伸酶活性或A5-或A6-去飽和酶活性。以該方式，鑒定到多不飽和C20-和C22-脂肪酸含量升高的抹系。b)轉(zhuǎn)基因諸葛菜植物的產(chǎn)生使用如a)中描述的油菜植物轉(zhuǎn)化方案(Moloney等人(1992)PlantCdlReports8:238-242的修改方案)。為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，將雙元載體pGPTV-D6D5E6(Tp)o3PiE5D4轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌C58Cl:pGV2260中(Deblaere等人(1984)Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)。陽性轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌落的過夜培養(yǎng)物在含3%蔗糖的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)(3MS培養(yǎng)基)中l(wèi):50稀釋后用于轉(zhuǎn)化諸葛菜。新萌發(fā)的無菌植物的葉柄或下胚軸(每種約1cm2)在培養(yǎng)臟內(nèi)與1:50的農(nóng)桿菌稀釋物溫育5_10分鐘。隨后在添加有0.8%Bacto瓊脂的3MS培養(yǎng)基上在25。C暗中共溫育3天。隨后在含500mg/1頭孢噻將(頭孢噢將鈉)、15mg/1卡那霉素、20nM節(jié)基氨基噤呤(BAP)和1.6g/1葡萄糖的MS培養(yǎng)基上以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗及每周節(jié)律繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移長出的苗至添加有2%蔗糖、250mg/1頭孢瘞肟和0.8%Bacto瓊脂的MS培養(yǎng)基。如果三周后根未發(fā)育，那么向培養(yǎng)基添加2-吲咮丁酸作為生根用生長激素。在含卡那霉素和頭孢噻肟的2MS培養(yǎng)基上獲得再生苗并，并在生根后轉(zhuǎn)移至土壤，并栽培后，在受控環(huán)境箱或溫室內(nèi)生長兩周，允許開花，收獲成熟種子并通過脂類分析來檢驗(yàn)延伸酶的表達(dá)如A-6-延伸酶活性或A-5-或A-6-去飽和酶活性。以該方式鑒定多不飽和C20-和C22-脂肪酸含量升高的林系。c)擬南芥植物的轉(zhuǎn)化使用Bechthold等人(1993)C.R.Acad.Sci.Ser.IllSci.Vie.316:1194-1199的方案。為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，將產(chǎn)生的雙元載體pGPTV-D6D5E6(Tp)(o3PiE5D4轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌C58Cl:pMP卯中(Deblaere等人(1984)Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)，并按照Bechthold等人(1993)的方案，將擬南芥cv.Columbia0的花浸在OD600=1.0的農(nóng)桿菌溶液中。兩天后再次重復(fù)該步驟。然后將這些花的種子放置于含V2MS、2%蔗糖和50mg/1卡那霉素的瓊脂板上。然后將綠色幼苗轉(zhuǎn)移至土壤。實(shí)施例11:轉(zhuǎn)基因諸葛菜屬(Orychophragmus)或擬南芥植物的植物材料的分析如實(shí)施例8中描述進(jìn)行pGPTV-D6D5E6(Tp)co3PiE5D4轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物諸葛茱和擬南芥葉片材料的提取及氣相色譜分析。表2顯示分析結(jié)果。多種脂肪酸以重量百分比指出?？赡鼙砻鏖L鏈多不飽和脂肪酸由兩種不同植物物種合成。與例如Robert等人(2005)FunctionalPlantBiology32:473-479才艮道的用擬南芥獲得1.5%DHA相比，利用來自O(shè)streococcustauri的AS-延伸酶的優(yōu)化序列(如SEQIDNO:64中描述)得到顯著更高的DHA產(chǎn)量，這是令人驚訝的。第一次實(shí)現(xiàn)諸葛菜中長鏈多不飽和脂肪酸的合成是可能的。實(shí)施例12:轉(zhuǎn)基因芥菜林系種子的分析如實(shí)施例8中描述進(jìn)行pSUN-9G轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因芥菜種子的提取和氣相色鐠分析。表6顯示分析結(jié)果。多種脂肪酸以百分比面積指出。如在Wu等人2005中，可能表明長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)的合成。令人驚奇地，修飾的延伸酶序列OtEL02.2如SEQIDNO:64描述的核酸序列的使用導(dǎo)致C22脂肪酸含量顯著提高。總之，以重量％計(jì)，種子油含約8。/。的多不飽和C22脂肪酸。尤其是，以重量％計(jì)種子油中脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)的含量為1.9%，表示與Wu等人2005相比升高10倍。實(shí)施例13:來自"^者葛菜葉材料的的脂類類別和位置分析的詳細(xì)分析約lg的葉組織在4ml異丙醇中95。C下加熱10分鐘，通過Polytron進(jìn)行勻漿并在加入1.5ml氯仿后振蕩。將樣品離心，收集上清液，并用異丙醇氯仿1:1(v/v)再次抽提沉淀。將兩種提取物合并，干燥并在氯仿中溶解。在二氧化硅prepsep柱(FisherScientific,Nepean，加拿大)上將脂提取物預(yù)分級分離成中性脂類、糖脂和磷脂，分別用氯仿乙酸100:1(v/v)、丙酮乙酸100:1(v/v)和甲醇氯仿水100:50:40(v/v/v)洗脫。這些級分在二氧化硅G-25薄層層析板(TLC;Macherey-Nagel，Dtiren，德國)上進(jìn)一步分級分離。中性脂類用己烷二乙醚乙酸(70:30:1)顯色，糖脂用氯仿曱醇氨(65:25:4v/v/v)顯色，且磷脂用氯仿曱醇氨水(70:30:4:1v/v/v/v)顯色。在UV燈下用櫻草靈噴霧后鑒定各脂類，用于進(jìn)一步的分析。通過公開的方法分級分離多種脂類(中性脂類、磷脂和半乳糖脂)并分別分析是可能的。糖脂用于額外檢測各脂肪酸的位置。a)三酰甘油酯(TAG)的區(qū)域?qū)Ｒ恍苑治?至5毫克TLC純化的TAG在玻璃管中氮?dú)庀赂稍铮谒跃彌_液中通過短暫的超聲處理(1MTrispH8;2.2%CaCl2(w/v);0.05%膽汁鹽(w/v))重懸浮并在40°C溫育4分鐘。在加入0.1ml胰脂肪酶(水中10mg/ml)溶液后，將樣品劇烈渦旋3分鐘，并通過加入1ml乙醇和1.5ml4MHC1終止消化。用二乙醚兩次萃取部分消化的TAG,用水洗滌，干燥并在小體積的氯仿中溶解。如上對于中性脂類所述，在TLC板上從游離脂肪酸和未消化的TAG中分離單?；视?MAG)。對應(yīng)于MAG的點(diǎn)通過GC來分析并代表TAG的sn-2位置。通過以下公式來計(jì)算脂肪酸相對于剩余sn-1和sn-3位置的分布sn-1+sn-3=(TAGx3-MAG)/2。三酰甘油酯的該位置分析揭示在該情況下EPA和DHA以相似濃度存在于sn-2和sn-1/3位置中，而發(fā)現(xiàn)ARA全部地僅以少量存在于三酰甘油酯中，并且此處主要在sn-2位置中(表3)。b)磷脂的立體特異性分析分級分離并萃取的磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰膽堿(PC)在N2下干燥并在0.5ml硼酸鹽緩沖液(0.5M，pH7.5，含有0，4mMCaCl2)中重懸浮。短暫超聲處理后，加入來自莫桑比克眼鏡蛇(Najamossambica)毒液的5U磷脂酶A2(SigmaP-7778)和2ml二乙醚并在室溫下將樣品渦旋2小時(shí)。將醚相干燥，用0.3ml的1MHC1終止所述消化，并用氯仿甲醇(2:1v/v)萃取反應(yīng)混合物。在氯仿甲醇氨水(70:30:4:2v/v/v/v)中通過TLC分離消化的磷脂并且通過刮除來去除對應(yīng)于釋放的游離脂肪酸和溶血磷脂的點(diǎn)并直接進(jìn)行轉(zhuǎn)甲基作用。磷脂的位置分析顯示EPA和DHA在磷脂酰膽堿(PC)的sn-2位置中積累，而DHA類似地分別在磷脂酰乙醇胺(PE)的sn-1和sn-2位置中。在兩種磷脂中發(fā)現(xiàn)僅痕量的ARA或者沒有ARA(表4)。EPA和DHA在磷脂酰甘油中的濃度低于在其它研究的磷脂中的濃度，在該脂類類別中也觀察到在sn-2位置中的積累(表4，PG)。c)糖脂的立體特異性分析研究半乳糖脂作為其它極性脂類。半乳糖脂在質(zhì)體的膜中發(fā)現(xiàn)并在那里形成主要成分。TLC純化的單半乳糖二?；视?MGDG)和二半乳糖二?；视?DGDG)在氮?dú)庀赂稍锊⒃?.51111二乙醚中溶解。然后加入來自少才艮才艮霉(Rhizopusarrhizus)的25單位的脂肪酶(Sigma62305)(該脂肪酶在2ml硼酸鹽緩沖液(50mM，pH7.5含有2mMCaCl2)中重懸浮)，并且在室溫下將樣品渦旋2小時(shí)。將所述醚相干燥并通過加入0.311111MHC1終止消化作用，并用4ml氯仿甲醇(2:lv/v)萃取所述脂類。干燥后，消化的半乳糖脂存在于小體積的氯仿甲醇(2:1v/v)中并首先用氯仿曱醇氨7K(70:30:4:1v/v/v/v)在預(yù)涂布的二氧化硅TLC板上顯色兩次到達(dá)平板高度的約2/3，接著是在己烷二乙醚乙酸(70:30:1)中完全顯色。在用櫻草靈噴霧后鑒定了對應(yīng)于釋放的游離脂肪酸和溶血半乳糖脂的點(diǎn)，將其刮掉并直接進(jìn)行轉(zhuǎn)曱基用于GC分析。在這些脂類中發(fā)現(xiàn)VLCPUFA也是可能的，觀察到EPA在sn-2位置中的積累。僅在二半乳糖二?；视?DGDG)中發(fā)現(xiàn)了DHA，且在單半乳糖二?；视?MGDG)中未檢測到(表5)。VLCPUFA在半乳糖脂中的分布顯示了合成和隨后轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)，所述半乳糖脂是沒有預(yù)期含有這些脂肪酸的區(qū)室。極性脂類中的VLCPUFA具有特別的營養(yǎng)價(jià)值，因?yàn)橄啾扔谥行灾悾鼈兛梢栽诓溉閯?dòng)物腸內(nèi)被更好地吸收。表1:酵母中pOTEl.l和pOTE2.1優(yōu)化序列的檢測。根據(jù)底物轉(zhuǎn)化確定轉(zhuǎn)化率。用質(zhì)粒pOTE2.2中的優(yōu)化序列可以實(shí)現(xiàn)活性的顯著提高。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表2:諸葛菜和擬南芥葉材料的氣相色語分析。各脂肪酸以百分比面積指出。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>擬南芥葉材料的脂肪酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表3:來自轉(zhuǎn)基因諸葛菜植物葉材料的三酰甘油酯的區(qū)域?qū)Ｒ恍苑治?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表5:來自轉(zhuǎn)基因諸葛菜植物葉材料的半乳糖脂的立體特異性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>表6:氣相色譜確定用構(gòu)建體pSUN-9G轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因芥菜植物種子的脂肪酸(以重量百分比計(jì))。WT描述了未^"飾的野生型對照。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>權(quán)利要求1.在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的方法，其包括在植物中提供編碼具有Δ6-去飽和酶活性的多肽的至少一種核酸序列；編碼具有Δ6-延伸酶活性的多肽的至少一種核酸序列；編碼具有Δ5-去飽和酶活性的多肽的至少一種核酸序列；和編碼具有Δ5-延伸酶活性的多肽和任選地編碼Δ4-去飽和酶的至少一種核酸序列，其中編碼具有Δ5-延伸酶活性的多肽的核酸序列因?yàn)槠溥m應(yīng)于一種或更多植物物種中的密碼子選擇，與該序列的來源生物中的核酸序列相比較受到修飾。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述核酸序列至少適應(yīng)于油菜、大豆和/或亞麻中的密碼子選棒。3.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，其中考慮個(gè)體密碼子的固有頻率來適應(yīng)所述核酸序列。4.權(quán)利要求1到3任何一項(xiàng)的方法，其中所述經(jīng)修飾的核酸序列對應(yīng)于SEQIDNo.64中指出的核酸序列。5.權(quán)利要求1到4任何一項(xiàng)的方法，其中所述核酸序列在種子特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述啟動(dòng)子是USP、豌豆球蛋白、油茱沖予蛋白、Glp、SBP、過氧化物氧還蛋白(peroxireduxin)、豆球蛋白、Fad3、conlinin或油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子。7.權(quán)利要求6的方法，其中多不飽和C22脂肪酸在種子油中的含量以重量計(jì)為種子油含量的5%或更高。8.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中在植物中額外地提供一種或多種核酸序列，其編碼具有co3去飽和酶和/或A4-去飽和酶活性的多肽。9.權(quán)利要求8的方法，其中二十二碳六烯酸在種子油中的含量以重量計(jì)為種子油含量的1%或更高。10.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸主要作為酯如磷脂或三酰甘油酯以結(jié)合形式存在于植物中。11.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述植物為選自歐洲油菜、芥菜和大豆的產(chǎn)油植物。12.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，還包括從植物中以油、脂類或游離脂肪酸形式吸收二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。13.分離的核酸分子，其包含如在SEQIDNo.64中顯示的核酸序列。14.重組核酸分子，其包含a)在植物細(xì)胞中有活性的一個(gè)或更多拷貝的至少一種啟動(dòng)子，b)至少一種核酸序列，其編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽，c)至少一種核酸序列，其編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽，d)至少一種核酸序列，其編碼具有A6-延伸酶活性的多肽，e)至少一種核酸序列，其編碼具有A5-延伸酶活性的多肽并且由于適應(yīng)于一種或更多植物物種中的密碼子選擇，與該序列的來源生物中的核酸序列相比較受到修飾，和f)一個(gè)或更多拷貝的至少一種終止子序列。15.權(quán)利要求14的重組核酸分子，其中所述修飾的核酸分子對應(yīng)于在SEQIDNo.64中指出的核醋列。16.權(quán)利要求14或15任何一項(xiàng)的重組核酸分子，其額外地包含編碼具有co3-去飽和酶和/或A-4-去飽和酶活性的多肽的一種或多種核酸序列。17.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求22至25任何一項(xiàng)的重組核酸分子或包含在SEQIDNo.64中指出的核餅列。18.權(quán)利要求19中要求保護(hù)或通過權(quán)利要求18的方法獲得的油、脂類或游離脂肪酸用于生產(chǎn)飼料、食品、化妝品或藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸的方法。根據(jù)所述方法，提供了植物，該植物具有至少一種核酸序列，其編碼具有Δ6-去飽和酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有Δ6-延伸酶活性的多肽；至少一種核酸序列，其編碼具有Δ5-去飽和酶活性的多肽；和至少一種核酸序列，其編碼具有Δ5-延伸酶活性的多肽，其中編碼具有Δ5-延伸酶活性的多肽的核酸序列與該序列的來源生物中的核酸序列相比較受到修飾，使得它適應(yīng)于至少一種類型的植物中的密碼子選擇。為了產(chǎn)生二十二碳六烯酸，還向植物中引入編碼具有Δ4-去飽和酶活性的多肽的至少一種核酸序列。文檔編號C12N15/82GK101400798SQ200780007847公開日2009年4月1日申請日期2007年2月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日發(fā)明者B·程,G·吳,J·鮑爾,M·特魯克薩,P·奇爾普斯,T·韋特耶恩,X·邱申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司