專利名稱：：作為昆蟲控制劑的dsrna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一般而言，本發(fā)明涉及對有害生物(pest)侵襲的遺傳學(xué)控制。更具體地，本發(fā)明涉及雙鏈RNA重組技術(shù)，用于阻遏或抑制有害生物中靼編碼序列的表達(dá)。導(dǎo)論環(huán)境中充滿有害生物，人們已經(jīng)試圖^f吏用多種方法來控制有害生物對植物的侵襲。用于控制顯微有害生物侵襲的組合物已經(jīng)以抗生素、抗病毒和抗真菌組合物的形式提供。通常，用于控制較大有害生物(例如，線蟲)侵襲的方法是化學(xué)組合物的形式，其被應(yīng)用于有害生物駐留的表面，或者以小丸、散劑、片劑、糊劑或膠嚢劑的形式施用給受^:襲的動(dòng)物。商業(yè)作物通常是昆蟲攻擊的目標(biāo)。過去數(shù)十年來已經(jīng)做出了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，開發(fā)出了更高效的方法和組合物用于控制植物中的昆蟲侵襲?；瘜W(xué)殺蟲劑對于根除有害生物侵襲非常有用。然而，使用化學(xué)殺蟲劑有若干種缺點(diǎn)。化學(xué)殺蟲劑有可能對于環(huán)境有害，而且，化學(xué)殺蟲劑還不是選擇性的，其對于多種作物和非靶標(biāo)動(dòng)物群體同樣有害?；瘜W(xué)殺蟲劑持續(xù)存在于環(huán)境中，通常代謝得很慢(如果有代謝)。它們在食物鏈中積累，特別是高等食肉動(dòng)物物種中。這些化學(xué)殺蟲物質(zhì)的積累導(dǎo)致對這些物質(zhì)抗性的發(fā)展，并且可能在進(jìn)化梯中高等的物種中，成為誘變劑和/或致癌物，導(dǎo)致不可逆的和有害的遺傳修飾。因?yàn)榕c化學(xué)殺蟲劑相關(guān)的這些危險(xiǎn)，已經(jīng)開發(fā)了分子手段來控制植物上的有害生物侵襲。例如，蘇云金芽孢桿菌(必""'//附^"/7>^&朋&)(B.t.)細(xì)菌已經(jīng)可商業(yè)獲得，其在超過三十年來用作為環(huán)境安全的、可接受的殺昆蟲劑?；瘜W(xué)殺蟲物質(zhì)應(yīng)用的減少已經(jīng)產(chǎn)生了更干凈的土壤，以及從從土壤流入周圍溪流、河流、池塘和湖泊的更干凈的水。除了這些環(huán)境益處之外，由于化學(xué)殺昆蟲物質(zhì)使用的減少，在生長轉(zhuǎn)基因昆蟲抗性作物的作物田間，有益昆蟲數(shù)量也顯著增加了。RNA干擾(RNAi)提供了用于控制基因表達(dá)的潛在的強(qiáng)大工具，因?yàn)槠淠芴禺愋园邢蜻x捧，并且以顯著高的效率進(jìn)行靶向mRNA遏制。RNAi指通過短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Zamore，P.等人，O//101:25-33(2000);Fire,A.等人，391:806(1998);Hamilton等人,286，950-951(1999);Lin等人，A^""402:128-129(1999))。雖然RNAi的機(jī)制還沒有獲得完全表征，但是人們認(rèn)為，細(xì)胞中dsRNA的存在通過激活核糖核酸酶III切酶來觸發(fā)RNAi(Zamore，P.等人(2000);Hammond等人，7V"/m"404，293(2000))。切酶將的dsRNA加工為短片段，其被稱為短干擾RNA(siRNA),其為大約21至大約23個(gè)核苦酸長，包含約19個(gè)>^^"雙鏈體(231110^等人，(2000);Elbashir等人，Z)ev.，15，188(2001))。遞送進(jìn)細(xì)胞后，siRNA分子與內(nèi)切核酸酶復(fù)合物相關(guān)聯(lián)，該復(fù)合體通常被稱為RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC),其將siRNA的反義鏈和細(xì)胞mRNA基因耙?guī)У揭黄稹ISC切割mRNA，然后所述mRNA釋放并被降解。重要地，然后RISC能降解粑mRNA的額外拷貝。因此，本發(fā)明提供了通過阻遏、延遲或降低特定有害生物中的基因表達(dá)來控制有害生物侵襲的方法和組合物。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730--2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的核酸序列。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈核糖核苷酸序列，其是多核普^列的表達(dá)產(chǎn)生的，其中，植物的有害生物才聶入所述核糖核苷酸序列能抑制所述有害生物的生長。在又一實(shí)施方案中，才l^所述序列抑制與所述序列充分互補(bǔ)的核苷*列的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，用該多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在還一實(shí)施方案中，用該多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子或產(chǎn)品。在再一實(shí)施方案中，產(chǎn)品選自食品、飼料、纖維、紙、餐食、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉、青貯飼料、咖啡、茶和油構(gòu)成的纟且。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列示出的核紗列具有至少70。/。序列同一性的核苷酸序列。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈核糖核普酸序列，其是多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)生的，其中，植物的有害生物攝入所述核糖核苷酸序列能抑制所述有害生物的生長。在又一實(shí)施方案中，a/v所述序列抑制與所述序列充分互補(bǔ)的核苷酸序列的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，用該多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在還一實(shí)施方案中，用該多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子或產(chǎn)品。在再一實(shí)施方案中，產(chǎn)品選自食品、飼料、纖維、紙、餐食、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉、青貯伺料、咖啡、茶和油。在另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列或其互補(bǔ)序列的至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的直向同源物。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈核糖核苷酸序列，其是多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)生的，其中，植物的有害生物攝入所述核糖核苷酸序列能抑制所述有害生物的生長。在又一實(shí)施方案中，攝入所述序列抑制與所述序列充分互補(bǔ)的核苷酸序列的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，用該多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在還一實(shí)施方案中，用該多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子或產(chǎn)品。在再一實(shí)施方案中，產(chǎn)品選自食品、飼料、纖維、紙、餐食、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉、青貯飼料、咖啡、茶和油。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含源自有害生物物種的雙鏈核糖核酸序列的植物。在一種實(shí)施方案中，有害生物選自昆蟲、蜘蛛類、曱殼類、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、扁形動(dòng)物、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絳蟲、錐蟲、血吸蟲、狂蠅、跳蚤、壁虱、螨和虱。在另一實(shí)施方案中，植物;U&質(zhì)雄性不育的。在另一實(shí)施方案中，序列能抑制有害生物的生物學(xué)活性。在另一實(shí)施方案中，序列能抑制靼序列的表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，乾序列是昆蟲、線蟲、細(xì)菌或真菌序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括向有害生物提供植物材料，所述植物材料包含能抑制有害生物生物學(xué)活性的多核苦酸序列。在一種實(shí)施方案中，所述多核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49一158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621_767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730--2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、,2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列或其互補(bǔ)序列示出的。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含表達(dá)耙多核苷酸序列的植物的殺蟲劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于控制有害生物侵襲，所述方法包括(a)鑒定出有害生物中的靼序列；(b)將所述序列引入植物；以及(c)向所述有害生物提供所述植物或其部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于控制有害生物侵襲，所述方法包括(a)鑒定出第一有害生物物種中的把序列；(b)搜索出第二有害生物物種中的直向同源耙序列；(c)將所述直向同源序列引入植物；以及(d)向所述第二有害生物提供所述植物或其部分。在另一實(shí)施方案中，所述耙是來自馬鈴薯葉甲(L)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜(beet)、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜(canola)、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、,菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜(endive)、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠45^杉(gumhemlock)、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物(peat)、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣(radicchio)、蘿卜、油菜(rapeseed)、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔(tangerine)、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、芟生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于提高作物產(chǎn)量，所述方法包括U)向植物中引入多核苷酸；以及(b)種植所述植物，以令多核普g達(dá)，其中，所ii^達(dá)抑制有害生物進(jìn)食(feeding)以及由于有害生物侵襲導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。在一種實(shí)施方案中，所述有害生物選自昆蟲、線蟲和真菌。在另一實(shí)施方案中，多核苷^達(dá)產(chǎn)生下述RNA分子，其能在攝入了所述作物植物的一部分的昆蟲有害生物中遏制下述靶基因，其中，所迷耙基因執(zhí)行選自以下的至少一種重要功能有害生物進(jìn)食、有害生物生存能力(viability)、有害生物細(xì)胞凋亡、有害生物或任何有害生物細(xì)胞的分化和發(fā)育、有害生物的有性繁殖、肌肉形成、肌肉顫搐、肌肉收縮、保幼激素形成和/或降低、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜電位保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感知、觸角形成、翅膀形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴保持、神經(jīng)傳遞、幼蟲期轉(zhuǎn)換、蛹化、從蛹化出現(xiàn)、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)合成和保持、核苷酸代謝、氮代謝、水的使用、7JC駐留和感知。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于生產(chǎn)商品產(chǎn)品，所述方法包括(a)鑒定出有害生物中的耙序列；(b)將所述序列引入植物細(xì)胞；(c)在適于產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；以及(d)從所述植物或其部分來生產(chǎn)商品產(chǎn)品。在另一實(shí)施方案中，所述靶是來自馬鈴薯葉甲的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、垮梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜(beet)、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜(caiiola)、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜(endive)、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉(gumhemlock)、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐開、歐洲防風(fēng)草、豌豆、書匕、花生、梨、沼澤植物(peat)、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣(radicchio)、蘿卜、油菜(rapeseed)、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向曰葵、甘薯、甜玉米、紅桔(tangerine)、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述耙是來自辣根猿葉甲(P.coc/ife"n'fle)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、垮梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫,、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草碎草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述耙是來自墨西哥豆瓢蟲(Ev"nV幼、)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹茱、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫聲、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草沖草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述耙是來自墨西哥棉鈴象(A)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、扛豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述靼是來自赤擬谷盜(r.cas似we"附)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、萍菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述靶是來自桃蜱(M/7em'aie)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、齊菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番癡、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述靶是來自褐飛虱(TV./"^"s)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、,菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核書匕、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草碎草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述乾是來自二化螟(C.SW/7/7"M"fe)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱘梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐萍、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫聲、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述耙是來自菜蛾(戶.J9，/Mte//"的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、齊菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、肛豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫,、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草扦草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述靼是來自居屋艾蟋(A^we幼'c"s)的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，所述耙是來自真菌的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐萍、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草畔草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核苷酸序列、雙鏈核糖核苷酸序列、細(xì)胞、植物或產(chǎn)品用于處理植物的昆蟲侵襲的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核苷酸序列、雙鏈核糖核苷酸序列、細(xì)胞、植物或產(chǎn)品用于處理植物的線蟲侵襲的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核苷酸序列、雙鏈核糖核苷酸序列、細(xì)胞、植物或產(chǎn)品用于處理植物的真菌侵襲的用途。圖1-LD:馬鈴薯葉甲在用dsRNA處理過的人工食物上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼用50pl局部應(yīng)用的dsRNA(靶或gfp對照)溶液處理過的膳食。膳食在7天后被含有局部應(yīng)用dsRNA的新鮮膳^^換。在第2、5、7、8、9和13天評定存活昆蟲的數(shù)量。計(jì)算相對于第O天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。靼LD006:(SEQIDNO:178);靼LD007(SEQIDNO:183);耙LDOIO(SEQIDNO:188);組DOll(SEQIDNO:193);耙LD014(SEQIDNO:198);gfpdsRNA(SEQIDNO:235)。圖2-LD:馬鈴薯葉甲在用dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼用50pl局部應(yīng)用的dsRNA(靶或gfp對照)溶液處理過的膳食。膳食僅在7天后被新鮮膳M換。在第2、5、6、7、8、9、12和14天評定存活昆蟲的數(shù)量。計(jì)算相對于第O天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。粑LD001:(SEQIDNO:163);耙LD002(SEQIDNO:168);耙LD003(SEQIDNO:173);耙L固5(SEQIDNO:215);靶LD016(SEQIDNO:220);gfpdsRNA(SEQIDNO:235)。圖3-LD:在用dsRNA處理過的馬鈴薯葉盤上的馬鈴薯葉甲幼蟲平均重量。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼用20jil局部應(yīng)用的dsRNA(靶LD002或gfp對照)溶液(10ng/pl)處理過的葉盤。2天后，每天都將昆蟲轉(zhuǎn)移到未經(jīng)處理的葉上。圖4-LD:馬鈴薯葉甲在用靼LD014dsRNA的較短形式和多聯(lián)體dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼經(jīng)50jal局部應(yīng)用的dsRNA(gfp或靼)溶液處理過的膳食。在第3、4、5、6和7天評定存活昆蟲的數(shù)量。計(jì)算相對于第0天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。圖5-LD:馬鈴薯葉甲幼蟲在用不同濃度的靶LD002(a)、靶LD007(b)、把LDOIO(c)、耙LDOll(d)、乾LD014(e)、把LD015(f)、LD016(g)和靶LD027(h)的dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼經(jīng)50n隔部應(yīng)用的dsRNA溶液處理過的膳食。膳食在7天后被含有局部應(yīng)用dsRNA的新鮮膳食替換。以常規(guī)間隔評定存活昆蟲的數(shù)量。計(jì)算相對于第O天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。圖6-LD:表達(dá)dsRNA耙LD010的大腸桿菌(￡".o/Z)菌林對馬鈴薯甲蟲——馬鈴薯葉甲幼蟲存活隨時(shí)間的影響。在單獨(dú)的基于人工膳食的生物測定中，對兩種細(xì)菌菌株進(jìn)行了測試(a)AB309-105;針對pGBNJ003和pGN29的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表了來自5個(gè)不同細(xì)菌克隆的平均死亡率的值，(b)BL21(DE3);針對pGBNJ003和pGN29的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表了分別來自5個(gè)不同和l個(gè)單細(xì)菌克隆的平均死亡率的值。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖7-LD:侵襲后12天，大腸桿菌菌林的不同克隆(a)AB309-105和(b)表達(dá)dsRNA靼LD010的BL21(DE3)對馬鈴薯甲蟲——馬鈴薯葉甲幼蟲存活的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)是針對pGN29和pGBNJ003而言每個(gè)克隆的平均死亡率的值。攜帶有質(zhì)粒pGBNJ003的AB309-105的克隆l在該時(shí)間點(diǎn)顯示出針對CPB的100。/。死亡率。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖8-LD:侵^7天，大腸桿菌菌林的不同克隆(a)AB309-105和(b)表達(dá)dsRNA靶LDO10的BL21(DE3)對馬鈴薯曱蟲——馬鈴薯葉甲幼蟲存活者的生長和發(fā)育的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)是基于表10的數(shù)據(jù)針對每個(gè)克隆(對于pGN29而言l個(gè)克隆，對于pGBNJ003而言5個(gè)克隆)的％平均幼蟲重量值。僅給予膳食的處理代表100%正常的幼蟲重量。圖9-LD:在侵襲后7天用產(chǎn)生雙鏈RNA的細(xì)菌噴霧過的馬鈴薯植物上，馬鈴薯曱蟲——馬鈴薯葉甲幼蟲的存活。對幼蟲存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，表示為。/。死亡率的形式。所用的細(xì)菌宿主菌林是RNaseIII-缺陷型菌林AB309-105。昆蟲基因耙ALDOIO。圖IO-LD:在侵襲后11天用產(chǎn)生dsRNA的細(xì)菌噴霧的馬鈴薯植物上喂飼的馬鈴薯甲蟲——馬鈴薯葉曱幼蟲存活者的生長/發(fā)育延遲。所用的細(xì)菌宿主菌林是RNaseIII-缺陷型菌林AB309-105。數(shù)據(jù)圖表示為正常幼蟲重量的百分比；僅給予膳食的處理被視為正常幼蟲重量的100%。昆蟲基因乾是LDOIO。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖11-LD:在侵襲后7天通過產(chǎn)生雙鏈RNA的細(xì)菌導(dǎo)致的、對馬鈴薯甲蟲—馬鈴薯葉曱幼蟲引起的馬鈴薯損傷的抗性。左邊是用7個(gè)單位的含pGN29質(zhì)粒的細(xì)菌AB309-105噴霧的植物；右邊是用7個(gè)單位的含pGBNJ003質(zhì)粒的細(xì)菌AB309-105噴霧的植物。一個(gè)單位被定義為在600nm處OD值為l的lml細(xì)菌懸浮液的等同物。昆蟲基因耙處DOIO。圖12-LD:在用dsRNA處理過的馬鈴薯葉盤上馬鈴薯葉甲成蟲的存活。最初兩天用雙鏈RNA處理過的葉盤來喂飼年輕的昆蟲成蟲，之后將它們放在未經(jīng)處理的馬鈴薯葉子上。常規(guī)評定存活昆蟲的數(shù)量；活著并且看起來正常移動(dòng)的昆蟲被記為可移動(dòng)的昆蟲；活著但A^"起來病態(tài)并且移動(dòng)緩慢的昆蟲^L記為瀕死的昆蟲——這些昆蟲一旦被背朝下放置無法自己翻過身來。耙LD002(SEQIDNO:168);耙LDOIO(SEQIDNO:188);耙LD014(SEQIDNO:198);耙LD016(SEQIDNO:220);gfpdsRNA(SEQIDNO:235)。圖13-LD:產(chǎn)生靶雙鏈RNA的細(xì)菌對馬鈴薯葉甲幼蟲的影響。將50piOD為l的經(jīng)熱處理細(xì)菌(表達(dá)dsRNA(SEQIDNO:188))的懸浮液局部應(yīng)用到48孔板每個(gè)孔中的固體人工膳食上。將L2期的CPB幼蟲放置于每個(gè)孔中。在第7天，對于含有下述物質(zhì)的板中的CPB幼蟲取圖，其中含有(a)含有表達(dá)靼10雙鏈RNA的細(xì)菌的膳食，(b)具有攜帶有空載體pGN29的細(xì)菌的膳食以及(c)僅膳食。圖14-LD:在昆蟲侵襲之前，局部應(yīng)用到馬鈴薯葉上的不同量的滅活大腸桿菌AB309-105菌林(攜帶質(zhì)粒pGBNJ003)對于CPB幼蟲存活和生長的影響。向10只L1幼蟲喂伺經(jīng)處理的馬鈴薯，喂飼7天。噴霧到植物上的細(xì)菌懸浮液的量為0.25U、0.08U、0.025U、0.008U的耙10以及0.25U的pGN29(陰性對照，還包括Milli-Q水)。一個(gè)單位(U)被定義為與在600nm光密度值為1的1ml培養(yǎng)物中存在的細(xì)菌等同的量。噴霧到每^物上的總體積為1.6ml。昆蟲基因靶是LD010。圖15-LD:侵襲后7天，攜帶質(zhì)粒pGBNJ003的滅活大腸桿菌AB309-105菌林導(dǎo)致的CPB幼蟲對馬鈴薯損傷的抗性。(a)水，(b)0.25U攜帶pGN29的大腸桿菌AB309-105，(c)0.025U攜帶pGBNJ003的大腸桿菌AB309-105,(d)0.008U攜帶pGBNJ003的大腸桿菌AB309-105。一個(gè)單位(U)被定義為與在600nm光密度值為l的lml培養(yǎng)物中存在的細(xì)菌等同的量。噴霧到每^^t物上的總體積為1.6ml。昆蟲基因耙是LDOIO。圖1-PC:捅"的靶dsRNA對辣根猿葉曱幼蟲存活和生長的影響。向新生(neonate)幼蟲喂飼用25pl^部應(yīng)用的O.lpg/juldsRNA(耙或gfp對照)溶液處理過油菜葉盤。2天后，將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。第4天，針對每種處理收集來自一份重復(fù)的幼蟲，將其放進(jìn)含有新鮮的未經(jīng)處理的油菜葉子的Petri培秦臟中。在第2、4、7、9和11天，對昆蟲加以評定。(a)墨西哥豆瓢蟲幼蟲在用dsRNA處理過的油菜葉盤上的存活。計(jì)算相對于第O天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。(b)在用dsRNA處理過的油菜葉盤上辣才艮猿葉曱幼蟲的平均重量。將來自每份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的昆蟲一起稱重，確定每只幼蟲的平均重量。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶l(wèi):SEQIDNO:473;靶3:SEQIDNO:478;靶5:SEQIDNO:483;靶IO:SEQIDNO:488;靶14:SEQIDNO:493;靶16:SEQIDNO:498;靶27:SEQIDNO:503;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。圖2-PC:在用不同濃度的(a)靶PC010和(b)靶PC027的dsRNA處理過的油菜葉盤上辣才艮猿葉甲的存活。將新生幼蟲;^文到用25pl^部應(yīng)用的dsRNA溶液處理過的葉盤上。在第2天將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的經(jīng)處理葉盤上。對耙PC010而言在第4天，對靶PC027而言在第5天，將昆蟲轉(zhuǎn)移到未經(jīng)處理的葉上。針對PC010在第2、4、7、8、9和11天，針對PC027在第2、5、8、9和12天，評定存活昆蟲的數(shù)量。計(jì)算相對于第0天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。圖3-PC:表達(dá)dsRNA靶PC010的大腸桿菌菌林AB309-105對白芥葉甲蟲一_^根猿葉曱幼蟲存活隨時(shí)間的影響。針對每種處理的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表來自3份不同重復(fù)的平均死亡率的值。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶10:SEQIDNO:488。圖1-EV:墨西哥豆瓢蟲幼蟲在用dsRNa處理過的豆葉盤上的存活。向新生幼蟲喂飼用25pl^部應(yīng)用的l照/pldsRNA(耙或gfp對照)溶液處理過的豆葉盤。2天后，將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。第4天，收集來自一種處理的幼蟲，將其放進(jìn)含有新鮮的未經(jīng)處理的豆葉的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天，對昆蟲的死亡率加以評定。計(jì)算相對于第O天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。耙5:SEQIDNO:576;靼10:SEQIDNO:586;耙15:SEQIDNO:591;耙16:SEQIDNO:596;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。圖2-EV:攝入的耙dsRNA對于墨西哥豆瓢蟲成蟲存活以及對食莢菜豆葉的昆蟲損傷的抗性的影響。(a)墨西哥豆瓢蟲成蟲在用dsRNA處理過的豆葉上的存活。向成蟲喂飼用75pl^部應(yīng)用的0.1ng/^ildsRNA(靶或gfp對照)溶液處理過的豆葉盤。24小時(shí)后，將昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。再24小時(shí)后，收集來自一種處理的成蟲，將其放進(jìn)含有盆栽的新鮮未經(jīng)處理整林豆植林的塑料盒里。在第4、5、6、7、8和11天評定昆蟲的死亡率。計(jì)算相對于第O天(檢測開始時(shí))的存活成蟲百分比。靶10:SEQIDNO:586;耙15:SEQIDNO:591;耙16:SEQIDNO:596;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。(b)通過dsRNA導(dǎo)致的對墨西哥豆胍蟲成蟲引起的豆葉損傷的抗性。在第9天,針對葉的損傷對含有來自一種處理(見(a))的昆蟲的整林植物進(jìn)行目視檢查。(i)粑10;(ii)靶15;(iii)靶16;(iv)gfpdsRNA;(v)未經(jīng)處理的。圖1-TC:赤擬谷盜幼蟲在用靶14的dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向新生幼蟲喂飼含有l(wèi)mgdsRNA靶14的基于面粉/奶混合物的膳食。對照是膳食中的水(沒有dsRNA)。針對每種處理采用四份重復(fù)，每份重復(fù)為10只第一齡蟲。在第6、17、31、45和60天，評定昆蟲的存活(作為平均百分比值)。計(jì)算相對于第o天(檢測開始時(shí))的存活幼蟲百分比。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶TC014:SEQIDNO:878。圖1-MP:攝入的乾27dsRNA對于桃辨蛹的存活的影響。將第一齡蟲放進(jìn)喂飼室中，其中含有50jil具2pg/;i1dsRNA(靼27或gfpdsRNA對照)的液體膳食。對每種處理而言，使用5個(gè)喂飼室，每個(gè)喂飼室中10只齡蟲。在生物測定開始后8天評定存活者的數(shù)量。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶MP027:SEQIDNO:1061;gfpdsRNA:SEQIDNO:235。圖1-NL:褐飛虱在用dsRNA處理過的液體人工膳食上的存活。在分別的生物測定中，向第一至第二幼蟲期的蛹喂飼補(bǔ)充有2mg/mldsRNA靼溶液的膳食(a)NL002、NL003、NL005、NL010;(b)NL009、NL016;(c)NL014、NL018;(d)NL013、NL015、NL021。將昆蟲在耙上的存活與僅用膳食以及用含有同樣濃度的gfpdsRNA對照的膳食時(shí)的情況相比。膳食每兩天被含有dsRNA的新鮮膳食替換。每天評定存活昆蟲的數(shù)量。圖2-NL:褐飛虱在用不同濃度的靶dsRNANL002處理的液體人工膳食上的存活。向第一至第二幼蟲期的蛹喂飼補(bǔ)充有l(wèi)、0.2、0.08和0.04mg/ml(最終濃度)NL002的膳食。膳食每兩天被含有dsRNA的新鮮膳食替換。每天評定存活昆蟲的數(shù)量。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了控制有害生物侵襲的手段，這是通過向有害生物施用靶編碼序列來實(shí)現(xiàn)的，所述序列能對有害生物中必要的生物學(xué)功能造成轉(zhuǎn)錄后阻遏或抑制。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括向有害生物喂飼一種或多種轉(zhuǎn)錄自靶編碼序列的全部或一部分的、雙鏈或小干擾核糖核酸(RNA)分子，所述靶編碼序列對于有害生物的給養(yǎng)和存活來說是重要的。因此，本發(fā)明涉及使用雙鏈RNA(dsRNA),包括小干擾RNA(siRNA)對編碼序列進(jìn)行序列特異性抑制，用作為有害生物控制的手段。直到現(xiàn)在，在大多數(shù)有害生物物種的膳食中提供dsRNA分子也還是不切實(shí)際的，因?yàn)镽NA分子易于被環(huán)境中的核酸酶降解，其被認(rèn)為在溫和堿性或酸性環(huán)境(例如，在大多數(shù)無脊推有害生物消化道中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境)中不穩(wěn)定。因此，為了控制有害生物侵襲或引入新的表型性狀的目的，人們需要通過阻遏、延遲或降低特定有害生物中的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的改進(jìn)的方法。發(fā)明人在此鑒定出了控制有害生物侵襲的方法，所述方法通過在所述有害生物的膳食中提供dsRNA分子來實(shí)現(xiàn)。dsRNA的序列對應(yīng)于重要的有害生物基因的部分或全部，其引起了通過RNA干擾(RNAi)對有害生物靼的下調(diào)。作為對mRNA下調(diào)的結(jié)果，dsRNA防止了耙有害生物蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生(包括但不限于)下述性質(zhì)中的一種或多種有害生物進(jìn)食減少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；對有害生物分化和發(fā)育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，凋亡以及真核細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的任何組分(例如，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白)能力的消失或降低。這些性質(zhì)中的任何一種或任何組合能導(dǎo)致對有害生物侵襲的有效抑制，在植物有害生物的情況下，導(dǎo)致對植物侵襲的抑制。本申請文件中使用的所有技術(shù)術(shù)語是通常用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域中的，因此，它們是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的。這些技術(shù)術(shù)語可在，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第3版，巻l-3，編著,Sambrook和Russel，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，2001、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,編著Ausubel等人，GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience，NewYork,1988(及定期更新)、SHORTPROTOCOLSinMolecularBiology:▲CompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,第5版，巻l-2，編著A翻bel等人，JohnWiley&Sons,Inc.,2002、GENOMEANALYSIS:ALABORATORYManual,巻l畫2，編著Green等人,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1997中找到。本文描述了涉及植物生物學(xué)技術(shù)的方法，其還在例如下述論文中被詳細(xì)描述MethodsinPlantMoleularBiology:ALaboratoryCoursemanual,編輯Maliga等人，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1995。使用PCR的多種技術(shù)被描述于，例如，Innis等人,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress,SanDiego,1990和Dieffenbach和Dveksler，PCRPrimer:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2003中。可通過已知4支術(shù)從已知序列獲得PCR-引物對，所述技術(shù)例如使用用于該目的的計(jì)算枳4呈序，例如Primer，版本0.5，1991，WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA。用于核酸化學(xué)合成的方法在例如Beaucage&Caruthers，r"m.22:1859-62(1981)和Matteucci&Camthers，/爿附.CAe附.Soc.103:3185(1981)中討論過。限制性酶消化、磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化按照Sambrook等人，MOLECULARCloning:ALaboratoryManual,第2版(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress所述來進(jìn)行。如無其它指明，用于細(xì)菌細(xì)胞生長和保持的所有試劑和材料都從阿爾德里克化學(xué)公司(AldrichChemicals)(Milwaukee,Wis.)、DIFCO實(shí)驗(yàn)室(DIFCOLaboratories)(Detroit,Mich.)、英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen)(Gaithersburg,Md.)或西格瑪化學(xué)公司(SigmaChemicalCompany)(St.Louis，Mo.)獲得。農(nóng)桿菌(Jg/y6"cfeWK附)或細(xì)菌轉(zhuǎn)化:如本領(lǐng)域公知的，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌是通常根癌農(nóng)桿菌(^gro^cteW"附似附e/"de"s)、發(fā)根農(nóng)桿菌(々尸o6flcter/M附r/r/^gewes)的卸甲(disarmed)和有毒利(virulent)衍生物，其含有載體。通常，載體含有位于T-DNA邊界之間的想要的多核苷酸。但是，能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的任何細(xì)菌都可使用，例如三葉草根瘤菌(及A/zo6/u附^nyb///)、豌豆才艮瘤菌(及A/zo6/m附/egM附fw0snni附)、Phyllobacteriummyrsinacearum,苜蓿中華根瘤菌(SinoRhizobiummeliloti)和百脈根中慢生根瘤菌(MesoRhizobiumloti)。被子植物:在子房中含有種子的維管植物。凈皮子植物是產(chǎn)生能結(jié)果的花的種子植物。被子植物被分為雙子葉植物和單子葉植物。生物學(xué)活性指蛋白質(zhì)或肽的生物學(xué)行為和影響及其對有害生物的表現(xiàn)。例如，本發(fā)明的RNAi可防止特定mRNA的翻譯，由此抑制所述mRNA編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或者有害生物的其它生物學(xué)活性。在本說明書中，RNAi分子可抑制有害生物中的生物學(xué)活性，產(chǎn)生(包括但不限于)下述性質(zhì)中的一種或多種有害生物進(jìn)食減少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；對有害生物分化和發(fā)育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，凋亡以及真核細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的任何組分(例如，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白)能力的消失或降低。商品產(chǎn)品包括從植物制備或源自植物的任何產(chǎn)品，其包括但不限于食品、伺料、纖維、紙、M、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉、青貯伺料、咖啡、茶和油?；パa(bǔ)DNA(cDNA)指從成熟的mRNA模板合成的單鏈DNA。雖然有若干種方法，但是最通常是使用逆轉(zhuǎn)錄酶這種酶從成熟(經(jīng)完全剪接的)mRNA來合成cDNA。該酶在mRNA的單鏈上進(jìn)行操作，基于RNA堿基對(A、U、G、C)與其DNA互補(bǔ)體(T、A、C、G)的配對產(chǎn)生所述mRNA的互補(bǔ)DNA。兩條核酸鏈的威基中有至少85%配對時(shí)，這兩條鏈就是充分互補(bǔ)的。想要的多核苷酸:本發(fā)明的想要的多核苷酸是遺傳元件，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或終止子，或?qū)⒃谄浠蚪M中包含想要的多核苷酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的基因或多核*酸。如果想要的多核苷酸包含編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的序列，編碼區(qū)域可與調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子和終止子)有效地連接，所述調(diào)控元件能使得相關(guān)聯(lián)的信使RNA轉(zhuǎn)錄本和/或想要的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)。因此，"想要的多核苷酸"可包含這樣的基因其以5'-至3'-方向有效地連接啟動(dòng)子、編碼蛋白質(zhì)的基因和終止子。或者，想要的多核苷酸可包含"正義"和/或"反義"方向的基因或其片段，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生可能影響到植物細(xì)胞中內(nèi)源基因表達(dá)的核酸。想要的多核苷酸還可基于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈RNA產(chǎn)物，在此基礎(chǔ)上起始對所述想要的多核苷酸相關(guān)聯(lián)的基因的RNA干擾。本發(fā)明的想要的多核苷酸可凈M置于載體中，使得左右邊界序列側(cè)翼連接于想要的多核苷酸或在其任何一側(cè)。本發(fā)明設(shè)想將一種或多種想要的多核苷酸穩(wěn)定整合進(jìn)至少一種宿主細(xì)胞的基因組。想要的多核苷酸可經(jīng)突變或者是其野生型序列的變體。應(yīng)當(dāng)理解，想要的多核苷酸的全部或部分可整合進(jìn)宿主的基因組。還應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語"想要的多核苷酸"包括一種或多種此類多核苷酸。因此，本發(fā)明的載體可包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種想要的多核苷酸。雙子葉植物(dicotyledonousplant,英文中也稱dicot)是開花植物，其胚具有兩個(gè)種子半邊部分或者兩片子葉，分支葉脈，花的各部分為4或5的倍數(shù)。雙子葉植物的實(shí)例包括但不限于桉屬(五woi/j^船)、楊屬(J"o/ui/"s)、楓香屬(Z^rwV/"附&f)、金合欠屬(v4cflc/")、柚木、杉^花心木、棉花、煙草、擬南芥屬(Arabidopsis)、番茄、馬鈴薯、糖蘿卜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、猩猩木、菜豆、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、槭樹、核桃、薔薇、薄荷、南瓜、雛菊、老鸛草、鱷梨和仙人掌。在提到核酸時(shí)，外源表示核酸源自非宿主生物。根據(jù)本發(fā)明，夕卜源DNA或RNA表示天然存在于真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物、魚或鳥的遺傳構(gòu)成中但是在待轉(zhuǎn)化的宿主中并非天然存在的核酸。因此，外源核酸是這樣的核酸，其編碼例如經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主并不天然產(chǎn)生的多肽。外源核酸不一定編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本文中使用的喜簠或真菌細(xì)胞指屬于真菌界的生物中存在的或源自所述生物的任何細(xì)胞。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于下述所有真菌和真菌細(xì)胞，它們對于RNA干擾導(dǎo)致的基因沉默來說是易感(susceptible)的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環(huán)境被內(nèi)在化。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，真菌可以是霉菌，或者更特別地，絲狀真菌。在本發(fā)明的其它一些實(shí)施方案中，真菌可以是酵母。在一種實(shí)施方案中，真菌可以是子嚢菌真菌，即，屬于子嚢菌(Asc麵j;c0似)門的真菌。在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制性的實(shí)施方案和方法中，真菌細(xì)胞選自植物病原性真菌的真菌細(xì)胞或源自植物病原性真菌的細(xì)胞，其例如但不限于小枝頂孢屬物種(Jcreiwi/e//"spp.)、異水霉屬物種(^//o附j(luò);c"spp.)、鏈#^&屬物種(J/ferw"fspp.)(例如蕓莒生鏈格孢(J/terwaW"6m^/co/fl)4'索蘭尼(氏)鏈格孢(J/tem"r/"so/朋/))、暗膜菌屬物種(Amorphothecspp.)、殼二孢屬物種(^4sco勿tospp.)(例如豌豆殼二))、曲霉屬物種(As/7efg///ZMSSpp.)、短梗霉屬物種(^4Mfeo6fiw/flf/M附spp.)、'J、芽才支霉屬物種(5/astoc/fiw/Ze//flrspp.)、葡萄孢屬物種(必Wrj;"sspp.)(例如灰葡萄孢(5Wo^/sd"wefl)或富克葡萄孢(5勿函/"))、假絲酵母屬物種(Owm/油spp.)、枝孢屬物種(C7<w/<wr/wr/"/fispp.)、尾孢屬物種(O,c0s/wmspp.)(例如菊池尾抱(Ceiras/wniA;/A:wc/r//)或Cefras/wniztfeff-iflj^&)、毛殼屬物種(C7ifle似附/imispp.)、才支孢屬物種(C7flt/os/wr/"/wspp.)(侈'J:i口黃4支孢(C7flfifos/wr/"/w/"/vm附))、刺盤孢屬物種(Co//eto^*/c/r"/wspp.)(例如豆刺盤抱(Cb//^^/c/w/M/;Vf^/em"幼/朋M附))、球抱子菌屬物種(CWc油》zVfesspp.)、耳霉屬物種(C卵,V/,V^o/"sspp.)、鬼傘菌屬物種(O戸Vi，isspp.)、。zj""sc附spp.、栗疫屬物種(0^p/^"g"r/a卿.)、隱球酵母屬物種(O"toacc"sspp.)、小克銀漢霉屬物種(C"朋/"gAfl艦/tospp.)、彎孢屬物種(C"rv"/fln'"spp.)、德巴利酵母屬物種("W"o^附K"spp.)、色二孢屬物種(D^/oflf/flspp.)(例如玉米色二孢(D^7/oflfiV))、棵胞殼屬物種(￡>er/"http://flssp.)、腦炎微孢子蟲屬(五wce/7^fl/Ztozoowspp.)、假嚢酵母屬物種(jE^附W&c/"附spp.)、白粉菌屬物種(五o^》Aespp.)(例^口￡>^5^/^grfl/mVi/s/sp.gm附iVi/s1、大麥白粉菌(Ei^s^Aegm附/w/s/s/./fon/e/)或豌豆白粉菌(jEy^5^/re/7/s/))、￡>h/"/"flf附y(tǒng)/owm、鐮孢屬物種(Fms"Ww附spp.)(例如雪腐鐮孢(F附flW"附w/vfl/e)、擬分支孢鐮孢(F"s^r/w附5poro加'c/tzVwV/es1)、尖錄抱(Fmsw/m柳axys/7or"附)、禾本科錄抱(F"sw."柳gr"附Z"e"尸w附)、F"s肌'w附gc附/"earw附、大刀錄抱(Fm^w/i/附cw/附orn挑)、腐皮錄抱(F"5^n'w附so/crw/)、串珠錄抱(F"5w/w附附o"/ftybr附g)或粉紅嫌抱(/V/^w7'"/mrayeM附))、丁頁囊殼屬物種(G^M附朋o考cesspp.)(例如小麥禾頂嚢殼(G""e"附fl朋附y(tǒng)c"gr纖/"is/5/7.)、G附戸SSpp.、赤霉屬物種(G幼^e,/flSpp.)(例如玉蜀黍赤霉(GZMwe//"z^^))、粘褶菌屬物種(Gloeophyllumspp.)、球嚢霉屬物種(G/ow附spp.)、長蠕孢屬物種(/Te//mVf^<w/wWM/wspp.)(例^。jye//w/"http://tos/wn'w/w/"/T/c"/w、炭色長蠕孢(/Te/挑/"^ro5/7or/"w)、玉蜀黍長蠕孢(好e/附/w幼0s/7on7/附附rmZ/s)或7K稻小球菌核病菌(J^/附/w^(spw/w附s/g附wV/e"附))、肉座菌屬物種(iy^/wcretfspp.)、克魯維酵母屬物種(A/wjn^Y附j(luò);c^spp.)、香菇屬物種(i^wftVi"/"spp.)、稻小球腔菌(丄e/似sp/^enVis"/v///)、白4^酵母屬物種(丄efic仍/7onflf/M附spp.)、殼球孢屬物種(spp.)(例如菜豆殼球孢(例如稻痘病菌(A/ag"fl/wW/ie))、M^/rflr/r/z,Vi附spp.、毛霉屬物種(iVfwcorspp.)、球腔菌屬物種(Spp.)、脈孢菌屬物種(iVewnW/WflSpp.)、從赤殼屬物種(Ator/flspp.)(例如7Ve""'"/^fl卿tococcfl)、長味殼屬物種(C^p/f/osto附flfspp.)、jPa/*"co"V//o,V/eyspp、霜審屬物種(戶eAYWfas/wrtfspp.)(例如東北霜霉(尸efwiaspom附"附/r"r/cfl)或煙草霜霉(jPefwias/wmto^"Vi"))、莖點(diǎn)霉屬物種(spp.X例如泰菜莖點(diǎn)霉(戶/^/mi6C"e))、尸/^o/7由r/aspp.、平革菌屬物種(尸/r"/imK^flefespp.)、層銹菌屬物種(i^flA^/7SO/Yispp.)OJ:i口豆薯層錄菌(iV^A:o/7Som/)"c/^W^zi'))、瘤梗孢屬物種(戶/^附"似加.c/rw附spp.)(例如多主瘤梗孢(iV^附"to^7'cA"w0w/von//w))、疫霉屬物種(iV^top/r^w"spp.)(侈'如樟疫霉(/V13;top/1說on1"Vi艦附o附/)、惡疫霉(i^鄉(xiāng)/r幼0/Yicflf"ww附)、菜豆疫霉(i^鄉(xiāng)/r汰omp/r"wo//)、寄生疫霉(i^j;to/7/^/^m/7flr"wftctf)、才甘桔褐腐疫霉(尸/y;to/;/^/^rflc/^Y/A^rorfl)、P/^,o/7/^Aorflf附egos/^r/iwi/sp.sofVie或致病疫審(尸/rj;to/7A幼WYi/"/^似fw))、單軸霉屬物種(iVoy附o/7ffmspp.)(侈'J:ft口葡萄生單軸霉(/to附o/mmv/ft'co/"))、肺孢子屬物種(尸"e"腳qv對/sspp.)、叉絲單嚢殼屬物種(/\7^wp/^erflspp.)(例如白叉絲單嚢殼(尸oflfas/^flem/ewcWr/c/^))、柄銹菌屬物種(戶"cc/",Vispp.)(例如高粱柄銹菌(戶"cc/w/"sorg/r/)、條形柄錄菌(戶Mc"VfZfls^f7zybnw/s1)、小麥禾柄錄菌(jPwc"Vii'"grfl附/"/s,5/7.,r/ftc/)、天門冬屬柄銹菌(Pmcc!Vi/"os/m/Yig/)、隱、匿柄銹菌(戶"c"Vi/"rmw^")或落花生柄錄菌(尸"cc/附Viamc/riV//s))、腐霉屬物種(i^幼/鵬Spp,)(例如瓜果腐霉(/^汰/H附flt/7/lflw/fifef附fl^簡))、火絲菌屬物種(i^wie柳"spp.)、核腔菌屬物種(^v"wo/7/romspp.)(例如寸區(qū)麥草核腔菌(/^尸ewo;p/rw"/riYiW-repe/itews)或圓核腔菌(^vrewo/7/r0mteres))、梨抱屬物種(i^r/c"/flnVispp.)(例^口稻梨抱(PjTZc"/flr/tf))、腐霉屬物種(/^幼/w附spp.)(例如終極腐霉(iy/^'M柳w/ftVw"/w))、及/^Vic05/wW"柳sec"/^、絲核菌屬物種(及A&octow《Vispp.)(侈'j:i(口立沖古絲核菌(及/j&octow,Viso/tfw/)、稻才古斑絲核菌(J/r/zoctofwViofjzfle)或禾谷絲核菌(/^/^"朋/"",^/&))、根霉屬物種(及A/zo/;"sspp.)(例如華根霉(J/r/zo/7M51c/r/"ewsiV/))、酵母屬物種(5Vicc/raro考ces1spp.)、iScm^/i/附spp.(侈'J如iScefW/"附roWi7)、核盤菌屬物種(Sc/en^iVi/flspp.)(侈'J長口核盤菌(5^/c0&ViZflsc/erW/ww附))、殼針孢屬物種(iSe/;toWflspp.)(食寸:ft口番癡殼針孢(5"印ton'")、大豆殼針抱(5^ptor/ag(v"Vies)、穎枯殼針抱(S印toWff朋i/orM附)或小麥殼針抱(iScptor/fl的7/c/))、5^/z"/o附戸"pp.、嗜熱真菌屬物種(Tto附o附戸sspp.)、根串珠霉屬物種(T7i/e/tfv/ojw/sspp.)(例如根串珠霉(T7^'e/tfv/o/w/s6"s/co/tf))、腥黑粉菌屬物種(r,7/CVispp.)、栓菌屬物種(7VwmCmspp.)、木霉屬物種(7WcAoife尸/mispp.)(例如綠色木霉(7WcA6Uifer附"wVv/e))、發(fā)辨菌屬物種(7Wc/^/7/^勿"spp.)、鉤絲殼屬物種(f/"c/"w/"spp.)(例如葡萄鉤絲殼())、玉蜀黍黑粉菌(C/5t//flgO附"yffc)(例如玉蜀黍黑粉病)、黑星菌屬物種(Ke","/vVispp.)(例如蘋果黑星菌(Ke"似r/"/冊^r做//50或梨黑星菌(Kew似"Vi盧>/膽))、spp.或輪枝孢屬物種(KeW/"7/iVmispp.)(侈寸如大麗花輪斗支孢(Ker,/"7//w/wtif"/t/iVie)或黃菱輪枝抱(FeW"7/Z"附a幼o(hù)扁fl^,w附))o基因指這樣的多核苷,列，其包含對于多肽或前體的生產(chǎn)來說必要的控制和編碼序列。多肽可由全長編碼序列或編碼序列的任何部分所編碼?；蚩山M成連續(xù)的編碼序列，或者其可包括通過合適的剪接點(diǎn)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子。此外，基因可在編碼或非翻譯區(qū)域含有一種或多種修飾，這可能會影響到表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)速率或表達(dá)控制方式。此類修飾包括但不限于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的突變、插入、缺失和取代。在這方面，此類經(jīng)修飾的基因可被稱為"天然"基因的"變體，，。遺傳元件是任何重要的(discreet)核苷酸序列，其例如但不限于，啟動(dòng)子、基因、終止子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、間隔區(qū)、5'-非翻譯區(qū)域、3'-非翻譯區(qū)域或重組酶識別位點(diǎn)。遺傳修飾指:通過應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法，將DNA穩(wěn)定引入某些生物的基因組。"基因遏制"或"對基因表達(dá)的下調(diào)"或"對基因表達(dá)的抑制"可互換使用，其指在來自耙基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和/或mRNA產(chǎn)物的水平上可測量的或可觀察到的基因表達(dá)的降低，或可探測到的基因表達(dá)的完全消失。當(dāng)靶基因的下調(diào)或抑制發(fā)生但對有害生物的其它基因沒有明顯影響的時(shí)候，對基因表達(dá)的下調(diào)或抑制是"特異性的"。才艮據(jù)靼基因的性質(zhì)，可通過使用分子技術(shù)，例如，RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、微陣列基因表達(dá)監(jiān)測、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡、放射性免疫測定(RIA)、其它免疫測定或熒光活化細(xì)胞分析(FACS)測量mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)，或通過對細(xì)胞或整個(gè)有害生物進(jìn)行表型分析，來發(fā)$對有害生物細(xì)胞中基因表達(dá)的下調(diào)或抑制。在本文中使用時(shí)，棵子植物指產(chǎn)生種子但沒有子房的種子植物?？米又参锏膶?shí)例包括針葉樹、蘇鐵、銀杏和麻黃。在本文中使用時(shí)，同源性涉級序列；如果蛋白質(zhì)或核苷酸序列顯示出"顯著"水平的序列相似性或更優(yōu)選地序列同一性，那么所述蛋白或核酸序列就可能是同源的。真正同源的序列通過來自共同祖先基因的趨異相關(guān)聯(lián)。序列同源物可以是兩種類型的(i)同源物存在于不同物種中時(shí)，它們被認(rèn)為是直向同源物，例如，在小鼠和人中的a-珠蛋白基因是直向同源物；(ii)旁系同源物(paralogue)是在單種物種中的同源基因，例如，小鼠中的a-珠蛋白和p-珠蛋白基因是旁系同源物。宿主細(xì)胞指這樣的微生物、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或作為單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的細(xì)胞系，其可以或已經(jīng)用作為重組載體或其它多核苷酸傳遞的受體，包括已被轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的子代。由于天然的、偶然的或刻意的突變，單個(gè)細(xì)胞的子代在形態(tài)，或基因組DNA或總DNA互補(bǔ)的方面并不一定與原始親本完全相同。在本文中使用時(shí)，昆蟲可以是任何昆蟲，這表示屬于動(dòng)物界的任何生物，更具體地，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)任何生物、以及屬于昆蟲綱(Insecta)或蛛形綱(Arachnida)的任何生物。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有昆蟲，所述昆蟲對于RNA干擾導(dǎo)致的基因沉默來說是易感的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環(huán)境被內(nèi)在化。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，昆蟲可以屬于下述的目螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、彈尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、網(wǎng)翅目(Dictyoptera)、雙尾目(Diplura)、雙翅目(Diptera)、紡足目(Embioptera)、蛘蝣目(Ephemeroptera)、愛蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymen叩tera)、等翅目(Isoptera)、鱗翅目(L印idoptera)、食毛目(Mallophaga)、長翅目(Mecoptera)、脈翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹節(jié)蟲目(Phasmida)、積翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、嚙蟲目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphimculata)、纓尾目(Thysa證a)、掄翅目(Strepsiptera)、纓翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)和缺翅目(Zoraptera)。在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制性的實(shí)施方案和方法中，昆蟲選自是植物有害生物的昆蟲，其例如但不限于褐飛虱屬物種(7V//"/7"rm,flspp.)(例如褐飛虱(尺丄"^附)(褐稻虱))；灰飛氦屬物種(Z^wfc/p/^cspp.)(例如灰飛虱(Z.)(灰飛虱))；黑尾葉蟬屬物種(iV印/^/e^cspp.)(例如二點(diǎn)黑尾葉蟬(TV.K/my"船)或黑尾葉蟬(TV.a""/c印s)(青葉蟬)或二條黑尾葉蟬(iV.w/g/7/""s)(稻葉蟬))；白背飛虱屬物種(Sf^flte//"spp.)(例如白背飛虱(白背飛虱))；桿長漆屬物種(5/isy"sspp.)(侈'j戈口美')川谷桿長棒(J5./ewco/^enis/eMC0/ter"s)(美洲谷桿長蝽))；黑蝽屬物種(ScWi>io/;/^mspp.)(例如S.vw/mV/w/fffe(稻黑蝽))；綠蝽屬物種(爿mwterww附spp.)(例如擬綠蝽A/u'/"re(擬綠蝽))；稻弄蝶屬物種(spp.)(例如直統(tǒng)稻弄蝶(i>.)(直故稻弄蝶))；禾草螟屬物種(C/iZ/(spp.)(例如二化螟(C.5:"/^f"s"fc)(稻二化螟(ricestripedstemborer))、臺灣稻螟(C.爿ii"c報(bào)Ms)(金線二4匕螟(gold-fringedstemborer))或C./wfyc/io^is(黑頭二4匕螟(dark-headedstembored)));spp.(例如C./w/yc/ii^fir(水稻經(jīng)心蟲(ricestalkborer)));蛀莖^^蛾屬物種(5^<wmVispp.)(例如稻蛀莖夜蛾/"/"e附)(大螟))；蛀禾螟屬物種(2>j;/k>o;z"spp.)(例力口r./rni^ato(白稻三4t螟(whitericeborer))或三4匕螟(r./w"f似/"s)(三化螟))；縱巻葉野螟屬物種(Of"/7/m/oc"'sspp.)(例如稻縱巻葉野螟(C.Me力Vi"似)(稻縱巻葉野螟))；潛蠅屬物種(^gw附y(tǒng)z"spp.)(例如日本稻潛蠅(AOo^ie)(日本稻潛蠅)或美洲黍潛葉蠅(A/^mVw7f&)(潛葉蠅))；桿草螟屬物種(Z),Wf"e"spp.)(例如小蔗螟(IX5V^cA"mfe)(小蔗螟)或西南玉米桿草螟(ZXOflm//"^//")(玉米軒草螟))；螟蛉夜蛾屬物種(JVflf朋gtfspp.)(例如iV.^"^ce附(稻螟蛉))；黃夜蛾屬物種(Ar做^oflfesspp.)(例如犁紋黃夜蛾(XJhmsvemi)(犁紋黃夜蛾))；灰翅夜蛾屬物種(^Mo/7temspp.)(例如草地貪夜蛾(&Fr"gz;pefY/")(秋天行軍蟲)、甜菜夜蛾(51.五x/g"")(甜菜夜蛾)、灰翅夜蛾(51.故omto)(月斑虎甲(climbingcutworm))或&/7me/cfl(西部黃條行軍蟲(westernyellowstripedarmyworm)));秘夜蛾屬物種(柳幼/附waspp.)(伊H口凈占蟲(Afy^附wflfPsewflto/eft'fl)m/7c"似(行軍蟲))；鈴夜蛾屬物種(Helicoverpaspp.)(例如谷實(shí)夜蛾(^)(棉鈴蟲(cornearworm)));肖葉甲屬物種(spp.)(例如C6n/朋e"(葡萄肖葉甲))；稻水象屬物種(Z^wrb/^附spp.)(例如稻水象甲(丄.Ofy^p/"7"s)(稻7K象曱))；稻象屬物種(五c/i/"0Crte附船spp.)(例如稻象(ES《"tf附仍)(稻象))；Z>,W<w//y/wispp.(例如D."r附/ger"(稻鐵甲))；禾谷負(fù)泥蟲屬物種(o"/e附"spp.)(例如水稻負(fù)泥蟲(a6^we)(葉甲)；米象屬物種(spp.)(例如米象(0/^"e)(稻象蟲))；癭蚊屬物種(尸flc/^力》/仍^spp.)(例如稻癭蚊(戶.(稻癭蚊))；水蠅屬物種(i^^e/ZZ"spp.)(例如麥葉毛眼水錄(漢GWwo/fl)(大麥水蠅)或日稻毛眼水蠅(好.SflSfl/^'X稻桿潛繩(ricestemmaggot)));黃潛蠅屬物種(C/i/w印sspp.)(例如稻黃潛蠅(C.0zjz"e)(稈蠅))；桿野螟屬物種(O對WmVispp.)(例如玉米螟(a7V"6//"fe)(歐洲玉米鉆心蟲))；地虎屬(^gn船spp.)(例如小地老虎(Ai》w7ow)(小地老虎))；E/flwio/m//"^spp.(例如南美玉米苗斑螟(￡".丄/g"仍e/,ws)(小玉米莖炷蟲(lessercornstalkborer)));才危爪叩頭蟲屬物種(M^mW"sspp.)(金針蟲)；圓頭犀金龜屬物種(Cy/oc^/ifltospp.)(例力口CZwe"/is(;j匕方假面金龜子(northernmaskedchafer))，或C./附/mic"/flto(南方假面金龜子(southernmaskedchafer)));孓瓜麗金龜屬物種spp.)(例如日本弧麗金龜(尸.(日本弧麗金龜))；跳曱屬物種(C7^etoc"e柳flspp.)(例如玉米銅色跳甲(C.尸"/Zc"〃Vi)(玉米銅色跳甲))；龍頸象屬物種(S/^em/;/^f"sspp.)(例如玉米長喙象(51.Affl,Vfc)(玉米長咮象))；縊管對屬物種(及^/;tf/仍,j^"附spp.)(例如玉米對(及.Ar似Vfc)(玉米對))；圓尾蜂屬物種(^wwm/^/sspp.(玉米根奸(cornrootaphid)));黑蝗屬物種(M^/"mo/7/msspp.)(例如紅足黑埴(M:尸e柳wt"&"附)(紅足黑蝗)、特異黑蝗(MiDfj^"ftVi//s)(特異黑蝗)或遷飛黑蝗(MS""g"/m;pM)(遷飛黑鰉))；種蠅屬物種(^fy/e附j(luò)^spp.)(例如灰地種蠅(好.尸/"似m)(灰地種蠅))；呆薊馬屬物種(spp.)(例如黃呆薊馬(」.0&""r^)(黃呆薊馬))；火蟻屬物種(5We朋/w&spp.)(例如竊蟻(&Af"^似)(盜竊蟻))；或葉螨屬物種(Tetranychusspp.)(例如二點(diǎn)葉螨(r.C/W/c"e)(二點(diǎn)葉螨)、朱砂葉螨(r.C/"w"^W""s)(朱砂葉螨))；鈴夜蛾屬物種(Helicoverpaspp.)(例如谷實(shí)夜蛾(好.(棉鈴蟲(cottonbollworm))，或棉鈴蟲(好.爿/7w/gem)(美洲棉鈴蟲))；」Pe"/"o/^w"spp.(例如紅鈴麥蛾(尸.G。^v/wW/fl)(棉花紅鈴蟲))；金剛鉆屬物種(五flW""pp.)(例如翠纟丈金剛鉆(五.KiVte//")(翠玟金剛鉆))；實(shí)夜蛾屬物種(好e&W/^spp.)(例如煙芽夜蛾(i/.W^sce船)(煙青蟲))；花象屬物種(jw幼o(hù)加附msspp.)(侈'H口墨、西哥棉鈴象(A)(才帛子象鼻蟲))；spp.(例如棉偽斑腿盲蝽(P.Sm'"似s)(棉偽斑腿盲蝽))；結(jié)翅粉虱屬物種(7W"/e"fYwfeyspp.)(例如結(jié)翅粉虱(r.J6"似owe附)(結(jié)翅粉虱)、溫室粉虱(7:Kff/w/w/o/ww)(溫室粉虱))；小粉虱屬物種(5e附/y/flspp.)(例如4艮葉粉虱(J5.)(銀葉粉虱))；蚜屬物種(spp.)(例如棉螃(AGWsy/^')(棉蚜)、A附W/^m);草盲蝽屬物種spp.)(例如美國牧草盲蝽(L丄Z"/"/^)(美國牧草盲蝽)或豆莢草盲棒(I.(西牧草盲棒(westerntarnishedplantbug)));美洲漆屬物種(五附cA/s似sspp.)(例如斑點(diǎn)美洲蝽(oms/^w附)(斑點(diǎn)美洲蝽))；O/wmr/bwispp.(例如賽氏蝽(C.S""')(賽氏蝽))；綠蝽屬物種(iV^"mspp.)(例如稻綠蝽(ACK/Wrf"/fl)(稻綠蝽))；薊馬屬物種(TT^jwspp.)(例如蔥薊馬(r.T^6ac/)(蔥薊馬(oniontrips)));花薊馬屬物種(FmwA/iVi/e//"spp.)(例如煙褐薊馬()(煙褐薊馬)，或西方花薊馬(F.Oc"Vfe"toto)(西方花薊馬))；馬鈴薯葉甲屬物種(丄e^/"otorsflspp.)(例如馬鈴薯葉曱(丄.Z)ecem//"eflto)(馬鈴薯葉曱)、偽馬鈴薯葉甲(丄./""cto)(偽馬鈴薯葉曱)或丄.(泰克斯偽馬鈴薯葉曱(Texanfalsepotatobeetle)));合爪負(fù)泥蟲屬物種(/:e附flspp.)(例如三條負(fù)泥蟲(1.7W/,Vie^")(三條負(fù)泥蟲))；跳曱屬物種(￡^>/x:spp.)(例如馬鈴薯跳甲C"c"附er&)(馬鈴薯跳甲)、煙草跳甲(E幼Wj^"w&)(跳甲)或塊莖跳甲(五.r"6c/s)(塊莖跳甲))；豆芫菁屬物種(E/7/cff"tospp.)(例如北美豆芫菁(￡".K故Wa)(北美豆蕪薈))；綠小葉蟬屬物種(五附/w必cflspp.)(例如蠶豆小綠葉蟬(E/^6"e)(黑豆蚜))；瘤蚜屬物種(Mj;z"sspp.)(例如桃蚜(ikf.i^m'cae)(桃蚜))；薯個(gè)木亂屬物種(尸"m加kffspp.)(例如馬鈴薯木虱(/0cA:e"http:///)(木虱))；單葉叩曱屬物種(C卵Ww附spp.)(例如C/"戰(zhàn)(南方馬鈴薯鐵線蟲(sourthernpotatowireworm))或叩頭曱(C.F邵erftVi附)(煙草4失線蟲(tobaccowireworm)));尸/^/^17Vm1eflspp.(，寸嗦口馬鈴薯麥蛾(P.)(馬鈴薯麥蛾))；長管蚜屬物種(Macn7w;p/1"附spp.)(例如大戟長管蜂(Mi五"/7/^^/"e)(馬鈴薯蚜))；7%戸"似(例:i口r./7///f/ovi>ews(redshoulderedstinkbug));i^說onVmie"5/7/7.(侈寸:S口馬鈴薯麥蛾(戶.Qperc"/e//fl((馬鈴薯麥蛾))；鈴夜蛾屬物種(^e//cover/7"J(例如谷實(shí)衣^蛾()(美洲柿鈴蟲(tomatofruitworm));/T"y^Vi卿.(例如番癡蠹蛾凡(v考em'ce"flf(番癡蠹蛾))；Zi附om"sspp.(鐵線蟲(wireworm));天蛾屬物種(M"m/"cfls/7/7.)(例如煙草天蛾(AT.So加)(煙草天蛾)，或番茄天蛾(Af.gwiVi《"e附ffcw/"to)(番茄天蛾))；斑潛蠅屬物種(丄i'n》附j(luò);zfl)(例如蔬菜斑潛蠅(丄.S",/v"e)、三葉草斑潛錄(7>1>肌)或南美斑潛蠅(iy"/^6re附Zs)(斑潛蠅))；果蠅屬物種(Z)fw(vj/i"/aspp.)(例如黑尾果蠅(Z).Me/flwog^tef)、D.y"紐6fl、2).，eMflf卯6scwm或2).s/附w/a朋)；步甲屬物種(CVwyi6wsspp.)(例如粒步曱(Cgm""/W附))；搖蚊屬物種(C^/Vwi0附"sspp,)(例:i口Cl);祁頭蚤屬物種(Ctewo"/^a/,V/"spp.)(例:ft口貓祁頭蚤(CIFelis)(貓?jiān)?)；非耳味象屬物種(Diapreps.spp.)(例如甘蔗才艮螟蟲(D.Abbreviatus)(根象鼻蟲))；齒小蠹屬物種Ipsspp.)(例如美松齒小蠹I.Pini)(美松齒小蠹))；擬谷盜屬物種(Triboliumspp.)(例如赤擬谷盜(T.Caustaneum)(赤擬谷盜))；舌娓屬物種(Glossinaspp.)(例如刺舌蠅(G.Morsitans)(采采錄))；按蚊屬物種Anophelesspp.)(例如岡比亞按蚊(AGambiae)(癡蚊))；鈴夜蛾屬物種(Helicoverpaspp)(例如棉鈴蟲(H.Armigera)(非洲棉鈴蟲))；無網(wǎng)長管坊屬物種(Acyrthosiphonspp.)(例如豆無網(wǎng)長管蜂(A.pisum)(豌豆蜂))；蜜蜂屬物種(Apisspp.X例如意大利喇MeliferaX蜜蜂))；Homalodiscaspp.(例如玻璃葉蟬(H.coagulate)(玻璃翅葉蟬))；寸尹蚊屬物種(Aedesspp.)(例如埃及伊蚊(Ae.Aegypti)(埃及伊蚊))；蠶蛾屬物種(Bomabyxspp.)(例如家蠶(及B.Mori)(家蠶)、野桑蠶(B.Mamtor/"fl));飛鰉屬物種(Locustaspp.)(例如飛蝗(B.Microplus)(飛蝗))；牛蜱屬物種(5卯/;/^7船spp.)(例如微小牛蜱(及MiVto^/船)(具環(huán)牛蜱))；y4c做,/tftscwmVispp.(例如」.go附es7a朋(紅毛褐鳥蟲(red-hairedchololatebirdeater)));Z>^7/o/7temspp.(例如Z).戶wwcto似(太平洋曱蟲蟑埤(pacificbeetlecockroach)));毒蝶屬物種(&//麵/"5spp.)(例如瓦氏袖蝶(紅型花蝶(redpassionflowerbutterfly))或墨爾波蝶(/T.Me/;w附ewe)(郵差蝶(postmanbutterfly)));象蟲屬物種(Cwrc"/"spp.)(例如歐洲櫟象(C.g/aw&M附)(橡實(shí)象曱(acornweevil)));菜蛾屬物種(spp.)(例如菜蛾(i*.X3;/0ste/to)(菜蛾(diamontbackmoth)));鈍眼蜱屬物種(爿/w6/"附附flspp.)(例如彩飾鈍眼蜱(AK"Wega似附)(具環(huán)牛蜱))；拃蠶屬物種(j"tem^rspp.)(侈'〗:fep半目大^^蛾(J.Fa附fl附似.)(蠶蛾(silkmoth)));5e/g/c"spp.(侈'j:i口南極百吉卡蚊(B.Antartica)、Bemisaspp.(侈l)如B.Tabaci)、Bicyclusspp.、Biphillusspp.、瘤背豆象屬物種(Callosobruchusspp.)、色巻蛾屬物種(Choristoneuraspp.)、虎曱屬物種(Cicindelaspp.)、庫蚊屬物種(Culexspp.)，庫蠓屬(Culicoidesspp.)、桔木虱屬物種(Diaphorinaspp.)、非耳味象屬物種(Diaprepes)、Eucidiaapp.、舌蠅屬物種(Glossinaspp.)、蟋蟀屬物種(Gryllusspp.)、紋石蛾屬物種(Hydropsychespp.)、土吉丁屬物種(Julodiaspp.)、Lonomiaspp.,羅玲屬物種(Lutzomyiaspp.)、Lysiphebusspp.Melademaspp.,萆甲屬物種(Mycetophagusspp.)、金小蜂屬物種(nasniaspp.)、Rhyncosciaraspp.、鳳蝶屬物種(Papiiospp.)、虱屬物種(Pedicuusspp.)、谷斑螟屬物種(Plodaspp.)、Rhynchsciaraspp.Sphaeriusspp.、聲蚜蟲屬物種(Tocopteraspp.)、Trichoplusaspp.、和阿蚊屬物種(Armigeresspp.)(例如騷擾阿蚊(ASubalbatus))。"有害生物控制劑"或"基因遏制劑"指包含第一RNA片斷和第二RNA片斷的特定RNA分子，其中，第一和第二RNA片斷之間的互補(bǔ)性導(dǎo)致兩條片斷能在體內(nèi)和體外雜交，形成雙鏈分子。通常，其優(yōu)選可以包括連接和穩(wěn)定第一和第二序列的第三RNA片斷，從而可形成莖，其中通過第三片段將第一和第二片段的各一端連接在一起以形成環(huán)，從而整個(gè)結(jié)構(gòu)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，甚至更緊密地雜交結(jié)構(gòu)可形成莖環(huán)有結(jié)(stem-loopknotted)結(jié)構(gòu)?；蛘?，可在沒有第三片斷的情況下形成對稱發(fā)夾，其中，沒有設(shè)計(jì)的環(huán)，但是就立體理由來說，當(dāng)莖足夠長到能穩(wěn)定自身的時(shí)候，發(fā)夾將產(chǎn)生其自身的環(huán)。通常，第一和第二RNA片斷將處于RNA分子的長度內(nèi)，是各自的充分倒置重復(fù)序列，并通過第三RNA片斷連到一起。對于在被dsRNA分子的攝入所遏制的靶昆蟲有害生物中從耙基因轉(zhuǎn)錄來的靼RNA而言，第一和第二片斷總是(并非分別)對應(yīng)于所述耙RNA的正義和反義序列。有害生物控制劑還可以是經(jīng)充分純化(或分離)的核酸分子，更具體地，來自基因組DNA(gDNA)或cDNA文庫的核酸分子或其核酸片段分子。或者，片段可包含具有大約15至大約250個(gè)核苷酸殘基(更優(yōu)選地，大約15至大約30個(gè)核香酸殘基)的更小的寡核苷酸。在本文中使用時(shí)，引入指核酸序列插入細(xì)胞，這通過包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法來實(shí)現(xiàn)。單子葉植物(monocotyledonousplant,英文也作monocot)是開花植物，其具有含一片子葉的胚，平行葉脈，花的各部分為3的倍數(shù)。單子葉植物的實(shí)例包括但不限于草碎草、玉米、稻、燕麥、小麥、大麥、高粱、紅門蘭、鴛尾、百合、蔥和棕櫚。線蟲或蛔蟲是最常見的動(dòng)物門之一，其具有超過20，000種不同的已知物種(超過15，000種是寄生的)。它們在淡水、海洋和陸地環(huán)境中普遍存在，在這些環(huán)境中，它們在個(gè)體數(shù)量和物種數(shù)量上通常都超過其它動(dòng)物，在遠(yuǎn)至南極和海溝的地方都能發(fā)現(xiàn)它們。此外，有大量的寄生形式，包括大多數(shù)植物和動(dòng)物中的病原體。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有線蟲，其對于RNA千擾導(dǎo)致的基因沉默來說是易感的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環(huán)境被內(nèi)在化。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，線蟲可以屬于異皮科(Heteroderidae),包括胞嚢線蟲屬(Heterodera)和球胞嚢線蟲屬(Globodera)。在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制性的實(shí)施方案和方法中，昆蟲選自下述組，該組包括但不限于根結(jié)線蟲屬物種(Me/wV/ogv"espp.)(例如南方根結(jié)線蟲(M/wcogm'/")、爪哇根結(jié)線蟲(Af./flv"m'ai)、禾草根結(jié)線蟲(MiGm附/w/c0/fl)、花生才艮結(jié)線蟲(AT.^wmn'fl)、奇氏才艮結(jié)線蟲(3/.CAiVhww//)、北方才艮結(jié)線蟲(Af.i/叩/fl)或M;/;flm/mew/s);胞嚢線蟲屬物種(好etenwfemspp.)(例如7jc稻胞嚢線蟲(好.。o;^e)、大豆胞嚢線蟲(ZT.G7yc,ViM)、玉米胞嚢線蟲(漢Ze^)或甜菜胞囊線蟲Sc/iflc/^/));球胞嚢線蟲屬物種(G/o6o&rflspp.)(例如馬鈴薯白線蟲(G.i\i//iWfl)或馬鈴薯金線蟲(G.及ostoc/^ewsfe));腎形線蟲屬物種(及o印/ewcA"/"sspp.)(例如腎形線蟲(兄及e",yi/"附/s));短體線蟲屬物種(iVfl印/ewd附spp.)(例如咖啡短體線蟲(P.coj^fle)、玉米短體線蟲(戶.Zetfe)或古迪短體線蟲(戶.gw^y/));穿孔線蟲屬物種(及"fifo/7Ao/附spp.)(例如香蕉穿孔線蟲(及.s/附/fe));潛才艮線蟲屬物種(/rzracA附做fW/flspp.)(例如稻潛才艮線蟲(好.Oo^te));鉤口線蟲屬物種(^wq;/Mto附aspp.)(例力口犬鉤口線蟲(J.c"w/"w附)、錫蘭鉤口線蟲(AC^j;/flr附'c"w)、十二指腸鉤口線蟲(AD柳&""/e)或管形鉤口線蟲(Ar"6"e/or附e));Jw&"/bV/;滑刃線蟲屬物種(J/;/^/e"c/^,V/^spp.)(例如水稻干尖線蟲(A必e^^/));鮰蟲(Ascarids);鮰蟲屬物種(爿sctffisspp.)(例如豬鮰蟲(A)或A/"/w6nV/o/fifes);刺線蟲屬物種(J5e/owo/a/附Msspp.);布魯絲蟲屬物種(丑rM^Vispp.)(例如馬來絲蟲(及Affl/^/)或彭亨絲蟲(及7，ff^z"g/));傘滑刃線蟲屬物種(必"Mfl/^e/e"d附spp.);新桿狀線蟲屬物種(a^"w^^&他spp.)(例如漂亮新小桿線蟲(ce/"fl朋)、C.6r/欲s^或C/T附aw"');梭菌屬物種(C7osfnVZ/"附spp.)(例如丙西同丁醇梭菌(CJce似6w0^/c"/w));古柏線蟲屬物種(awpeW"spp.)(例如腫孑L古柏線蟲(COwco//^m));輪線蟲屬物種(CWcwie附wVfesspp.);杯口屬物種(Q^^o對o/ww附spp.)(例如碗狀杯口線蟲(C.CV"/rt"似附)、冠狀杯口線蟲(CCV/y"fl似附)或C/mfeni似附)；杯環(huán)屬物種(Cj;/i'cocj;c/msspp.)(例如鮮明杯環(huán)線蟲(C/w/^ie)、細(xì)頸杯環(huán)線蟲(C7V"s仰,附)或C.nw/,W"s);杯冠屬物種((^//c^fe/^"w"sspp.)(例如高氏杯冠線蟲(C.GoW/)或長傘杯冠線蟲(C.Z^rag訪wra"似s));裂頭屬;惡絲蟲屬物種(/^>^//""紐spp.)(例如犬惡絲蟲(1X/附附/他))；莖線蟲屬物種(D一/ewcA附spp.)(例如續(xù)斷雙墊刃線蟲(Z).Z)&sad)、馬鈴薯腐爛線蟲(D.Z)"frw"w)或水稻莖線蟲(Z).Jwg"對附))；蟯蟲屬物種(五wteW附spp.)(例如蠕形住腸蟯蟲Ker附/c"/"Ws));血矛線蟲屬物種(/T"e附0Wc/jMSspp.)(例3口掄轉(zhuǎn)血矛線蟲(EOmtoW"s));螺旋線蟲屬物種(HcZ,'a^/euc/iMsspp.);紐帶線蟲屬物種(/To/7/o/"/附msspp.);光絲蟲屬物種(丄/tow^wV/Mspp.)(例如棉鼠絲蟲(丄.57g/m^tow泡))；長針線蟲屬物種(丄owg/^r船spp.)(例如大體長4十線蟲(丄.AfflCFYW0附"))；板口線蟲屬物種(2Vecatorspp.)(例如美洲板口線蟲(TVJ/weWam附))；日本圓線蟲屬物種(7Vi>/7<w,/wi^);/wsspp.)(例如巴西鉤蟲(TV.必ms,7/e附/s));盤尾絲蟲屬物種(O/ic/^ce/r"spp.)(例如4tit尾絲蟲(0.Ko/vm/ms));胃線蟲屬物種(Ostertog/flspp.)(例如奧斯特線蟲("as&"ag/));i^ms^wiw/wVfesspp.(例力口戶.加'c/r仍"n');類毛刺線蟲屬物種(戶flm的'c/^fltor附spp.)(例如較小類毛刺線蟲(jP.i\^>iw)或圓形類毛刺線蟲(尸.rera));擬馬鹿圓線蟲屬物種(尸ffre/"/7/fos^wigy/附spp.)(例:ft口薄富，J麂圓線蟲(/1.7^wi//s));Jfldo/7/fM/"sspp.;盾線蟲屬物種(1^"^//<《/71".spp.);類圓線蟲屬物種(S^wigy/wV/esspp,)(例如鼠類圓線蟲(X及a加')或糞類圓線蟲Sfe"om/^));背帶線蟲屬物種(7W"^rsagiVispp.)(例如j;"Vrw附"Vi"a);弓鮰線蟲屬物種(Taxflscw/sspp.)(例如獅弓蛔線蟲(r.);弓鮰蟲屬物種(rawc"r"spp.)(例如犬弓蛔蟲(r.C""&)或貓弓蛔蟲(7:CW/);毛線蟲屬物種(7Wc/^"e//aspp.)(例如7:6r/tov/、旋毛線蟲(r.5^/m//s)或r.印/n^);毛刺線蟲屬物種(7Wc/wfltor";ysp/.)(例如相似毛刺線蟲(7:));鞭蟲屬物種(2WcA"Wsspp.)(例如鼠鞭蟲(r.Afwis)、狐毛首線蟲(r.F"/;Zs)或鞭形鞭蟲(T.7>/c/iZmi7i));小墊刃線蟲屬物種(7>/柳由/附spp.);矮化線蟲屬物種(7>/ewcto—ctospp.);鉤蟲屬物種(t/"c/""nVzspp.)(例j口小頭鉤蟲屬(C/.Stewoc印Aff/fl));吳策線蟲屬物種(『mc/^wi7Vispp.)(例如班氏吳策線蟲(『5""cro/ft'));劍線蟲屬物種(A^7/i/we附"spp.)(例如標(biāo)準(zhǔn)劍線蟲(X/Mflfec)或美洲劍線蟲(Xy4歸Wamw附))。植物寄生線蟲導(dǎo)致嚴(yán)重作物損失。最常見的屬是滑刃線蟲屬(J/7/^/ewc/^/fifes)(葉線蟲)、才艮結(jié)線蟲屬(Me/wVto^;we)(才艮結(jié)線蟲)、胞嚢線蟲屬、球胞嚢線蟲屬(胞嚢線蟲)(例如，馬鈴薯根線蟲)、珍珠線蟲屬(7Vfl"A6附)、短體線蟲屬(腐線蟲)、莖線蟲屬、劍線蟲屬、長針線蟲屬、毛刺線蟲屬。其它線蟲攻擊樹皮和林木。該組中最重要的代表是爭〉材線蟲(5"rafl/7/^/e"c/r附J9;/oipA,7附)，這是木》木線蟲，其存在于亞洲和美洲，近來也被發(fā)現(xiàn)于歐洲。正常細(xì)胞是指未轉(zhuǎn)化表型的細(xì)胞或表現(xiàn)出待檢測組織類型的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。有效地連接表示將兩個(gè)或多個(gè)分子以下述方式組合起來，所述方式使得在組合中它們可以在植物細(xì)胞中正確發(fā)揮功能。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子就是與結(jié)構(gòu)基因有效地連接的。直向同源物是通過來自共同祖先的垂直演化相關(guān)的基因，它們編碼在不同物種中具有相同功能的蛋白質(zhì)。由于它們在物種形成事件后分離，因此，直向同源物可能有所差異，但是通常具有序列和結(jié)構(gòu)水平上的相似性。源自共同祖先并且編碼具有相似功能的蛋白質(zhì)的兩個(gè)基因被稱為直向同源物。對直向同源物的鑒定對于可靠預(yù)測新測序基因組中基因的功能來說是關(guān)鍵的。有害生物或耙有害生物包括但不限于昆蟲、焓蛛類、甲殼類、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、扁形動(dòng)物、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絳蟲、錐蟲、血吸蟲、狂蠅、跳蚤、壁虱、螨和虱，它們是人類環(huán)境中遍布的，并且會對植物造成損傷。有害生物可攝入或接觸用雙鏈基因遏制劑轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的一種或多種細(xì)胞、組織或產(chǎn)物。殺蟲劑指意欲用來防止、破壞、擊退或減輕任何有害生物的任何物質(zhì)或物質(zhì)的混合物。殺蟲劑可以是化學(xué)物質(zhì)或生物劑，例如，轉(zhuǎn)基因植物，其用于抵抗與人類竟?fàn)幨澄?、破壞?cái)產(chǎn)、傳播疾病或令人討厭的有害生物，包括昆蟲、植物病原體、雜草、線蟲和微生物。表型是植物的區(qū)別特性或特征，可根據(jù)本發(fā)明通過將一種或多種"想要的多核苷酸"和/或可篩選/選擇標(biāo)記整合進(jìn)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組中來對其加以改變。"想要的多核苷酸"和/或標(biāo)記可通過對經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或整林植物的大量遺傳、分子、生物化學(xué)、生理、形態(tài)或農(nóng)藝學(xué)特征或?qū)傩灾械娜魏我环N加以修飾，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物表型賦予變化。因此，一種或多種穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組中的想要的多核苷酸地表達(dá)可能產(chǎn)生選自(但不限于)下述的表型增加的疾病耐受性、增加的昆蟲耐受性、增加的干旱耐受性、增強(qiáng)的寒冷和霜凍耐受性、改善的活力(vigor)、增強(qiáng)的顏色、增強(qiáng)的健康和營養(yǎng)特征、改善的貯藏性、增強(qiáng)的產(chǎn)量、增強(qiáng)的鹽耐受性、增強(qiáng)的重金屬耐受性、增加的7jc脅迫耐受性、增強(qiáng)的甜度、改善的活力、改善的味道、改善的質(zhì)地、減少的磷酸鹽含量、增加的萌發(fā)、增加的微量營養(yǎng)素?cái)z取、改善的淀粉組成以及改善的花壽命。植物組織"植物"是植物界的多種光合、真核、多細(xì)胞生物中的任何生物，其特征性地產(chǎn)生胚，含有葉綠體并且具有纖維素細(xì)胞壁。可根據(jù)本發(fā)明的方法，對植物的一部分，即"植物組織"加以處理，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?？筛鶕?jù)本發(fā)明，來轉(zhuǎn)化很多合適的植物組織，其包括但不限于體細(xì)胞胚、花粉、葉、莖、愈傷組織、匍旬莖、微塊莖(microtubers)和枝條。因此，本發(fā)明預(yù)想對被子植物和棵子植物的轉(zhuǎn)化，所述植物例如，金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、谷物、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫，、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。根據(jù)本發(fā)明，"植物組織"還包括植物細(xì)胞。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、胼胝體、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物組織可以是多種成熟期的，其可生長于液體或固體培養(yǎng)物中，或者生長于罐、溫室或田間的土壤或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。植物組織還可指此類植物、種子、子代、繁殖體(無論有性還是無性產(chǎn)生的)以及任何這些的后續(xù)傳代物(descendent)(例如插條或種子)的任何克隆。植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞培養(yǎng)泛指下述工藝，通過所述工藝，對植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，并將其轉(zhuǎn)移到合適的植物培養(yǎng)基中用于保持、進(jìn)一步生長和/或進(jìn)一步發(fā)育。此類方法是技術(shù)人員>^的。子代(progeny):本發(fā)明的"子代"，例如，轉(zhuǎn)基因植物的子代，是由植物或轉(zhuǎn)基因植物作為母本或父本產(chǎn)生的或源自其的子代。因此，"子代"植物，即"F1"代植物是本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的后裔或后代。轉(zhuǎn)基因植物的子代可在其至少一個(gè)、一些或全部的細(xì)胞基因組中含有通過本文所述的方法整合進(jìn)親本轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的想要的多核苷酸。因此，想要的多核苷酸被子代植物"傳遞"或"遺傳"。由此在子代植物中遺傳的想要的多核苷酸可處于T-DNA構(gòu)建體中，所述構(gòu)建體也從其親本通過子代植物遺傳。本文中使用的術(shù)語"子代"還可被認(rèn)為是一組植物的后裔或后代。啟動(dòng)子啟動(dòng)子意^^示與RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的核酸，優(yōu)選地，DNA。和任何啟動(dòng)子一樣，本發(fā)明的啟動(dòng)子將協(xié)助或控制DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄，以從與所述啟動(dòng)子有效地連接的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。如前文所迷，產(chǎn)生的RNA可編碼蛋白質(zhì)或多肽，或者編碼RNA干擾或反義分子。植物啟動(dòng)子是能起始植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，而無論其來源是否是植物細(xì)胞。示例性的植物啟動(dòng)子包括但不限于從植物、植物病毒和細(xì)菌(例如農(nóng)桿菌屬或根瘤菌屬(及A/w6/"附))(其包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因)ll得的啟動(dòng)子。處于發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的例子包括優(yōu)先在某些組織(例如，木質(zhì)部、葉、根和種子)中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子被稱為組織優(yōu)先型啟動(dòng)子。能僅在某些組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子被稱為組織特異性啟動(dòng)子。細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一種或多種器官中某些細(xì)胞類型(例如，根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)，例如根特異性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型或阻抑型啟動(dòng)子是處于環(huán)境控制下的啟動(dòng)子。可通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件或光的存在。組織特異性、組織優(yōu)先型、細(xì)胞類型特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成了非組成型啟動(dòng)子的組,啟動(dòng)子。多核苷酸是這樣的核苷酸序列，其包含基因編碼序列或其片段、啟動(dòng)子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子區(qū)域、聚腺苷酸化位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、5'或3啡翻譯區(qū)域、報(bào)道基因、可選擇標(biāo)記等。多核苷酸可包含單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的堿基或經(jīng)修飾的主鏈。多核苷酸可以是基因組、RNA轉(zhuǎn)錄本(例如mRNA)或經(jīng)加工的核苷酸序列(例如cDNA)。多核苷酸可包含正義或反義方向的序列。經(jīng)分離的多核苷^并非處于其天然狀態(tài)的多核苷酸序列，例如，所述多核苷酸包含并非在自然界中發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列，或者所述多核苷酸與其通常接近的核苷酸序列分開，或者所述多核苷酸與其通常不接近的核苷酸序列相鄰。重組核苷酸序列指這樣的核酸分子，其含有通過誘變、限制性酶等進(jìn)行的操作產(chǎn)生的遺傳工程修飾。RNA干擾(RNAi)指通過短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的、對基因表達(dá)(蛋白質(zhì)合成)的序列特異性或基因特異性遏制。種子"種子，，可,皮認(rèn)為是成熟的植物胚珠(含胚)以及植物的繁殖部分，例如塊莖或孢子?？稍诤⑹飞锝閷?dǎo)的轉(zhuǎn)化之前，在黑暗中對種子進(jìn)行孵育，例如以促進(jìn)萌發(fā)。還可在孵育之前對種子滅菌，例如通過用漂白劑簡單處理。然后可將得到的幼苗暴露給想要的細(xì)菌，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化?？蛇x擇/可篩選標(biāo)記在植物或植物組織中表達(dá)時(shí)，使得可以將所述植物或植物組織與不表達(dá)該基因的其它植物或植物組織區(qū)別開的基因。篩選流程可能需要針對可篩選標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)的檢測?？蛇x擇標(biāo)記的例子包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(7V戶r//)基因(編碼卡那霉素和遺傳霉素(geneticin)抗性)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(好尸r或APHJF)基因(編碼對潮霉素的抗性)或本領(lǐng)域已知的其它類似基因。序列同一性在本文中使用時(shí)，在提到兩條核,列的上下文中，"序列同一性"或"同一性"包括指當(dāng)在特定區(qū)域上為最大程度對應(yīng)而比對時(shí)兩條序列中相同的殘基。當(dāng)序列因?yàn)楸Ｊ厝〈兴煌瑫r(shí)，可對百分比序列同一性加以調(diào)整，以針對取代的保守性質(zhì)加以校正。由于此類保守取代而有所不同的序列祐^人為具有"序列相似性"或"相似性"。用于進(jìn)行該調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本文中使用時(shí)，序列同一性百分比表示通過在比較窗口上比較兩條最優(yōu)比對的序列所確定的值，其中，為了對兩條序列進(jìn)行最優(yōu)比對，比較窗口中多核苷酸序列的部分較之對照序列(不包含添加或缺失)而言可包含添加或缺失(即，空位)。通過下述方法來計(jì)算百分比測定在兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基的位置數(shù)量，以產(chǎn)生匹配的位置，用所述匹配位置數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100，產(chǎn)生序列同一性百分比。"序列同一性"具有本領(lǐng)域認(rèn)可的含義，可使用公開的技術(shù)來計(jì)算。見ComputationalMolecularBiology,Lesk,編著(OxfordUniversityPress,1988)、BlOCOMPUTING:INFORMATICSANDGENOMEProjects,Smith,編著(AcademicPress,1993)、computerAnalysisOfsequenceData,部分I，Griffin&Griffm，編著，(HumanaPress,1994)、SequenceAnalysisInMolecularBiology,VonHeinje編著，AcademicPress(1987)、sequenceanalysisPrimer,Gribskov&Devereux,編著.(MacmillanStocktonPress,1991)和CariUo&Lipton，SZ4Af/.々^//MAffl狄.48:1073(1988)。通常用來測定兩條序列間同一性或相似性的方法包括但不限于GuideToHugeComputers,Bishop，編著，(AcademicPress,1994)和上文CariUo&Lipton中7〉開的。用于測定同一性和相似性的方法被編碼為計(jì)算機(jī)程序。用于測定兩條序列間同一性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，iYMcfe/c爿"Vfe及esewcA12:387(1984))、BLASTN、FASTA(Atschul等<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>和FASTDB(Bmtlag等人，Co附/;.必/固'.6:237(1990))。短發(fā)夾RNA(shRNA)是這樣的短單鏈RNA，其具有高度二級結(jié)構(gòu)，使得RNA鏈的一部分可形成發(fā)夾環(huán)。短干擾RNA(siRNA)指大約10至大約30個(gè)核苷酸長的雙鏈RNA分子，其具有特異性干擾基因蛋白質(zhì)表達(dá)的能力并由此得名。靶序列指有害生物中被選來通過雙鏈RNA技術(shù)遏制或抑制的核苷酸序列。靼序列編碼有害生物中重要的特性或生物學(xué)活性。轉(zhuǎn)錄終止子通常，本發(fā)明的表達(dá)DNA構(gòu)建體具有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其位于轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域的反向端?？删蚼RNA的穩(wěn)定性(以增強(qiáng)表達(dá))和/或就加到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的聚腺苷酸化尾的添加，來選擇轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。當(dāng)三鏈終止密碼子中的任何一個(gè)進(jìn)入核糖體上的A位點(diǎn)時(shí)，剛產(chǎn)生的多肽的翻譯就終止了。翻譯終止密碼子是UAA、UAG和UGA。轉(zhuǎn)化DNA(T-DNA):細(xì)菌T-DNA是公知的遺傳元件，其是能將其邊界內(nèi)含有的核苷酸序列整合進(jìn)另一基因組的元件。在這方面，通常，T-DNA側(cè)翼有兩條"邊界"序列。本發(fā)明的想要的多核苷酸和可選擇標(biāo)記可位于T-DNA的左邊界樣序列和右邊界樣序列之間。T-DNA中含有的想要的多核苦酸和可選擇標(biāo)記可與多種不同的、植物特異性的(即，天然的)或外源的核酸(例如啟動(dòng)子和終止子調(diào)控元件)有效地連接，所述核酸協(xié)助其表達(dá)(即，想要的多核苷酸或可選擇標(biāo)記編碼的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。對植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通過其將核酸穩(wěn)定插入進(jìn)植物細(xì)胞基因組的方法。可使用本領(lǐng)域公知的多種方法，在天然或人工條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可依賴于用于將核酸序列插入原核或真核宿主細(xì)胞的任何已知方法，其包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案(例如，"精細(xì)轉(zhuǎn)化"或"精準(zhǔn)育種")、病毒感染、Whiskers、電穿孔、顯微注射、聚乙二醇處理、熱激、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包含至少一個(gè)其中已穩(wěn)定整合了外源核酸的細(xì)胞基因組。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物是包含僅一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞和細(xì)胞基因組的植物，或者是包含一些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的植物，或者是其中全部細(xì)胞被遺傳修飾的植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是僅在轉(zhuǎn)基因植物可僅在其結(jié)構(gòu)的某些部分含有經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。變體在本文中使用時(shí)，"變體"應(yīng)當(dāng)被理解為表示與特定基因的標(biāo)準(zhǔn)或給定核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。術(shù)語"同等型(isoform)，，、"同種型(isotype)"和"類似物，，也表示核香酸序列的"變體"形式。通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、移除或取代改變的核苷酸序列可被認(rèn)為是"變體"序列。"變體"還可指"經(jīng)改組的基因"，例如Maxygen名下的專利中描述的。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于本文描述的特定方法、方案、載體和試劑等，這些都可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，而非意欲限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)當(dāng)注意，除非上下文明確另外指示，在本文和所附權(quán)利要求中使用時(shí)，單數(shù)形式"一個(gè)/一種，，和"這個(gè)/這種"("a"、"an"和"the")包括復(fù)數(shù)。因此，例如，提到"一種基因/基因"時(shí)也表示一種或多種基因，并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。I.耙有害生物本發(fā)明提供了控制有害生物侵襲的方法和構(gòu)建體，這是通過向有害生物施用靶編碼序列來實(shí)現(xiàn)的，所述序列能對有害生物中必要的生物學(xué)功能加以轉(zhuǎn)錄后阻遏或抑制。在本文中使用時(shí)，術(shù)語"有害生物"指昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、扁形動(dòng)物、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絳蟲、錐蟲、血吸蟲、狂蠅、跳蚤、壁虱、螨和虱等，其是人、動(dòng)物和植物中普遍存在的。有害生物可攝入或接觸用雙鏈基因遏制劑轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的一種或多種細(xì)胞、組織或產(chǎn)物。"有害生物抗性"性狀是使得植物對有害生物攻擊(通常，能造成植物的損傷或損失)有抗性的轉(zhuǎn)基因植物宿主的特征。此類有害生物抗性可以是天然突變導(dǎo)致的，或者，更通常^J陚予有害生物抗性的重組DNA的摻入導(dǎo)致的。為向轉(zhuǎn)基因植物給予昆蟲抗性，可以例如將重組DNA轉(zhuǎn)錄為RNA分子，其在重組植物的組織或液體中形成dsRNA分子。所述dsRNA分子部分地由RNA片段組成，所述RNA片段與喜好在重組植物上進(jìn)食的昆蟲有害生物中DNA序列編碼的相應(yīng)RNA片斷相同。靶昆蟲有害生物中的基因表達(dá)被所述dsRNA遏制，并且對靼昆蟲有害生物中基因表達(dá)的遏制導(dǎo)致植物對昆蟲具有抗性。合適的有害生物包括導(dǎo)致對植物或其部分的損傷的任何食植動(dòng)物。本發(fā)明特別包括昆蟲、線蟲和真菌有害生物。昆蟲有害生物是特別感興趣的，其包括但不限于來自鱗翅目的，例如，長翅4M屬物種(爿c/w/s印/0、褐帶巻蛾屬物種(J^m/7/^"5p^.)、透翅蛾屬物種(JegeWa)、地虎屬物種(JgW^S)、棉葉蟲(J/flAfl附flrfl/^///"ceae)、v4附盧/s1s/7/7.、梨豆夜域(^4"f/ca"5i"ge/M附flto//51)、黃^l^屬物種(j/r/iijws/7/)、i^M屬物種(Jrgj;尸o似eAwVi5/3/7.)、銀紋夜斌屬物種(^4wtogr"/7Afl5/3^.)、必M靴0/a/附Cfl、干果斑螺(cMte//fl)、杉匕虹果域(Gwyas/""mj^/wwewsis1)、禾草螺屬物種(CMo5//7.)、色il^屬物種(OroWstofiewm)、葡萄果蠹蛾(C7戸"fl/WgMe//fl)、縱巻葉野螟屬物種(Oi—fl/oc度/s卿.)、云;^J^屬物種(0ic/7/r"s/as/;/.)、Cbc/^/s5/7/7.、鞘織屬物種(CV/eo/7/roni5//7.)、大菜螺(Ow/rfo/o/mVi6/wo似"s)、蘋果異形小(Oj/7to/7/r/e6/"/e"a^Cfl)、小巻蛾屬物種(Q，力Vis/;/7.)、桿草螟屬物種(D/fl,iwfl印;0、蘇丹棉鈴蟲(Dz》fl/Y/w/sca^rne")、金剛鉆屬物種(s/7/.)、粉斑螟屬物種(￡/^eM/a5/3/7.)、花小巻蛾屬物種(iwcos附a5/7/7.)、女貞細(xì)巻蛾(E"/We"7/""挑A/g"e//)、黃毒蛾屬物種(五"/7fY"/s5/7/7.)、切夜域?qū)傥锓N(JE"mxo"sp/7.)、小食心蟲屬物種(Ofl/7/ro腸s/7/;.)、仏d[vflww6^mw"、實(shí)夜蛾屬物種(/^//WMs;y/7/7j、菜心野螟(/^//"/""m/flfe)、美國白蛾(母//rfl"/r/flr)、番癡蠹域d"/肌Vi)、旋纟丈潛域(Z^MC0/7femsr/te//")、柯扁奸屬物種(Zi^coto/r/ssp/;.)、葡萄花翅小巻域(Z^ewVl^^YWm)、毒域?qū)傥锓N(Zj7M朋,Wfl5/7/7.)、潛斌屬物種(Zjwi"iVi)、天幕毛蟲屬物種(Ma/"coswwflsp/.)、甘藍(lán)夜蛾(A/a膨s^m6mss/cfle)、煙草天械(Ma"d"cflsex:to)、秋尺域?qū)傥锓N((9/7ero/7Aterasp/.)、玉米螟(OWi7'"/fl7V"6,7fl/is)、超小巻蛾屬物種(戶fl附柳e"e5/7/7.)、揭i^^屬物種(尸a"^fe附/s5/)/7.)、d、目艮夜域/toi附e")、紅鈴麥蛾(i^"/"印/ro,")、馬鈴薯麥蛾(尸Mor/附ae")、菜粉蝶(尸/er/s1ra/me)、粉蝶屬物種(/VeWss/;/;.)、菜域(iV"teZ/a)、7Vfl戸5/7/7.、白禾螺屬物種(5W/7wp/r"g<iS/7/h)、姓莖野蛾屬物種(S^fl附l'")、長須4^屬物種(5^fl^gfWK狄^5/7/7.)、灰翅夜蛾屬物種((S/70fifo/7fem5/7/1.)、5^"朋幼《</。"5/7/7.、異舟蛾屬物種(77tffMiw"o/weflsp/;.)、巻蛾屬物種(r。r//^5/;/;.)、粉斑夜蛾(7V/c/w尸/"wVi)和巢域?qū)傥锓N(！^w"o附e"/fls早)；來自鞘翅目的，例如，叩頭蟲屬物種(jgr&to、花象屬物種(j"狄owo附nss/7/;.)、甜菜隱食甲(^to/miW"http://"e"Ws)、甜菜脛跳甲(OlfletoCfie附tfft'6/afc)、才艮頸象曱屬物種(Ow/f/7(7//teS5/7/7.)、象蟲屬物種(Cwrcn//ow/).)、皮蠹屬物種(Der附"tes)、食植瓢蟲屬物種(￡/7//flc/jwtfsp/7.)、五/T附fiwssp/7.、馬鈴薯葉甲(JLepri"o似raafifece附/Z"efl似)、稻7jC象屬物種(丄/sSW/^p&MSSp/,)、親金龜屬物種(臉/o/卵幼"5/7/7.)、6>^印/7"5S/7/7.、耳味象屬物種(6^/0尸A"c/rMSS/7/.)、i^(v"/WMSS/7/7.、弧麗金龜屬物種(jP0/H7//fl)、十節(jié)跳甲屬物種(i^y/Z/Oflfes)、炷長蠹屬物種(/J/^0/"^a)、金龜甲科(Sawa6dV/"e)、米象屬物種(57to/7/r//1^s/7/;.)、5"/to^Ygas/7p.、粉蟲屬物種(7>"^/7》w/;.)、擬谷盜屬物種(7>幼<///)和斑皮蠹屬物種來自直翅目的，例如蠊屬物種(說"加印/0、小蠊屬物種(5/"股//"5/7/7.)、螻蛄屬物種(5/7/7.)、馬德拉蜚蠊(Z^MCOp/lttett附tfcfe/Yie)、飛埴屬物種(sp/7.)、大蠊屬物種(尸e/7》/aweto)和沙漠埴屬物種(5Ww療簡卿.)；來自等翅目的，例如散白蚊屬物種(JWc"http://tei"m/7);來自嚙蟲目的，例如虱嚙屬物種(w/;.);來自虱目(Anoplura)的,例長口血虱屬物種(好"e附ato//w附印/;.)、毛虱屬物種(Z/"o^m幼"ssp/7.)、虱屬物種(戶"〖/c"/附5/;/.)、癭綿蜂屬物種(i^附/7/r/g船)和倭辨屬物種(sp/.);來自食毛目的，例如Z)"wfl/iVie"sp/;.和噴毛虱屬物種(7>/c/w<fecfes卿.)；來自纓翅目的，例如花薊馬屬物種(FrnwA^Vie/Zfl^/.)、籬薊馬屬物種(/TemVw幼r—卿.)、帶薊馬屬物種(r"wV幼r—卿.)、節(jié)瓜薊馬(77^7>y/m/附/)、煙薊馬(T7^7j^似6flc/)和南非黃硬薊馬(5Wrto,/rn》s來自異翅目(/^tero^tem)的，例如，臭蟲屬物種(C7附a^p.)、狄盲蜂(D/stowrie//"幼eo6n附a)、棉紅蜂屬物種(Z)y油/TMs)、五"c/riste卿.、扁盾蝽屬物種(五"rj^wter卿.)、稻緣蝽屬物種(丄印tocw/sa卿.)、綠蝽屬物種(7V"tfmW/O、皮蝽屬物種(尸/m附"s/7/;.)、紅獵蝽屬物種(i/i油Z"s卿.)、可可褐盲棒(Sfl/^rge//"、黑蝽屬物種(&W"—扁卿.)、錐獵棒屬物種(7>油卿卿.)、盲漆科物種(M/nV/fles/7/;.)，例:i口豆莢草盲蝽(Ziesperws)和美洲牧草盲棒(Z穿s//"eo/oWs)、長蝽科物種(Z^g緒V/"efamily卿.)例如美洲谷桿長蝽(J5Z&sms/ewco/teri/s)和蝽科物種(familysp/;.);來自同翅目的，例如，棉粉虱(j/e"^j^a/Zocc仍ms)、菜粉虱(j/ej;/w/es6mssz'c"e)、腎圓盾蜂屬物種(JomW/e//"5/7/7.)、蜂科(J/^Z力V/"e)、蜂屬物種(J/7/^s)、圓盾蜂屬物種(s/7p.)、甘薯粉虱(Je附/s/"似6ffci')、蠟嬌屬物種(Oro/7/"stersp/.)、Cfe/^w柳/^"/"s^/wVZ/"附、網(wǎng)籽草葉圓蜂(0^/^so附//^/"s<//cos/7eri/)、褐軟蠟嬌(/^5/erzV/M附)、綠小葉蟬屬物種(JT附/WflSC"5/7/7.)、J5Wm。扁/"Wgm/柳、斑葉蟬屬物種(^0^//^"e"/Yi卿.)、("scrwY//fl卿.、灰飛虱屬物種(Z^fife//7/fflX卿.)、丄flCfl"iM附co簡'、栃盾蜍屬物種(丄e/7iV/ayfl/7/^)、Af"cmsi》/r"ss/7/7.、瘤蜂屬物種、iVe/rWCZx;sp/;，、褐飛虱屬物種(iV/%mn^fl、」PflmtonVs/;/.、癭綿辨屬物種、螯紋粉嬌屬物種(戶/fl朋COCC"S5/7/7.)、白盾瑜屬物種(i^e"fif""/flaisp/ss/7/;.)、粉嬌屬物種(i^"flfococc"s1卿.)、木氛屬物種(i^〃fl邵.)、尸"/v/wwVi"e幼/o^cflr、笠圓盾蜂屬物種(gmw/ms/;/rfiW"s5/7/7.)、縊管蜂屬物種(及Ao/;"/仍f》力"附印/;.)、珠蠟價(jià)屬物種(S"/w"/a^p,)、帶葉蟬屬物種(Sai/7/^fV/e"ss/7/7.)、二叉辨屬物種(Sc/^"p/^s"/.)、谷網(wǎng)蜂屬物種(5/7/7.)、5顯^rHL(7Wflf/eWWjfesVfl/Wfl/7V尸W附)、^M州H(JW曜)和矢尖蜍(f/"fls/7/s"Yr/);來自膜翅目的，例如JC7WMJTWd美切葉蚊屬物種(j加印/7.)、麥莖蜂屬物種、松葉蜂屬物種(2>f>nVw印/7.)、松葉蜂科(Z),》WowfV/fle)、(7////"/fl/wi[vto附"、李實(shí)蜂屬物種(T^/7/ocfl挑p"sp/;.)、毛蚊屬物種(丄fls!7wsp/7/.)、d、家議(Af(9W0附w,M/M/7/rflrflow/s)、新+>葉蜂屬物種(7Veo^pf/o"印p)、火議屬物種(So/ewo/^/ss/p.)和胡蜂屬物種(F邵a邵.)；來自雙翅目的，例如,伊蚊屬物種(y4^fe卿.)、Jw^eW^ifl就aito、全;j匕毛蟻(AoW"/tf/f"s)、紅頭麗錄(Cfl//^7/r</YJrcj;狄/Yce/;/rtf/")、蠟實(shí)繩屬物種(C^YI故&S/7/;，)、金蠅屬物種(C7"，0附"'")、庫蚊屬物種(C"fejcw/0、黃蠅屬物種(C"te"6r"s/^.)、寡鬃實(shí)蠅屬物種(Dflc"s)、黑尾果蠅、廁蠅屬物種(F"MW/fl5/7/7.)、胃蠅屬物種((fl^Y/7/^7船卿.)、舌錄屬物種(G/柳/"fl卿.)、牛繩屬物種(場p^r廳卿.)、外p/^仍cfl卿.、斑潛錄屬物種(IiW歸""卿.)、綠錄屬物種(1""7Z"s/7/7.)、黑潛錄屬物種(Afe/^mflgra附j(luò);z")、家錄屬物種()、狂錄屬物種(卿.)、卿.、歐洲麥稈蠅(Osd""/a，)、天仙子泉錄(i^gww"'"戸c戸附z')、草種錄屬物種(尸/^rA/fl卿.)、蘋繞實(shí)蠅(i^ago/"/s)、蕈蚊屬物種(Sd"ms/;/7.)、廄錄屬物種(5^附0\:>^5/7/7.)、虻蟲屬物種(Tla6afiMSsp/7.)、7^ww/as/7/7.和大蚊屬物種(/"5p/.);來自蚤目的，例如角葉蚤屬物種(Orflto/7/^//"s)和鼠疫蚤(Xewc*/^//"c/refl;pZs1);以及來自纓尾目的，例如衣魚(丄印/s柳fls"cc/^nVm)。特別感興趣的線蟲有害生物包括，例如犬鉤口線蟲Cfl"/""wJ、錫蘭鉤口線蟲(AC^/做c/ww)、搶轉(zhuǎn)血矛線蟲(及OmtoW附)、奧斯特線蟲(aosfewag/)、漂亮新小桿線蟲、c.6WggsM、jP./7fl"yc附、糞類圓線蟲(S.Stercomto),鼠類圓線蟲(51.及"故)、戶.rn'd^min'、花生才艮結(jié)線蟲(Af.J"w<W7Vi)、奇氏根結(jié)線蟲(M.C7^Yhww/i")、北方根結(jié)線蟲(7w:好印/)、南方才艮結(jié)線蟲(tw:/wcogw/似)、爪哇才艮結(jié)線蟲(iw;/"v朋Zcfl)、m:馬鈴薯金線蟲(G.i仍toc/^"s的、馬鈴薯白線蟲(G.尸"肌V/fl)、大豆胞嚢線蟲(及G/j;"Vim)、甜菜胞嚢線蟲(K&Afl故7)、穿刺短體線蟲(戶.」Pew"m附)、傷殘短體線蟲(i5.K"/"附)、香蕉穿孔線蟲(及.S/附/fc)、Z.pwictoto、豬蛔蟲(ASw"附)、犬弓蛔蟲(r.Om&)、馬來絲蟲(及Ma/""')、犬惡絲蟲(Z)./附附/泡)、4t^:尾絲蟲(aFb/vw/"s)、狐毛首線蟲(r.、旋毛線蟲(r.S//mfc)、標(biāo)準(zhǔn)劍線蟲(X/m/ex)、十二指腸鉤口線蟲(j.D柳^femi/e)、人蛔蟲(A丄ww6WcwVfes)以及來自下述屬的物種滑刃線蟲屬、珍珠線蟲屬、莖線蟲屬、長針線蟲屬、毛刺線蟲屬和傘滑刃線蟲屬。特別感興趣的真菌有害生物包括但不限于小枝頂孢屬物種(Jcrewow^//"spp.)、鏈#^&屬物種(J/te/7iffnVispp.)(例如蕓苔生鏈(jftmi"r/fl6mw'co/")戚索蘭尼(氏)鏈^fe(J/tef7i肌Viso/翻'))、殼二孢屬物種(爿5coc/^似spp.)(伊J:ft口婉豆殼二孢(Jscoc/^to))、葡萄孢屬物種(丑o^j船spp.)(例如灰葡萄孢("Vicefl)或富克葡萄孢(5<^/joft>i/fl/wc&e//ffWfl))、4支孢屬物種(C7ados/w尸/wwspp.)、尾抱屬物種(O/rosporflspp.)(侈'J:i口菊池尾抱(CWr0s/7caA:汰wc/i//)或Orcas/wrflz"ea-附"yrf/s)、4支抱屬物種(C/fl^w/wn"附spp.)(侈'J如黃沖支孢(C/flflfos/wW"附/m/v/m))、刺盤孢屬物種(CW/etofrZc/i"附spp.)(例如豆刺盤孢(CW/etoWdw/w//"&附"^iVm"附))、彎孢屬物種(C"rv"/ar/flspp.)、色二孢屬物種(Z)^/oW"spp.)(例如玉米色二孢(Z)i)/oflf/fl))、大麥白粉菌(￡>jw);/regnwwiVi/s/印./rwflfe,')或豌豆白粉菌(五/jw》Ae/;/s/))、￡"nW/ffa尸附y(tǒng)/ovofvi、鐮孢屬物種(F"^ir/"附spp.X伊Ji口雪腐鐮孢(FwsaW"附w/vfl/e)、擬分支抱鐮孢(Fmsw/m柳spo/y,Wcto/to)、尖錄抱(F附flWw附oxys/7orM附)、禾本科嫌抱(Fwsfln.w附gm附/we"r"附)、F"5^Ww附ger附/wea尸"附、大刀錄抱(Fi/5w/m附c"/附orw附)、腐皮錄抱(F"sfl""附sy/flw/)、串珠鐮孢(Fw5w/m附附ow/ftyiw7we)或粉紅鐮孢(Fmsww附nwew附))、頂囊殼屬物種(GfleM附awo附y(tǒng)cesspp.)(伊J如d、麥禾丁員囊殼(G^eM附awo附j(luò);c&sgrawwViis,r/ft'"'))、赤審屬物種(G766crc//flspp.)(例如玉蜀黍赤霉(^fle))、長蠕孢屬物種(好e/附/"^仍/wWw附spp.)(侈iJ如jH^/附/fi幼o(hù)s/7oWM附^Mfc/c"附、炭色長螺抱(J7^/wwVi幼as/wWw附air6wiw附)、玉蜀泰長螺抱(^e/柳iVi狄as/wri7i附附flvd/s)或7j^稻^、球菌核病菌(/Te/附zVi^os/7w/m附s/g附wVfew附))、稻'J、球腔菌(I^ptosp/r<ier/am/v/"http://)、殼球孢屬物種(Macro/7/^附/""spp.)(例如菜豆殼球孢(例如稻痙病菌(Af"g鹿"r,/^))、球腔菌屬物種(Af戸一"ere,/flspp.)、從赤殼屬物種(7Ve"r/tfspp.)(例如Ato,/"/^應(yīng)fltococcfl)、霜霉屬物種(i^fwios/70fYispp.)(例如東北霜霉(jPe/wi仍/wra附a附/rMf/c")或煙草霜霉(i^/wi仍/wrfl似6flc/mi))、莖點(diǎn)霉屬物種(i^o附"spp.)(例如泰菜莖點(diǎn)霉(/，/^附"&似e))、層銹菌屬物種(戶/^^/wor"spp.)(例如豆著層錄菌(i^fl^o/wo/Yi/mc/^Wi/z/))、瘤梗孢屬物種(iViy附"似^^cA"柳spp.)(例如多主瘤梗孢(戶/^附ato加'c/ri/附0/mi/von/附))、疫霉屬物種(戶/y;to/7/t幼WYispp.)(侈，J3口掉疫審(尸/y;to/7/r狄o/Yid"""附o附/)、惡、疫審(尸/^to/7/^/^rfl)、菜豆疫霉(尸/^to/7/^/^ra/7/itfseo//)、寄生疫霉(尸/^to/7A^orfl/7flr"w7/c")、才甘桔褐腐疫霉(/V^to//^/^/*"">fl>/;/^/^rfl)、尸/ij^o/^^ora附egfls/^/7iM/5/7.S0f7ie或致病疫霉(尸/^to/7A,/^rfl/w/estows))、單軸霉屬物種(iV氾ww"mspp.)(例如葡萄生單軸霉(iVfls柳o/7flmWft'co/"))、叉絲單嚢殼屬物種(尸orf仍/^tfemspp.)(例如白叉絲單嚢殼(尸油5//rfl綁/ewa^/c/^f))、柄銹菌屬物種(i^/cc/"/flspp.)(例如高粱柄銹菌(戶wcc/w/flrswg/f/)、條形柄銹菌(尸wc"Vn"Wr/!ybr附/y)、'J、麥禾柄銹菌(尸"c"Vi,Vigr"柳/"Zs/s/.,n7/ci')、天門冬屬柄銹菌(戶"cc/"/""5/7flmg/)、隱匿柄錄菌(^Pmc"VmVi"co"flf/to)或落花生柄錄菌(戶"c"Vi/""mc/hVfc))、腐霉屬物種(&幼/"柳spp.)(例如瓜果腐霉(iy/i/"附flp/^肌V/e/7mi似附))、核腔菌屬物種(i^re/Jo/7/^mspp.)(例如4匿麥草核腔菌(i^mio/7/^fl)或圓核腔菌(尸戸wo/7/rwflteres))、梨孢屬物種(i^r/cM/fl/7Vispp.)(例如矛舀梨孢(尸戸'cw/"W"^潔))、腐霉屬物種(i^幼z.w附spp.)(例如終極腐霉(々^/"m"旭附m附))、if/i/fic0s/7or/"附seca//s、絲核菌屬物種(iA&oc似w/"spp.)(侈'J:ft口立才古絲核菌(及A/zoctofMViso/"w/)、稻沖古斑絲核菌(及/^'zoctowZ"orj^"e)或禾谷絲核菌(i/^octowZ"ce"fl//s))、根霉屬物種(及/^印"sspp.)(例如華根霉(及/t/zc;pmsc/rZ"ewwV/))、ScerC/w附spp.(爭J:ft口5^e尸W/"柳fo(^i/)、核盤菌屬物種(5Weroriw/aspp.)(侈'J長口核盤菌(5WcC/mVisr/ei7《iVr"附))、殼針孢屬物種(S印tonVispp.)(例如番蕩殼針孢(5^/7to"Vi(vco/7era/d)、大豆殼4f孢(Se/toWflgfyc/"es)、穎才古殼針孢(SeptonVimw/w"附)或小麥殼針孢(s印toWfl加'&w))、根串珠霉屬物種(rA/e/flv/o/w/sspp.)(例如根串珠霉(77hW"Wo/w&6fls/co/a))、腥黑粉菌屬物種(spp.)、木霉屬物種(7Wc/ro&r附flspp.)(例如綠色木霉(JWc/^cfef附"v/n/e))、鉤絲殼屬物種(C/d""/aspp.)(例如葡萄鉤絲殼(C/w"Viw/a))、玉蜀黍黑粉菌(C75說flg0附"j;&s)(例如玉蜀黍黑粉病)、黑星菌屬物種(Few似r/flspp.)(例如蘋果黑星菌(/fia^rMafc)或梨黑星菌(K^imr/"尸ZnVm))、或輪沖支孢屬物種(spp.)(侈'J3口大麗花輪斗支抱(f/aA/1V1e)或黃姿輪沖支抱(「^/"'///"附a/6o層a^M附))。II.鑒定耙序列本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒定和獲得包含用于生產(chǎn)dsRNA或siRNA的核苷酸序列的核酸。例如，此類方法包括(a)用包含來自被耙向昆蟲的核苷酸序列或其同源物的全部或一部分的雜交探針去探測cDNA或基因組DNA文庫；(b)鑒定出與雜交探針雜交的DNA克?。?c)分離出步驟(b)中鑒定的DNA克??；以及(d)對包含步驟(c)中分離出的克隆的cDNA或基因組DNA片段測序，其中，被測序的核酸分子轉(zhuǎn)錄RNA核苷酸序列或其同源物的全部或相當(dāng)大部分。此外，本發(fā)明包括獲得下述核酸片段的方法，所述核酸片段包含用于生產(chǎn)dsRNA或siRNA的相當(dāng)大部分的核苷酸序列，所述方法包括(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其對應(yīng)于來自4皮靼向有害生物的核苷酸序列之一的一部分；以及(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物，擴(kuò)增克隆載體中的cDNA或基因組DNA模板，其中，被擴(kuò)增的核酸分子轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的dsRNA或siRNA的相當(dāng)大部分。在對本發(fā)明的實(shí)踐中，耙基因可源自導(dǎo)致對作物植物的損傷并且因此導(dǎo)致產(chǎn)量損失的任何有害生物。采用若干種標(biāo)準(zhǔn)來選擇優(yōu)選的靼基因。所述基因是這樣的其蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有迅速的周轉(zhuǎn)率，使得dsRNA抑制導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平上的迅速減少。在某些實(shí)施方案中，選用下述基因是有好處的，所述基因表達(dá)水平的小降低就會對受體有害生物造成有害影響。如果想要靶向?qū)挿秶睦ハx物種，則例如，選擇在這些物種間高度保守的基因。相反，為了賦予特異性的目的而言，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，選用這樣的基因，其含有在各昆蟲物種間，或昆蟲與其它生物間保守程度較低的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，可能想要選用在其它生物中沒有已知同源物的基因。本文中使用的術(shù)語"源自"指可從特定來源或物種獲得的特定的核苷酸序列，但是不一定要直接從該特定來源或物種獲得。在一種實(shí)施方案中，選用在昆蟲腸中表達(dá)的基因。靶向在腸中表達(dá)的基因避免了對在昆蟲內(nèi)部擴(kuò)散dsRNA的需求。用于本發(fā)明的靶基因可包括，例如，與已知腸表達(dá)的、編碼質(zhì)膜質(zhì)子V-ATPase的蛋白質(zhì)組分(Dow等人，1997，；Dow，1999),例如V-ATPaseB或E亞基的基因的核普酸序列享有充分同源性的那些。該蛋白質(zhì)復(fù)合體是上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)的唯一增能劑(energizer),并且負(fù)責(zé)中腸腔的堿化。V-ATPase還在馬氏管中表達(dá)，馬氏管是昆蟲后腸的突起，其作用于液體平衡以及以類似于哺乳動(dòng)物腎臟器官的方式針對外來化合物解毒。在另一實(shí)施方案中，選用以重要方式參與昆蟲生長、發(fā)育和繁殖的基因。示例性的基因包括但不限于核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)亞基和p-coatamer基因，CHD3基因。核糖體蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是參與蛋白質(zhì)生物合成的核糖體的結(jié)構(gòu)組成成分，它們是胞質(zhì)小核糖體亞基的組分，核結(jié)構(gòu)組成成分。漂亮新小桿線蟲中的P-coatamer基因編碼蛋白質(zhì)，其是形成膜小泡外殼的多聚復(fù)合體的亞基。已在不同的生物體(例如擬南芥(J尸tf6/tfo/w/5")、黑尾果錄和酉良酒酵母(/S"cc/^wv附j(luò);c^ycerev/s/"e))中發(fā)現(xiàn)了相似的序列。還在不同生物體(例如，馬鈴薯葉甲(丄印ri"otomififece附/zVie"似)、辣根猿葉甲(尸/ifle^"coc/r/e肌W)、墨西哥豆孤蟲(五/j,7"c力朋vtfr/vC/yJ、墨西哥棉鈴象(Jw幼o(hù)朋附"s^rawffc)、赤擬谷盜(7>幼0""附c"s似wew附)、^>對(7V^z附/7ersic"e)、褐飛虱(iVi7flf/;ffn^似/"gews1)、二化螺(Or/tosw//7r柳a//51)、菜域(7V"te〃aA5;/0他"a)和居屋艾蟋(」d^to^附e幼"s))中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)序列。用于本發(fā)明的其它靶基因可包括，例如，在生存能力、生長、發(fā)育、繁殖和侵染性方面具有重要作用的那些基因。這些乾基因包括，例如持家基因、轉(zhuǎn)錄因子以及昆蟲特異性基因或新桿狀線蟲屬(Qiemw^flM/^s)或果蠅屬(Dmw//^7fl)中的致死敲除突變。用于本發(fā)明的粑基因還可以是來自其它生物體的那些，例如，來自線蟲(例如，根結(jié)線蟲屬物種或胞嚢線蟲屬物種)、其它昆蟲或蛛形綱(例如，馬鈴薯葉曱屬物種(丄^^/朋似mispp.)、猿葉甲屬物種(尸/m^/owspp.)、食植胍蟲屬物種(五/7i7"c/^f"spp.)、花象屬物種(Jw^owo附"sspp.)、4以谷盜屬物種(7W6o/Zw附spp.)、瘤辨屬物種、褐飛虱屬物種(7V/%7"/r^ispp.)、禾草螟屬物種(C7h'tospp.)、菜蛾屬物種(尸/"&//"8卩口.)或Jc/^/flSpp.)。此外，在本發(fā)明中用作為乾序列的核苷酸序列還可源自下述病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲或真菌基因，所述基因的功能已從文獻(xiàn)中建立，其核苷酸序列與昆蟲基因組中的耙基因共享充分相似性。對于可能成為本發(fā)明控制的靶的很多昆蟲來說，在關(guān)于大多l(xiāng)t&因的序列方面或特定基因突變導(dǎo)致的表型方面信息有限。因此，可基于模式生物(例如新桿狀線蟲屬fa^"w/rflr6力'^J或果蠅屬())中或其它一些昆蟲物種中的相應(yīng)基因的可獲得的信息來選擇基因。還可基于其基因已M征過的其它物種(例如線蟲或真菌物種)的可獲得的序列信息來選擇基因。在一些情況下，可能通過使用基因名或基因序列的檢索數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)來獲得來自靶昆蟲的相應(yīng)基因的序列。一旦獲得了序列，就可以使用PCR來擴(kuò)增昆蟲中,皮適當(dāng)選出的基因片斷，以用于本發(fā)明。為獲得來自昆蟲物種的相應(yīng)基因的DNA片斷，例如，可基于在漂亮新小桿線蟲或果蠅屬中，或其基因已被克隆的昆蟲中發(fā)現(xiàn)的序列，來設(shè)計(jì)PCR引物。對引物加以設(shè)計(jì)，以擴(kuò)增足夠長的DNA片斷，以用于本發(fā)明。選擇擴(kuò)增*使得即使引物并不精確匹配耙序列但擴(kuò)增仍能進(jìn)行。或者，可使用已知的昆蟲基因作為探針，從制備自昆蟲有害生物物種的基因組DNA或cDNA文庫，克隆出基因或其部分。用于進(jìn)行PCR和從文庫克隆的技術(shù)是已知的。在實(shí)施例中提供了關(guān)于基于以前從昆蟲物種中克隆出的基因序列來從靼昆蟲有害生物物種分離出DNA片斷的工藝的詳細(xì)細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，可以用多種技術(shù)來從昆蟲有害生物物種中分離出對應(yīng)于以前從其它物種分離出的基因的基因片斷。III.用于抑制或遏制耙基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了使用dsRNA方法抑制一種或多種靶基因在靶有害生物中的基因表達(dá)的方法。本發(fā)明特別可用于對真核基因表達(dá)加以調(diào)節(jié)，特別是對下述有害生物中存在的基因的表達(dá)加以調(diào)節(jié)，所述有害生物展示出大約4.5至大約9.5的消化系統(tǒng)？11水平，更優(yōu)選地，大約5.0至大約8.0，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約6.5至大約7.5。對于具有展示出上述范圍之外的pH水平的消化系統(tǒng)的植物有害生物來說，可能需要使用無須攝入dsRNA分子的遞送方法。本發(fā)明的方法包括將兩種或多種不同的雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體同時(shí)或順序提供給同一昆蟲，使得實(shí)現(xiàn)對多條耙基因的下調(diào)或抑制，或者使得實(shí)現(xiàn)對單個(gè)耙基因的更有效的抑制?；蛘?，通過提供擊中多條靼序列的一種雙鏈RNA來擊中多個(gè)靶，以及通過對應(yīng)于靼基因的雙鏈RNA片段的超過一個(gè)拷貝的存在，來更高效地抑制單個(gè)乾。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，雙鏈RNA構(gòu)建體包含多個(gè)dsRNA區(qū)域，每個(gè)dsRNA區(qū)域中的至少一條鏈包含與昆蟲耙基因的耙核苷酸序列的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，RNA構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)域可與相同或不同的靶基因互補(bǔ)和/或dsRNA區(qū)域可與來自相同或不同昆蟲物種的靶互補(bǔ)。由此，在植物宿主細(xì)胞中使用此類dsRNA構(gòu)建體，在植物中建立對單種或多種昆蟲物種的更為有效的抗性。在一種實(shí)施方案中，雙鏈RNA區(qū)域包括與耙基因互補(bǔ)的核苷^列的多個(gè)拷貝?；蛘?，dsRNA擊中同一耙基因的超過一個(gè)耙序列。本發(fā)明由此包括下述經(jīng)分離的雙鏈RNA構(gòu)建體，其包含與昆蟲靶的核苷酸序列的至少一部分互補(bǔ)的所述核普酸的至少兩個(gè)拷貝。開發(fā)了擊中多于一個(gè)上述耙的dsRNA或者針對不同的上述耙的不同dsRNA的組合，并將它們用于本發(fā)明的方法。申請人在WO2006/046148中描述了合適的dsRNA核苷酸和dsRNA構(gòu)建體，該文獻(xiàn)以其全文引入本文。術(shù)語"擊中"及其各種時(shí)態(tài)形式是表示dsRNA的至少一務(wù)隨與靼基因或核苷酸序列互補(bǔ)(以及從而可以結(jié)合)的替換性M方式。dsRNA的調(diào)節(jié)作用可應(yīng)用于有害生物中表達(dá)的多種基因，例如，負(fù)責(zé)細(xì)胞代謝或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源基因，包括持家基因、轉(zhuǎn)錄因子和編碼涉及細(xì)胞代謝的多肽的其它基因。在本文中使用時(shí)，短語"對基因表達(dá)的抑制"或"抑制靼基因在有害生物細(xì)胞中的表達(dá)"指來自所述耙基因的mRNA產(chǎn)物和/或蛋白質(zhì)水平不存在(或可觀察到的減少)。特異性指能抑制靶基因但不會對細(xì)胞的其它基何影響的能力。對耙基因在昆蟲有害生物中的基因表達(dá)的抑制可能導(dǎo)致昆蟲有害生物中產(chǎn)生新的表型性狀。"基因遏制"指用于降低基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的水平和/或I^mRNA的翻譯水平的任何公知方法?；蚨糁七€意欲表示來自基因或編碼序列的蛋白質(zhì)表達(dá)的降低，這包括轉(zhuǎn)錄后基因遏制和轉(zhuǎn)錄遏制。轉(zhuǎn)錄后基因遏制由從被耙向遏制的基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄來的mRNA的全部或部分與相應(yīng)的用于遏制的雙鏈RNA之間的同源性介導(dǎo)，其指細(xì)胞中可獲得來與核糖體結(jié)合的mRNA可獲得的量的充分并且可測量到的降低。轉(zhuǎn)錄的RNA可以是正義向的，實(shí)現(xiàn)所謂的共遏制，或者l良義向的，實(shí)現(xiàn)所謂的反義遏制，或者是雙向的，產(chǎn)生dsRNA，實(shí)現(xiàn)所謂的RNA干擾(RNAi)。轉(zhuǎn)錄遏制由細(xì)胞中dsRNA基因遏制劑的存在介導(dǎo)，所述遏制劑展示出與啟動(dòng)子DNA序列或其互補(bǔ)序列的充分序列同一性，以實(shí)現(xiàn)被稱為啟動(dòng)子反式遏制的效果?；蚨糁瓶蓪εc性狀相關(guān)的天然植物基因有效，例如，提供給植物降低的蛋白質(zhì)(天然基因編碼的)水平，或增強(qiáng)或降低的受影響代謝物水平。基因遏制還可對植物的下述有害生物中的靶基因有效，所述有害生物可才K或接觸含有基因遏制劑的植物材料，所述基因遏制劑具體地設(shè)計(jì)用來抑制或遏制在有害生物細(xì)胞中一種或多種同源或互補(bǔ)序列的表達(dá)。在美國專利No.5，107，065、5，759，829、5，283，184和5，231，020中公開了反義或正義方向的RNA進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄后基因遏制，以調(diào)控植物細(xì)胞中的基因表達(dá)。在WO99/53050、WO99/4卯29、美國專利申請公開No.2003/0175965和2003/0061626、美國專利申請No.lO/465,800和美國專利No.6，506，559和6，326，193中，公開了dsRNA在植物中遏制基因的用途。在植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因遏制的有益方法既利用了正義方向也利用了反義方向的轉(zhuǎn)錄RNA，它們作為例如發(fā)夾和莖和環(huán)結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的。用于實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因遏制的優(yōu)選DNA構(gòu)建體是這樣的其中，第一片斷編碼展示出反義方向的RNA，其展示出與被耙向遏制的基因片斷的充分同一性，其與正義方向的第二片斷相連，所述笫二片斷編碼展示出與第一片斷充分互補(bǔ)的RNA。此類構(gòu)建體通過第一片斷與第二片斷的雜交以及來自連接兩條片斷的核苦酸序列的環(huán)結(jié)構(gòu)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(見，WO94/01550、WO98/05770、US2002/0048814和S2003/0018993)。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，提供了下述核苷酸序列，其體外表達(dá)導(dǎo)致下述dsRNA^列的轉(zhuǎn)錄，所述dsRNA序列與有害生物中被耙向基因的RNA分子充分同源，所述有害生物包含有害生物基因組中核苷酸序列編碼的RNA序列。因此，在有害生物攝入或吸收摻入膳食中或噴霧到植物表面上的dsRNA序列后，就實(shí)現(xiàn)了對應(yīng)于耙有害生物細(xì)胞中耙基因的核苷^列下調(diào)。使用本發(fā)明的dsRNA技術(shù)對耙基因的抑制;l^列特異性的，因?yàn)閷?yīng)于RNA的雙鏈體區(qū)域的核苷酸序列被耙向進(jìn)行遺傳抑制。對于抑制而言，含有與耙基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA是優(yōu)選的。相對于耙序列而言具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列也被認(rèn)為是有效于抑制的。在對本發(fā)明的實(shí)施中，優(yōu)選地，抑制性dsRNA和耙基因的部分至少享有大約80%的序列同一性，或者大約85%的序列同一性，或者大約90%的序列同一性，或者大約95。/。的序列同一性，或者大約99%的序列同一性或者甚至大約100%的序列同一性。或者，可將RNA的雙鏈體區(qū)域功能性定義為能與靶基因轉(zhuǎn)錄本的一部分雜交的核苷酸序列。展示出更高同源性但短于全長的序列能夠抵補(bǔ)較長但同源性較少的序列。相同核苷酸序列的長度可以為至少大約25、50、100、200、300、400、500或者至少大約1000個(gè)堿基。通常，應(yīng)當(dāng)使用超過20-100個(gè)核苷酸的序列，雖然超過大約200-300個(gè)核苷酸的序列將是優(yōu)選的，并且超過大約500-1000個(gè)核苷酸的序列將是尤其優(yōu)選的，這取決于耙基因的大小。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)能耐受可能由于遺傳突變、林系多態(tài)性或進(jìn)化趨異性預(yù)期的序列變異。相對于耙基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或經(jīng)完全加工的mRNA來說，引入的核酸分子可以無需是絕對同源的，可以無需是全長的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要認(rèn)識到，如本文所公開的，為實(shí)踐本發(fā)明，RNA和靶基因之間無需100。/。的序列同一性。IV.制備dsRNA的方法可體內(nèi)或體外合成dsRNA分子。可通過單條自身互補(bǔ)的RNA鏈或從兩條互補(bǔ)的RNA鏈來形成dsRNA。細(xì)胞的內(nèi)源RNA聚合酶可介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或者，可用克隆的RNA聚合酶來用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄。可通過在器官、組織或細(xì)胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄；環(huán)境條件(例如，感染、脅迫、溫度、化學(xué)誘導(dǎo)物)的刺激；和/或在發(fā)育期或年齡的工程轉(zhuǎn)錄(engineeringtranscription)來粑向抑制。RNA鏈可被聚腺苷酸化或者可不,皮聚腺苷酸化；RNA鏈可以能夠通過細(xì)胞的翻譯設(shè)備翻譯為多肽，或者可以不能這樣。的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA，或在另一生物體中體內(nèi)產(chǎn)生。還可通過部分或全部的有機(jī)合成來產(chǎn)生RNA;可以通過體外齊&或有機(jī)合成引入任何經(jīng)修飾的核糖核苷酸?？赏ㄟ^細(xì)胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)來合成RNA。表達(dá)構(gòu)建體的4吏用和產(chǎn)生都是本領(lǐng)域已知的(見，例如，WO97/32016;美國專利No.5,593，874、5,698,425、5，712，135、5，789，214和5，804，693)。如果RNA是通過化學(xué)合成或者通過體外il^合成的話，那么可在引入細(xì)胞之前對RNA進(jìn)行純化。例如，可使用溶劑或樹脂萃取、沉淀、電泳、色譜或其組合從混合物中純化出RNA?？蛇x地，可在不純化或盡量少純化的條件下使用RNA，以避免由于樣品加工造成的損失。RNA可凈皮干燥用于貯存，或者可溶解于水溶液中。溶液可含有緩沖液或鹽，以促進(jìn)雙鏈體的退火和/或穩(wěn)定。V.多核苦酸序列根據(jù)本發(fā)明提供了下述核苷酸序列，其表達(dá)產(chǎn)生了與有害生物中被靼向基因的RNA分子(包含有害生物基因組中核苷^^列編碼的RNA^列)充分同源的RNA序列。因此，dsRNA序列被才IU^后，可獲得對有害生物細(xì)胞中耙基因的核苷酸序列的下調(diào)，這導(dǎo)致對有害生物的保持、生存能力、增殖、繁殖和侵襲來說有害的影響。本文示出的每條"核苷酸序列"都表示為脫氧核糖核苷酸(縮寫為A、G、C和T)序列。但是，核酸分子或多核苷酸的"核苷酸序列"對于RNA分子或多核苷酸而言表示脫氧核糖核苷酸的序列，但是對于RNA分子或多核苷酸而言，其表示相應(yīng)的核糖核苷酸(A、G、C和U)的序列，其中，給定的脫氧核苷酸序列中的每個(gè)胸苷脫氧核苷酸(T)被核糖核苷酸尿苷(U)替換。在本文中使用時(shí)，"核酸"表示從5'到3'末端閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸威基的單鏈或雙鏈聚合物。任選地，核酸還可含有下述非天然存在的核苷酸威基或改變的核苷酸堿基，其允許聚合酶的正確連讀，并且不會降低所述核酸編碼的多肽的表達(dá)。"核苷酸序列"或"核酸序列"既指核酸的正義鏈也指其反義鏈，并且無論是單個(gè)單鏈狀態(tài)或處于雙鏈體中的。術(shù)語"核糖核酸"(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(雙鏈RNA)、siRNA(小干擾RNA)、mRNAH言4吏RNA)、miRNA(孩￡小RNA)、tRNA(轉(zhuǎn)移RNA，無論是否被相應(yīng)的酰基化氨基酸加上電荷或卸掉電荷)和cRNA(互補(bǔ)RNA)，術(shù)語"脫氧核糖核酸"(DNA)包括cDNA和基因組DNA和DNA-RNA雜交體。本領(lǐng)域4支術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將詞匯——"核酸片斷"、"核苷酸片斷"或更一般性的"片斷"理解為功能性術(shù)語，其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉(zhuǎn)移RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列以及更小的經(jīng)過改造的核苷酸序列，所述核苷酸序列表達(dá)或被改造來表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的核酸分子，其包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813_862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、卯8-■1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核苷酸序列的序列。本發(fā)明還提供了SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、mi-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、is^1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的多核苷紗列的功能性片段。本發(fā)明還提供了SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730—2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核苷^列的互補(bǔ)核酸或其片段，以及包含至少15個(gè)連續(xù)g的核酸，其與SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、卯8-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730—2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481的j壬何多核苷酸序列雜交。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、卯8-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的多核苷,列的直向同源物序列及其互補(bǔ)序列和片段。因此，本發(fā)明包括下述耙基因，它們是包含下述核苷,列的基因的昆蟲直向同源物，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、卯8-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何所示。舉例而言，昆蟲直向同源物可包含SEQIDNO:49-123、275-434、533-562、621-738、813-852、卯8-1010、1161-1437、1730-1987、2120-2290、2384-2438中任何所示的核苷酸序列，或其至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個(gè)核苷酸的片段。包含本發(fā)明的序列之一的至少15bp(優(yōu)選至少17bp)片段的、昆蟲或蛛形綱直向同源物基因或序列的非限制性列表在表4中給出。本發(fā)明還包括下述耙基因，它們是包含下述核苷g列的基因的線蟲直向同源物，所述核苷酸序列如本發(fā)明的任何SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813--862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中所示。舉例而言，線蟲直向同源物可包含本發(fā)明的SEQIDNOs:124-135、435-446、563、564、739-751、853、854、1011-1025、1438-1473、1988-2001、2291-2298、2439-2440中任何所示的核苷酸序列，或者其至少15、16、17、18、19、20或21個(gè)核苷酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明由此包括本文所述的、用于控制生物體中線蟲生長或者用于防止線蟲侵襲對線蟲感染易感的生物體的任何方法，所述方法包括將線蟲細(xì)胞與下述雙鏈RNA相接觸，其中，所述雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中之一具有與下述耙基因的核苷,列的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，所述耙基因包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730—2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120—2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個(gè)核苦酸的片段，由此，所述雙鏈RNA被真菌攝取，并由此控制了生長或防止了侵襲。本發(fā)明還涉及線蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物，其包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621_767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、卯8畫1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個(gè)核苷酸的片段。包含本發(fā)明的序列之一的至少15bp(優(yōu)選至少17bp)的片段的、線蟲直向同源物基因或序列的非限制性列表在表5中給出。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明包括下述靶基因，它們是包含下述核苷酸序列的基因的真菌直向同源物，所述核苷酸序列如本發(fā)明的SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521'.533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、,1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730—2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何所示。舉例而言，真菌直向同源物可包含SEQIDNO:136-158、447-472、565-575、752-767、855-862、1026-1040、1474-1571、2002-2039、2299-2338、2441-2460中任何序列所示的核苷酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個(gè)核苷酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明由此包括本文所述的、用于控制細(xì)胞或生物體上真菌生長或者用于防止真菌侵襲對真菌感染易感的細(xì)胞或生物體的任何方法，所述方法包括將真菌細(xì)胞與下述雙鏈RNA相接觸，其中，所述雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中之一具有與下述靶基因的核苷酸序列的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，所述耙基因包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、卯8-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個(gè)核苷酸的片段，由此，所述雙鏈RNA被真菌攝取，并由此控制了生長或防止了侵襲。本發(fā)明還涉及真菌抗性轉(zhuǎn)基因植物，其包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-.2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個(gè)的片段。包含本發(fā)明的序列之一的至少15bp(優(yōu)選至少17bp)的片段的、真菌直向同源物基因或序列的非限制性列表在表6中給出。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的dsRNA分子包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、卯8-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120一2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列，雖然SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730—2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120--2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的序列是非限制性的。本發(fā)明的dsRNA分子可包含來自有害生物物種的任何連續(xù)的靼基因(例如，大約15至大約25或更多，或大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸)。"經(jīng)分離的"核酸分子表示已從其天然環(huán)境移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本發(fā)明的目的而言，DNA構(gòu)建體中含有的重組DNA分子就被認(rèn)為是經(jīng)分離的。經(jīng)分離的DNA分子的另外實(shí)例包括在異源宿主細(xì)胞中保持的重組DNA分子，或溶液中經(jīng)(部分或充分)純化的DNA分子。經(jīng)分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體外RNA轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)分離的核酸分子還包括合成生產(chǎn)的那些分子。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA(例如mRNA)的形式或DNA的形式，包括，例如，cDNA或基因組DNA，它們是通過克隆獲得的或合成產(chǎn)生的。DNA或RNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈，其也被稱為正義鏈，或者其可以是非編碼鏈，這也被稱為反義鏈。VI.序列分析除非另有指明，本文中通過對DNA分子進(jìn)行測序測定的所有核苷,列都是用自動(dòng)DNA測序儀(例如來自應(yīng)用生物系統(tǒng)>5^司(AppliedBiosystems，Inc.)的373型)測定的。因此，如本領(lǐng)域中關(guān)于通過該自動(dòng)手段測定的任何DNA序列而言已知的那樣，本文測定的任何核苷酸序列可能含有一些餘溪。通常，通過自動(dòng)方法測定的核普酸序列與被測序DNA分子的實(shí)際核苷酸序列有至少大約95%同一，更通常，至少大約96%至至少大約99.9%同一?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的其它手段，包括手動(dòng)DNA測序法，來更為精確地測定實(shí)際序列。如本領(lǐng)域中還已知的那樣，測定的核苷酸序列中較之實(shí)際序列的單個(gè)插入或缺失將引起在核苷酸序列翻譯中移碼，從而，測定的核苷酸序列編碼的預(yù)測M酸序列可能從此類插入或缺失之處開始與被測序DNA分子實(shí)際編碼的^J^^列完全不同。在另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其包含在嚴(yán)格雜交M下與上文所述的;^發(fā)明核酸分子中多核苷酸的一部分雜交的多核苷酸。與多核苷酸的"一部分，，雜交的多核苷酸意指與參照多核苷酸的至少大約15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，至少大約20個(gè)核苷酸，仍更優(yōu)選地，至少大約30個(gè)核普酸，甚至更優(yōu)選地，超it30個(gè)核苷酸雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。與參照片段雜交的這些片段可用作為診斷探針和引物。就本發(fā)明的目的而言，當(dāng)兩條序列能在6xSSC，0.5%SDS，5xDenhardt，s溶液和100照非特異性運(yùn)載體(carrier)DNA的雜交溶液中形成雙鏈復(fù)合體時(shí)，那么兩條序列就是能雜交的。見，Ausubel等人，2.9部分，supplement增刊27(1994)。序列可在"中等嚴(yán)格度"下雜交，其被定義為在6xSSC，0.5%SDS，5xDenhardt，s溶液和100嗎非特異性載體DNA的雜交溶液中，溫度為60。C。對"高嚴(yán)4^度"雜交而言，溫度增加至68。C。中等嚴(yán)格度雜交反應(yīng)之后，于室溫下，在2xsSC加0.05。/。SDS中的溶液中對核苷酸洗滌5次，隨后在60。C用0.1xSSC加0.1。/。SDS洗l小時(shí)。對于高嚴(yán)格度而言，洗滌溫度增加至68°C。就本發(fā)明的目的而言，雜交的核苷酸是使用lng具有10，000cpm/ng的特異放射性的經(jīng)放射標(biāo)記的探針探測到的那些，其中，在-70。C暴露給X-射線膠片不超過72小時(shí)后，雜交的核苷酸清晰可見。本申請涉及下述核酸分子，它們與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、卯8-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120—2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384—2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列所示的核酸序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一。但是，優(yōu)選的是與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的核酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核酸分子。兩條核酸序列間的差異可能發(fā)生于參照核普酸序列的5'或3'末端的位置，或者這些末端位置之間的任何地方，它們可以各自單獨(dú)地散布于參照序列的核苷酸中，或者散布在參照序列中的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的組中。在實(shí)踐方面而言，任何特定核酸分子是否與參照核普酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%同一是指使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)算法在兩個(gè)分子間進(jìn)行的比較，這可以使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序，例如BLASTN算法方便地測定。見，Altschul等人，7VMc/"cJ"Vfe及w25:3389-3402(1997)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，核酸包含具有大約15至大約30(例如，大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個(gè)核苷酸的反義鏈，其中，所ii^義鏈與編碼下述蛋白質(zhì)的RNA序列或其一部分互補(bǔ)，所述蛋白質(zhì)能控制細(xì)胞周期或同源重組，并且，其中，所述siNA還包含具有大約15至大約30(例如，大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個(gè)核苷酸的正義鏈，并且，其中，所述正義鏈和所^義鏈?zhǔn)遣煌暮塑账嵝蛄?，其中，每條漣中至少大約15個(gè)核苷酸與另一g互補(bǔ)。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能介導(dǎo)RNA千擾基因沉默的雙鏈核酸分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子由下述雙鏈體核酸分子構(gòu)成，所述核酸分子在包含大約15至大約30(例如，大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個(gè)核苷酸的寡^核苷酸之間含有大約15至大約30個(gè)^對。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有大約1至大約32(例如，大約l、2或3)個(gè)核苷酸的突出末端的雙鏈體核酸分子，例如，大約21-核苷酸雙鏈體，其具有大約19個(gè)^對和3'端單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出端。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有平端的雙鏈體核酸分子，其中兩端均是平端，或者可選地，其末端之一是平末端。本發(fā)明的siNA分子可包含經(jīng)修飾的核普酸，并且同時(shí)保留介導(dǎo)RNAi的能力。經(jīng)修飾的核苷酸可用于改善體外或體內(nèi)特征，例如，穩(wěn)定性、活性和/或生物利用性。例如，本發(fā)明的siNA分子可包含占siNA分子中存在的核苷酸總數(shù)百分比的經(jīng)修飾核苷酸。同樣地，一般而言，本發(fā)明的siNA分子可包含大約5%至大約100%的經(jīng)#"飾核苷酸(例如，大約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的經(jīng)<務(wù)飾核苷酸)。給定的siNA分子中存在的經(jīng)修飾核苷酸的實(shí)際百分比將取決于siNA中存在的核苷酸的總數(shù)。如果siNA分子是單鏈的，那么百分比修飾可基于單鏈siNA分子中存在的核苷酸的總數(shù)。類似地，如果siNA分子是雙鏈的，那么，百分比修飾可基于正義鏈、反義鏈或正義和反義兩條鏈中存在的核苷酸的總數(shù)。VII.核酸構(gòu)建體重組核酸載體，可以例如是線性質(zhì)粒或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以是單個(gè)栽體或質(zhì)?；蛞黄鸷袑⒁爰?xì)菌宿主基因組中的全部核酸的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒。此外，細(xì)菌載體可以是表達(dá)載體。例如，可在合適啟動(dòng)子的控制下，將SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1070、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481示出的核酸分子或其片段適當(dāng)?shù)夭迦胼d體，所述啟動(dòng)子在一種或多種微生物宿主中發(fā)揮作用，以驅(qū)動(dòng)所連的編碼序列或其它DNA序列的表達(dá)。就此目的而言，很多種載體都是可獲得的，對合適的載體的選擇主要取決于將插入載體的核酸的大小以及將用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。每種載體都含有多種組分，這取決于其功能(擴(kuò)增DNA或表達(dá)DNA)和與其相容的特定宿主細(xì)胞。對于細(xì)菌轉(zhuǎn)化而言，栽體組分通常包括但不限于下述中的一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種可選擇標(biāo)記基因和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以允許外源DNA的表達(dá)。啟動(dòng)子提到調(diào)控序列和結(jié)構(gòu)核苷酸序列時(shí)使用的"有效地連接"表示，調(diào)控序列能使得所連接的結(jié)構(gòu)核苷酸序列受調(diào)控表達(dá)。"調(diào)控序列"或"控制元件"指位于結(jié)構(gòu)核普酸序列上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3'非翻譯序列)的核苷酸序列，其能影響轉(zhuǎn)錄的時(shí)間選擇和水平或量、RNA加工或穩(wěn)定性或相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)核苷酸序列的翻譯。調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、阻抑物結(jié)合序列和聚腺苷酸化識別序列等。用于生產(chǎn)mRNA的表達(dá)載體還可含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其可被宿主細(xì)菌生物體識別，并且其與感興趣的核酸有效地連接，所述核酸編碼，例如，編碼玉米才艮螢葉甲(D.v.v/rp/mi)mRNA的核酸分子或其片段。適用于細(xì)菌宿主的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括p-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子、大腸桿菌入噬菌體PL和PR啟動(dòng)子和大腸桿菌半乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子和乳糖操縱子啟動(dòng)子及其變異以及雜合啟動(dòng)子，例如tac啟動(dòng)子。但是，已知的其它細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也是合適的。本發(fā)明包括在不同植物物種中具有功能的啟動(dòng)子?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)多肽的啟動(dòng)子包括如Odell等人(1985)所述的，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，和/或受時(shí)間調(diào)控、受空間調(diào)控和受時(shí)空調(diào)控的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子和FMV35S啟動(dòng)子。就本發(fā)明的目的而言，例如，為了對以#>為食的物種進(jìn)行最優(yōu)控制，實(shí)現(xiàn)這些基因在植物根中的最高水平表達(dá)可能是優(yōu)選的。大量的根增強(qiáng)啟動(dòng)子已得到鑒定，它們是本領(lǐng)域中已知的(Lu等人，2000、美國專利No.5，837，848和6，489，542)。在一種實(shí)施方案中，植物轉(zhuǎn)化載體包含經(jīng)分離的和經(jīng)純化的DNA分子，其包含與本發(fā)明的一條或多條核苷酸序列有效地連接的啟動(dòng)子。所述核苦斷列選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240—246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1070、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481。所述核苷酸序列包括編碼被靼向的有害生物RNA轉(zhuǎn)錄本中存在的RNA的全部或部分的片斷，并且可以包含被靼向的有害生物RNA全部或部分的倒置重復(fù)序列。包含表達(dá)載體能性內(nèi)含子序列，并且還可含有位于啟動(dòng)子和翻譯起始點(diǎn)之間的5撇(5')非翻譯前導(dǎo)序列(即，UTR或5，-UTR)?？蛇x擇標(biāo)記基因通常，本發(fā)明的重組DNA栽體或構(gòu)建體將包含可選擇標(biāo)記，其賦予植物細(xì)胞可選擇的表型?？蛇x擇標(biāo)記還可用于選出含有編碼本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)的外源核酸的植物或植物細(xì)胞。所述標(biāo)記可編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素等)或除草劑抗性(例如，草甘膦等)?？蛇x擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于neo基因，其編碼卡那霉素抗性，可使用卡那霉素、G418等來加以選擇；bar基因，其編碼雙丙氨膦抗性；突變EPSP合酶基因，其編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予對溴苯腈的抗性；突變乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其賦予對咪唑啉酮類和磺酰脲類的抗性；以及氨曱蝶呤抗性的DHFR基因。此類可選擇標(biāo)記的實(shí)例在美國專利5,550，318、5,633,435、5，780，708和6，118，047中有所闡述。本發(fā)明的重組載體或構(gòu)建體還可包括可篩選標(biāo)記?？珊Y選標(biāo)記可用于監(jiān)測表達(dá)。示例性的可篩選標(biāo)記包括p-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，已知有多種顯色底物可用于其編碼的酶(Jefferson,1987;Jefferson等人，1987);R-基因座基因，其編碼的產(chǎn)物調(diào)控植物組織中花色素苷色素(紅色)的產(chǎn)生(Dellaporta等人，1988);p-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978),已知有多種顯色底物可用于該基因編碼的酶(例如，PADAC，顯色的頭孢菌素)；熒光素酶基因(Ow等人，1986);xylE基因(Zukowsky等人，1983)，其編碼兒茶酚加雙氧酶，該酶可轉(zhuǎn)化顯色的兒茶酚；ot-淀粉酶基因(Ikatu等人，19卯)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其編碼能將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌(進(jìn)而縮合為黑色素)的酶；和a-半乳糖苷酶，其催化顯色的a-半乳糖底物。優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化載體包括源自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的那些(例如，美國專利No.4,536,475、4，693，977、4，886，937、5，501，967和EP0122791)。發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒(或"Ri")也可使用，其也是本領(lǐng)域已知的。其它優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化載體包括公開的那些，例如，Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和EP01205167>開的。一般而言，優(yōu)選將功能性重組DNA引入到植物基因組的非特異性位置上。在特定的情況下，通過位點(diǎn)特異性整合來插入重組DNA構(gòu)建體可能是有用的。存在若干種已知能使植入物發(fā)揮功能的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，包括美國專利4，959,317公開的cre-lox和美國專利5，527，695公開的FLP-FRT?？墒褂帽绢I(lǐng)域中可獲得的方法，來容易地制備轉(zhuǎn)化載體。轉(zhuǎn)化載體包含一種或多種下述核苷酸序列，所述序列能^皮轉(zhuǎn)錄為RNA分子并且與昆蟲基因組編碼的一種或多種核苷酸序列充分同源和/或互補(bǔ)，從而，吸收所述RNA后，昆蟲基因組中分別的核苷酸序列中的至少一種的表達(dá)被下調(diào)。植物轉(zhuǎn)化載體可含有來自多于一個(gè)基因的序列，由此允許產(chǎn)生多于一種dsRNA，以抑制M害生物細(xì)胞中兩種或多種基因的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識到其序列對應(yīng)于不同基因中存在的序列的DNA片斷可被組合為單個(gè)復(fù)合DNA片斷，用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)?？蛇x地，可通過在增強(qiáng)子和啟動(dòng)子和終止子序列之間順序插入額外的DNA片斷，來修飾本發(fā)明的已經(jīng)含有至少一種DNA片斷的質(zhì)粒。在設(shè)計(jì)來抑制多種基因的本發(fā)明的昆蟲控制劑中，將被抑制的基因可以從相同的昆蟲物種獲得，以增強(qiáng)昆蟲控制劑的有效性。在某些實(shí)施方案中，基因可源自不同的昆蟲，以拓寬所述劑有效的昆蟲范圍。當(dāng)為了遏制或?yàn)榱吮磉_(dá)和遏制的組合靶向了多種基因時(shí)，可按照Fillatti，申請^^開文本No.US2004-0029283的闡述和公開，來構(gòu)造多順反子DNA元件。轉(zhuǎn)化載體可被稱為dsDNA構(gòu)建體，其還可被界定為重組分子、昆蟲控制劑、遺傳分子或嵌合遺傳構(gòu)建體。本發(fā)明的嵌合遺傳構(gòu)建體可包含，例如，核苷酸序列，其編碼一種或多種反義轉(zhuǎn)錄本、一種或多種正義轉(zhuǎn)錄本、一種或多種前述每種，其中，轉(zhuǎn)錄本的全部或部分與下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含昆蟲基因組中的核苷酸序列編碼的RNA^列。VIII.用于遺傳工程改造的植物"植物"是植物界的多種光合、真核、多細(xì)胞生物中的任何生物，其特征性地產(chǎn)生胚，含有葉綠體并且具有纖維素細(xì)胞壁?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法，對植物的一部分，即"植物組織"加以處理，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?？筛鶕?jù)本發(fā)明，來轉(zhuǎn)化很多合適的植物組織，其包括但不限于體細(xì)胞胚、花粉、葉、莖、愈傷組織、匍旬莖、微塊莖和枝條。因此，本發(fā)明包括對被子植物和棵子植物的轉(zhuǎn)化，所述植物例如，金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白茱、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、谷物、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。根據(jù)本發(fā)明，"植物組織"還包括植物細(xì)胞。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、胼胝體、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物組織可以是多種成熟階段的，其可生長于液體或固體培養(yǎng)物中，或者生長于罐、溫室或田間的土壤或合適的培養(yǎng)基中。植物組織還可指此類植物、種子、子代、繁殖體(無論有性還是無性產(chǎn)生的)以及任何這些的后續(xù)傳代物(例如枝條或種子)的任何克隆。本發(fā)明的"子代"，例如，轉(zhuǎn)基因植物的子代，是由植物或轉(zhuǎn)基因植物作為母本或父本產(chǎn)生的或源自其的子代。因此，"子代"植物，即"F1"代植物是本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的后裔或后代。轉(zhuǎn)基因植物的子代可在其至少一個(gè)、一些或全部的細(xì)胞基因組中含有通過本文所述的方法整合進(jìn)親本轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的想要的多核苷酸。因此，想要的多核苷酸被子代植物"傳遞，，或"遺傳"。由此在子代植物中遺傳的想要的多核苷酸可處于T-DNA構(gòu)建體中，所述構(gòu)建體也從其親本通過子代植物遺傳。本文中使用的術(shù)語"子代"還可被認(rèn)為是一組植物的后裔或后代。"種子"可被認(rèn)為是成熟的植物胚珠(含胚)以及植物的繁殖部分，例如塊莖或孢子?？稍谵r(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之前，在黑暗中對種子進(jìn)^f亍孵育，例如以促進(jìn)萌發(fā)。還可在孵育之前對種子滅菌，例如通過用漂白劑簡單處理。然后可將得到的幼苗暴露給想要的農(nóng)桿菌屬菌林或者其它合適的細(xì)菌，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是馬鈴薯葉甲(馬鈴薯曱蟲)，所述植物是馬鈴薯、茄子、番茄、胡椒、煙草、酸漿或稻、谷物或棉。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是辣根猿葉甲(白芥葉甲蟲)，所述植物是芥末、大白菜、蕪青葉(turnipgreens)、綠色芥藍(lán)菜(collardgreens)或白菜。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是墨西哥豆瓢蟲(墨西哥豆甲)，所述植物是菜豆、蕓豆、四季豆、食莢菜豆、利馬豆、綠豆、青豆、牛眼豆、絨毛豆(velvetbean)、大豆、豇豆、木豆、三葉草或苜蓿。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是墨西哥棉鈴象(棉鈴象蟲曱)，所述植物是棉。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是赤擬谷盜(赤擬谷盜)，所述植物是貯藏谷類(grain)產(chǎn)品，例如，面粉、谷物、餐食、餅干、豆類、香料、食用面食、蛋糕混合料、干寵物食品、干花、巧克力、堅(jiān)果、種子甚至干的博物館標(biāo)本。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是桃蚜(桃對)，所述植物是樹，例如李屬(尸r"""s)，特別是杉匕、杏和李；茄科(So/""ff"fle)、藜科(C/rewciporfzVicefle)、菊科(C謹(jǐn)/7固'似e)、十字花科(CWi"y^me)和葫蘆科(C"c"rW似ce^)的蔬菜作物，其包括但不限于，朝鮮薊、天門冬、菜豆、甜菜、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、胡蘿卜、花椰菜、甜瓜、芽菜、谷物、黃瓜、茴香、羽衣甘藍(lán)、擘藍(lán)、蕪青、茄子、萵苣、白芥、秋葵、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、胡椒、馬鈴薯、蘿卜、菠茱、南瓜、番茄、蕪青、豆瓣菜和西瓜；田間作物，例如但不限于，煙草、糖蘿卜和向曰葵；花卉作物或其它裝飾植物。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是褐飛虱，所述植物是稻種n。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是二化螟(稻二化螟)，所述植物是稻植物、大麥、高粱、玉米、小麥或草。本發(fā)明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是菜蛾(菜蛾)，所述植物是蕓苔屬(5m^/c")物種，其例如但不限于，甘藍(lán)、大白菜、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、油菜、椰菜、花椰菜、蕪青、白芥或蘿卜。本發(fā)明還涉及下述本文所述的方法，其中，所述昆蟲是居屋艾蟋(家蟋蟀)，所述植物是本文所述的任何植物或任何有機(jī)物質(zhì)。IX.用于遺傳工程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明包括將核苷酸序列引入植物，以使得一種或多種dsRNA分子以能抑制有害生物的水平表達(dá)。可通過本領(lǐng)域已知用來將重組序列引入粑宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)流程，來將本發(fā)明的多核苷酸和多肽引入宿主植物細(xì)胞。此類流程包括但不限于轉(zhuǎn)染、感染、轉(zhuǎn)化、天然攝取、磷酸鈣、電穿孔、顯微注射生物射彈和微生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案。見，例如，Miki等人1993，"ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants",In:MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick和Thompson，編著，CRCPress,Inc.,BocaRaton,pages67-88。選用的方法隨宿主植物而變4匕。微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移指使用微生物將外源基因引入宿主植物。雖然農(nóng)桿菌屬(Horsch等人，Science227:1229-31，1985)已廣泛用于將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)植物，但是其并非唯一的能轉(zhuǎn)化植物的細(xì)菌。例如，已經(jīng)顯示，除農(nóng)桿菌屬之外的若干細(xì)菌物種可被修飾，以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)不同的植物。來自兩個(gè)科三個(gè)屬的細(xì)菌——^艮瘤菌屬物種(及/^M/"wsp.)NGR234、苜蓿中華根瘤菌和百脈根生慢生根瘤菌可通過獲得卸甲Ti質(zhì)粒和二元載體而能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。Broothaerts，W.等人A^""Feb10，433(7026):629-633(2005)。4吏用葉盤、源自盾片的愈傷組織或浸花法(floraldip)，用這些非農(nóng)桿菌屬物種，實(shí)現(xiàn)了對三種才直物物種——煙草、稻和擬南芥的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。因此，當(dāng)攜帶有卸甲TLt粒和二元栽體(或推測來說，共整合或整個(gè)Ti質(zhì)粒)時(shí)，與不同植物相關(guān)聯(lián)的細(xì)菌能夠易于向植物轉(zhuǎn)移T-DNA，其可根據(jù)本發(fā)明使用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是這樣的植物，其包含其中已穩(wěn)定整合了外源核酸的至少一個(gè)細(xì)胞基因組。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物是包含僅一個(gè)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞和細(xì)胞基因組的植物，或者是包含一些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的植物，或者是其中所有細(xì)胞都被遺傳修飾的植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是包含想要的多核苷酸(即，外源核酸)在植物的僅某些部分表達(dá)的植物。因此，轉(zhuǎn)基因可以僅在其結(jié)構(gòu)的某些部分包含經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物以及在植物中表達(dá)異源核酸的方法是特別已知的，其可與本文提供的核酸一起4吏用，以制備展示出對靼有害生物的進(jìn)食的易感性降低的轉(zhuǎn)基因植物。例如，可通過將本文公開的產(chǎn)生dsRNA的核酸插入植物轉(zhuǎn)化載體來制備植物轉(zhuǎn)化載體，并且將它們引入植物。一種已知的載體系統(tǒng)源自對根癌農(nóng)桿菌的天然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的4務(wù)飾。該天然系統(tǒng)包含大Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒，其中含有已知為T-DNA的大片斷，其被轉(zhuǎn)移進(jìn)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。Ti質(zhì)粒的另一片斷——vir區(qū)域負(fù)責(zé)T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域的邊界是末端重復(fù)序列。在經(jīng)修飾的二元載體中，腫瘤誘導(dǎo)基因已被缺失，vir區(qū)域的功能被用來轉(zhuǎn)移T-DNA邊界序列作邊界的外源DNA。T-區(qū)域還可含有可選擇標(biāo)記(用于高效回收轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞)以及多克隆位點(diǎn)(用于插入序列，以轉(zhuǎn)移編碼dsRNA的核酸)。通常，使用農(nóng)桿菌屬或其它微生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物含有插入一個(gè)染色體中的重組核苷酸序列，其被稱為轉(zhuǎn)基因事件。此類轉(zhuǎn)基因植物可被認(rèn)為對于插入的外源序列是雜合的?？赏ㄟ^將獨(dú)立的分離子轉(zhuǎn)基因植物自交，產(chǎn)生F1種子，來獲得轉(zhuǎn)基因純合的轉(zhuǎn)基因植物。產(chǎn)生的Fl種子中有四分之一是對于轉(zhuǎn)基因而言純合的。令F1種子萌發(fā)，產(chǎn)生植物，可針對雜合性或純合性對這些植物加以測試，通常，使用允許區(qū)分開雜合子和純合子的SNP測定或熱擴(kuò)增測定(即，接合性測定)來進(jìn)行。因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸或多肽的植物或植物細(xì)胞。在一種實(shí)施方案中，植物是被子植物或棵子植物。除了植物的常規(guī)含義，術(shù)語"植物"還意^示植物的果實(shí)、種子、花、球花等。本發(fā)明的植物可以是直接的轉(zhuǎn)染子，意思是載體直接引入植物，例如通過農(nóng)桿菌，或者，植物可以是經(jīng)轉(zhuǎn)染植物的子代。還可通過經(jīng)轉(zhuǎn)染植物的無性繁殖來獲得子代。第二代或后續(xù)世代的植物可以或可以不通過有性繁殖(即，受精)產(chǎn)生。此外，植物可以是配子體(單倍體階段)或孢子體(二倍體階段)。X.傳統(tǒng)育種/雜交除了用重組核酸構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化植物之外，可以通過將具有重組核酸構(gòu)建體的第一植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將用于基因遏制的重組核酸引入第一植物系，其可被轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生可與第二植物系雜交的轉(zhuǎn)基因植物，以將用于基因遏制的重組核酸漸滲入第二植物系。在雄性不育植物中表達(dá)重組核酸構(gòu)建體可能是有好處的，例如作為用于降低對轉(zhuǎn)基因流向周圍植物的關(guān)注的手段。實(shí)踐中，本發(fā)明可與植物中的其它昆蟲控制性狀組合，以實(shí)現(xiàn)想要的性狀，用于增強(qiáng)對昆蟲侵襲的控制。將利用不同作用模式的昆蟲控制性狀組合起來可提供被保護(hù)免受昆蟲侵襲的轉(zhuǎn)基因植物，其較之?dāng)y帶單個(gè)昆蟲控制性狀的植物而言具有更好的耐久性，因?yàn)樵谔镩g抗性發(fā)展有降低的可能性。某些dsRNA構(gòu)建體與一種或多種有害生物控制蛋白質(zhì)基因的組合可能導(dǎo)致協(xié)同性，其能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的有害生物控制表型。利用人工膳食或整個(gè)植物組織對有害生物進(jìn)行的生物測定可用于例如定義對使用dsRNA和有害生物控制蛋白質(zhì)時(shí)幼蟲死亡率或生長抑制的劑量應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在生物測定中對dsRNA分子和有害生物控制蛋白質(zhì)的混合物加以測試，以鑒定出活性組合，所述活性是協(xié)同的并且是在受保護(hù)免遭有害生物侵襲的植物中配置所希望的(Tabashnik，1992)。已報(bào)道了不同昆蟲控制蛋白質(zhì)之間殺死有害生物的協(xié)同性(綜述見Schnepf等人，1998)。應(yīng)當(dāng)預(yù)見到，協(xié)同性將存在于某些dsRNA之間，以及存在于某些dsRNA和某些昆蟲控制蛋白質(zhì)之間。XI.定量對把基因表達(dá)的抑制可通過測量內(nèi)源靼RNA或通過靼RNA的翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，來定量對靶基因表達(dá)的抑制，并且可以通過檢查細(xì)胞或生物的外部性質(zhì)來驗(yàn)證抑制的結(jié)果。用于對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的?？色@得賦予對氨節(jié)青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素、壯觀霉素、利福霉素和四環(huán)素等的抗性的多種可選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，基因表達(dá)被抑制至少10%，優(yōu)選地，至少33%，更優(yōu)選地，至少50%，還更優(yōu)選地，至少80%。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，有害生物的細(xì)胞中，基因表達(dá)被抑制至少80%，更優(yōu)選地，至少90%,更優(yōu)選地，至少95%，或者至少99%，所以發(fā)生顯著的抑制。顯著的抑制意欲指這樣的顯著抑制，其產(chǎn)生可探測到的表型(例如，幼蟲生長的停止、癱瘓或死亡等)或可探測到的、對應(yīng)于被抑制的耙基因的RNA和/或蛋白質(zhì)的減少。雖然在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抑制在昆蟲的幾乎所有細(xì)胞中發(fā)生，但是在其它一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制僅在表達(dá)該基因的細(xì)胞亞群中發(fā)生。例如，如果將被抑制的基因在昆蟲消化道的細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，那么對這些細(xì)胞中基因的抑制就足以向昆蟲施加有害作用。XII.產(chǎn)物本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的一種或多種序列、以及從含有一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的重組植物或種子生產(chǎn)的商品產(chǎn)品。含有本發(fā)明的一種或多種序列的商品產(chǎn)品意欲包括但不限于餐食、油、經(jīng)磨碎的或完整的植物種?；蚍N子、任何食物產(chǎn)品(包括任何的餐食、油或重組植物或種子的經(jīng)磨碎的或完整的谷粒)或任何青貯飼料、纖維、紙或源自含有本發(fā)明的一種或多種序列的本發(fā)明植物的其它產(chǎn)品。對商品產(chǎn)品中本發(fā)明序列的探測提供了切實(shí)的證據(jù)即商品包含表達(dá)本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，所述本發(fā)明序列使用dsRNA介導(dǎo)的基因遏制方法控制有害生物侵襲。********************************下文提供了關(guān)于鑒定包含至少一種或多種雙鏈RNA分子的靼序列，以及將所述耙序列引入植物的方法的特定實(shí)施例，所述雙鏈RNA分子在本文示例出，用于遏制有害生物中重要特性或功能。它們僅作示例用，而非對本發(fā)明加以限制。實(shí)施例l:在高通量篩選中沉默漂亮新小桿線蟲中的漂亮新小桿線蟲靶基因在pGN9A載體(WO01/88121)中制備漂亮新小桿線蟲全基因組文庫，其處于兩個(gè)相同的T7啟動(dòng)子和終止子之間，在T7聚合酶表達(dá)(,皮IPTG誘導(dǎo))的情況下驅(qū)動(dòng)其在正義和反義方向上的表達(dá)。將該文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)96孑L板形式中的細(xì)菌菌林AB301-105(DE3)中。為進(jìn)行全基因組篩選，將這些細(xì)菌細(xì)胞喂飼給核酸酶缺陷型漂亮新小桿線蟲""0/"5^林系。按照下文所述，在96孔板形式中將細(xì)菌菌林AB301-105(DE3)產(chǎn)生的dsRNA艱飼給漂亮新小軒線蟲""c層/(WM2)蟲將"MC-J卵轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的板上，令其同時(shí)在20。C孵化，以使得L1世代同步。向96孔板中裝入100pL包含IPTG的液體培養(yǎng)基以及IOjiL漂亮新小桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物(OD6。。為l)，所述文庫每個(gè)都攜帶有具漂亮新小桿線蟲基因組片段的載體，用于表達(dá)dsRNA。向每個(gè)孔中加入4只同步的L1蟲，在25。C孵育至少4至5天。這些實(shí)驗(yàn)都采用一式四份來進(jìn)行。在篩選中使用6個(gè)對照pGN29=陰性對照，野生型pGZl==顫搐者表型pGZ18=幾丁質(zhì)合酶=胚胎致死pGZ25==胚胎致死pGZ59=6&WZ)=急性致死ACC=乙酰輔酶A羧化酶=急性致死5天后，將用產(chǎn)生dsRNA的細(xì)菌喂飼的漂亮新小桿線蟲"9"蟲的表型與用空載體(pGN29)和其它對照喂飼的蟲的表型相比較。針對致死性(急性或幼蟲)，親本(Po)世代的致死性，第一子代(Fl)世代的(胚胎)致死性，或者針對Po的生長延緩，對用dsRNA喂飼的蟲加以篩選，這按照下文所述來進(jìn)行(i)Po的急性致死性Ll蟲沒有發(fā)育并且死亡，該表型沒有產(chǎn)生子代，孔看起來相當(dāng)?shù)乜眨?ii)Po的(幼蟲)致死性Po在Ll之后的期死亡，該表型也沒有產(chǎn)生子代。在孔中發(fā)現(xiàn)了死亡的幼蟲或死亡的成蟲；(m)Fl的致死性Ll蟲發(fā)育到成年期，并且仍然活著。該表型沒有子代。這可能是由于不育、胚胎致死性(在孔底有死亡的卵)、胚胎停止或幼蟲停止(最終死亡)；(iv)生長停止或生長延^/延遲與具有正常發(fā)育或正常子代#的孔比較。對于表1A中示出的耙序列而言，我們推斷出，dsRNA介導(dǎo)的線蟲(例如漂亮新小桿線蟲)中漂亮新小桿線蟲靶基因的沉默對于蟲的生長和生存能力具有致命影響。上述dsRNA沉默實(shí)驗(yàn)之后，在24孔板上，以高通量模式，在漂亮新小桿線蟲中進(jìn)行了更為詳細(xì)的表型實(shí)驗(yàn)。按照下文所述，將上文所述的細(xì)菌菌林AB301-105(DE3)中產(chǎn)生的dsRNA文庫喂飼給24孔板上的漂亮新小桿線蟲(W392」蟲將fiMoJ卵轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的板上，令其同時(shí)在20。C賻化，以使得L1世代同步。(^,將100只同步的L1蟲浸泡于500pLS-完全艱祠培養(yǎng)基(包含5照/mL膽固醇、4^L/mLPEG和1mMIPTG)和500pL漂亮新小桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物(OD600為l)中，所述文庫每個(gè)都攜帶有具漂亮新小桿線蟲基因組片段的載體，用于表達(dá)dsRNA。在25。C對浸泡的L1蟲進(jìn)行2小時(shí)搖晃。離心并除去950jiL上清液之后，將5pL剩余的且重懸的沉淀(包含大約10至15只蟲)，轉(zhuǎn)移進(jìn)24孔板的每個(gè)孔的中部，所述孔裝有瓊脂LB肉湯層。在25。C對經(jīng)接種的板進(jìn)行2天孵育。在成年期，單獨(dú)選出l只成蟲并在25。C孵育2天，以觀察其子代。對其它成蟲的觀察在原來的24孔板上原位進(jìn)行。這些實(shí)驗(yàn)一式四份進(jìn)行。用笫二批蟲重復(fù)進(jìn)行這種詳細(xì)的表型篩選，唯一的不同在于，第二批蟲在20。C賻育3天。將用漂亮新小桿線蟲dsRNA喂祠的蟲的表型與用空載體喂飼的漂亮新小軒線蟲""C"7"9"蟲的表型相比較?；谠搶?shí)驗(yàn)推斷出對表1A中示出的漂亮新小桿線蟲靼基因的沉默對于蟲的生長和生存能力有致命影響，該耙基因?qū)€蟲生存能力來說是重要的。因此，這些基因是通過dsRNA介導(dǎo)的基因沉默控制(殺死或防止其生長)線蟲的良好耙基因。因此，本發(fā)明包括上述漂亮新小桿線蟲耙基因的線蟲直向同源物控制線蟲侵襲，例如植物的線蟲侵襲的用途。實(shí)施例2:對黑尾果蠅直向同源物的鑒定如上文實(shí)施例l中所述，鑒定出了多種漂亮新小桿線蟲致死序列，它們可用于鑒定其它物種和屬中的直向同源物。例如，可用漂亮新小桿線蟲致死序列來鑒定直向同源的黑尾果蠅序列。即，可用每條漂亮新小桿線蟲序列就黑尾果蠅中的直向同源序列去檢索公共數(shù)據(jù)庫，例如GenBank。選出可能的黑尾果蠅直向同源物，其享有高度序列同源性(E值優(yōu)選小于或等于lE-30)，并且序列是blast相互最佳擊中(hit)，后者表明來自不同生物體(例如漂亮新小桿線蟲和黑尾果蠅)的序列是彼此最高的blast擊中。例如，使用BLAST，將來自漂亮新小桿線蟲的序列C與黑尾果蠅中的序列相比。如果黑尾果蠅序列D是序列C的最佳擊中，并且當(dāng)將D與漂亮新小桿線蟲的所有序列進(jìn)行比較時(shí)也得到序列C，那么D和C就是相互最佳擊中。該標(biāo)準(zhǔn)通常用于定義直向同源性，這表示不同物種中具有相似功能的相似序列。黑尾果蠅序列標(biāo)識符示于表1A中。實(shí)施例3:馬鈴薯葉曱(馬鈴薯曱蟲)A.從馬鈴薯葉甲克隆部分基因序列按照廠商i兌明書，4吏用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從馬鈴薯葉曱(馬鈴薯甲蟲的來源JeroenvanSchaik，EntocareCVBiologischeGewasbescherming，Postbus162，6700ADWageningen，荷蘭)的四種不同幼蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含LDOOl、LD002、LD003、LD006、LD007、LDOIO、LDOll、LD014、LD015、LD016和LD018基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于^2-LD中，該M示了馬鈴薯葉甲靶基因，包括引物序列和獲得的cDNA序列。這些引物用于各PCR反應(yīng)中，其中采用如下條件95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、55°C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAquickGelExtractionkit)，目錄Nr.28706，快而精乂^司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR8/GW/topo載體(目錄Nr.K250020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由扇J-LD給出的各SEQIDNO示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分M酸序列由表3-LD中給出的各SEQIDNO示出，其中，讀框的起點(diǎn)用括號示出。B.馬鈴薯葉甲基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700，普洛麥格7>司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。就每種靼基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7才莫板。用于擴(kuò)增每種靼基因的正義模板的各引物的序列給于表8-LD中。PCR^應(yīng)條件如下所述95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55。C30秒和72。C1分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上^目同的條件的PCR反應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的反義模板的各引物的序列給于表8-LD中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106,快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaCK)4沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種乾基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-LD中。表8-LD展示了用于制備馬鈴薯葉甲耙序列的dsRNA片段和多聯(lián)體序列的序列，包括引物序列。C.將馬鈴薯葉甲基因克隆進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(n)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的乾基因的^fe苷^f列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例l)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(H))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWTWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseTMII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對LD002、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014和LD016基因中每種的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義_內(nèi)含子_CmR-內(nèi)含子-反義方向，或者啟動(dòng)子-反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-正義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。對于LD002而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/t叩o的LD002上用限制性酶BsoBI和PvuI進(jìn)行雙消化(見實(shí)施例3A)。對于LD006而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/topo的LD006上用限制性酶BsoBI進(jìn)行消化(見實(shí)施例3A)。對于LD007而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/topo的LD007上用限制性酶BsoBI進(jìn)行消化(見實(shí)施例3A)。對于LD007而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/topo的LD007上用限制性酶BsoBI進(jìn)行消化(見實(shí)施例3A)。對于LD010而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/topo的LD010上用限制性酶PvuI和PvuII進(jìn)行雙消化(見實(shí)施例3A)。對于LD014而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/t叩o的LD014上用限制性酶BsoBI進(jìn)行消化(見實(shí)施例l)。對于LD016而言，在克隆進(jìn)pCR8/GW/topo的LD016上用限制性酶BsoBI進(jìn)行消化(見實(shí)施例3A)。使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶(donase)II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37。C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。對于下H夾構(gòu)建體的完全序列-對LD002(反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-正義)而言，示于SEQIDNO::240中；-對LD006(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQID脆241中；誦對LD007(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO::242中；-對LD010(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO::243中；-對LD011(反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-正義)而言，示于SEQIDNO::244中；國對LD014(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO::245中；-對LD016(反義畫內(nèi)含子陽CmR-內(nèi)含子國正義)而言，在SEQIDNO::246中給出；表9-LD提供了針對每種發(fā)夾構(gòu)建體的完全序列。D.使用人工膳食，就對馬鈴薯葉甲的活性來篩選dsRNA靶用于馬鈴薯甲蟲的人工膳食如下文所述來制備(對Gelmaii等人，2001，J.Ins.Sc.,巻l，號7，1-10做了一些改變)對水和瓊脂進(jìn)行高壓滅菌，當(dāng)溫度降到55。C時(shí)加入剩余的成分(如下表2所示)。在該溫度，將成分4艮好地混合起來，之后將膳食等分到24孔板(納恩克公司(Nunc))，每孔的量為lml膳食。通過在室溫冷卻，令人工膳食固化。將膳食貯存于4。C,可貯存多i^3周。表2:人工膳食的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>2<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>將50pldsRNA溶液以濃度為lmg/ml局部應(yīng)用到多孑L板孔中的固體人工膳食上。在層流室中干燥膳食。對每種處理而言，對24只馬鈴薯甲蟲幼蟲(第2期)進(jìn)行測試，每孔兩只昆蟲。將板貯藏于昆蟲飼養(yǎng)室中，其中為25士2。C,60%相對濕度和16:8小時(shí)的亮:暗光周期。每l、2或3天對甲蟲做出活或死的評定。7天之后，對耙LD006、LD007、LD010、LD011和LD014而言，膳^皮具有局部應(yīng)用了同樣濃度(1mg/ml)的dsRNA的新鮮膳食替換，對耙LD001、LD002、LD003、LD015和LD016而言，膳食被僅新鮮膳食本身替換。將dsRNA靶與僅膳食本身或具有經(jīng)局部應(yīng)用了對應(yīng)于GFP(綠色熒光蛋白)編碼序列(SEQIDNO:235)的片段的dsRNA的膳食相比較。如兩次分別的生物測定所示，向馬鈴薯葉甲幼蟲喂飼含有完整棵dsRNA的人工膳食導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著增加(圖1LD-2LD)。測試的所有dsRNAs都最終導(dǎo)致7-14天后100。/。的死亡率。在生物測定期間，有或沒有GFPdsRNA的膳食使得昆蟲得以維持，死亡率非常小或沒有死亡率。通常，在》見察的所有測定中，CPB第二期幼蟲在有或沒有dsRNA的膳食上正常進(jìn)食2天，并蛻變?yōu)榈谌谟紫x。在該新的幼蟲期，觀察到CPB顯著降低或完全停止了其進(jìn)食，結(jié)果死亡率增加。E.使用馬鈴薯葉盤，針對對馬鈴薯葉甲的活性的dsRNA靶的生物測定使用馬鈴薯葉材料而非人工膳食作為CPB的食物來源，進(jìn)行另一可選的生物測定方法。使用大小合適的穿孔器，從2-3周齡的馬鈴薯植物葉上切下直徑大約為l.lcm(或0.95cm2)的盤。通過在近軸葉表面應(yīng)用2010ng/inl的耙LD002dsRNA或?qū)φ誫fpdsRNA溶液來制備經(jīng)處理的葉盤。令葉盤干燥，各自放置于24孑L板(納恩克公司(Nunc))的24個(gè)孔中。向每個(gè)孔中放入一只處于第二幼蟲期的CPB，然后用薄紙和多孔塑料蓋蓋上。將含有昆蟲和葉盤的板保持在28。C的昆蟲室中，光周期為16小時(shí)亮/8小時(shí)暗。令昆蟲在葉盤上進(jìn)食2天，之后將昆蟲轉(zhuǎn)移至含有新鮮的經(jīng)處理葉盤的新板上。之后，每天將昆蟲轉(zhuǎn)移至含有未經(jīng)處理的葉盤的板上，直到第7天。記錄昆蟲死亡率和重量分?jǐn)?shù)。向馬鈴薯葉曱幼蟲喂飼表面應(yīng)用了耙LD002完整棵dsRNA的馬鈴薯葉盤導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著增加(即，在第7天所有昆蟲都死亡了；100%死亡率)，而對照gfpdsRNA則對CPB的存活沒有影響。在2至3天后，靶LD002dsRNA嚴(yán)重影響到幼蟲的生長，而喂飼同樣濃度的gfpdsRNA的幼蟲卻發(fā)育正常(圖3-LD)。F.使用人工膳食，就對馬鈴薯葉曱的活性，來篩選dsRNA的較短版本本實(shí)施例闡迷了下^J^現(xiàn)較短的(60或100bp)的dsRNA片段自身或作為多聯(lián)體構(gòu)建體足以導(dǎo)致對馬鈴薯甲蟲的毒性。為本實(shí)施例選擇LD014，已知能誘導(dǎo)馬鈴薯曱蟲致死的靶。該基因編碼V-ATPase亞基E(SEQIDNO::15)。進(jìn)一步選用100個(gè)^S^對的片段-位于SEQIDNO::15的第195-294位的LD014—F1(SEQIDNO:159)和60個(gè)堿基對的片段——位于SEQIDNO::15的第235-294位的LD014—F2(SEQIDNO:160)。也見表7-LD。設(shè)計(jì)出300個(gè)堿基對的兩個(gè)多聯(lián)體LD014—C1和LD014—C2(SEQIDNO::161和SEQIDNO::162)。LD014—C1含有上文所述的100個(gè)^J^對的片段(SEQIDNO::159)的3次重復(fù)，而LD014—C2含有上文所述的60個(gè)4^對的片段(SEQIDNO::160)的5次重復(fù)。還見表7-LD。片段LD014一F1和LD014—F2作為正義和反義引物被合成。將這些引物退火，以在克隆前產(chǎn)生雙鏈DNA分子。分別在引物的5'和3，末端包括A^al和AT附flI限制性位點(diǎn)，以協(xié)助克隆。多聯(lián)體被制備為300個(gè)堿基對的合成基因。分別在合成的DNA片段的5'和3'末端包括A^iI和X/Mfll限制性位點(diǎn)，以協(xié)助克隆。用X&fll和ATw"I消化4種DNA分子，即，兩種單一單元(LD01^F1和LD014—F2)和兩種多聯(lián)體(LD014j:i和LD014j:2)，并將其亞克隆進(jìn)通itX&al和JV:附fll消化被線性化的pBluescriptnSK+中，分別產(chǎn)生重組質(zhì)粒pl、p2、p3和p4。產(chǎn)生雙鏈RNA:使用可商購試劑盒T7RibomaxExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格7〉司(Promega))來合成dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。對于LD01^F1而言，使用特異性的T7正向引物oGBM159和特異性的反向引物oGBM164(在本文中被分別示為SEQIDNO::204和SEQIDNO:205)，在PCIL良應(yīng)中產(chǎn)生正義T7模板，所述PCR^應(yīng)條件如下95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在具有與上文所勤目同條件的PCR^應(yīng)中，使用特異性的正向引物oGBM163和特異性的T7反向引物oGBM160(在本文中被分別示為SEQIDNO::206和SEQIDNO:207)，產(chǎn)生反義T7才莫板。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。得到的dsRNA的正義鏈在本文中如SEQIDNO:203所示。對于LD01^F2而言，使用特異性的T7正向引物oGBM161和特異性的反向引物oGBM166(在本文中被分別示為SEQIDNO::209和SEQIDNO:210)，在PCR^應(yīng)中產(chǎn)生正義T7模板，所述PCRA應(yīng)條件如下95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在具有與上文所述相同條件的PCR^應(yīng)中，使用特異性的正向引物oGBM165和特異性的T7反向引物oGBM162(在本文中被分別示為SEQIDNO::211和SEQIDNO:212)，產(chǎn)生反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混^來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。得到的dsRNA的正義鏈在本文中如SEQIDNO:208所示。此外，對于多聯(lián)體而言，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生分別的單5，T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的靼序列。用AT^I或AT附fll對含有LD014—C1和LD014—C2的重組質(zhì)粒p3和p4線性化，純化針對每種構(gòu)建體的兩條線性片段，將其作為模板用于體外轉(zhuǎn)錄檢測，其中使用側(cè)接于克隆位點(diǎn)的T7啟動(dòng)子。通過使用T7RiboMAXTMExpressRNAi系統(tǒng)(普洛麥格公司(Promega))進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄來制備雙鏈RNA。針對LD014—C1和LD014—C2得到的dsRNA的正義鏈在本文中被分別示為SEQIDNO::213和2114。靶LD014的較短序列和多聯(lián)體能在馬鈴薯葉曱中誘導(dǎo)致死性，如圖4-LD所示。G.使用人工膳食，針對對馬鈴薯葉曱的活性，篩選不同濃度的dsRNA將50pldsRNA溶液(一系列10倍的濃度，從l照/pl(對于耙LD027而言，0.1照/jtl)下降到0.01ng/pl)局部應(yīng)用到24孔板(納恩克公司(Nunc))孔中的固體人工膳食上。在層流室中干燥膳食。對每種處理而言，對24只馬鈴薯甲蟲幼蟲(第2期)進(jìn)行測試，每孔兩只昆蟲。將板貯藏于昆蟲伺養(yǎng)室中，條件為25士2。C,60%相對濕度和16:8小時(shí)的亮:暗光周期。以常規(guī)間隔對甲蟲做出活或死的評定，直至第14天。7天之后，膳^f皮局部應(yīng)用了同樣濃度的dsRNA的新鮮膳M換。將dsRNA靶與僅膳食本身的情況相比較。以低至0.1至10ngdsRNA/jil的濃度，向馬鈴薯葉甲幼蟲喂飼含有不同靶的完整棵dsRNAs的人工膳食導(dǎo)致幼蟲的高死亡率，如圖5-LD所示。H.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆CPB基因片段雖然可以使用任何高效的細(xì)菌啟動(dòng)子，在載體中克隆對應(yīng)于MLB基因靼的DNA片段，用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA(見WO00/01846)。用于擴(kuò)增靼基因的特異性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何粑序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精7^司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用^/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體,皮命名為pGBNJ003。用于擴(kuò)增耙基因片段LD010的特異性引物的序列提供于表8中(正向引物SEQIDNO::191和反向引物SEQIDNO::l卯)。所用的模板是含有LD010序列的pCR8/GW/topo載體(SEQIDNO::11)。在采用下述條件的PCR^應(yīng)中使用引物98°C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen)),平端克隆進(jìn)用5>/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00/188121A1)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8給出的SEQIDNO::188。攜帶該序列的重組載體被命名為pGBNJ003。I.在兩種大腸桿菌(jKsc/^Wc/^ico/Z)菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA靶為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的把LD010的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaselII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNase111細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。AB309-105和BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化在50^d的水冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，并輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞放回到冰上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450pl室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取IOOpl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100ng/ml羧千青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基>5危代半乳糖苷或110時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100照/ml羧千青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ7jC中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新(refreshment)。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。J.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對馬鈴薯葉甲，表達(dá)dsRNA耙LD010的大腸桿菌用兩種生物測定方法來測試大腸桿菌中產(chǎn)生的雙鏈RNA針對馬鈴薯曱蟲幼蟲的抵擋(1)基于人工膳食的生物測定，以及(2)基于植物的生物測定?；谌斯ど攀成餃y定按照實(shí)施例4中前文所述來制備用于馬鈴薯甲蟲的人工膳食。向48孔的多孔測試板(納恩克公司(Nunc))的每個(gè)孔中^UV半毫升膳食。對于每種處理而言，將50ial經(jīng)熱處理的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌(等同于大約5xio7個(gè)細(xì)菌細(xì)胞)懸浮液(OD為l)局部應(yīng)用到孔中的固體膳食上，令板在層流室中干燥。對每種處理而言，對48只第2期馬鈴薯甲蟲幼蟲進(jìn)行測試，含有膳食和細(xì)菌的每孔一只昆蟲。板上每排(即，8個(gè)孔)被認(rèn)為是一份重復(fù)。將板保持于昆蟲飼養(yǎng)室中，條件為25士2。C，60。/。相對濕度和16:8小時(shí)的亮:暗光周期。每4天后，將甲蟲轉(zhuǎn)移至含有經(jīng)局部應(yīng)用的細(xì)菌的新鮮膳食上。侵襲后每一天或每三天對曱蟲做出活或死的評定。侵襲后第7天，以幼蟲重量形式，記錄存活者的生長和發(fā)育。對于RNaseIII缺陷型大腸桿菌菌林AB309-105而言，在生物測定中，針對CPB毒性對含有質(zhì)粒pGBNJ003的細(xì)菌和含有空載體pGN29(參考WO00/188121A1)的那些加以測試。攜帶pGBNJ003質(zhì)粒的細(xì)菌顯示出昆蟲死亡率隨時(shí)間的明顯增加，而對pGN29和僅給予膳食的對照而言則只觀察到了極少的死亡率或者沒有死亡(圖6a-LD和7a-LD)。在含有表達(dá)dsRNA靶LD010的細(xì)菌的人工膳食上進(jìn)食7天后，馬鈴薯甲蟲幼蟲存活者的生長和發(fā)育被嚴(yán)重妨礙(表10-LD、圖8a-LD)。對于大腸桿菌菌林BL21(DE3)而言，針對馬鈴薯甲蟲幼蟲，對含有質(zhì)粒pGBNJ003的細(xì)菌和含有空載體pGN29的那些加以測試。在喂飼補(bǔ)充有BL21(DE3)細(xì)菌的膳食的幼蟲上觀察到了與RNAseIII缺陷型菌林AB309-105類似的有害作用(圖6b-LD和7b-LD)。但是，對BL21(DE3)而言，5個(gè)克隆的存活者的數(shù)量要高于AB309-105;在第12天，對該菌林而言，平均死亡率的值比RNaselII缺陷型菌林要低大約25。/。。此外，在含有表達(dá)對應(yīng)于靶LD010的dsRNA的BL21(DE3)的膳食上進(jìn)食的存活者的平均重量嚴(yán)重降低(表10-LD、圖8b-LD)。在含有攜帶質(zhì)粒pGBNJ003的兩種細(xì)菌菌林中任何一種的膳食上進(jìn)食的CPB幼蟲生長和發(fā)育的延遲與進(jìn)食抑制直接相關(guān)，因?yàn)檩^之?dāng)y帶空栽體pGN29的細(xì)菌或僅膳食的板而言，從第4天開始在更新過的板的孔中就看不到蟲糞。該觀察與CPB在體外轉(zhuǎn)錄的雙鏈RNA(局部應(yīng)用到人工膳食上)上進(jìn)食的情況(見實(shí)施例3D)類似；此時(shí)，在經(jīng)處理的膳食上第2天起進(jìn)食就停止了?；谥参锏纳餃y定在將植物喂銅給CPB幼蟲之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整林馬鈴薯植物噴霧。在植物培養(yǎng)室中，將馬鈴薯植物品種"5系，，從塊莖生長到8-12片展開葉的階段，其中采用下述條件25士2。C,60%相對濕度，16:8小時(shí)的亮/暗光周期。將500ml塑料瓶頂部向下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，M切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。在籠中每林經(jīng)處理植物上放15只Ll期的馬鈴薯甲蟲幼蟲。用攜帶有pGBNJ003質(zhì)粒(克隆l;圖7a-LD)或pGN29質(zhì)粒(克隆l;見圖7a-LD)的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將總體積1.6ml噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。當(dāng)對細(xì)菌細(xì)胞懸浮液的量進(jìn)行9倍稀釋時(shí)，死亡率數(shù)仍然保持(圖9-LD)。在用攜帶pGBNJ003載體的細(xì)菌噴霧過的植物上第ll天的幼蟲存活者的平均重量比pGN29的少大約10倍(圖10-LD)。較之在用含有空栽體pGN29的細(xì)菌噴霧過的馬鈴薯植物上的導(dǎo)致的損傷相比，CPB幼蟲對用含有pGBNJ003質(zhì)粒的細(xì)菌噴霧過的馬鈴薯植物造成的進(jìn)食損傷大大降低(圖ll-LD)。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，這表現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表M應(yīng)于昆蟲基因靶的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。K.針對馬鈴薯葉曱，對表達(dá)dsRNA靶LD010的大腸桿菌的多種培養(yǎng)懸浮液密度加以測試按照實(shí)施例3J所述來制備和處理細(xì)菌培養(yǎng)物。將表達(dá)耙LD010的雙鏈RNA的大腸桿菌RNAseIII缺陷型菌林AB309-105培養(yǎng)物的三倍系列稀釋(從0,25個(gè)單位的等同物開始)應(yīng)用到8-12展開葉階段的馬鈴薯植物品種"Bintje"的葉上。在經(jīng)處理的植物上放10只馬鈴薯葉甲L1幼蟲，每種處理一林植物。在第7天(即，侵襲后7天)針對昆蟲死亡率和生長妨礙進(jìn)行計(jì)分。如圖14-LD所示，當(dāng)向昆蟲喂飼通過良好噴霧攜帶質(zhì)粒pGBNJ003(用于靶IOdsRNA的表達(dá))的大腸桿菌熱滅活培養(yǎng)物(密度為0.25、0.08和0.025個(gè)細(xì)菌單位)進(jìn)行局部應(yīng)用處理的馬鈴薯植物時(shí)，在l周后記錄到了高CPB幼蟲死亡率(卯至100%)。0.008個(gè)單位時(shí)，有大約l/3的昆蟲死亡，但是存活的昆蟲比對照組(攜帶空載體pGN29的大腸桿菌以及僅用水的植物)中的那些顯著更小。較之用含有空載體pGN29的細(xì)菌噴霧的馬鈴薯植物上招致的損傷而言，CPB幼蟲對用包含0.025或0.008個(gè)單位濃度的pGBNJ003質(zhì)粒的細(xì)菌噴霧過的馬鈴薯植物的進(jìn)食損傷大大降低(圖15-LD)。L.成蟲對于口月M仏的對應(yīng)于耙基因的dsRNA極端易感下文提供的實(shí)施例強(qiáng)調(diào)了下述發(fā)現(xiàn)成年昆蟲(以及不僅是幼蟲期的昆蟲)對口服才IUV的對應(yīng)于靶基因的dsRNA極端易感。選用了四種耙來進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)靶2、10、14和16(分別是SEQIDNO:168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQIDNO:235)用作為對照。從我們實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的培養(yǎng)物中隨機(jī)挑出年輕成蟲(2-3日齡)，對昆蟲性別無偏向。每種處理選用十只成蟲。在處理開始前對成蟲進(jìn)行至少6小時(shí)的預(yù)饑餓。在處理的第一天，向每只成蟲喂飼四片馬鈴薯葉盤(直徑1.5cm2)，所述葉盤每盤用25]nl的0.1照/pl靶dsRNA(按照實(shí)施例3A所述合成；按照實(shí)施例3E所述進(jìn)行局部應(yīng)用)的局部應(yīng)用處理過。每只成蟲被限制在小培養(yǎng)i(直徑3cm)中，以確保所有昆蟲都攝入了等量的食物，并且由此獲得等劑量的dsRNA。第二天，每只成蟲再喂伺四片按照上文所述處理過的葉盤。第三天，收集每種處理的全部10只成蟲，將它們一起放到籠子中，所述籠子是具有細(xì)尼龍網(wǎng)當(dāng)蓋子(以提供良好通風(fēng))的塑料盒(大小為30cmx20cmx15cm)組成的。盒子內(nèi)部，在底部放有一些打濕的濾紙。一些(未經(jīng)處理的)馬鈴薯葉被放到紙上面，以在實(shí)驗(yàn)期間保持成蟲。從第5天開始，進(jìn)行常規(guī)評定，以對死的、活的(移動(dòng)的)和瀕死的昆蟲進(jìn)^f亍計(jì)數(shù)。對于昆蟲的瀕死性而言，將成蟲背朝下放置，檢查它們是否能在數(shù)分鐘內(nèi)自己翻過身來，只要其不能自己翻起來那么該昆蟲就被認(rèn)為是瀕死的。在該實(shí)驗(yàn)中顯示了對應(yīng)于不同靶的雙鏈RNA對馬鈴薯甲蟲(馬鈴薯葉曱)成蟲的清楚的、特異性的毒性作用(圖12-LD)。在最終評定日(第19天)，對應(yīng)于gfp片段的雙鏈RNA沒有對CPB成蟲顯示出毒性。該實(shí)驗(yàn)清楚顯示，口服遞送時(shí)暴露給dsRNA僅幾天后，CPB成蟲的存活就被嚴(yán)重降低。例如，對于靶10而言，在第5天，10只成蟲中有5只瀕死(病態(tài)并且移動(dòng)緩慢)；在第6天，10只成蟲中的4只死亡，存活者中有3只瀕死；第9天時(shí)觀察到所有成蟲死亡。作為該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，針對昆蟲有害生物對靶雙鏈RNA的應(yīng)用可被拓寬為包括昆蟲有害生物的兩種生命階段(即，幼蟲和成蟲)，所述階段能導(dǎo)致廣泛的作物損傷的，如馬鈴薯甲蟲的情況一樣。實(shí)施例4:辣根猿葉甲(白芥葉甲蟲)A.通過家族PCR，克隆辣根猿葉曱(白芥葉甲蟲)的PCOOl、PC003、PC005、PCOIO、PC014、PC016和PC027基因的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA),從辣根猿葉甲(白芥葉甲蟲；來源Dr.CarolineMuller，Julius畫von-Sachs-InstituteforBiosciences,ChemicalEcologyGroup,UniversityofWuerzburg,Julius畫von-Sachs誦Platz3,D-97082Wuerzburg,Germany)的第三幼蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商"^兌明書，通過DNase(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega))處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville,Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含PC001、PC003、PC005、PCOIO、PC014、PC016和PC027基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用Amplit叫Gold(目錄Nr.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)7>司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于表2-PC中。扇二PC展示了辣根猿葉曱粑基因，包括引物序列和獲得的cDNA^列。這些引物用于各PCR反應(yīng)中，其中采用如下條件95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR4/TOPO載體(目錄Nr.K4530-20,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由^2-PC給出的各SEQIDNO示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分^J^紗列由表3-PC中給出的各SEQIDNO示出。表3-PC提供了cDNA克隆的^Ju^列，讀框的起點(diǎn)用括號示出。B.辣才艮猿葉甲基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格^>司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的正義模板的各引物的序列給于表8-PC中。表8-PC提供了制g根猿葉甲耙序列的dsRNA片段的細(xì)節(jié)，包括引物序列。PCR^應(yīng)條件如下所述95。Cl分鐘，接著是20個(gè)95。C30秒、60°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上^目同的條件的PCRA應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種靶基因的反義模板的各引物的序列給于表8-PC中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106,快而精7>司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaCK)4沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種靼基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-PC中。C.將辣根猿葉甲(白芥葉甲蟲)基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(11)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的耙基因的耙核苷M列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例4A)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(H))間J吏用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)i義(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對PC001、PC010、PC014、PC016和PC027基因中每種的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同耙(見實(shí)施例4B)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化對于PC001而言，用BsoBI和PvuI進(jìn)行雙消化；對于PC010而言，用PvuI和PvuII進(jìn)行雙消化；對于PC014而言，用HincII、PvuI和XhoI進(jìn)行三消化；對于PC016而言，用ApaLI進(jìn)行單消化；對于PC027而言，用AvaI和DrdI進(jìn)行雙消化。j吏用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶I1酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37°C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。對于下^JL夾構(gòu)建體的完全序列-對PC001(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:508中；-對PC010(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:509中；-對PC014(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:510中；畫對PC016(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:511中；畫對PC027(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:512中；表9-PC提供了每種發(fā)夾構(gòu)建體的序列。D.^使用油菜葉盤，針對對辣根猿葉甲幼蟲的活性，測試dsRNA靶的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)下文提供的實(shí)施例是對下述發(fā)現(xiàn)的示例白芥葉甲蟲(MLB)幼蟲對于口月MIUV的對應(yīng)于其自身耙基因的dsRNA易感。為測試不同的雙鏈RNA樣品對MLB幼蟲的抵擋，使用油菜(歐洲油菜(5r,'cfi冊戸)品種SWOban;來源NickBalaam,SwSeedLtd.,49NorthRoad,Abington，Cambridge,CB16AS，UK)葉材料作為食物來源，進(jìn)行葉盤測定。將昆蟲培養(yǎng)物保持在昆蟲室中同品種的油菜上，條件為25±2。C，60±5%的相對濕度和16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的光周期。使用大小合適的穿孔器，從4-6周齡的油菜植物葉上切下直徑大約為1.1cm(或0.95cm2)的盤。在含有0.05%TritonX-100的Milli-Q水中，將雙鏈RNA樣品稀釋至0.1照1。通過在近軸葉表面應(yīng)用25pl乾PC001、PC003、PC005、PCOIO、PC014、PC016、PC027dsRNA和對照gfpdsRNA或0.050/0TritonX-100的經(jīng)稀釋溶液，來制備經(jīng)處理的葉盤。令葉盤干燥，單獨(dú)放置于24孔板的24個(gè)孔的每個(gè)中，其中含有l(wèi)ml已膠凝的2。/。瓊脂，幫助防止葉盤干掉。向板的每個(gè)孔中放入兩只新生MLB幼蟲，然后用多孔塑料蓋蓋上。將板(一種處理含有48只昆蟲)分為一式四份重復(fù)，每份重復(fù)12只昆蟲(每排)。將含有昆蟲和葉盤的M置于昆蟲室中，^Ht為25士2。C，60±5%的相對濕度和16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的光周期。令昆蟲進(jìn)食葉盤2天，之后將它們轉(zhuǎn)移至含有新鮮的經(jīng)處理葉盤的新板上。之后，生物測定開始后4天，收集來自每份重復(fù)的昆蟲，將其轉(zhuǎn)移至含有未經(jīng)處理的新鮮油菜葉的培養(yǎng)孤上。在第2、4、7、9和11天，記錄幼蟲死亡率和平均重量。對測試的所有靶而言，在用完整棵露的靶dsRNA處理過的油菜葉上喂飼的辣根猿葉曱幼蟲都導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著增加，如圖l(a)所示。針對把PC010的測試雙鏈RNA導(dǎo)致第9天時(shí)100。/。幼蟲死亡率，對靶PC027而言，在第ll天100。/。幼蟲死亡率。對于所有其它靶而言，與對照gfpdsRNA、僅0.05%TritionX-100或僅未經(jīng)處理的葉相比，在ll天時(shí)都達(dá)到了顯著高的死亡率值(百分比平均值士a0.05置信區(qū)間)PC001(94.4±8.2);PC003(86.1±4.1);PC005(83.3±7.8);PC014(63.9±20.6);PC016(75.0±16.8);gfpdsRNA(11.1±8.2);0.05%TritonX-100(19.4±10.5);僅葉(8.3±10.5)。基于其平均重量來評定幼蟲存活者。對于測試的所有靶而言，在生物測定的第4天后，白芥葉曱蟲都具有顯著降低的平均重量；而喂飼對照g印dsRNA或僅0.05。/。TritonX-100的昆蟲都發(fā)育正常，與在僅葉上的幼蟲一樣(圖l(b)畫PC)。E.使用油菜葉盤，針對對辣根猿葉曱幼蟲的活性，篩選不同濃度的dsRNA的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)按照上文實(shí)施例4D所述，將25pl來自靶PC010或PC027的dsRNA溶液(一系列10倍的濃度，從0.1將/pl下降到0.1ng/pl)局部應(yīng)用到油菜葉盤上。作為陰性對照，向葉盤僅施用0.05%TritonX-IOO。對每種處理而言，對24只白芥葉甲蟲新生幼蟲進(jìn)行測試，每孔兩只昆蟲。將板貯藏于昆蟲飼養(yǎng)室中，^Ht為25士2。C，60±5%的相對濕度和16:8小時(shí)的亮:暗光周期。在第2天，將幼蟲轉(zhuǎn)移到含有新鮮的經(jīng)dsRNA處理的葉盤的新板上。對靶PCOIO而言，在第4天，對靶PC027而言，在第5天，將來自每份重復(fù)的昆蟲轉(zhuǎn)移到含有豐富的未經(jīng)處理的葉材料的培養(yǎng)臟上。對耙PC010而言，在第2、4、7、8、9和11天對甲蟲做出活或死的評定，對耙PC027而言，在第2、5、8、9和12天進(jìn)行。以低至lngdsRNA/nl溶液的濃度，向辣根猿葉甲幼蟲喂飼含有兩種不同耙(PC010和PC027)的完整棵dsRNA的油菜葉盤均能導(dǎo)致高死亡率，如圖2(a)和(b)所示。針對不同濃度dsRNA的百分比平均死亡率值士a0.05時(shí)的置信區(qū)間，對靼PC010而言，在第11天，Ong/pl:8.3士9.4;0.1100;0.0179.2±20.6;0.001照/pl:58.3±9.4;0.0001照/pl:12.5±15.6;對耙PC027而言，在第12天，0照V1:8.3±9.4;0.1pg>l:95.8±8.2;0.01pg/pl:95.8±8.2;0.001jtg/jtl:83.3±13.3;0.0001pg/^tl:12.5±8.2。F.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆MLB基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于MLB基因靶的DNA片段(參考WO0001846)。用于擴(kuò)增靼基因的特異性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55。C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精z〉司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用Sr/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體凈皮命名為pGBNJOO(待完成)。用于擴(kuò)增耙基因片段PC010的特異性引物的序列提供于表8-PC中。所用的模板是含有PC010序列的pCR8/GW/topo栽體(SEQIDNO:253)。在采用下述條件的遞降PCR^應(yīng)中使用引物95°Cl分鐘，接著力0個(gè)95。C30秒、60。C30秒(并且每個(gè)循環(huán)溫度降低-0.5。C)和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用^/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121A1)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-PC給出的SEQIDNO::488。攜帶該序列的重組載體被命名為pGCDJ001。G.在兩種菌林大腸桿菌AB309-105中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA靶為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲乾的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。在該實(shí)驗(yàn)中，使用RNAaselII缺陷型菌株AB309-105。AB309-105的轉(zhuǎn)化在50pl的水冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105的等分試fl"中加入300ng的質(zhì)粒，并輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞放回到冰上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450pl室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行1小時(shí)孵育。取IOOjtl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100ing/ml羧節(jié)青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌株AB309-105中從重組栽體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通it^a入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為l。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100照/ml羧節(jié)青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的i秀導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于總體積50ml0.05%TritonX-100溶液中。將管5&存于4。C直到進(jìn)一步使用。H.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對辣根猿葉曱，表達(dá)dsRNA耙的大腸桿菌葉盤生物測定用葉盤生物測定方法來測試來自大腸桿菌中產(chǎn)生的耙PC010的雙鏈RNA(來自質(zhì)粒pGCDJOOl)對白芥葉曱蟲幼蟲的抵擋。按照實(shí)施例4所述，從油菜葉制備葉盤。將20jil細(xì)菌懸浮液(在600nm波長處測量的光密度為1)移液到每個(gè)盤上。將葉盤放置于含有l(wèi)ml經(jīng)膠凝瓊脂的24多孑L板的孔中。每個(gè)葉盤上加入兩只新生幼蟲。對每種處理而言，制備3份重復(fù)，每份重復(fù)16只新生幼蟲。將M置于昆蟲飼養(yǎng)室中，條件為25士2。C，60±5%的相對濕度和16:8小時(shí)的亮:暗光周期。在第3天(即生物測定開始后3天)，將幼蟲轉(zhuǎn)移到含有新鮮的經(jīng)處理(同樣劑量)葉盤的新板上。從第5^每隔一天更新葉材料。針對死亡率和平均重量對生物測定評分。陰性對照是用攜帶質(zhì)粒pGN29(空載體)的細(xì)菌處理的葉盤和僅給予葉的情況。昆蟲在用含質(zhì)粒pGCDJOOl的RNaseIII缺陷型大腸桿菌菌林AB309-105的懸浮液處理過的油菜葉上進(jìn)食后，顯示出了辣根猿葉甲幼蟲死亡率隨時(shí)間的明顯增加，而在含質(zhì)粒pGN29的細(xì)菌或僅葉對照的情況下僅，見察到4艮少的昆蟲死亡率或者沒有死亡(圖3-PC)?；谥参锏纳餃y定在將植物喂飼給MLB之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整林植物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上MLB。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)?；騪GN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將1至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因靼序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，這表現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表i^J"應(yīng)于昆蟲基因靶的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例5:墨西哥豆瓢蟲(墨西哥豆甲)A.克隆墨西哥豆胍蟲的部分基因序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)/>司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA),從墨西哥豆胍蟲(墨西哥豆甲；來源ThomasDorsey，SupervisingEntomologist,NewJerseyDepartmentofAgriculture,DivisionofPlantIndustry,BureauofBiologicalPestControl,PhillipAlampiBene行cialInsectLaboratory,POBox330，Trenton,NewJersey08625-0330，USA)的四種不同幼蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen),Rockville，Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含EV005、EV009、EVOIO、EV015和EV016基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)^^司(AppliedBiosystems))，用筒并引物進(jìn)行一系列PCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于表2-EV中，該M示了墨西哥豆瓢蟲耙基因，包括引物序列和獲得的cDNA序列。這些引物用于各PCR反應(yīng)中，其中采用如下條件對于EV005和EV009而言，95°CIO分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、50°C1分鐘和72。Cl分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘；對EV014而言，95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、53。Cl分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。C7分鐘；對EV010和EV016而言，95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C1分40秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR4/TOPO載體(目錄Nr.K4530畫20,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-EV給出的各SEQIDNO示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分^J^^列由婦-EV中給出的各SEQIDNO示出，其中，讀框的起點(diǎn)用括號示出。B.墨西哥豆胍蟲基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的靼序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的正義模板的各引物的序列給于表8-EV中。PCR^應(yīng)條件如下所述95。Cl分鐘，接著A20個(gè)95。C30秒、60。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上述相同的條件的PCR^應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種靶基因的反義模板的各引物的序列給于表8-EV中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit，目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混^來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種耙基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-EV中。C.將墨西哥豆瓢蟲基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(H)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的靼基因的耙核苷*列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNAJ良夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例l)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(H))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)v^VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(11)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對每種粑基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(11)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同靶(見實(shí)施例B)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.:28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37°CIO分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)T叩IO化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.使用豆葉盤，針對對墨西哥豆狐蟲幼蟲的活性，測試dsRNA靶的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)下文提供的實(shí)施例是對下述發(fā)現(xiàn)的示例墨西哥豆甲(MBB)幼蟲對于口月艮才仏的對應(yīng)于其自身靼基因的dsRNA易感。為測試不同的雙鏈RNA樣品對MBB幼蟲的抵擋，使用食莢菜豆(菜豆(尸Affs^o/"sVM/gtfr/s)品種Montano;來源AveveNV，Belgium)葉材料作為食物來源，進(jìn)行葉盤測定。用同品種的豆，將昆蟲培養(yǎng)物保持在昆蟲室中，條件為25士2。C,60±5%的相對濕度和16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的光周期。使用大小合適的穿孔器，從1-2周齡的豆植物葉上切下直徑大約為1.1cm(或0.95cm2)的盤。在含有0.05%TritonX-100的Milli-Q水中，將雙鏈RNA樣品稀釋至l照/]nl。通過在近軸葉表面應(yīng)用25^d耙Ev005、Ev010、Ev015、Ev016dsRNA和對照gfpdsRNA或0.05。/0TritonX-100的經(jīng)稀釋溶液，來制備經(jīng)處理的葉盤。令葉盤干燥，單獨(dú)放置于24孔板的24個(gè)孔的每個(gè)中，其中含有l(wèi)ml已膠凝的2。/。瓊脂，幫助防止葉盤干掉。向板的每個(gè)孔中放入一只新生MBB幼蟲，然后用多孔塑料蓋蓋上。將板分為一式三份重復(fù)，每份重復(fù)8只昆蟲(每排)。將含有昆蟲和葉盤的板保持于昆蟲室中，條件為25士2。C，60±5%的相對濕度和16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的光周期。令昆蟲在葉盤上進(jìn)食2天，之后將昆蟲轉(zhuǎn)移至含有新鮮的經(jīng)處理葉盤的新板上。之后，生物測定開始后4天，每天都將昆蟲轉(zhuǎn)移至含有未經(jīng)處理的新鮮豆葉的培養(yǎng)板上，直到第10天。在笫2天以及之后每隔一天，記錄昆蟲死亡率。向墨西哥豆瓢蟲幼蟲喂飼含有表面應(yīng)用的完整棵露的靶dsRNA的食莢菜豆葉導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著增加，如圖1所示。在8天后，測試的靶Ev010、Ev015和Ev016的雙鏈RNA都導(dǎo)致了10()o/。的死亡率，而靶Ev005的dsRNA殺死所有幼蟲用了10天。在含有對照gfpdsRNA或^f^面活性TritonX-100(圖l-EV)E.4吏用豆寸盤，4十對對墨西哥豆鉱蟲(E/w7flc/iw"vaWve^/s)成蟲的活性，測試dsRNA耙的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)下文提供的實(shí)施例是對下述發(fā)現(xiàn)的示例墨西哥豆甲成蟲對于口服攝入的對應(yīng)于其自身靼基因的dsRNA易感。在設(shè)置與針對墨西哥豆曱幼蟲的生物測定類似的生物測定中，針對局部應(yīng)用給豆葉盤的雙鏈RNA,對成年MBB進(jìn)行測試。在0.05%TritonX-100中將來自每種粑Ev010、Ev015和Ev016的測試dsRNA稀釋至終濃度為O.l]ag/jU。通過向每個(gè)盤上局部應(yīng)用30jil測試溶液來處理豆葉盤。令盤完全干燥，之后將每個(gè)放到24孔多孑L板每個(gè)孔中經(jīng)膠凝的2。/。瓊脂片上。從培養(yǎng)籠中收集三日齡的成蟲，禁食7-8小時(shí)，之后向生物測定板的每個(gè)孔中《A—只成蟲(由此每種處理24只成蟲)。將板保持于昆蟲飼養(yǎng)室中(在與用于MBB幼蟲的條件相同的條件下放24小時(shí))，之后將成蟲轉(zhuǎn)移到含有新鮮的經(jīng)dsRNA處理的葉盤的新板中。再24小時(shí)之后，收集來自每種處理的成蟲，將其放在大小為30cmx15cmxiOcm的塑料盒中，所述盒中含有兩林罐裝的、未經(jīng)處理的3周齡的豆植物。從第4天到第11天，評定昆蟲死亡率。從第4天開始(生物測定開始后4天)，墨西哥豆胍蟲成蟲才H^的所有三種乾dsRNA(Ev010、Ev015和Ev016)都導(dǎo)致死亡率顯著增加，如圖2(a)-EV所示。從第5天，在最初喂飼經(jīng)靶dsRNA處理的豆葉盤的昆蟲和喂祠含有對照gfpdsRNA或表面活性劑TritonX-100的昆蟲之間，觀察到進(jìn)食才莫式的顯著改變。與gfpdsRNA和^面活性劑對照相比時(shí)，針對所有三種靶都清楚觀察到，MBB成蟲對未經(jīng)處理的豆植物的葉損傷有所降低，雖然降低水平有所不同；喂飼靶15的昆蟲導(dǎo)致對豆葉的最小損傷(圖2(b)畫EV)。F.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆MBB基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于MBB基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增靼基因的特異性引物的序列提供于表8-EV中。使用的模板是含有任何耙序列的pCR8/GW/topo栽體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精7>司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用Sr/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-EV給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體被命名為pGBNJ00XX。G.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA靶為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲耙的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaselII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaselII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50pl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞放回到水上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450jil室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取100pl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100照/ml羧千青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Iimova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5jag/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100jtg/ml羧千青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙toNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。H.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對墨西哥豆瓢蟲，表達(dá)dsRNA靼的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給MBB之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整橋歐物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每抹經(jīng)處理植物上放上MMB。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)?；騪GN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位^皮定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將1至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的乾dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮^t植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，這表現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表i^J"應(yīng)于昆蟲基因耙的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例6:墨西哥棉鈴象(棉鈴象蟲甲)A.克隆墨西哥棉鈴象的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從墨西哥棉鈴象(棉鈴象蟲甲；來源Dr.GaryBenzon,BenzonResearchInc.,7KuhnDrive,Carlisle,Pennsylvania17013，USA)的第三齡蟲分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書，通過DNase(目錄Nr.1700，普洛麥格7〉司(Promega))處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.lSOSOO",英杰生命科學(xué)/>司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA),產(chǎn)生cDNA。為分離出包含AGOOl、AG005、AGOIO、AG014和AG016基因的部分的cDNA^列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240，應(yīng)用生物系統(tǒng)^^司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR反應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于表2-AG中。這些引物用于各PCR^應(yīng)中，其中采用如下條件對AGOOl、AG005和AG016而言，95。CIO分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、50。C1分鐘和72。C1分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘；對于AG010而言，95°CIO分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、54°C1分鐘和72。C2分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘；對于AG014而言，95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。Cl分種的循環(huán)，接著在72。C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精7>司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR8/GW/TOPO載體(目錄Nr.K2500-20，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-AG給出的各SEQIDNO:示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分g酸序列由表3-AG中給出的各SEQIDNO:示出。B.墨西哥棉鈴象(棉鈴象蟲甲)基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的靼序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種靶基因的正義模板的各引物的序列給于表8-AG中。按照下文所述來進(jìn)行遞降PCR:95°Cl分鐘，接著力0個(gè)95。C30秒、60°C30秒(并且每個(gè)循環(huán)溫度降低0.5。C)和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在采用與上i^目同的條件的PCR^應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用f擴(kuò)增每種乾基因的反義模板的各引物的序列給于表8-AG中。在瓊脂糖^上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaCK)4沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種靼基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-AG中。C.將墨西哥棉鈴象基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(H)鑒于RNA千擾的機(jī)制是通過dsRNA片！^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的耙基因的耙核苷^列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA;良夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例l)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(H))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對每種靶基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(H)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同靼(見實(shí)施例2)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37°C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)TopIO化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.使用人工膳食，針對對家蟋蟀居屋艾蟋幼蟲的活性的測試dsRNA靼的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)將家蟋蟀居屋艾蟋保持于昆蟲研究有限公司(InsectInvestigationsLtd.)(來源BladesBiologicalLtd.,Kent,UK)。在麩皮團(tuán)塊和甘藍(lán)葉上飼養(yǎng)昆蟲。選出大小等同并且不超過5日齡的混合性別蛹，用于該試驗(yàn)。將雙鏈RNA與基于小麥團(tuán)塊的嚙齒動(dòng)物膳食(大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)膳食，B&K總公司(B&KUniversalLtd.)，Grimston，Aldbrough，Hull,UK)混合。膳食BK001P含有下述成分，它們的重量依次降低小麥、大豆、麩皮粉、大麥、團(tuán)塊粘合劑、嚙齒動(dòng)物5維生素、脂肪#^物、磷酸二鈣、防霉劑(mouldcarb)。為使得任何酶組分失活，將團(tuán)塊嚙齒動(dòng)物膳食細(xì)致碾碎，在微波爐中進(jìn)行熱處理，之后混合起來。所有嚙齒動(dòng)物膳食都取自同一批，以確保一致性。將經(jīng)碾碎的膳食和dsRNA徹底混合起來，成型為等重小團(tuán)塊，令它們在室溫下干燥過夜。濃度為IOing/jLil的、來自靶和gfp對照的雙鏈RNA以lg經(jīng)^Uf膳食加lmldsRNA溶液的比例應(yīng)用，由此使得應(yīng)用比例為每g團(tuán)塊10mgdsRNA。每周替換團(tuán)塊。試驗(yàn)的前三周向昆蟲提供經(jīng)處理的團(tuán)塊。之后提供未經(jīng)處理的團(tuán)塊。在有蓋塑料容器(9cm直徑，4.5cm深)中保持昆蟲，每個(gè)容器十只昆蟲。每片場地含有一份經(jīng)處理的飾料團(tuán)塊以及一份水源(濕的棉絮球)，每片場地都放在各小稱量盤中。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間水無限制補(bǔ)充。以每周兩次的間隔進(jìn)行評定，評定之間不超過4天，直到所有對照昆蟲都死亡或蛻變?yōu)槌赡昶?84天)。在每次評定中，昆蟲^皮評定為活的或死的，針對異?，F(xiàn)象對它們加以檢查。從第46天起，一旦開始向成蟲蛻變，所有昆蟲(活的和死的)就凈皮評定為蛹或成蟲。在試驗(yàn)的第55天對存活昆蟲加以稱重。每種處理采用一式四份重復(fù)。在試驗(yàn)期間，測試條件為25至33。C，20至25%的相對濕度，以及12:12小時(shí)的亮:暗光周期。E.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆MLB基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于MBB基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增耙基因的特異性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55。C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用^/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8給出的分別的序列。攜帶該序列的重組栽體纟皮命名為pGBNJ00XX。F.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA耙為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲靶的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaselII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaselII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50pl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞放回到冰上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450pl室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取IOOpl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100照/ml羧千青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Iimova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)耙序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100ng/ml羧節(jié)青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。G.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對墨西哥棉鈴象，表達(dá)dsRNA靼的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給CBW之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整*^物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上CBW。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)粒或pGN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將1至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因乾序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，il^現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表i^t應(yīng)于昆蟲基因靶的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例7:赤擬谷盜(赤擬谷盜)A.克隆赤擬谷盜的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)/>司(Invitrogen),Rockville,Maryland,USA)，從赤擬谷盜(赤擬谷盜；來源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd,CapitalBusinessPark,Wentloog，Cardiff,CF32PX，Wales,UK)的所有不同昆蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700,普洛麥格公司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)>^司(Invitrogen),Rockville,Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含TC001、TC002、TC010、TC014和TC015基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)z^司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于表2-TC中。這些引物用于各PCR反應(yīng)中，其中采用如下條件95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、50。C1分鐘和72。C1分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘(TCOOl、TC014、TC015);95°CIO分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C2分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘(TC010);95。CIO分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、53°C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著在72。C7分鐘(TC002)。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR8/GW/TOPO載體(目錄Nr.K2500-20，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由^2-TC給出的各SEQIDNO:示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分M紗列由表3-TC中給出的各SEQIDNO:示出。B.赤擬谷盜基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的靼序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的正義模板的各引物的序列給于表8-TC中。PCRA應(yīng)條件如下所述95。Cl分鐘，接著A20個(gè)95。C30秒、60。C30秒(-0.5"C/循環(huán))和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50。C30秒和72。C1分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上勤目同的條件的PCR反應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種靼基因的反義模板的各引物的序列給于表8-TC中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit，目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaCK)4沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混^^來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種耙基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-TC中。C.將赤擬谷盜基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(H)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片M作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的耙基因的耙核苷*列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的ii^克隆(見實(shí)施例l)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(11))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物栽體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對每種耙基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元栽體pK7GWIWG2D(H)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同靶(見實(shí)施例2)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.28706，快而精7>司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37°C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.使用人工膳食，針對對赤擬谷盜幼蟲的活性，測試dsRNA靼的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)下文提供的實(shí)施例是對下述發(fā)現(xiàn)的示例赤擬谷盜(RFB)幼蟲對于口服攝入的對應(yīng)于其自身耙基因的dsRNA易感。將赤擬谷盜保持于昆蟲研究有限公司(InsectInvestigationsLtd.)(來源ImperialCollegeofScience,TechnologyandMedicine,SilwoodPark,Berkshire,UK)。按照公司SOP/251/01來培養(yǎng)昆蟲。簡言之，將甲蟲放在塑料廣口瓶或桶中。這些具有敞開的頂端以允許空氣流通。在頂部罩上一層網(wǎng)，用彈性條帶加固，以防止逃脫。將幼蟲飼養(yǎng)培養(yǎng)基(面粉)放在養(yǎng)育甲蟲的容器中。在溫控室中保持儲藏的產(chǎn)物曱蟲群落，所述在25±3。C以及16:8小時(shí)的亮:暗周期下進(jìn)行。將來自耙TC014的雙鏈RNA(具有對應(yīng)于SEQIDNO:-799的序列)加入到面粉和奶粉混合物(全麥面粉:奶粉比例為4:1)中，令其干燥過夜。每份重復(fù)分別制備向O.lg面粉/奶混合物中加入100pi10pg/^UdsRNA溶液(1mgdsRNA)。將干燥的混合物碾碎為細(xì)粉。將昆蟲保持在培—(55mm直徑)中，用雙層濾紙作襯里。將經(jīng)處理的膳食放在兩層濾紙之間。每個(gè)培養(yǎng)皿(重復(fù))中放入十只第一齡的性別混合的幼蟲。對于每種處理而言采用一式四份重復(fù)。對照是Milli-Q水?；诔Ｒ?guī)進(jìn)行評定(存活者數(shù)量)。試驗(yàn)期間，測試條件為25-33。C和20-25%的相對濕度以及12:12小時(shí)的亮:暗光周期。如圖1所示，較之僅膳食的對照，赤擬谷盜幼蟲在經(jīng)靼TC014dsRNA處理過的人工膳食上的存活隨時(shí)間顯著降低。E.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆RFB基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何栽體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于RFB基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增靼基因的特異性引物的序列提供于表8-TC中。使用的模板是含有任何耙序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精z^司(Qiagen)),平端克隆進(jìn)用Sr/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-TC給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體被命名為pGBNJ00XX。F.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA靼為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲靶的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaseIII缺陷型菌抹AB309-105與野生型含RNaseIII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50jil的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞改回到水上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450jil室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取IOOjtl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100照/ml羧節(jié)青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組栽體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100照/ml羧爺青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的i秀導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ7JC中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。G.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對赤擬谷盜，表達(dá)dsRNA靶的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給RFB之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整林植物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上RFB。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)粒或pGN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將1至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因靼序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，W現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表M應(yīng)于昆蟲基因耙的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例10:桃蜂(桃圻)A.克隆桃蜂的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從桃蜂(桃辨；來源Dr.RachelDown,Insect&PathogenInteractions,CentralScienceLaboratory,SandHutton,York,Y041ILZ，UK)的蛹分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)/>司(Invitrogen)，Rockville,Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含MP001、MP002、MPOIO、MP016和MP027基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240，應(yīng)用生物系統(tǒng)^^司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR反應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于表2-MP中。這些引物用于各PCR^應(yīng)中，其中采用如下條件對MP001、MP002和MP016而言，95°C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、50。C1分鐘和72。C1分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘；對MP027而言，使用遞降程序95°CIO分鐘，接著是IO個(gè)95。C30秒、60°C40秒(每個(gè)循環(huán)溫度降低1。C)和72。C1分10秒的循環(huán)，接著是30個(gè)95。C30秒、50。C40秒和72。C1分10秒的循環(huán)，接著是72。C7分鐘；對于MP010而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。Cl分鐘和72。C3分鐘的循環(huán)，接著是72。C7分鐘。在瓊脂糖皿上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR8/GW/TOPO載體(目錄Nr.K2500-20，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-MP給出的各SEQIDNO示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分M^f列由表3-MP中給出的各SEQIDNO示出。B.桃柝基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格z^司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5，T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的正義模板的各引物的序列給于表8-MP中。如下進(jìn)行遞降PCR:95。Cl分鐘，接著A20個(gè)95。C30秒、55。C30秒(對于MPOOl、MP002、MP016、MP027和gfp而言)或50。C30秒(對MP010而言)(每個(gè)循環(huán)溫度降低0.5。C)和72。C1分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、45。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘。在采用與上勤目同的條件的PCR^應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種乾基因的反義模板的各引物的序列給于表8-MP中。在瓊脂糖^上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混^來以;陂轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種乾基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-MP中。C.將桃對基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(H)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片段作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的乾基因的乾核苷酸序列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例A)和含attR的目的栽體(二pK7GWIWG2D(11))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020,英杰生命科學(xué)乂>司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組^^應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對MP001、MP002、MP010、MP016和MP026基因中每種的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。針對克隆進(jìn)pCR8/GW/topo(見實(shí)施例B)的所有靶用限制性酶Alw441加以消化。4吏用Qiaquick凝膠提取試劑盒(目錄Nr.28706，快而精/>司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37°C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。發(fā)夾構(gòu)建體的完全序列-對于MP001(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:1066中；-對于MP002(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:1067中；-對于MP010(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:1068中；畫對于MP016(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:1069中；曙對于MP027(正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)而言，示于SEQIDNO:1070中。表9-MP提供了針對每種發(fā)夾構(gòu)建體的完全序列。D.使用液體人工膳食，針對對桃奸的活性，測試dsRNA靶的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)按照Febvay等人(1988)[InfluenceoftheaminoacidbalanceontheimprovementofanartificialdietforabiotypeofJcyW/fay—cw/7/sw/w(Homoptera:Aphididae)./.Zoo/.66:2449-2453所述，稍加一些改變，基于對豌豆辨(豆無網(wǎng)長管圻(Jq;r幼o(hù)w》/^w/7&w附))合適的膳食來制備用于桃辨的液體人工膳食。按照下文所述來制備膳食的氨基酸組分以mg/100ml計(jì)，丙氨酸178.71、P-丙氨酸6.22、精氨^244.9、天冬酰胺298.55、天冬氨酸88.25、半胱氨l9.59、谷氨酸149.36、谷氨酰胺445.61、甘氨酸166.56、組氨酸136.02、異亮氨酸164.75、亮氨酸231.56、賴氨酸鹽酸鹽351.09、甲硫氨酸72.35、鳥氨酸(HC1)9.41、苯丙氨ifc93、脯氨酸129.33、絲氨酸124.28、蘇氨酸127.16、色氨酸42.75、酪氨酸38.63、L-纈氨酸190.85。將^J^酸溶解于30mlMilli-Q水中，除了酪氨酸是在加入到氨基酸混合物之前先溶解于幾滴lMHC1中的。按照下文所述，將膳食的維生素混合物組分制備為5x濃縮Ji&液以mg/L計(jì)，氛基苯甲酸100、抗壞血酸1000、生物素l、泛酸釣50、氯化膽堿500、葉酸10、肌醇420、煙酸IOO、鹽酸吡噴醇2S、核黃素5、鹽酸硫胺素25。在50。C將核黃素溶解于lmlH2O中，然后加入到維生素混合物貯液中。將維生素混合物分為每份20ml的等分試樣，p&存于-20。C。取一份維生素混合物加入到^^酸溶液中。按照分別為20g和242mg的量向該混合物中加入蔗糖和MgS04.7H20。按照下文所述來制備痕量金屬貯液以mg/100ml計(jì)，CuS04.5H204.7、FeCl3.6H2044.5、MnCl2.4H206.5、NaC125.4、ZnCI28.3。向膳食中加入IOml痕量金屬溶液和250mgKH2PO4，再加入Milli-Q水，至最終液體膳食體積為IOOml。用lMKOH溶液將膳食的pH調(diào)節(jié)為7。通過0.22jim濾盤(密理博公司(Millipore))上對液體膳食進(jìn)行過濾滅菌。在環(huán)境受控室的鋁框籠(含有70inm的網(wǎng)眼)中，在4-6周齡的油菜(歐洲油菜(5mss/c"w"/7附)品種SWOban;來源NickBalaam,SwSeedLtd.,49NorthRoad，Abington，Cambridge,CB16AS，UK)上飼養(yǎng)桃辨(桃奸；來源Dr.RachelDown,Insect&PathogenInteractions,CentralScienceLaboratory,SandHutton，York,Y041ILZ，UK)，其中采用下述條件23士2。C和60土5。/o的相對濕度，以及16:8小時(shí)的亮:暗光周期。在生物測定開始前一天，從飼養(yǎng)籠中收集成蟲，將它們放在培養(yǎng)皿中新鮮的獨(dú)立的油菜葉上，留在昆蟲室中過夜。第二天，撿出第一齡蛹，轉(zhuǎn)移到喂飼室中。喂飼室包含10只第一齡蛹，它們^it在小培養(yǎng)皿(直徑3cm)中，所述培養(yǎng)恥上蓋有單層薄的延伸石蠟?zāi),其上加有50pl膳食。用第二層石蠟?zāi)っ芊庠撌?，在與成蟲培養(yǎng)相同的條件下進(jìn)^f亍孵育。每隔一天更新具有dsRNA的膳食，在第8天，即生物測定開始后第8天評定昆蟲的存活。對每種處理而言，同時(shí)設(shè)立5個(gè)生物測定喂飼室(重復(fù))。向膳食中加入的測試和對照(gfp)dsRNA溶液至終濃度為2j^g/jtl。將喂飼室保持于23±2。C和60±5%的相對濕度，以及16:8小時(shí)的亮:暗光周期。通過GraphPadPrism第4版來測定Mann-Whitney檢驗(yàn)，以確定靼27(MP027)和g印dsRNA之間中位fcl否確實(shí)有顯著不同。在生物測定中，使用喂飼室，向桃辨的蛹喂祠補(bǔ)充有來自靶27(SEQIDNO:1061)的完整棵dsRNA的液體人工膳食導(dǎo)致死亡率顯著增加，如圖l所示。對于靼27、gfpdsRNA和僅膳食的處理而言，存活者的平均百分比分別為2、34和82。使用Maim-whitney檢驗(yàn)，將耙027與gfpdsRNA組相比較產(chǎn)生了0.004的單側(cè)P值，這表明靶027的中位數(shù)與gfpdsRNA的預(yù)計(jì)更大的中位數(shù)顯著不同(P<0.05)。包括有耙27dsRNA的液體膳食上的桃對比僅用膳食喂飼或用含有g(shù)fpdsRNA對照的膳食喂飼的那些顯著更小(數(shù)據(jù)未示出)。E.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆GPA基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于GPA基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增耙基因的特異性引物的序列提供于表8-MP中。使用的模板是含有任何耙序列的pCR8/GW/topo栽體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55。C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706,快而精乂>司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用Sr/I線性化過的pGNA49A栽體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-MP給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體被命名為pGBNJ00XX。F.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA靼為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲耙的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaselII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaselII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50jtl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞放回到冰上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450pl室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)醉育。取100jil細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100照/ml羧千青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5ug/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100pg/ml羧千青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。G.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對桃辨，表達(dá)dsRNA靼的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給GPA之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整M物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上GPA。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)?；騪GN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將1至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，il^現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了對使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表達(dá)對應(yīng)于昆蟲基因靼的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例ll:褐飛虱(褐稻虱)A.克隆褐飛虱的部分序列按照廠商方案，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄N。.18080044，英杰生命科學(xué)>^司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA),從褐飛虱(來源Dr.J.A.Gatehouse,Dept.BiologicalSciences,DurhamUniversity,UK)的高質(zhì)量總RNA，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含褐飛虱NLOOl、NL002、NL003、NL004、NL005、NL006、NL007、NL008、NL009、NLOIO、NLOll、NL012、NL013、NL014、NL015、NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因的部分的cDNA序列，按照廠商方案，使用AmplitaqGold(目錄N。N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)7>司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于^2-NL中。這些引物用于各PCR^應(yīng)中，其中采用如下條件對于NL001而言95。C5分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。C1分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL002而言，95。C3分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。C1分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL003而言，95。C3分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、61°C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL004而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、51。C1分鐘和72。C1分鐘的循環(huán)；對于NL005而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL006而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。C3分30秒的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL007而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C1分15秒的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL008而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、53。C1分鐘和72。C1分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL009而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL010而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C2分30秒的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL011而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、550C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)；對于NL012而言，95°CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、55°C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)；對于NL013而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C1分10秒的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL014而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、53。C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL015而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C1分40秒的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL016而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、540C1分鐘和72。Cl分40秒的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL018而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C1分35秒的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL019而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、55°C1分鐘和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL021而言，95。C10分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54°C1分鐘和72。Cl分45秒的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL022而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54°C1分鐘和72。Cl分45秒的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；以及對于NL027而言，95。CIO分鐘，接著是40個(gè)95。C30秒、54。C1分鐘和72。C1分45秒的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR8/GW/topo載體(目錄Nr.K250020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-NL給出的各SEQIDNO:示出，它們4皮稱為部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列由3-NL中給出的各SEQIDNO:示出。B.通過EST序列克隆褐飛虱NL023基因的部分序列按照廠商方案，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄N。.18080044，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從褐飛虱(來源Dr.J.A.Gatehouse,Dept.BiologicalSciences,DurhamUniversity,UK)的高質(zhì)量總RNA，產(chǎn)生cDNA。從對應(yīng)于公共數(shù)據(jù)庫Genbank中登錄號為CAH65679.2的褐飛虱EST序列的褐飛虱cDNA，擴(kuò)增部分的cDNA序列，NL023。為分離出包含NL023基因的部分的分離的cDNA序列，按照廠商方案，使用PerfectShotTMExTaq(CatN0.RR005A，塔卡拉生物乂>司(TakaraBioInc.))，用基于EST的特異性引物進(jìn)行一系列PCR良應(yīng)。對NL023而言，在兩次獨(dú)立的PCR反應(yīng)中，使用特異性引物oGBKW002和oGBKW003(在本文中分別示為SEQIDNO:1157和SEQIDNO:1158)，其中采用下述條件95。C3分鐘，接著是30個(gè)95。C30秒、56。C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒；目錄N。.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR4-TOPO載體(CatN。.K4575-40,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)),并測序。MJt兩種PCR產(chǎn)物測序獲得的共有序列在本文中示為SEQIDNO:1111，其被稱為NL023基因的部分序列。對應(yīng)的部分^J^酸序列在本文中被示為SEQIDNO:1112。C.褐飛亂基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格^>司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的正義模板的各引物的序列給于表4中。PCRA應(yīng)條件如下所述對于NL001而言，94。C4分鐘，接著是35個(gè)94。C30秒、60。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL002而言，94。C4分鐘，接著是35個(gè)94。C30秒、60。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL003而言，94。C4分鐘，接著是35個(gè)94。C30秒、66。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL004而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、54。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL005而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、57。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL006而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、54。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL007而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、51°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL008而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、54°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL009而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、54。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL010而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、54。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL011而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、53°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL012而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、53。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL013而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL014而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、51。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL015而言，95°C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL016而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、57。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL018而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL019而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、54°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL021而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95°C30秒、55。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；對于NL022而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、53。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘；對于NL023而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、52。C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘；以;Sjt于NL027而言，95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、52。C30秒和72。C1分鐘的循環(huán)，接著是72。CIO分鐘。在采用與上ii^目同的M的PCR^應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種靼基因的反義模板的各引物的序列給于表4-NL中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑敘QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這些按照廠商說明書來進(jìn)行，但具有如下改變在70。/。的乙醇中對RNA沉淀洗兩次。針對每種靼基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-NL中。用于用T7引物在綠色熒光蛋白(gfp)對照上進(jìn)行的PCR反應(yīng)的模板DNA是質(zhì)粒pPD96.12(theFireLab，http:〃genome-www.stanford.edii/group/fire/),其含有野生型gfp編碼序列，所述序列由3個(gè)合成內(nèi)含子隔開。使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄N。.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成雙鏈RNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5，T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。對gfp而言，使用特異性T7FW引物oGAU183和特異性RV引物oGAU182(在本文中分別示為SEQIDNO:236和SEQIDNO:237)，在采用下述條件的PCR^應(yīng)中來產(chǎn)生正義T7模板95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55°C30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是72。C10分鐘。使用特異性FW引物oGAU181和特異性T7RV引物oGAU184(在本文中分別示為SEQIDNO:238和SEQIDNO:239)，在采用與上文所^目同的條件的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，并且純化(QiaquickPCRPurificationKit,目錄N。.28106，快而精公司(Qiagen))。將產(chǎn)生的T7FW和RV模板混^^來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉和異丙醇沉淀進(jìn)行純化，這些按照廠商方案來進(jìn)行，但具有如下改變在70。/o的乙醇中對RNA沉淀洗兩次。得到的dsRNA的正義鏈在本文中如SEQIDNO:235所示。D.使用液體人工膳食，針對對褐飛虱的活性，篩選dsRNA靶的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)按照Koyama(1988)[Artificialrearingandnutritionalphysiologyoftheplanthoppersandleafhoppers(Homoptera:DelphacidaeandDeltocephalidae)onaholidicdiet.X4及g22:20—27](其中略加改變使用的膳食組分蔗糖的終濃度為14.4%(重量對體積比))所述，來制備用于褐稻虱(褐飛虱)的液體人工膳食(MMD-1)。膳食組分被制備為分別的濃縮物10x礦物質(zhì)貯液(貯存于4。C)、2x氮基酸貯液(貯存于-20。C)以及l(fā)Ox維生素貯液(貯存于-20。C)。在開始生物測定之前，將貯液組分現(xiàn)混合為4/3x濃度，以用測試dsRNA溶液(4x濃度)加以稀釋，將pH調(diào)節(jié)為6.5，過濾滅菌為大約500jU的等分試樣。在環(huán)境受控室中，在2-3月齡的7jC稻(臺中再來l號水稻(0/^"Mft'wcvTaichungNative1))上飼輛稻虱(褐飛虱)，采用的^^t為27士2。C，80。/。的相對濕度以及16:8小時(shí)的亮:暗光周期。喂飼室包含10只第一或第二齡的蛹，它們祐放在小培養(yǎng)虹(直徑3cm)上，所述培養(yǎng)臟上蓋有單層薄的延伸石蠟?zāi),其上加有50pl膳食。用第二層石蠟?zāi)っ芊馕癸暿遥谂c成蟲培養(yǎng)相同的條件下進(jìn)行孵育，只是沒有直接的光暴露。每隔一天更新具有dsRNA的膳食，每天對昆蟲的存活加以評定。對每種處理而言，同時(shí)設(shè)立5個(gè)生物測定喂飼室(重復(fù))。向膳食中摻入測試和對照(gfp)dsRNA溶液至終濃度為2mg/ml。將喂飼室保持于27士2。C,80%的相對濕度，以及16:8小時(shí)的亮暗光周期。使用Kaplan-Mder存活曲線模型來分析昆蟲存活數(shù)據(jù)，使用logrank檢驗(yàn)(Prism，4.0版)來比較組間存活。使用喂飼室，向褐飛氬體外喂飼補(bǔ)充有完整棵dsRNA的液體人工膳食導(dǎo)致蛹死亡率顯著增加，如四次分別的生物測定中所示(圖l(a)-(d)-NL;表la-d-NL)。這些結(jié)果證實(shí)，對應(yīng)于不同的重要BPH基因的dsRNA顯示出了對褐稻虱的顯著毒性。在這些生物測定中，gfpdsRNA對BPH存活的影響與在僅膳食的情況下的存活相比沒有顯著不同。表10a-d-NL顯示了補(bǔ)充有2mg/ml(終濃度)下述耙的人工膳食上褐飛虱的存活情況概括；在表10(a)-NL中NL002、NL003、NL005、NL010;在表10(b)-NL中，NL009、NL016;在表10(c)-NL中，NL014、NL018;以及在表10(d)-NL中，NL013、NL015、NL021。在存活分析柱中，RNAi的影響如下文所示+=較之gfpdsRNA對照存活顯著減少(a<0.05);-=較之gfpdsRNA對照存活無顯著不同。使用logrank檢驗(yàn)，對存活曲線加以比較(在僅膳食和補(bǔ)充有測試dsRNA的膳食之間、gfpdsRNA和測試dsRNA之間，以及僅膳食和gfpdsRNA之間進(jìn)行)。E.使用人工膳食，針對對褐飛虱的活性篩選不同濃度的dsRNA的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)將50jal補(bǔ)充有不同濃度(即，1、0.2、0.08和0.04mg/ml(終濃度))的耙NL002dsRNA的液體人工膳食應(yīng)用到褐稻鼠喂飼室中。每隔一天更新具有dsRNA的膳食，每天對昆蟲的存活加以評定。對每種處理而言，同時(shí)設(shè)立5個(gè)生物測定喂詞室(重復(fù))。將喂飼室保持于27士2。C和80。/。的相對濕度，以及16:8小時(shí)的亮:暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲線模型來分析昆蟲存活數(shù)據(jù)，使用logrank檢驗(yàn)(Prism,4.0版)來比較組間存活。較之在僅膳食上的存活而言，喂飼補(bǔ)充有不同濃度的完整棵露的靶NL002的dsRNA的液體人工膳食導(dǎo)致在低至0.04mgdsRNA/ml膳食的終濃度下，仍能導(dǎo)致顯著更高的BPH死亡率，如圖2-NL和表9-NL所示。表9-NL概括了補(bǔ)充有l(wèi)、0.2、0.08和0.04mg/ml(終濃度)的靶NL002的褐飛ILA工膳食喂飼試驗(yàn)的存活情況。在存活分析柱中，RNAi的影響如下文所示+=較之僅膳食的對照存活顯著減少(a<0.05);-=較之僅膳食的對照存活無顯著不同。使用logrank檢驗(yàn)來比較存活曲線。F.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆BPH基因片段雖然可以4吏用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的栽體中克隆對應(yīng)于BPH基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增靼基因的特異性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何耙序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706,快而精7>司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用Sr/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-NL給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體凈皮命名為pGBNJOO。G.在兩種大腸桿菌菌抹(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA耙為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲靶的昆蟲活性雙鏈RNA,按照下述流程來進(jìn)4亍。將RNAaseIII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaselII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50jtl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞故回到水上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450jnl室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取100j^l細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100ing/ml羧節(jié)青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100ng/ml羧千青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。H.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對褐飛虱，表達(dá)dsRNA靶的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給BPH之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整林植物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上BPH。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)?；騪GN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位^皮定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將I至IOml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一抹植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，il^現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了對使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表達(dá)對應(yīng)于昆蟲基因把的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例10:二化螟(稻二化螟)A.通過家族PCR克隆二化螟基因的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)乂i^司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從二化螟(稻二化螟)的4種不同幼蟲期來分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700,普洛麥^^>司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(S叩erScripttmm逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含CSOOl、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、CSOll、CS013、CS014、CS015、CS016和CS018基因的部分的cDNA^列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.NStWOMO,應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosyst函))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的筒并引物的序列給于表2-CS中。這些引物用于各PCR^應(yīng)中，其中采用如下條件95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、55。C1分鐘和72。C1分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆進(jìn)pCR4/TOPO載體(目錄Nr.K2500-20,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-CS給出的各SEQIDNO:示出，它們4皮稱為部分序列。相應(yīng)的部分#^#列由表3-CS中給出的各SEQIDNO:示出。B.二化螟基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega)),合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的靼序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種靼基因的正義模板的各引物的序列給于表8-CS中。PCR^應(yīng)條件如下所述95。C4分鐘，接著是35個(gè)95。C30秒、55。C30秒和72。C1分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上勤目同的條件的PCR反應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種靼基因的反義模板的各引物的序列給于表8-CS中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaCK)4沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混a來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種耙基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-CS中。C.將二化螟基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(n)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的耙基因的靼核苷^列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例l)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(11))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對每種靼基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(11)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同靶(見實(shí)施例B)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用Qiaquick凝膠提取試劑盒試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37。CIO分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)TopIO化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.使用人工膳食，針對對二化螟幼蟲的活性，測試dsRNA靶的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)將稻二化螟，二化螟(來源Syngenta，Stein,Switzerland)保持在經(jīng)改良的基于KamanoandSato,1985(在HandbookofInsectRearing.VolumesI&II.PSingh和RFMoore,編著，ElsevierSciencePublishers,AmsterdamandNewYork,1985，第448頁中)所述的人工膳食上。簡言之，按照下述來制備l升膳食20g瓊脂加入到980mlMilli-Q水中并高壓滅菌；將瓊脂溶液冷卻至大約55。C，加入剩余成分并徹底混合40g玉米粉(普蘭達(dá)公司(Polenta))、20g纖維素、30g蔗糖、30g酪蛋白、20g麥胚芽(烤過的)、8gWesson鹽混合物、12gVanderzant維生素混合物、1.8g山梨酸、1.6g尼泊金(對羥基苯甲酸甲酯)、0.3g金霉素、0.4g膽固醇和0.6gL-半胱氨酸。將膳食冷卻至大約45。C，傾倒進(jìn)飼養(yǎng)盤或杯中。將膳食放在水平層流室中。從籠飼成蟲取具有產(chǎn)的卵的稻葉切片，釘進(jìn)飼養(yǎng)杯或盤中的固體膳食上。令卵孵化，新生幼蟲可用于生物測定和對昆蟲培養(yǎng)物的保持。在試驗(yàn)和飼養(yǎng)期間，M為28±2。C和80±5%的相對濕度，以及16:8小時(shí)的亮:暗光周期。同樣的人工膳食譯皮用于生物測定，但是在這種情況下，將膳食等量傾倒進(jìn)24孔板中，每孔含有l(wèi)ml膳食。一旦設(shè)置好膳食，將測試制劑以50p11照/pl靶dsRNA的比例應(yīng)用到膳食表面(2cm2)。令dsRNA溶液干燥，在每個(gè)孔中放兩只第一齡幼蟲。7天后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至多孔板中新鮮的經(jīng)過處理的膳食上。在第14天(即，生物測定開始后14天)，記錄活的和死的昆蟲的數(shù)量，針對異常性對它們加以檢查。每種處理測試了總共24只幼蟲。進(jìn)^f亍另一項(xiàng)可選的生物測定，其中，向稻二化螟的新生幼蟲喂飼經(jīng)處理的稻葉。將/m/Zc"稻品種Taichungnativel的小葉切片浸于含有l(wèi)jig/pl靶dsRNA的0.050/0TritonX-100溶液中，令其干燥，每片切片放在含有經(jīng)膠凝2。/。瓊脂的24多孔板的孔中。將兩只新生幼蟲從飼養(yǎng)盤轉(zhuǎn)移到每片經(jīng)dsRNA處理過的葉切片上(每種處理24只幼蟲)。4和8天后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至新鮮的經(jīng)處理的稻葉切片上。在第4、8和12天評定活的和死的幼蟲的數(shù)量；還對任何異常進(jìn)行記錄。E.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的栽體中克隆SSB基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于SSB基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增耙基因的特異性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靼序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精7>司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用^/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-CS給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體被命名為pGBNJ00XX。F.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA把為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲靶的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaselII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaselII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50inl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞改回到冰上，再方文5分鐘。向細(xì)胞中加入450jiil室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取IOO]nl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100照/ml羧節(jié)青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)豫導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)耙序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5]tig/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100ing/ml羧節(jié)青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。H.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對二化螟，表達(dá)dsRNA耙的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給SSB之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整,物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，mj^切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上SSB。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)粒或pGN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的1ml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將l至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一B物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因靼序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，W現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了對使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表達(dá)對應(yīng)于昆蟲基因靶的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例9:菜蛾(菜蛾)A.克隆菜蛾的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從菜蛾(菜蛾；來源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd.,CapitalBusinessPark,Wentloog，Cardiff,CF32PX，Wales,UK)的所有不同幼蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044，英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen)，Rockville,Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含PX001、PX009、PXOIO、PX015、PX016基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)z^司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系歹'JPCR^應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的筒并引物的序列給于表2-PX中。這些引物用于各PCR^應(yīng)中，其中采用如下條件95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、50。C1分鐘和72。Cl分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘(對PX001、PX009、PX015、PX016而言)；95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、54°Cl分鐘和72。C2分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘(對于PX010而言)。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，將其克隆進(jìn)pCR8/GW/TOPO載體(目錄NrK2500-20，英杰生命科學(xué)公司(Invogen))，并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-PX給出的各SEQIDNO:示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分"ll^醋列由表3-PX中給出的各SEQIDNO:示出。B.菜蛾基因的dsRNA產(chǎn)生使用可商購試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成亳克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR良應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5'T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的靼序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的正義模板的各引物的序列給于表8-PX中。PCR^應(yīng)條件如下所述95。Cl分鐘，接著^20個(gè)95。C30秒、60。C(-0.5T/循環(huán))30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50°C30秒和72。C1分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上ii4目同的條件的PCR反應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7模板。用于擴(kuò)增每種耙基因的反義模板的各引物的序列給于表8-PX中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混M來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種耙基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-PX中。C.將菜蛾基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(n)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的把基因的^fe苷^列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例l)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(11))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(11)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對每種耙基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(11)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同靶(見實(shí)施例2)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37°CIO分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)TopIO化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.使用人工膳食，針對對菜蛾幼蟲的活性，測試dsRNA靶的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)將菜蛾保持于昆蟲研究有P艮z^司(InsectInvestigationsLtd.)(來源NewcastleUniversity,Newcastle-upon-Tyne,UK)。在甘藍(lán)葉上飼養(yǎng)昆蟲。在試驗(yàn)中，選用笫一齡的混合性別的幼蟲(年齡為大約l天)。將昆蟲保持于Eppdendorf管(1.5ml容量)中。將按照廠商說明書制備的可商業(yè)獲得的菜蛾膳食(生物服務(wù)公司(Bio-Serv)，NJ，USA)放進(jìn)每個(gè)管的蓋中(0,25ml容量，8mm直徑)。雖然仍是液體，但M食更加平滑，以除去多余物，并且產(chǎn)生平坦的表面。一旦已經(jīng)建立了膳食，將測試制劑以每份重復(fù)25pl未經(jīng)稀釋制劑(1照/^d耙dsRNA)的比例應(yīng)用到膳食表面。令測試制劑干燥，在每個(gè)管中放置一只第一齡幼蟲。將幼蟲放到蓋中膳食的表面上，小心關(guān)上管。將管在蓋上倒過來儲存，使得每只幼蟲都保留在膳食表面上。每周兩次將幼蟲轉(zhuǎn)移到含有新鮮膳食的新Eppendorf管中。在試驗(yàn)的最初兩周向昆蟲提供經(jīng)處理的膳食，之后提供未經(jīng)處理的膳食。在總共38天(此時(shí)所有幼蟲都死亡)中，每周進(jìn)行兩次評定。在每次評定時(shí)，針對活的或死的對昆蟲加以評定，并針對異常性加以檢查。對于每種處理而言，進(jìn)行40只單獨(dú)幼蟲的重復(fù)。在試驗(yàn)期間，測試條件為23至26。C以及50至65%的相對濕度，以及16:8小時(shí)的亮:暗光周期。E.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆DBM基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的栽體中克隆對應(yīng)于DBM基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增耙基因的特異性引物的序列提供于表8-PX中。使用的模板是含有任何靼序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下述條件的PCR反應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精7>司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用^/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-PX給出的分別的序列。攜帶該序列的重組載體被命名為pGBNJOOXX。F.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA靶為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲靶的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaseIII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaseIII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50jtl的水冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞故回到冰上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450jil室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取100jil細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100將/ml羧節(jié)青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)豫導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5pg/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100jag/ml羧芐青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。G.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對菜蛾，表達(dá)dsRNA靶的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂伺給DBM之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整林植物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，瓶底切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上DBM。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)?；騪GN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位被定義為600nm波長下，光密度值為l的lml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將I至IOml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的靶dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，il^現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表M應(yīng)于昆蟲基因靶的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例12:居屋艾錄(家蟋蟀)A.克隆居屋艾蟋的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從居屋艾蟋(家墦蟀；來源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd.,CapitalBusinessPark,Wentloog，Cardiff,CF32PX，Wales,UK)的所有不同昆蟲期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega)),通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.180別044，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含ADOOl、AD002、AD009、AD015和AD016基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240，應(yīng)用生物系統(tǒng)^^司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行一系列PCR反應(yīng)。用于擴(kuò)增每條基因的簡并引物的序列給于表2-AD中。這些引物用于各PCR^應(yīng)中，其中采用如下條件95。C10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)95。C30秒、50°C1分鐘和72。Cl分30秒的循環(huán)，接著在72。C7分鐘。在瓊脂糖皿上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，將其克隆進(jìn)pCR8/GW/topo栽體(目錄Nr.K250020，英杰生命科學(xué)^S司(Invitrogen)),并測序。得到的PCR產(chǎn)物的序列由表2-AD給出的各SEQIDNO:示出，它們被稱為部分序列。相應(yīng)的部分^J^斷列由表3-AD中給出的各SEQIDNO:示出。B.居屋艾蟠基因的dsRNA產(chǎn)生4吏用可商購試劑盒T7RibomaxExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個(gè)分別的PCR^應(yīng)中產(chǎn)生兩種分別的單5，T7RNA聚合酶啟動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)含有相對T7啟動(dòng)子而言不同方向的耙序列。就每種耙基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產(chǎn)生正義T7才莫板。用于擴(kuò)增每種靼基因的正義模板的各引物的序列給于表8-AD中。PCR^應(yīng)條件如下所述95。Cl分鐘，接著力0個(gè)95。C30秒、60°C(-0.5。C/循環(huán))30秒和72。Cl分鐘的循環(huán)，接著是15個(gè)95。C30秒、50。C30秒和72。C1分鐘的循環(huán)，接著在72。C10分鐘。在采用與上勤目同的條件的PCR反應(yīng)中，使用特異性正向引物和特異性T7反向引物來產(chǎn)生反義T7才莫板。用于擴(kuò)增每種靼基因的反義模板的各引物的序列給于表8-AD中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106,快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)4亍純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混^來以被轉(zhuǎn)錄，將得到的RNA鏈退火，用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。針對每種耙基因得到的dsRNA的正義鏈?zhǔn)居诒?-AD中。C.將居屋艾蟋基因重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(n)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的靼基因的革C^苷,列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的進(jìn)入克隆(見實(shí)施例1)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(11))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對每種靼基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(11)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有不同耙(見實(shí)施例2)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將150ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37。C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.使用人工膳食，針對對居屋艾蟋幼蟲的活性，檢測dsRNA靼的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)將家蟋蟀居屋艾蟋保持于昆蟲研究有限公司(InsectInvestigationsLtd.)(來源BladesBiologicalLtd.，Kent,UK)。在凄夫皮團(tuán)塊和甘藍(lán)葉上飼養(yǎng)昆蟲。選出大小等同并且不超過5日齡的混合性別蛹，用于該試驗(yàn)。將雙鏈RNA與基于小麥團(tuán)塊的嚙齒動(dòng)物膳食(大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)膳食，B&K總公司(B&KUniversalLtd.)，Grimston，Aldbrough，Hull,UK)混合。膳食BK001P含有下述成分，它們的重量依次降低小麥、大豆、麩皮粉、大麥、團(tuán)塊粘合劑、嚙齒動(dòng)物5維生素、脂肪#物、磷酸二鈣、防霉劑(mouldcarb)。為〗吏得任何酶組分失活，將團(tuán)塊嚙齒動(dòng)物膳食細(xì)致碾碎，在微波爐中進(jìn)行熱處理，之后混合起來。所有嚙齒動(dòng)物膳食都取自同一批，以確保一致性。將經(jīng)艱淬的膳食和dsRNA徹底混^來，成型為等重小團(tuán)塊，令它們在室溫下千燥過夜。濃度為IOing/jil的、來自靶和gfp對照的雙鏈RNA以lg經(jīng)裉淬膳食加lmldsRNA溶液的比例應(yīng)用，由此使得應(yīng)用比例為每g團(tuán)塊10mgdsRNA。每周替換團(tuán)塊。試驗(yàn)的前三周向昆蟲提供經(jīng)處理的團(tuán)塊。之后提供未經(jīng)處理的團(tuán)塊。在有蓋塑料容器(9cm直徑，4.5cm深)中保持昆蟲，每個(gè)容器十只昆蟲。每片場地含有一份經(jīng)處理的餅料團(tuán)塊以及一份水源(濕的棉絮球)，每片場地都放在各小稱量盤中。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間水無限制補(bǔ)充。以每周兩次的間隔進(jìn)行評定，評定之間不超過4天，直到所有對照昆蟲都死亡或蛻變?yōu)槌赡昶?84天)。在每次評定中，昆蟲4皮評定為活的或死的，針對異常現(xiàn)象對它們加以檢查。從第46天起，一旦開始向成蟲蛻變，所有昆蟲(活的和死的)就^L評定為蛹或成蟲。在試驗(yàn)的第55天對存活昆蟲加以稱重。每種處理采用一式四份重復(fù)。在試驗(yàn)期間，測試條件為25至33。C，20至25%的相對濕度，以及12:12小時(shí)的亮:暗光周期。E.在適合用于細(xì)菌生產(chǎn)昆蟲活性雙鏈RNA的載體中克隆HC基因片段雖然可以使用包含T7啟動(dòng)子或用于在細(xì)菌中高效轉(zhuǎn)錄的任何其它啟動(dòng)子的任何載體，但下面的實(shí)施例是在用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)雙鏈RNA的載體中克隆對應(yīng)于HC基因靶的DNA片段(參考WO00001846)。用于擴(kuò)增耙基因的特異性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何耙序列的pCR8/GW/topo載體。在采用下迷條件的PCR^應(yīng)中使用引物98。C5分鐘，接著是30個(gè)98。C10秒、55°C30秒和72。C2分鐘的循環(huán)，接著在72。CIO分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆進(jìn)用Sr/I線性化過的pGNA49A載體(參考WO00188121Al)中，并進(jìn)行測序。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的序列對應(yīng)于表8-AD給出的分別的序列。攜帶該序列的重組栽體被命名為pGBNJ00XX。F.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA耙為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的昆蟲靶的昆蟲活性雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaseIII缺陷型菌抹AB309-105與野生型含RNaseIII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50inl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL"(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在水上孵育加分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞故回到水上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450jtl室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于"。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取100jU細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100將/ml羧芐青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于37。C對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)耙序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通過加入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為1。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100照/ml羧千青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ水中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至孩i離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。G.實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，以測試針對居屋艾蟠，表達(dá)dsRNA靶的大腸桿菌基于植物的生物測定在將植物喂飼給HC之前，用經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的表達(dá)dsRNA的細(xì)菌的懸浮液對整,物噴霧。在植物培養(yǎng)室中種植植物。將500ml塑料瓶頂部朝下放到植物上，瓶頸穩(wěn)固放進(jìn)盆中的土壤中，M切開，蓋上細(xì)尼龍網(wǎng)以允許通風(fēng)、降低內(nèi)部冷凝以及防止幼蟲逃脫，由此為植物搭建籠子。向籠中每林經(jīng)處理植物上放上HC。用攜帶有pGBNJ001質(zhì)粒或pGN29質(zhì)粒的大腸桿菌AB309-105的懸浮液來處理植物。向植物應(yīng)用不同量的細(xì)菌例如66、22和7個(gè)單位，其中，一個(gè)單位4皮定義為600nm波長下，光密度值為l的1ml細(xì)菌懸浮液中，109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。每種情況下，在噴霧器協(xié)助下將l至10ml之間的總體積噴霧到植物上。在該試驗(yàn)中，每種處理使用一林植物。對存活者的數(shù)量加以計(jì)數(shù)，記錄每只存活者的重量。用表達(dá)來自pGBNJ003的耙dsRNA的大腸桿菌細(xì)菌菌林AB309-105的懸浮液對植物進(jìn)行噴霧，導(dǎo)致昆蟲死亡率較之pGN29對照的顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)顯示，在野生型或RNaseIII缺陷型細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的對應(yīng)于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，W現(xiàn)在昆蟲死亡率的高度增加以及幼蟲存活者生長/發(fā)育的延遲上。從這些實(shí)驗(yàn)中還顯而易見提供了使用制劑噴霧來有效保護(hù)植物/作物免受昆蟲損傷的范例，所述制劑由表i^t應(yīng)于昆蟲基因靶的雙鏈RNA的細(xì)菌組成。實(shí)施例13:稻瘋病菌(i^Wcw/flnVigr/wfl)(稻痘)A.克隆稻瘟病菌(尸.gW^")的部分序列按照廠商說明書，使用TRIzol試劑(目錄Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科學(xué)/>司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，從稻瘟病菌的不同生長期分離高質(zhì)量的完整RNA。按照廠商說明書(目錄Nr.1700，普洛麥格公司(Promega))，通過DNase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。按照廠商說明書，使用可商購試劑盒(SuperscriptTMlII逆轉(zhuǎn)錄酶，目錄Nr.18080044,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland,USA)，產(chǎn)生cDNA。為分離出包含靶基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用AmplitaqGold(目錄Nr.N8080240,應(yīng)用生物系統(tǒng)7>司(AppliedBiosystems))，用簡并引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。得到的PCR產(chǎn)物被分級分離并凈皮測序。B.稻癥病菌基因的dsRNA產(chǎn)生按照廠商說明書，使用可商購試劑盒，例如T7RibomaxTMExpressRNAi系統(tǒng)(目錄Nr.P1700,普洛麥格公司(Promega))，合成毫克級的dsRNA。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產(chǎn)物，通過PCR純化試劑盒(例如，QiaquickPCRPurificationKit,目錄Nr.28106，快而精公司(Qiagen))對其進(jìn)行純化，并進(jìn)行NaC104沉淀。將產(chǎn)生的T7正向和反向模板混合起來，將得到的RNA鏈退火，然后用DNase和RNase進(jìn)行處理，并且通過乙酸鈉純化，這都按照廠商說明書來進(jìn)行。C.將稻痙病菌靶重組進(jìn)植物載體pK7GWIWG2D(n)鑒于RNA干擾的機(jī)制是通過dsRNA片^作用的，因此以反義和正義方向克隆上文選出的乾基因的靼核苷,列，其通過內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分開(其中CmR是氯霉素抗性標(biāo)記)，以形成dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體。在含attL的ii7v克隆(見實(shí)施例A)和含attR的目的載體(=pK7GWIWG2D(H))間使用LR重組反應(yīng)來產(chǎn)生這些發(fā)夾構(gòu)建體。通過材料運(yùn)送協(xié)議(MaterialTransferAgreement)從VIB/植物系統(tǒng)生物(VIB/PlantSystemsBiology)獲得植物載體pK7GWIWG2D(H)。按照廠商說明書，使用LRClonaseII酶混合物(目錄Nr.11791-020，英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen))來進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這些克隆實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了針對耙基因的發(fā)夾構(gòu)建體，它們具有啟動(dòng)子-正義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中，啟動(dòng)子是植物的可操作的35S啟動(dòng)子。具有35S啟動(dòng)子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于進(jìn)行向根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化。在含有耙(見實(shí)施例B)的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒上進(jìn)行限制性酶消化。使用QiaquickGelExtraction試劑盒(目錄Nr.28706，快而精公司(Qiagen))來純化含有感興趣基因(側(cè)翼有attL位點(diǎn))的條帶。將1S0ng量的經(jīng)純化片段和150ngpK7GWIWG2D(II)與LR克隆酶II酶加到一起，在25。C溫育至少1小時(shí)。蛋白酶K溶液處理(37。C10分鐘)之后，將整個(gè)重組混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。通過限制性消化分析選出陽性克隆。D.在兩種大腸桿菌菌林(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表達(dá)和產(chǎn)生雙鏈RNA耙為了在細(xì)菌中表達(dá)合適水平的真菌靶的真菌雙鏈RNA，按照下述流程來進(jìn)行。將RNAaseIII缺陷型菌林AB309-105與野生型含RNaseIII細(xì)菌BL21(DE3)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)化AB309-105和BL21(DE3)在50inl的冰冷化學(xué)感染態(tài)大腸桿菌菌林AB309-105或BL21(DE3)的等分試樣中加入300ng的質(zhì)粒，輕柔混合。細(xì)胞在水上孵育20分鐘，之后對它們進(jìn)行37。C5分鐘的熱激處理，之后將細(xì)胞i文回到水上，再放5分鐘。向細(xì)胞中加入450iLil室溫SOC培養(yǎng)基，在搖床(250rpm)上于37。C對懸浮液進(jìn)行l(wèi)小時(shí)孵育。取100nl細(xì)菌細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，其中含有150ml補(bǔ)充有100照/ml羧千青霉素抗生素的液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在Innova4430搖床(250rpm)上于3TC對培養(yǎng)物進(jìn)行過夜(16至18小時(shí))孵育。雙鏈RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)因?yàn)榇嬖谟糜谑芸乇磉_(dá)的所有遺傳組分，因此使得在細(xì)菌菌林AB309-105或BL21(DE3)中從重組載體pGBNJ003表達(dá)雙鏈RNA成為可能。存在化學(xué)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷或IPTG時(shí)，T7聚合酶能驅(qū)動(dòng)靶序列以反義和正義方向的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)樗鼈儌?cè)翼有相反定向的T7啟動(dòng)子。使用合適的分光光度計(jì)來在600nm處測量過夜細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，通it^口入新鮮的LB培養(yǎng)基將其調(diào)節(jié)至該值為l。將50ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中，然后于15。C在3000g對培養(yǎng)物離心10分鐘。移出上清液，將細(xì)菌沉淀重懸于50ml新鮮的S完全培養(yǎng)基(SNC培養(yǎng)基+5照/ml膽固醇)中，其中補(bǔ)充有100ng/ml羧芐青霉素和lmMIPTG。在室溫下對細(xì)菌進(jìn)行2至4小時(shí)的誘導(dǎo)。對細(xì)菌的熱處理通過熱處理殺死細(xì)菌，以最小化對測試板中人工膳食造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌的熱處理并非誘導(dǎo)RNA干擾導(dǎo)致的對昆蟲的毒性的先決條件。于室溫下在3000g對經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行10分鐘離心，棄去上清液，在水浴中使沉淀進(jìn)行20分鐘的80。C處理。熱處理之后，將細(xì)菌沉淀重懸于1.5mlMilliQ7K中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至微離心管。制備若干管，在生物測定中用于每次更新。將管貯存于-20。C直到進(jìn)一步使用。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的核苷酸序列，其包含在SEQIDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的核酸序列。2.核苷紗列，其與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、11611571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730一2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列示出的核^列具有至少70%序列同一性。3.包含SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49一158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730—2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列或其互補(bǔ)序列的至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的直向同源物。4.從權(quán)利要求l-3中任意一項(xiàng)的多核苷酸序列表達(dá)產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中，植物的有害生物才IA所述核糖核苷酸序列抑制所述有害生物的生長。5.權(quán)利要求4的核糖核苷酸序列，其中，攝入所述序列抑制與所述序列充分互補(bǔ)的核苷酸序列的表達(dá)。6.用權(quán)利要求l-3中任意一項(xiàng)的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。7.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。8.用權(quán)利要求l-3中任意一項(xiàng)的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。9.權(quán)利要求8的植物的種子，其中所述種子包含所述多核苷酸。10.從權(quán)利要求8的植物產(chǎn)生的產(chǎn)品，其中，所述產(chǎn)品包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384--2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列示出的多核苷酸或其互補(bǔ)序列。11.權(quán)利要求10的產(chǎn)品，其中，所述產(chǎn)品選自食品、飼料、纖維、紙、餐食、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉、青貯飼料、咖啡、茶和油。12.包含來自有害生物物種的雙鏈核糖核酸序列的植物。13.權(quán)利要求12的植物，其中，所述有害生物選自昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、扁形動(dòng)物、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絳蟲、錐蟲、血吸蟲、狂蠅、跳蚤、壁虱、螨和虱。14.權(quán)利要求12的植物，其中，所述序列抑制有害生物的生物學(xué)活性。15.權(quán)利要求12的植物，其中，所述序列抑制耙序列的表達(dá)。16.權(quán)利要求15的植物，其中，所述耙序列是昆蟲、線蟲、細(xì)菌或真菌序列。17.權(quán)利要求12的植物，其中，所述植物;U&質(zhì)雄性不育的。18.用于控制有害生物侵襲M方法，所述方法包括向有害生物提供包含抑制有害生物生物學(xué)活性的多核苷酸序列的植物材料。19.權(quán)利要求18的方法，其中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49—158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621—767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813—862、863、868、873、878、883、888、8卯、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、16卯、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730--2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、20卯、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列或其互補(bǔ)序列所示。20.殺蟲劑，其包含表達(dá)乾多核苷,列的植物。21.用于控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括(a)鑒定出有害生物中的耙序列；(b)將所述序列引入植物；以及(c)向所述有害生物提供所述植物或其部分。22.用于控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括a)鑒定出第一有害生物物種中的耙序列；b)搜索出第二有害生物物種中的直向同源耙序列；c)將所述直向同源序列引入植物；以及d)向所述第二有害生物提供所述植物或其部分。23.用于改良作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括a)向植物中引入根據(jù)權(quán)利要求l-3中任意一項(xiàng)的多核苷酸；以及b)種植所述植物，以令多核苷酸表達(dá)，其中，所^達(dá)抑制有害生物進(jìn)食以及由于有害生物侵襲導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。24.權(quán)利要求23的方法，其中，多核苷i^4達(dá)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子在攝入了所述作物植物的一部分的昆蟲有害生物中遏制把基因，其中所述靼基因執(zhí)行選自以下的至少一種重要功能有害生物進(jìn)食、有害生物生存能力、有害生物細(xì)胞凋亡、有害生物或任何有害生物細(xì)胞的分化和發(fā)育、有害生物的有性繁殖、肌肉形成、肌肉顫搐、肌肉收縮、保幼激素形成和/或降低、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜電位保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感知、觸角形成、翅膀形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴保持、神經(jīng)傳遞、幼蟲期轉(zhuǎn)換、蛹化、從蛹化出現(xiàn)、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)合成和保持、核苷酸代謝、氮代謝、水的使用、7jC駐留和感知。25.權(quán)利要求23的方法，其中，所述有害生物選自昆蟲、線蟲和真菌。26.用于生產(chǎn)商品產(chǎn)品的方法，所述方法包括a)鑒定出有害生物中的耙序列；b)將所述序列引入植物細(xì)胞；c)在適于產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；以及d)從所述植物或其部分來生產(chǎn)商品產(chǎn)品。27.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靼是來自馬鈴薯葉甲的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。28.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述耙是來自辣根猿葉甲的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽茱、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。29.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靶是來自墨西哥豆瓢蟲的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向曰葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番癡、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。30.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述乾是來自墨西哥棉鈴象的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、虹豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫聲、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番癡、樹、黑小麥、草沖草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。31.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靶是來自赤擬谷盜的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、齊菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫聲、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草沖草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。32.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述耙是來自桃蚜的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱘梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪;^、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。33.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靶是來自褐飛虱的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。34.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靼是來自二化螟的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向曰葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番癡、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。35.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靼是來自菜蛾的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、垮梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芹菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠4失杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番癡、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。36.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述靼是來自居屋艾蟋的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、鱘梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芽、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草扦草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。37.根據(jù)權(quán)利要求18-19和21-26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述乾是來自真菌的基因，所述植物選自金合歡、苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、白蠟樹、天門冬、垮梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、樺木、山毛櫸、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、雪松、谷類、芽菜、栗、櫻、大白菜、柑橘、克萊門氏小柑橘、三葉草、咖啡、棉、豇豆、黃瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、冷杉、老鸛草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸漿、橡膠4失杉、山核桃、羽衣甘藍(lán)、獼猴桃、擘藍(lán)、落葉松、萵苣、韭蔥、檸檬、來檬、洋槐、松、鐵線蕨、玉米、芒果、槭樹、瓜、黍、蘑菇、白芥、堅(jiān)果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、桔、觀賞植物或花或樹、番木瓜、棕櫚、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石榴、馬鈴薯、西葫蘆、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、柳樹、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖蘿卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、紅桔、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、蕪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、薯蕷、紅豆杉和夏南瓜。38.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的經(jīng)分離的核苷*列、根據(jù)權(quán)利要求4-5中任意一項(xiàng)的雙鏈核糖核苷酸序列、根據(jù)權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)的細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)的植物或根據(jù)權(quán)利要求10-11中任意一項(xiàng)的產(chǎn)品用于處理植物的昆蟲侵襲的用途。39.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任意一項(xiàng)的經(jīng)分離的核苷酸序列、根據(jù)權(quán)利要求4-5中任意一項(xiàng)的雙鏈核糖核普^列、根據(jù)權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)的細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)的植物或根據(jù)權(quán)利要求10-11中任意一項(xiàng)的產(chǎn)品用于處理植物的線蟲侵襲的用途。40.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任意一項(xiàng)的經(jīng)分離的核苷^列、根據(jù)權(quán)利要求4-5中任意一項(xiàng)的雙鏈核糖核苷酸序列、根據(jù)權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)的細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)的植物或根據(jù)權(quán)利要求10-11中任意一項(xiàng)的產(chǎn)品用于處理植物的真菌侵襲的用途。全文摘要本發(fā)明涉及使用雙鏈RNA分子來控制有害生物侵襲的方法。本發(fā)明提供了制備表達(dá)所述雙鏈RNA分子的轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及通過本發(fā)明植物生產(chǎn)的殺蟲劑和商品產(chǎn)品。文檔編號C12N15/82GK101365795SQ200680042821公開日2009年2月11日申請日期2006年9月18日優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日發(fā)明者E·范布勒,F·佩克爾,G·普萊廷克,I·諾仁,P·菲爾德曼,R·拉馬克斯申請人:德福根有限公司