作為昆蟲(chóng)防治劑的dsRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)RNAi介導(dǎo)的基因沉默來(lái)防治害蟲(chóng)侵害的方法，其通過(guò)將完好的昆蟲(chóng)細(xì)胞與該昆蟲(chóng)細(xì)胞外部的雙鏈RNA接觸以及通過(guò)所述雙鏈RNA被所述完好的昆蟲(chóng)細(xì)胞攝取來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于減輕昆蟲(chóng)害蟲(chóng)對(duì)植物的侵害。作為替代地，所述方法用于向有此處理和/或防止需要的基層或?qū)ο筮M(jìn)行處理和/或防止昆蟲(chóng)侵害。公開(kāi)了適當(dāng)?shù)睦ハx(chóng)靶基因及其片段、dsRNA構(gòu)建體、重組構(gòu)建體和組合物。
【專利說(shuō)明】作為昆蟲(chóng)防治劑的dsRNA
[0001] 本申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)200780002294. X的分案，后者是2007年1月12日提交的 PCT申請(qǐng)PCT/EP2007/000287于2008年7月11日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及在昆蟲(chóng)物種中雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)基因沉默的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā) 明涉及設(shè)計(jì)用于表達(dá)對(duì)應(yīng)于新靶基因的dsRNA的遺傳構(gòu)建體。這些構(gòu)建體在RNAi介導(dǎo)的 害蟲(chóng)防治中尤其有用。本發(fā)明還涉及用于防治昆蟲(chóng)的方法、用于防止昆蟲(chóng)侵害的方法以及 使用RNAi下調(diào)昆蟲(chóng)中基因表達(dá)的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 昆蟲(chóng)及其它害蟲(chóng)可通過(guò)其叮咬或螫刺而導(dǎo)致?lián)p傷甚至死亡。而且，許多害蟲(chóng)傳播 導(dǎo)致疾病的細(xì)菌及其它病原體。例如，蚊子傳播導(dǎo)致瘧疾、黃熱病、腦炎和另一些疾病的病 原體。腺鼠疫（或黑死?。┯筛腥敬笫蠛土硪恍﹪X動(dòng)物的細(xì)菌所引起。用于防治微觀害 蟲(chóng)侵害的組合物已經(jīng)以抗生素、抗病毒和抗真菌的組合物的形式提供。用于防治害蟲(chóng)（如 線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)）侵害的方法通常采用化學(xué)組合物的形式，將所述化學(xué)組合物應(yīng)用于害蟲(chóng)停留 的表面上，或者以丸劑、粉劑、片劑、糊劑或膠囊劑的形式施用于被侵?jǐn)_動(dòng)物。
[0004] 重要農(nóng)作物的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)防治是非常重要的領(lǐng)域，例如破壞茄科植物的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)， 尤其是鞘翅目害蟲(chóng)的防治，所述爺科植物尤指馬鈴薯（Solanum tuberosum),以及番爺 (Solanum lycopersicum)、爺子（Solanum melongena)、辣椒（Solanum capsicum)和爺屬植 物（例如，Solanum aculeastrum、S. bulbocastanum( -種野生馬鈴薯）、S. cardiophyllum、 S. douglasii、歐白英（S. dulcamara)、S. lanceolatum、S. robustum 和 S. triquetrum) 〇
[0005] 在過(guò)去的幾十年中，用于防治植物中昆蟲(chóng)侵害的更有效方法和組合物的開(kāi)發(fā)已取 得顯著進(jìn)展。化學(xué)殺蟲(chóng)劑在根除害蟲(chóng)侵害中已非常有效。
[0006] 使用印楝籽提取物進(jìn)行生物防治已顯示出對(duì)植物鞘翅目害蟲(chóng)有作用。基于印楝的 市售殺蟲(chóng)劑將印楝素作為主要的活性成分。這些殺蟲(chóng)劑適用于廣譜的昆蟲(chóng)。它們作為昆蟲(chóng) 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；印楝素通過(guò)抑制一種昆蟲(chóng)激素（蛻皮素）的產(chǎn)生而阻止昆蟲(chóng)蛻皮。
[0007] 使用來(lái)自蘇云金芽孢桿菌粉蟲(chóng)變種（Bacillus thuringiensis varieties tenebrionis)和圣地亞哥變種（varieties san diego)的Cry3A蛋白以及衍生的殺蟲(chóng)蛋白 進(jìn)行生物防治是化學(xué)防治的可替代方法。所述Bt(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白對(duì) 于防治馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)是有效的，該毒素蛋白或者作為在植物上噴灑的制劑或者在馬鈴薯 的葉中表達(dá)。
[0008] -種可替代的生物制劑是dsRNA。在過(guò)去的幾年里，借助RNA干擾或"RNAi "下調(diào) 多細(xì)胞生物中的基因（也稱為"基因沉默"）已成為成熟的技術(shù)。
[0009] RNA干擾或"RNAi"是序列特異性下調(diào)基因表達(dá)的方法（也稱為"基因沉默"或"RNA 介導(dǎo)的基因沉默"），其由序列與待下調(diào)靶基因區(qū)域互補(bǔ)的雙鏈RNA (dsRNA)起始（Fire， A.Trends Genet. Vol. 15, 358-363,1999 ；Sharp,P. A. Genes Dev. Vol. 15,485-490,2001)〇
[0010] 在過(guò)去的幾年里，借助RNA干擾（RNAi)下調(diào)多細(xì)胞生物的靶基因已成為成熟的技 術(shù)?？蓞⒖紘?guó)際申請(qǐng)W099/32619(卡內(nèi)基學(xué)院）和W000/01846(本 申請(qǐng)人:）。
[0011] dsRNA基因沉默應(yīng)用于許多不同的領(lǐng)域中，例如在臨床應(yīng)用（W02004/001013)和 植物中dsRNA介導(dǎo)的基因沉默。在植物中，還已將用于基因沉默的dsRNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)成可 被切割及加工成小干擾RNA(siRNA)。
[0012] 盡管本領(lǐng)域已普遍了解植物、秀麗隱桿線蟲(chóng)（C. elegans)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 的RNAi技術(shù)若干年，然而對(duì)于使用RNAi下調(diào)昆蟲(chóng)中基因表達(dá)迄今幾乎是未知的。自從 W000/01846和W099/32619申請(qǐng)的提交和公布以來(lái)，僅有少量涉及使用RNAi保護(hù)植物免受 昆蟲(chóng)侵害的其它申請(qǐng)被公布。這些包括國(guó)際申請(qǐng)W001/37654(DNA Plant Technologies)、 W02005/019408 (Bar Ilan 大學(xué)）、W02005/049841 (CSIR0, Bayer Cropscience)、 W005/047300(猶他大學(xué)研究基金會(huì)）和美國(guó)申請(qǐng)2003/00150017 (Mesa等）。本發(fā)明提供 了用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)防治的靶基因和構(gòu)建體。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了通過(guò)抑制、延 遲或降低特定害蟲(chóng)中靶基因的表達(dá)來(lái)防治害蟲(chóng)侵害的方法和組合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明描述了用于防治作物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的不基于化合物、不基于蛋白質(zhì)的新方法。 其活性成分是核酸（雙鏈RNA (dsRNA))，所述核酸可用作殺蟲(chóng)制劑（例如，作為葉的噴霧 劑）。所述dsRNA的序列對(duì)應(yīng)于昆蟲(chóng)必需基因的部分或全部，并通過(guò)RNA干擾（RNAi)導(dǎo)致 昆蟲(chóng)靶標(biāo)的下調(diào)。由于mRNA的下調(diào)，所述dsRNA阻止昆蟲(chóng)靶蛋白的表達(dá)，并因此導(dǎo)致昆蟲(chóng) 死亡、生長(zhǎng)停滯或不育。
[0014] 本發(fā)明的方法可實(shí)際應(yīng)用在需要抑制昆蟲(chóng)的生存、生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖或者降低昆 蟲(chóng)的致病性或感染性的任何【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的方法還實(shí)際應(yīng)用于需要特異性下調(diào)昆蟲(chóng)中 一種或多種靶基因表達(dá)的情形。特別有用的實(shí)際應(yīng)用包括但不限于：（1)保護(hù)植物免受昆 蟲(chóng)害蟲(chóng)侵害；(2)在人和動(dòng)物中的藥物或獸醫(yī)用途（例如，控制、治療或預(yù)防人和動(dòng)物中的 昆蟲(chóng)感染）；(3)保護(hù)物品免遭昆蟲(chóng)破壞；(4)保護(hù)易腐的物品（如食品、種子等）免遭昆蟲(chóng) 破壞；以及通常需要防治昆蟲(chóng)和/或需要防止昆蟲(chóng)引起破壞的任何應(yīng)用。
[0015] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及控制細(xì)胞或生物上昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的方法，或者防止昆 蟲(chóng)侵害對(duì)昆蟲(chóng)感染敏感的細(xì)胞或生物的方法，其包括將昆蟲(chóng)與雙鏈RNA接觸，其中所述雙 鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含與昆蟲(chóng)靶基因核苷酸序列之至少一部 分互補(bǔ)的核苷酸序列，該雙鏈RNA被昆蟲(chóng)攝取并因此控制生長(zhǎng)或防止侵害。
[0016] 因此，本發(fā)明提供了分離的新的昆蟲(chóng)靶基因核苷酸序列，所述分離的核苷酸序列 包含選自以下的至少一種核酸序列：
[0017] (i)如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513， 515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767， 768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888， 890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090, 2095,2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 或 2460, 2461，2466， 2471，2476, 2481或2486,或其互補(bǔ)序列，
[0018] (ii)與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更 優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列：
[0019] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178.183.188.193.198.203.208.215.220.225.230.240 至 247,249,251，253,255,257， 259,275至 472,473,478,483,488,493,498,503,508至 513,515,517,519,521，533至 575， 576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793， 795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040， 1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補(bǔ) 序列，以及
[0020] (iii)包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列：
[0021] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178.183.188.193.198.203.208.215.220.225.230.240 至 247,249,251，253,255,257， 259,275至 472,473,478,483,488,493,498,503,508至513,515,517,519,521，533至575， 576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793， 795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040， 1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補(bǔ) 序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因 的直系同源物：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互補(bǔ)序列，所述核酸序列 可用于制備本發(fā)明的用于控制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的雙鏈RNA。
[0022] 本發(fā)明使用的"防治害蟲(chóng)"意指殺死害蟲(chóng)，或阻止害蟲(chóng)發(fā)育或生長(zhǎng)，或防止害蟲(chóng)感 染或侵害。本文使用的防治害蟲(chóng)還包括控制害蟲(chóng)的后代（卵的發(fā)育）。本文使用的害蟲(chóng)防 治還包括抑制昆蟲(chóng)的生存、生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖，或降低昆蟲(chóng)的致病性或感染性。本文所述的 化合物和/或組合物可用于維持生物健康，并可以治療性、預(yù)防性或全身性地使用來(lái)防治 害蟲(chóng)或者阻止昆蟲(chóng)生長(zhǎng)或發(fā)育或者感染或侵害。
[0023] 本發(fā)明涉及的特定害蟲(chóng)是昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。因此，本文使用的"防治昆蟲(chóng)"還包括控制昆 蟲(chóng)的后代（例如昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的卵的發(fā)育）。本文使用的防治昆蟲(chóng)還包括抑制昆蟲(chóng)的生存、生 長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖，或者降低昆蟲(chóng)的致病性或感染性。在本發(fā)明中，防治昆蟲(chóng)可以抑制昆蟲(chóng)中 的生物活性，其導(dǎo)致一種或多種以下特征：昆蟲(chóng)進(jìn)食減少，昆蟲(chóng)生存力降低，昆蟲(chóng)死亡，抑制 昆蟲(chóng)的分化和發(fā)育，以下的缺失或能力下降：昆蟲(chóng)有性繁殖、肌肉形成、保幼激素形成、保幼 激素功能調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜電勢(shì)的維持、氨基酸的生物合成、氨基酸降解、精子 形成、信息素合成、信息素的感知、觸角形成、翅的形成、足的形成、發(fā)育和分化、卵的形成、 幼蟲(chóng)的成熟、消化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的維持、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞分裂、能量代謝、 呼吸、凋亡以及真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)（如肌動(dòng)蛋白和微管蛋白）的任何組分。本文所 述的化合物和/或組合物可用于維持生物健康，并可以治療性、預(yù)防性或全身性地使用來(lái) 防治昆蟲(chóng)，或阻止害蟲(chóng)生長(zhǎng)或發(fā)育或者感染或侵害。因此，本發(fā)明可以使先前的敏感生物對(duì) 昆蟲(chóng)侵害產(chǎn)生抗性。
[0024] 本文使用的表述"與……的至少一部分互補(bǔ)"是指所述核苷酸序列與靶標(biāo)的核苷 酸序列在超過(guò)兩個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度上，例如超過(guò)至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更 多個(gè)連續(xù)核苷酸的長(zhǎng)度上完全互補(bǔ)。
[0025] 根據(jù)又一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及用于下調(diào)昆蟲(chóng)中靶基因表達(dá)的方法，其包括將所 述昆蟲(chóng)與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含與 待下調(diào)昆蟲(chóng)靶基因核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述雙鏈RNA被昆蟲(chóng) 攝取并因此下調(diào)昆蟲(chóng)靶基因的表達(dá)。
[0026] 在無(wú)數(shù)量詞修飾時(shí)，"靶基因"是指"至少一種"靶基因。同樣地，靶生物是指"至 少一種"靶生物，RNA分子或宿主細(xì)胞是指"至少一種"RNA分子或宿主細(xì)胞。這在后面還有 詳述。
[0027] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法依賴于昆蟲(chóng)攝取其外部的雙鏈RNA(例如，通過(guò) 進(jìn)食），而不需要在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA。另外，本發(fā)明還包括如上所述的方法，其中所 述昆蟲(chóng)與包含該雙鏈RNA的組合物接觸。
[0028] 可通過(guò)原核的（例如但不限于細(xì)菌）或真核的（例如但不限于酵母）宿主細(xì)胞或 宿主生物來(lái)表達(dá)所述雙鏈RNA。
[0029] 所述昆蟲(chóng)可以是任何昆蟲(chóng)，意指屬于動(dòng)物界、特別是節(jié)肢動(dòng)物門、尤其是昆蟲(chóng)綱或 蛛形綱的任何生物。本發(fā)明的方法適用于對(duì)利用RNA干擾進(jìn)行的基因沉默敏感的所有昆 蟲(chóng)，以及能夠從其鄰近環(huán)境將雙鏈RNA內(nèi)化的所有昆蟲(chóng)。本發(fā)明還適用于處于其任何發(fā)育 階段的昆蟲(chóng)。因?yàn)槔ハx(chóng)具有無(wú)生命的外骨骼，所以它們不能以均一的速率生長(zhǎng)，而是通過(guò)周 期性蛻落其外骨骼進(jìn)行分階段生長(zhǎng)。該過(guò)程稱作"蛻皮"。蛻皮之間的階段稱作"齡"，而這 些階段可以作為本發(fā)明的靶標(biāo)。同時(shí)，昆蟲(chóng)的卵或活的幼蟲(chóng)也可作為本發(fā)明的靶標(biāo)。發(fā)育 周期中的所有階段（包括有翅昆蟲(chóng)中的變態(tài)）均可以作為本發(fā)明的靶標(biāo)。因此，單個(gè)階段 (如幼蟲(chóng)、蛹、若蟲(chóng)等發(fā)育階段）均可以作為靶標(biāo)。
[0030] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述昆蟲(chóng)可以屬于以下的目：蜱螨目、蜘蛛目、虱目、 鞘翅目、彈尾目、革翅目、網(wǎng)翅目、雙尾目、雙翅目、紡足目、蜉蝣目、蛩蠊目、半翅目、同翅目、 膜翅目、等翅目、鱗翅目、食毛目、長(zhǎng)翅目、脈翅目、蜻蜓目、直翅目、竹節(jié)蟲(chóng)目、櫝翅目、原尾 目、嚙蟲(chóng)目、蚤目、虱目、纓尾目、捻翅目、纓翅目、毛翅目和缺翅目。
[0031] 在本發(fā)明優(yōu)選的非限制性實(shí)施方案和方法中，所述昆蟲(chóng)選自：
[0032] (1)植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，例如但不限于褐飛風(fēng)屬物種（Nilaparvata spp.))(例如，褐 飛風(fēng)（N.lugens))、灰飛風(fēng)屬物種（Laodelphax spp.)(例如，灰飛風(fēng)（L.striatellus))、 黑尾葉蝶屬物種（Nephotettix spp.)(例如，二點(diǎn)黑尾葉蝶（N. virescens)，或黑尾葉 蝶（N.cincticeps)，或二條黑尾葉蝶（N.nigropictus))、白背飛風(fēng)屬物種（Sogatella spp.)(例如，白背飛風(fēng)（S. furcifera))、桿長(zhǎng)蝽屬物種（Blissus spp.)(例如，美洲谷桿 長(zhǎng)蝽（B.leucopterus leucopterus))、黑蝽屬物種（Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽 (S. vermidulate))、綠蝽屬物種（Acrosternum spp.)(例如，擬綠蝽（A. hilare))、稻弄蝶 屬物種（Parnara spp.)(例如，直紋稻弄蝶（P. guttata))、禾草螟屬物種（Chilo spp.)(例 如，二化螟（C.suppressalis)、臺(tái)灣稻螟（C.auricilius)或稻多麗螟（C.polychrysus))、 禾草螟屬物種（Chilotraea spp.)(例如，稻桿螟（C. polychrysa))ji^夜蛾屬物種 (Sesamia spp.)(例如，稻駐莖夜蛾（S.inferens))、駐禾螟屬物種（Tryporyza spp.)(例 如，白稻螟（T. innotata)或三化螟（T. incertulas))、縱卷葉野螟屬物種（Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻縱卷葉野螟（C. medinalis))、潛蠅屬物種（Agromyza spp.)(例如，日本 稻潛蠅（A.oryzae)或玉米斑潛蠅（A.parvicornis))、桿草螟屬物種（Diatraea spp.) (例如，小鹿螟（D.saccharalis)或西南玉米桿草螟（D.grandiosella))、Narnaga屬 物種（例如，綠稻毛蟲(chóng)（N. aenescens))、黃夜蛾屬物種（Xanthodes spp.)(例如，犁 紋黃夜蛾（X. transversa))、灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)(例如，草地貪夜蛾 (S. frugiperda)、甜菜夜蛾（S. exigua)、?；页嵋苟辏⊿. littoralis)或西部黃條夜蛾 (S. praefica))、秘夜蛾屬物種（Mythimna spp.)(例如，粘蟲(chóng)（Mythmna(Pseudaletia) seperata))、鈴夜蛾屬物種（Helicoverpa spp.)(例如，谷實(shí)夜蛾（H.zea))、Colaspis 屬 物種（Colaspis spp.)(例如，葡萄肖葉甲（C.brunnea)、稻水象屬物種（Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲（L.oryzophilus))、稻象屬物種（Echinocnemus spp.)(例如，稻象 (E.squamos))、稻鐵甲屬物種（Diclodispa spp.)(例如，水稻鐵甲（D.armigera))、禾谷 負(fù)泥蟲(chóng)屬物種（Oulema spp.)(例如，水稻負(fù)泥蟲(chóng)（O.oryzae))、米象屬物種（Sitophilus spp.)(例如，米象（S. oryzae))、Pachydiplosis 屬物種（例如，稻癭蚊（Ρ· oryzae))、 毛眼水蠅屬物種（Hydrellia spp.)(例如，麥葉毛眼水蠅（H. griseola)或日稻毛眼 水蠅（H. sasakii) )、Chlorops屬物種（例如，稻桿潛蠅（C. oryzae))、根螢葉甲屬物 種（Diabrotica spp.)(例如，玉米根葉甲（D. virgifera virgifera)、北美玉米根葉 甲（D. barberi)、黃瓜十一星葉甲食根亞種（D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米 根葉甲（D. virgifera zeae)、條紋黃瓜葉甲（D.balteata))、桿野螟屬物種（Ostrinia spp.)(例如，玉米螟（0. nubilalis))、地虎屬物種（Agrotis spp.)(例如，小地老虎 (A. ipsilon))、Elasmopalpus 屬物種（例如，南美玉米苗斑螟（E. lignosellus))、梳爪 叩頭蟲(chóng)屬物種（Melanotus spp.)(線蟲(chóng)）、圓頭犀金龜屬物種（Cyclocephala spp.)(例 如，北部偽裝金龜（C. borealis)或南部偽裝金龜（C. immaculata))、弧麗金龜屬物種 (Popillia spp.)(例如，日本弧麗金龜（Ρ· japonica))、跳甲屬物種（Chaetocnema spp.) (例如，玉米銅色跳甲（C.pulicaria))、龍頸象屬物種（Sphenophorus spp.)(例如，玉米 長(zhǎng)_象（S.maidis))、纟益管姆屬物種（Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米姆（R.maidis))、 圓尾姆屬物種（Anuraphis spp.)(例如，玉米根姆（A. maidiradicis))、黑幢屬物種 (Melanoplus spp.)(例如，紅足黑幢（M. femurrubrum))、特異黑幢（M. differentialis) 或迀飛黑幢（Μ· sanguinipes))、種蠅屬物種（Hylemya spp.)(例如，種蠅（Η· platura))、 呆薊馬屬物種（Anaphothrips spp.)(例如，黃呆薊馬（A. obscrurus))、火蟻屬物種 (Solenopsis spp.)(例如，盜蟻（S.milesta))、葉螨屬物種（Tetranychus spp.)(例如， 二點(diǎn)葉螨（T. urticae)、朱砂葉螨（T. cinnabarinus))、鈴夜蛾屬物種（例如，谷實(shí)夜蛾或 棉鈴蟲(chóng)（H. atmigera))、Pectinophora 屬物種（例如，紅鈴麥蛾（P. gossypiella))、金剛 鉆屬物種（Earias spp.)(例如，翠紋鉆夜蛾（E. vittella))、實(shí)夜蛾屬物種（Heliothis spp.)(例如，煙芽夜蛾（H.virescens))、花象屬物種（Anthonomus spp.)(例如，墨西哥 棉鈴象（A. grandis))、Pseudatomoscelis 屬物種（例如，棉偽斑腿盲蝽（P. seriatus))、 結(jié)翅粉風(fēng)屬物種（Trialeurodes spp.)(例如，結(jié)翅粉風(fēng)（T. abutiloneus)、溫室粉風(fēng) (T.vaporariorum))、小粉風(fēng)屬物種（Bemisia spp.)(例如，銀葉粉風(fēng)（B.argentifolii))、 蟲(chóng)牙屬物種（Aphis spp.)(例如，棉姆（A. gossypii))、草盲蝽屬物種（Lygus spp.)(例如，美 國(guó)牧草盲疇（L. lineolaris)或美洲牧草盲疇（L. hesperus))、美洲疇屬物種（Euschistus spp.)(例如，斑點(diǎn)美洲蝽（Ε· conspersus))、Chlorochroa屬物種（例如，賽氏蝽（C. sayi))、 綠蝽屬物種（Nezara spp.)(例如，稻綠蝽（N.viridula))、薊馬屬物種（Thrips spp.)(例 如，煙薊馬（T. tabaci))、花薊馬屬物種（Frankliniella spp.)(例如，煙褐薊馬（F. fusca) 或西方花薊馬（F.occidentalis))、馬鈴薯葉甲屬物種（Leptinotarsa spp.)(例如，馬鈴 薯葉甲（L.decemlineata)、偽馬鈴薯葉甲（L. juncta)或胡頹子葉煎葉甲（L.texana))、 合爪負(fù)泥蟲(chóng)屬物種（Lema spp.)(例如，三條負(fù)泥蟲(chóng)（L. tri 1 ineata))、煎跳甲屬物種 (Epitrix spp.)(例如，美國(guó)馬鈴薯跳甲（E.cucumeris)、煙草跳甲（E.hirtipennis)或塊 莖跳甲（E.tuberis))、豆芫菁屬物種（Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁（E.vittata))、 猿葉甲屬物種（Phaedon spp.)(例如，辣根猿葉甲（P. cochleariae))、食植瓢蟲(chóng)屬物種 (Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢蟲(chóng)（E.varivetis))、Acheta屬物種（例如，居屋艾 幡（A. domesticus))、綠小葉蝶屬物種（Empoasca spp.)(例如，蠶豆小綠葉蝶（E. fabae))、 瘤蟲(chóng)牙屬（Myzus spp.)(例如，桃姆（M.persicae))、薯個(gè)木風(fēng)屬物種（Paratrioza spp.) (例如，馬鈴薯木風(fēng)（P.cockerelli))、寬胸金針蟲(chóng)屬物種（Conoderus spp.)(例如，南部 馬鈴薯線蟲(chóng)（C.falli)或煙草線蟲(chóng)（C.vespertinus))、麥蛾屬物種（Phthorimaea spp.) (例如，馬鈴薯麥蛾（P. operculella))、長(zhǎng)管姆屬物種（Macrosiphum spp.)(例如，大 戟長(zhǎng)管姆（M. euphorbiae))、Thyanta 屬物種（例如，紅肩蝽象（T. pallidovirens))、 麥蛾屬物種（Phthorimaea spp.)(例如，馬鈴薯麥蛾（P. operculella))、鈴夜蛾屬物 種（例如，谷實(shí)夜蛾）、Keiferia屬物種（例如，番煎蠢蛾（K. lycopersicella))、金針 蟲(chóng)屬物種（Limonius spp.)(線蟲(chóng)）、Manduca屬物種（例如，煙草天蛾（M. sexta)或 番煎天蛾（M.quinquemaculata))、斑潛蠅屬物種（Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潛 蠅（L.sativae)、三葉草斑潛蠅（L.trifolli)或南美斑潛蠅（L.huidobrensis))、果蠅 屬物種（Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蠅（D.melanogaster)、D.yakuba、擬暗果蠅 (D.pseudoobscura)或擬果M (D.simulans))、步甲屬物種（Carabus spp.)(例如，粒步甲 (C.granulatus))、搖蚊屬物種（Chironomus spp.)(例如，搖蚊（C.tentanus))、柿首蚤屬 物種（Ctenocephalides spp.)(例如，貓柿首蚤（C.felis))、非耳_象屬物種（Diaprepes spp.)(例如，根象鼻蟲(chóng)（D. abbreviatus))、齒小蠢屬物種（Ips spp.)(例如，美松齒小蠢 (I.pini))、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)(例如，赤擬谷盜（T.castaneum))、舌蠅屬物 種（Glossina spp.)(例如，刺舌蠅（G.morsitans))、按蚊屬物種（Anopheles spp.)(例如， 甘比亞按蚊（A. gambiae))、鈴夜蛾屬（例如，棉鈴蟲(chóng)（H. armigera))、Acyrthosiphon屬物種 (例如，豌豆姆（A. pisum))、蜜蜂屬物種（Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂（A. melifera))、 Homalodisca屬物種（例如，琉璃葉蝶（H.coagulate))、伊蚊屬物種（Aedes spp.)(例 如，埃及斑紋（Ae. aegypti))、蠶蛾屬物種（Bombyx spp.)(例如，家蠶（B. mori))、飛蟲(chóng)皇 屬物種（Locusta spp.)(例如，飛幢（L.migratoria))、牛蜱屬物種（Boophilus spp.) (例如，微小牛蜱（B. microplus))、Acanthoscurria屬物種（例如，紅毛巧克力捕鳥(niǎo)蛛 (A. gomesiana))、甲蠊屬物種（Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊（D. punctata))、袖 蝶屬物種（Heliconius spp.)(例如，瓦氏袖蝶（H.erato)或詩(shī)神袖蝶（H.melpomene))、象 蟲(chóng)屬物種（Curculio spp.)(例如，歐洲櫟象（C. glandium))、Plutella屬物種（例如，菜 蛾（P. xylostella))、鈍眼蜱屬物種（Amblyomma spp.)(例如，彩飾花蜱（A. variegatum))、 豐乍香屬物種（Anteraea spp.)(例如，天香（A.yamamai))和阿蚊屬物種（Armigeres spp.) (例如，騷擾阿蚊（A.subalbatus));
[0033] (2)能夠侵?jǐn)_或損傷人和/或動(dòng)物的昆蟲(chóng)，例如但不限于具有可見(jiàn)于半翅目和 某些膜翅目以及雙翅目（如蚊子、蜜蜂、黃蜂、虱、蚤和螞蟻）的刺吸式口器的昆蟲(chóng)以及 蛛形綱動(dòng)物（Arachnidae)(如蜱和螨）：蜱螨目（蜱和螨），例如代表性的科：軟蜱科 (Argasidae)、皮刺螨科（Dermanyssidae)、硬蜱科（Ixodidae)、癢螨科（Psoroptidae)或 擠螨科（Sarcoptidae)，以及代表性的物種：花蜱屬物種（Amblyomma spp.)、暗眼蜱屬物 種（Anocentor spp·)、銳緣蜱屬物種（Argas spp·)、牛蜱屬物種（Boophilus spp·)、姬螯 螨屬物種（Cheyletiella spp·)、足螨屬物種（Chorioptes spp·)、懦形螨屬物種（Demodex spp.)、革蜱屬物種（Dermacentor spp.)、皮刺螨屬物種（Dermanyssus spp.)、血蜱屬物 種（Haemophysalis spp·)、璃眼蜱屬物種（Hyalomma spp·)、硬蜱屬物種（Ixodes spp·)、 Lynxacarus屬物種、中氣門亞目物種（Mesostigmata spp.)、背肛螨屬物種（Notoedres spp.)、鈍緣蜱屬物種（Ornithodoros spp.)、禽刺螨屬物種（Ornithonyssus spp.)、殘_蜱 屬物種（Otobius spp·)、耳癢螨屬物種（Otodectes spp·)、肺刺螨屬物種（Pneumonyssus spp.)、癢螨屬物種（Psoroptes spp.)、扇頭蜱屬物種（Rhipicephalus spp.)、擠螨屬物種 (Sarcoptes spp.)或恙螨屬物種（Trombicula spp.);風(fēng)目（吸咣和叮咬的風(fēng)），例如代表 性物種：牛毛風(fēng)屬物種（Bovicola spp·)、血風(fēng)屬物種（Haematopinus spp·)、顎風(fēng)屬物種 (Linognathus spp.)、雞風(fēng)屬物種（Menopon spp.)、人風(fēng)屬物種（Pediculus spp.)、瘦綿蟲(chóng)牙 屬物種（Pemphigus spp·)、根瘤姆屬物種（Phylloxera spp.)或管風(fēng)屬物種（Solenopotes spp.);雙翅目（蠅），例如代表性的物種：伊蚊屬物種（Aedes spp.)、按蚊屬物種 (Anopheles spp·)、麗蠅屬物種（Calliphora spp·)、金蠅屬物種（Chrysomyia spp·)、斑 蛇屬物種（Chrysops spp·)、錐蠅屬物種（Cochliomyia spp·)、庫(kù)蚊屬物種（Culex spp·)、 庫(kù)蠓屬物種（Culicoides spp·)、黃蠅屬物種（Cuterebra spp·)、皮蠅屬物種（Dermatobia spp·)、胃蠅屬物種（Gastrophilus spp·)、舌蠅屬物種（Glossina spp·)、黑角蠅屬物種 (Haematobia spp.)、麻蛇屬物種（Haematopota spp.)、風(fēng)Μ屬物種（Hippobosca spp.)、皮 蠅屬物種（Hypoderma spp.)、綠蠅屬物種（Lucilia spp.)、角蠅屬物種（Lyperosia spp.)、 蜱蠅屬物種（Melophagus spp·)、狂蠅屬物種（Oestrus spp·)、綠蠅屬物種（Phaenicia spp.)、白蛉屬物種（Phlebotomus spp.)、伏蠅屬物種（Phormia spp.)、麻蠅屬物種 (Sarcophaga spp·)、蚋屬物種（Simulium spp·)、螫蠅屬物種（Stomoxys spp·)、蛇屬物種 (Tabanus spp. )、Tannia屬物種或大蚊屬（Tipula spp.);食毛目（叮咬的風(fēng)），例如代表 性的物種：Damalina屬物種、貓毛風(fēng)屬物種（Felicola spp.)、Heterodoxus屬物種或卩齒毛 風(fēng)屬物種（Trichodectes spp.);蚤目（無(wú)翅昆蟲(chóng)），例如角葉蚤屬物種（Ceratophyllus spp·)、蚤屬物種（Pulex spp.)或客蚤屬物種（Xenopsylla spp.);臭蟲(chóng)科（臭蟲(chóng)），例如代 表性的物種：臭蟲(chóng)屬物種（Cimex spp. )、Tritominae屬物種、Rhodinius屬物種或錐蝽屬物 種（Triatoma spp.)以及
[0034] (3)導(dǎo)致對(duì)基層（substrate)或物品的不利破壞的昆蟲(chóng)，如攻擊食品、種子、木材、 涂料、塑料、衣物等的昆蟲(chóng)。
[0035] (4)與公共健康和衛(wèi)生相關(guān)的昆蟲(chóng)或蛛形綱動(dòng)物，包括住屋昆蟲(chóng)和體外寄生 蟲(chóng)，例如但不限于蠅、葉螨、薊馬、蜱、紅色家禽螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀（包括住屋蟋 蟀）、蠢蟲(chóng)、書(shū)虱、甲蟲(chóng)、蠼螋、蚊子和蚤。更優(yōu)選的靶標(biāo)是蟑螂（蜚蠊目），例如但不限 于小蠊屬物種（Blatella spp.)(例如，德國(guó)小蠊（Blatella germanica)、大蠊屬物種 (Periplaneta spp.)(例如，美洲大臟（Periplaneta americana)和澳洲大臟（Periplaneta australiasiae)、蜚臟屬物種（Blatta spp.)(例如，東方蜚臟（Blatta orientalis))和皮 蠊屬物種（Supella spp.)(例如，長(zhǎng)須蜚蠊（Supella longipalpa))，螞蟻（蟻總科），如但 不限于火蟻屬（Solenopsis spp.)(例如，紅火蟻（Solenopsis invicta))、小家蟻屬物種 (Monomorium spp.)(例如，小家蟻（Monomorium pharaonis))、弓背蟻屬物種（Camponotus spp.)(例如，弓背蟻屬物種（木匠蟻））、毛蟻屬物種（Lasius spp.)(例如，黑毛蟻（lasius niger))、鋪道蟻屬物種（Tetramorium spp.)(例如，鋪道蟻（Tetramorium caespitum))、紅 蟻屬物種（Myrmica spp.)(例如，小紅蟻（Myrmica rubra))、蟻屬物種（Formica spp.)(木 蟻）、舉腹蟻屬物種（Crematogaster spp.)(例如，舉腹蟻（Crematogaster lineolata))、 虹臭蟻屬物種（Iridomyrmex spp.)(例如，阿根廷蟻（Iridomyrmex humilis))、大頭 蟻屬物種（Pheidole spp.)(大頭蟻）和 Dasymutilla 屬物種（例如，Dasymutilla occidentalis (蟻蜂）），白蟻（等翅目和/或白蟻科），例如但不限于丫白蟻屬物種 (Amitermes spp.)(例如佛羅里達(dá)黑翅散白蟻（Amitermes floridensis))、散白蟻屬物 種（Reticulitermes spp.)(例如，黃肢散白蟻（Reticulitermes flavips)、西部散白 蟻（Reticulitermes hesperus))、乳白蟻屬物種（Coptotermes spp.)(例如，臺(tái)灣乳白 蟻（Coptotermes formosanus))、植白蟻屬物種（Incisitermes spp.)(例如，小植白蟻 (Incisitermes minor))、新白蟻屬物種（Neotermes spp.)(例如，森林樹(shù)白蟻（Neotermes connexus))〇
[0036] 受益于本發(fā)明的"敏感生物"包括對(duì)害蟲(chóng)侵害敏感的任何生物。許多不同生物的害 蟲(chóng)，所述生物例如動(dòng)物（如人、家畜（如寵物（如貓、犬等））和牲畜（包括綿羊、奶牛、豬、 雞等））。
[0037] 由此，在本發(fā)明的優(yōu)選但非限制的實(shí)施方案中，所述昆蟲(chóng)或蛛形綱動(dòng)物選自：
[0038] (1)蜱螨目：包括蜱亞目（蜱）的螨類
[0039] (2)蛛形綱：蜘蛛目（蜘蛛）和盲蛛目（盲蜘蛛），實(shí)例包括黑寡婦蜘蛛 (Latrodectus mactans)和掠色隱遁蝴蛛（Loxosceles recluse)
[0040] (3)風(fēng)目：風(fēng)，如體風(fēng)（Pediculus humanus)
[0041] (4)蜚蠊目：蟑螂,包括德國(guó)小蠊、大蠊屬的美洲大蠊和澳洲大蠊、蜚蠊屬的東方 蜚蠊以及皮蠊屬的長(zhǎng)須蜚蠊。最優(yōu)選的靶標(biāo)是德國(guó)小蠊。
[0042] (5)鞘翅目：甲蟲(chóng)，實(shí)例包括長(zhǎng)蠹總科；大小蠹屬物種（Dendroctonus spp.) (Black Turpentine Beetle、南部松小蠹（Southern Pine Beetle)、IPS 雕刻小蠹（IPS Engraver Beetle));地毯甲蟲(chóng)（Carpet Beetles)(圓皮蠹屬物種（Anthrenus spp·)、毛皮 蠹屬物種（Attagenus spp·)) ;01d House Borer(天牛科：家天牛（Hylotrupes bajulus)); 家俱竊蠹（Anobium punctatum);擬谷盜屬物種（面象蟲(chóng)）；谷斑皮蠹（Trogoderma granarium) ；0ryzaephilus sarinamensis (鍋谷盜（Toothed Grain Beetle))等（書(shū)蟲(chóng)）
[0043] (6)革翅目：蠼螋類
[0044] (7)雙翅目：蚊（蚊科）和蠅（短角亞目），實(shí)例是Anophehnae (如按蚊屬物種）和 庫(kù)蚊亞科（如 Aedes fulvus);蛇科如 Tabanus punctifer (馬妮）、Glossina morsitans morsitans (舌蠅）、drain flies (毛艨科）以及有瓣蠅類（Calyptratae)如家蠅（Musca domestica)、肉蠅（麻蠅科）等
[0045] (8)異翅亞目：臭蟲(chóng)，如溫帶臭蟲(chóng)（Cimex lectularius)(床風(fēng)）
[0046] (9)膜翅目：黃蜂（細(xì)腰亞目），包括螞蟻（蟻總科）、蜜蜂（蜜蜂總科）：紅火蟻、 小家蟻、弓背蟻屬物種（木匠蟻）、黑毛蟻、鋪道蟻、小紅蟻、蟻屬物種（木蟻）、舉腹蟻、阿根 廷蟻、大頭蟻屬物種（大頭蟻）和Dasymutilla occidentalis (蟻蜂）等
[0047] (10)等翅目：白蟻，實(shí)例包括佛羅里達(dá)黑翅散白蟻（Amitermes fioridensis)、 黃肢散白蟻、西部散白蟻（R.hesperus)、臺(tái)灣乳白蟻、小植白蟻、森林樹(shù)白蟻（Neotermes connexus))和白蟻科
[0048] (11)鱗翅目：蛾，實(shí)例包括谷蛾科和織蛾科（如衣蛾（Tineola bisselliella))以 及螟蛾科（如紫斑谷螟（Pyralis farinalis))等
[0049] (12)嚙蟲(chóng)目：書(shū)虱（嚙蟲(chóng)目）
[0050] (13)蚤目：蚤，如致癢蚤（Pulex irritans)
[0051] (14)胸喙亞目：蟲(chóng)牙蟲(chóng)（蚜科）
[0052] (15)衣魚(yú)目：蠹蟲(chóng)，實(shí)例是：小灶衣魚(yú)（Thermobia domestica)和衣魚(yú)（Lepisma saccharina)
[0053] 本發(fā)明優(yōu)選的植物病原性昆蟲(chóng)是植物害蟲(chóng)并選自：馬鈴薯葉甲屬物種（例如，馬 鈴薯葉甲、偽馬鈴薯葉甲或胡頹子葉茄葉甲）、褐飛虱屬物種（例如，褐飛虱）、灰飛虱屬 物種（例如，灰飛虱）、黑尾葉蟬屬物種（例如，二點(diǎn)黑尾葉蟬，或黑尾葉蟬，或二條黑尾葉 蟬）、白背飛虱屬物種（例如，白背飛虱）、禾草螟屬物種（例如，二化螟、臺(tái)灣稻螟或稻多麗 螟）、蛀莖夜蛾屬物種（例如，稻蛀莖夜蛾）、蛀禾螟屬物種（例如，白稻螟或三化螟）、根螢 葉甲屬物種（例如，玉米根葉甲、北美玉米根葉甲、黃瓜十一星葉甲食根亞種、墨西哥玉米 根葉甲）、桿野螟屬物種（例如，玉米螟）、呆薊馬屬物種（例如，黃呆薊馬）、Pectinophora 屬物種（例如，紅鈴麥蛾）、實(shí)夜蛾屬物種（例如，煙芽夜蛾）、結(jié)翅粉風(fēng)屬物種（例如，結(jié)翅 粉虱、溫室粉虱）、小粉虱屬物種（例如，銀葉粉虱）、蚜屬物種（例如，棉蚜）、草盲蝽屬物種 (例如，美國(guó)牧草盲蝽或美洲牧草盲蝽）、美洲蝽屬物種（例如，斑點(diǎn)美洲蝽）、Chlorochroa 屬物種（例如，賽氏蝽）、綠蝽屬物種（例如，稻綠蝽）、薊馬屬物種（例如，煙薊馬）、花薊馬 屬物種（例如，煙褐薊馬或西方花薊馬）、瘤蚜屬物種（例如，桃蚜）、長(zhǎng)管蚜屬物種（例如， 大戟長(zhǎng)管蚜）、桿長(zhǎng)蝽屬物種（例如，美洲谷桿長(zhǎng)蝽）、綠蝽屬物種（例如，擬綠蝽）、禾草螟 屬物種（例如，稻桿螟（C. polychrysa))、稻水象屬物種（例如，稻水象甲）、縊管蚜屬物種 (例如，玉米姆）和圓尾姆屬物種（例如，玉米根姆（A.maidiradicis))。
[0054] 根據(jù)一個(gè)更具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法適用于馬鈴薯葉甲屬物種。馬鈴薯葉 甲屬屬于葉甲科或葉甲類。葉甲（如跳甲和玉米根蟲(chóng)）和象甲（如苜蓿葉象甲）是特別重 要的害蟲(chóng)。跳甲包括多種小型食葉甲蟲(chóng)，其以多種草、谷類和草本植物的葉為食。跳甲包括 多個(gè)屬（例如，八1：1：；^3、4口口111：11〇仙、4找〇口丨8七68、0丨8〇115^1^、爺跳甲屬、長(zhǎng)附跳甲屬、潛跳甲 屬（Prodagricomela)、Systena和黃條跳甲屬）。蔬菜黃條跳甲（Phyllotreta cruciferae) (也叫作油菜跳甲（Rape Flea Beetle))是特別重要的害蟲(chóng)。玉米根蟲(chóng)包括葉甲屬的物種 (例如，黃瓜十一星葉甲（D. undecimpunctata undecimpunctata)、黃瓜十一星葉甲食根亞 種、D. longicornis、玉米根葉甲和條紋黃瓜葉甲）。玉米根蟲(chóng)對(duì)玉米和瓜類（curcubit)造 成廣泛破壞。黃瓜i 星葉甲（Western Spotted Cucumber Beetle)是美國(guó)西部的瓜類害 蟲(chóng)。苜蓿葉象甲（亦稱三葉草象甲）屬于葉象屬（紫苜蓿葉象（H. postica)、埃及苜蓿葉象 (H. brunneipennis)、H. nigrirostris、三葉草葉象（H. punctata)和 H. meles)，并被認(rèn)為是 重要的豆類害蟲(chóng)。埃及苜蓿葉象是美國(guó)西部的重要苜蓿害蟲(chóng)。
[0055] 馬鈴薯葉甲屬物種超過(guò)30種。因此，本發(fā)明包括用于防治馬鈴薯葉甲屬物種的 方法，更特別地用于殺死昆蟲(chóng)、或阻止馬鈴薯葉甲屬昆蟲(chóng)發(fā)育或生長(zhǎng)、或者防止昆蟲(chóng)感染 或侵害的方法。本發(fā)明所防治的特定馬鈴薯葉甲屬物種包括馬鈴薯葉甲（Leptinotarsa decemlineata(Say))和偽馬鈴薯葉甲（Leptinotarsa juncta(Say))。
[0056] CPB (Colorado Potato Beetle，馬鈴薯葉甲）對(duì)我們本國(guó)的馬鈴薯、其它栽培和野 生的有塊莖和無(wú)塊莖的馬鈴薯物種（例如，S.demiSSUm(墨西哥馬鈴薯野生種）、富利亞薯 (S.phureja a.o.))以及另一些茄屬植物物種是（嚴(yán)重的）害蟲(chóng)，所述植物物種包括： [0057] (a)作物物種番爺（若干番爺屬物種）、爺子、胡椒（若干辣椒屬物種）、煙草（若 干煙草屬物種，其包括觀賞性植物）和醋栗（酸漿屬物種）；
[0058] (b)雜草/草本植物物種，北美刺龍葵（S. carolinense)、歐白英（S. dulcamara)、 顛茄（顛茄屬物種）、曼陀羅（曼陀羅屬物種）、天仙子（天仙子屬物種）和黃花刺茄 (S.rostratum)〇
[0059] FPB(False Potato Beetle,偽馬鈴薯葉甲）主要發(fā)現(xiàn)于北美刺龍葵上，也發(fā)生在 歐白英、醋栗和酸漿（酸漿屬物種）上。
[0060] 術(shù)語(yǔ)"昆蟲(chóng)"包括所有類型以及所有發(fā)育階段的昆蟲(chóng)，包括卵、幼蟲(chóng)或若蟲(chóng)、蛹和成 蟲(chóng)階段。
[0061] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是馬鈴薯葉甲，所述植物是馬鈴薯、 茄子、番茄、胡椒、煙草、醋栗或者稻、玉米或棉花。
[0062] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是辣根猿葉甲，所述植物是芥菜、大 白菜、蕪菁、羽衣甘藍(lán)或小白菜。
[0063] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是墨西哥豆瓢蟲(chóng)，所述植物是豆類、 菜豆、四季豆、食莢菜豆、利馬豆、綠豆、青豆、牛眼豆、絨毛豆、大豆、豇豆、木豆、三葉草或苜 蓿。
[0064] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是墨西哥棉鈴象，所述植物是棉花。 [0065] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是赤擬谷盜，所述植物以貯藏谷物 的形式，如面粉、谷類、粗粉、餅干、豆類、調(diào)味品、面食、點(diǎn)心粉、干的寵物食品、干花、巧克 力、堅(jiān)果、種子甚至干的博物館標(biāo)本。
[0066] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是桃蚜，所述植物是樹(shù)木如李屬，特 別是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫蘆科的蔬菜作物，其包括但不限于：朝 鮮薊、蘆筍、豆類、甜菜、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉 米、黃瓜、茴香、無(wú)頭甘藍(lán)、大頭菜、蕪菁、茄子、萵苣、芥菜、菜秋葵、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、 胡椒、馬鈴薯、蘿卜、菠菜、南瓜、番茄、蕪菁、豆瓣菜和西瓜；農(nóng)田作物例如但不限于：煙草、 糖用甜菜和向日葵；花作物或其它觀賞性植物。
[0067] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是褐飛虱，所述植物是稻類植物。 [0068] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是二化螟，所述植物是稻類植物、大 麥（bareley)、高粱、玉米、小麥或草。
[0069] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是菜蛾，所述植物是蕓苔屬物種，例 如但不限于卷心菜、大白菜、抱子甘藍(lán)、無(wú)頭甘藍(lán)、油菜籽、嫩莖花椰菜、花椰菜、蕪菁、芥菜 或蘿卜。
[0070] 本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)是居屋艾蟋，所述植物是本文所述 的任何植物或任何有機(jī)體。
[0071] 在本文中，術(shù)語(yǔ)"植物"包括期望被處理從而阻止或降低昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和/或昆蟲(chóng)侵 害的任何植物材料。這包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖材料（如種子、插條、接穗、外植體 等），以及植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物等。所述植物材料應(yīng)當(dāng)表達(dá)RNA分子或者具有表達(dá)RNA分 子的能力，所述RNA分子包含至少一種核苷酸序列，該核苷酸序列是害蟲(chóng)至少一種靶基因 的有義鏈核苷酸序列之至少一部分的RNA互補(bǔ)序列或代表了其RNA等價(jià)物，從而所述RNA 分子通過(guò)植物與害蟲(chóng)的相互作用被害蟲(chóng)攝取，所述RNA分子能夠通過(guò)RNA干擾來(lái)抑制靶基 因或者下調(diào)靶基因的表達(dá)。
[0072] 所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因，例如對(duì)于害蟲(chóng)的生存、生長(zhǎng)、發(fā)育或繁 殖必需的靶基因。本發(fā)明涉及昆蟲(chóng)中可被下調(diào)的任何目的基因（本文可稱作"靶基因"）。
[0073] 術(shù)語(yǔ)"下調(diào)基因表達(dá)"和"抑制基因表達(dá)"可互換使用，其指在靶基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物 和/或mRNA產(chǎn)物水平上可測(cè)量的或可觀察的基因表達(dá)減少或者完全消除可檢測(cè)的基因表 達(dá)。優(yōu)選地，所述下調(diào)不顯著地直接抑制昆蟲(chóng)其它基因的表達(dá)。當(dāng)與正常的基因表達(dá)比較 時(shí)，dsRNA對(duì)基因表達(dá)的下調(diào)效果可計(jì)算為至少為30%、40%、50%、60%，優(yōu)選70%、80%， 或者更優(yōu)選90 %或95 %。取決于靶基因的性質(zhì)，可通過(guò)對(duì)細(xì)胞或整只昆蟲(chóng)進(jìn)行表型分析或 者使用分子技術(shù)測(cè)量mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證昆蟲(chóng)細(xì)胞中基因表達(dá)的下調(diào)或抑制，所 述分子技術(shù)如RNA溶液雜交、PCR、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、使用微列陣監(jiān) 測(cè)基因表達(dá)、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)、We Stern印跡、放射免疫測(cè)定（RIA)、其 它免疫測(cè)定或熒光激活細(xì)胞分析（FACS)。
[0074] "靶基因"基本上可以是由于其干擾昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)或致病性或感染性而期望被抑制 的幾乎任何基因。例如，如果本發(fā)明的方法用于阻止昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和/或侵害，則優(yōu)選地選擇 對(duì)昆蟲(chóng)的生存、生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖必需的靶基因，或者參與昆蟲(chóng)的致病性或感染性的任何基 因，從而對(duì)靶基因的特異性抑制導(dǎo)致致死性表型或者降低或阻止昆蟲(chóng)侵害。
[0075] 根據(jù)一個(gè)非限制性的實(shí)施方案，所述靶基因是當(dāng)使用本發(fā)明的方法下調(diào)或抑制其 表達(dá)時(shí)，昆蟲(chóng)被殺死或者昆蟲(chóng)的繁殖或生長(zhǎng)被阻止或阻滯的那些基因。認(rèn)為這類靶基因是 昆蟲(chóng)生存所必需的，并稱作必需基因。因此，本發(fā)明包括本文所述的方法，其中所述靶基因 是必需基因。
[0076] 根據(jù)另一非限制性的實(shí)施方案，所述靶基因是當(dāng)使用本發(fā)明的方法將其下調(diào)時(shí)， 昆蟲(chóng)的侵害或感染、昆蟲(chóng)造成的破壞和/或昆蟲(chóng)侵害或感染宿主生物和/或?qū)е麓祟惼茐?的能力有所降低。一般地，術(shù)語(yǔ)"侵害"和"感染"始終可互換使用。認(rèn)為這類靶基因參與昆 蟲(chóng)的致病性或感染性。因此，本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述靶基因參與昆蟲(chóng)的致 病性或感染性。選擇后一類型靶基因的優(yōu)勢(shì)在于阻斷了昆蟲(chóng)進(jìn)一步感染植物或植物部分， 并抑制其形成后代。
[0077] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，靶基因是保守基因或昆蟲(chóng)特異性基因。
[0078] 另外，在本發(fā)明的方法中可以使用能夠指導(dǎo)RNAi或RNA介導(dǎo)的基因沉默或者抑制 昆蟲(chóng)靶基因的任何適當(dāng)?shù)碾p鏈RNA片段。
[0079] 在另一實(shí)施方案中，選擇實(shí)質(zhì)性參與害蟲(chóng)（如昆蟲(chóng)）生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的基因。示 例性的基因包括但不限于核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)亞基和β -外被體基因（如CHD3基因）。核 糖體蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是參與蛋白質(zhì)生物合成的核糖體的結(jié)構(gòu)組分，并且是胞 質(zhì)小核糖體亞基的組分，核糖體蛋白如L9和L19是參與蛋白質(zhì)生物合成的核糖體的結(jié)構(gòu)組 分，并且定位于核糖體。秀麗隱桿線蟲(chóng)中的β-外被體基因編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)形成 膜泡外衣的多聚復(fù)合體的亞基。已在多種生物中發(fā)現(xiàn)類似的序列，如擬南芥（Arabidopsis thaliana)、黑腹果妮（Drosophila melanogaster)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。在多種生物中發(fā)現(xiàn)相關(guān)的序列，如馬鈴薯葉甲、辣根猿葉甲、墨西哥豆瓢蟲(chóng)、 墨西哥棉鈴象、赤擬谷盜、桃蚜、褐飛虱、二化螟、菜蛾和居屋艾蟋。
[0080] 本發(fā)明使用的其它靶基因可包括例如在生存、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和感染性中扮演重 要角色的基因。這些靶基因包括例如持家基因、轉(zhuǎn)錄因子和害蟲(chóng)特異性基因或者線蟲(chóng)或果 蠅中致死性敲除突變。本發(fā)明使用的靶基因還可以是來(lái)自其它生物的基因，例如來(lái)自昆蟲(chóng) 或蛛形綱動(dòng)物（例如，馬鈴薯葉甲屬物種、猿葉甲屬物種、食植瓢蟲(chóng)屬物種、花象屬物種、擬 谷盜屬物種、瘤姆屬物種、褐飛風(fēng)屬物種、禾草螟屬物種、Plutella屬物種或Acheta屬物 種）的基因。
[0081] 優(yōu)選的靶基因包括表1A中指定的基因以及來(lái)自其它靶生物（如來(lái)自其它害蟲(chóng)） 的直向同源基因。
[0082] 在本發(fā)明的方法中，使用dsRNA抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)或干擾昆蟲(chóng)的致病性或感染性。
[0083] 因此，本發(fā)明涉及包含退火互補(bǔ)鏈的分離的雙鏈RNA，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含與 昆蟲(chóng)靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。所述靶基因可以是本文所述 的任意靶基因，或者其發(fā)揮同樣功能的一部分。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含退火互補(bǔ)鏈的分離的雙鏈RNA，其中一條 退火互補(bǔ)鏈包含與昆蟲(chóng)靶基因核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述靶基 因包含選自以下的序列：
[0085] (i)與如下表示的任意序列具有至少75%-致性的序列：SEQ ID N01，3,5,7,9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,1160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050, 2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085, 2090,2095,2100,2102,2104, 2106， 2108.2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互補(bǔ)序列，以及
[0086] (ii)包含以下任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列：SEQ ID N01、3、5、7、9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075, 2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104, 2106， 2108.2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476或2481，或其互補(bǔ)序列，或者，其中所述昆蟲(chóng)靶基因是包含以 下任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的昆蟲(chóng)直系同源物：SEQ ID N049至158、275至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384至2460或其互補(bǔ)序列。
[0087] 取決于用于測(cè)量基因沉默的測(cè)定，與已用對(duì)照dsRNA處理的害蟲(chóng)相比，生長(zhǎng)抑制 可定量為大于約5%、10%，更優(yōu)選約20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%，最優(yōu)選約 90%、95%或約 99%。
[0088] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了分離的雙鏈RNA，其中至少一條所述退火互 補(bǔ)鏈包含如下表示的任意序列之至少一種核苷酸序列的RNA等價(jià)物：SEQ ID N01、3、5、 7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198， 203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483， 488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，566,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1662,1684,1666,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055, 2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090, 2095,2100,2102,2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476或2481，或者其中至少一條所述退火互補(bǔ)鏈包含其長(zhǎng)度為至 少17個(gè)堿基對(duì)、優(yōu)選其長(zhǎng)度為至少18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個(gè)堿基對(duì)的RNA 等價(jià)物的片段。
[0089] 如果本發(fā)明的方法用于在宿主細(xì)胞或宿主生物中或者對(duì)宿主細(xì)胞或宿主生物特 異性控制特定昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)或侵害，則優(yōu)選所述雙鏈RNA不與任何宿主基因具有任何顯著的 同源性，或者至少不與宿主的任意必需基因具有任何顯著的同源性。在這種情況下，優(yōu)選所 述雙鏈RNA與宿主細(xì)胞任意基因的核酸序列一致性低于30%，更優(yōu)選低于20%，更優(yōu)選低 于10%，甚至更優(yōu)選低于5%。序列一致性百分比應(yīng)當(dāng)在所述雙鏈RNA的全長(zhǎng)區(qū)域上計(jì)算。 如果可獲得宿主生物的基因組序列數(shù)據(jù)，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)生物信息學(xué)工具來(lái)相互校驗(yàn)與所 述雙鏈RNA的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述dsRNA與宿主序列之間不存在超過(guò)21 個(gè)連續(xù)核苷酸的序列一致性，即在這種情況下，優(yōu)選宿主生物的基因組中不存在所述dsRNA 的21個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。在另一實(shí)施方案中，所述dsRNA與宿主物種任意核苷酸序列之間在24 個(gè)連續(xù)核苷酸上的序列一致性低于約10%或低于約12. 5%。
[0090] 所述雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含對(duì)應(yīng)于待下調(diào)之靶基 因的靶核苷酸序列的核苷酸序列。所述雙鏈RNA的另一條鏈能夠與上述第一條鏈進(jìn)行堿基 配對(duì)。
[0091] 所述昆蟲(chóng)靶基因的"靶區(qū)域"或"靶核苷酸序列"可以是基因的任何適當(dāng)?shù)膮^(qū)域或 核苷酸序列。所述靶區(qū)域應(yīng)包含靶基因的至少17、至少18或至少19個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選 至少20或至少21個(gè)核苷酸，并且更優(yōu)選所述靶基因的至少22、23或24個(gè)核苷酸。
[0092] 優(yōu)選（至少部分的）所述雙鏈RNA與昆蟲(chóng)靶基因的靶區(qū)域具有100%的序列一致 性。然而應(yīng)當(dāng)理解的是，在所述雙鏈區(qū)域的全長(zhǎng)上具有100 %序列一致性不是功能性RNA抑 制的必要條件。還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于靶序列來(lái)說(shuō)帶有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列對(duì)RNA抑 制是有效的。術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)于"或"與……互補(bǔ)"在本文可互換使用，并且當(dāng)這些術(shù)語(yǔ)用于指所 述雙鏈RNA和靶基因的靶區(qū)域之間的序列對(duì)應(yīng)性時(shí)，應(yīng)解釋為并非絕對(duì)需要100%的序列 一致性。然而，所述雙鏈RNA和靶區(qū)域之間的序列一致性百分比通常為至少80%或85% - 致，優(yōu)選至少90%、95%、96%-致，或者更優(yōu)選至少97%、98%-致，以及更優(yōu)選至少99% 一致。當(dāng)兩條核酸鏈的至少85%堿基配對(duì)時(shí)，它們是"基本上互補(bǔ)的"。
[0093] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"涉及DNA-DNA互補(bǔ)性和DNA-RNA互補(bǔ)性。類似地，術(shù)語(yǔ) "RNA等價(jià)物"實(shí)際上指在DNA序列中堿基"T"可以被通常存在于核糖核酸中的對(duì)應(yīng)堿基 "U"所替代。
[0094] 盡管所述dsRNA包含對(duì)應(yīng)于靶基因中靶區(qū)域的序列，然而整個(gè)dsRNA都對(duì)應(yīng)于靶 區(qū)域的序列卻不是絕對(duì)必需的。例如，所述dsRNA可在靶標(biāo)特異性序列的側(cè)翼包含短的非 靶區(qū)域，只要該序列不實(shí)質(zhì)性影響該dsRNA的RNA抑制性能即可。
[0095] 所述dsRNA可包含一個(gè)或多個(gè)替代堿基從而優(yōu)化RNAi的性能。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，如何依次改變所述dsRNA的每個(gè)堿基并測(cè)試所得dsRNA的活性（例如，在適當(dāng)?shù)?體外測(cè)試系統(tǒng)中）從而優(yōu)化給定dsRNA的性能是顯而易見(jiàn)的。
[0096] 所述dsRNA還可以包含DNA堿基、非天然的堿基或者糖-磷酸主鏈的非天然主鏈 連接或修飾，從而例如提高保藏期間的穩(wěn)定性或者增強(qiáng)對(duì)核酸酶降解的抗性。
[0097] 先前已有報(bào)道，對(duì)于有效的基因沉默來(lái)說(shuō)，形成約21bp的小干擾RNA(siRNA)是理 想的。然而，在 申請(qǐng)人:的應(yīng)用中已顯示，dsRNA的最小長(zhǎng)度優(yōu)選至少約80-100bp以便被某 些害蟲(chóng)有效攝取。有跡象表明，在無(wú)脊椎動(dòng)物（如自由生活的秀麗隱桿線蟲(chóng)或植物寄生性 的南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita))中，這些較長(zhǎng)的片段在基因沉默中更加有效， 這可能由于無(wú)脊椎動(dòng)物攝取這些較長(zhǎng)的dsRNA更為有效所致。
[0098] 最近還提出，與常規(guī)的21聚體（21-mer)siRNA相比，由27聚體平端組成的合成 RNA雙鏈體或者具有29bp的莖和2-nt3'突出端的短發(fā)夾（short hairpin，sh)RNA組成的 合成RNA雙鏈體是RNA干擾更有力的誘導(dǎo)物。因此，基于上述已鑒定靶標(biāo)、并且為27聚體 平端RNA分子或者具有29bp的莖和2-nt3'突出端的短發(fā)夾RNA分子的分子也包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。
[0099] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA片段（或區(qū)域）本身的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少 17bp，長(zhǎng)度優(yōu)選為18或19bp，更優(yōu)選至少20bp，長(zhǎng)度更優(yōu)選至少21bp，或至少22bp，或至少 23bp，或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp。"雙鏈RNA片段"或"雙鏈RNA區(qū)域"是指對(duì)應(yīng) 于（部分）靶基因的雙鏈RNA小實(shí)體。
[0100] 通常，所述雙鏈RNA優(yōu)選為約17-1500bp，更優(yōu)選約80-1000bp，最優(yōu)選約17-27bp 或約 80-250bp ;如雙鏈 RNA 區(qū)域約為 17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、 27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、 600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp 或 1500bp。
[0101] 所述雙鏈RNA的長(zhǎng)度上限可取決于i)昆蟲(chóng)攝取該dsRNA的需要，以及ii)該dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)部加工成指導(dǎo)RNAi的片段的需要。所選長(zhǎng)度還可受RNA合成方法以及向細(xì)胞遞 送RNA的模式的影響。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中待使用的雙鏈RNA的長(zhǎng)度小于10, 000bp，更優(yōu) 選1000bp或更小，更優(yōu)選500bp或更小，更優(yōu)選300bp或更小，更優(yōu)選100bp或更小。對(duì)于 任何給定的祀基因和昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，所述dsRNA進(jìn)行有效抑制的最佳長(zhǎng)度可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
[0102] 所述雙鏈RNA可以是完全或部分雙鏈的。部分雙鏈RNA可在雙鏈部分的一端或兩 端包含短的單鏈突出端，只要所述RNA仍能被昆蟲(chóng)攝取并指導(dǎo)RNAi即可。所述雙鏈RNA還 可包含內(nèi)部的非互補(bǔ)區(qū)。
[0103] 本發(fā)明的方法包括向同一昆蟲(chóng)同時(shí)或依次提供兩種或更多種不同的雙鏈RNA或 RNA構(gòu)建體，從而實(shí)現(xiàn)下調(diào)或抑制多種靶基因或者更有效地抑制單種靶基因。
[0104] 或者，通過(guò)提供命中多種靶序列的一種雙鏈RNA來(lái)命中多個(gè)靶標(biāo)，并且多于一個(gè) 拷貝的對(duì)應(yīng)于靶基因的雙鏈RNA片段的存在可更有效地抑制單個(gè)靶標(biāo)。因此，在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA構(gòu)建體包含多個(gè)dsRNA區(qū)域，每個(gè)dsRNA區(qū)域的至少一條鏈 包含與昆蟲(chóng)靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，所述RNA 構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)域可以與同樣或不同的靶基因互補(bǔ)，和/或所述dsRNA區(qū)域可以與來(lái) 自相同或不同昆蟲(chóng)物種的靶標(biāo)互補(bǔ)。
[0105] 術(shù)語(yǔ)"命中"是指所述dsRNA的至少一條鏈與靶基因或核苷酸序列互補(bǔ)，并由此可 與之結(jié)合。
[0106] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA區(qū)域包含與靶基因互補(bǔ)的核苷酸序列的多個(gè)拷 貝?；蛘?，所述dsRNA命中同一靶基因的多于一種靶序列。因此，本發(fā)明包括分離的雙鏈 RNA構(gòu)建體，其包含與昆蟲(chóng)靶標(biāo)的核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列的至少兩個(gè) 拷貝。
[0107] 在本文中，本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"多種（個(gè)）"意指至少2種（個(gè)）、至少3種（個(gè)）、至少 4種（個(gè)）、至少5種（個(gè)）、至少6種（個(gè)）等。
[0108] "另一靶基因"或"至少另一種靶基因"是指例如第二、第三或第四種靶基因等。
[0109] 本發(fā)明的方法開(kāi)發(fā)并使用了命中多于一種上述靶標(biāo)的dsRNA或者針對(duì)上述不同 靶標(biāo)的不同dsRNA的組合。
[0110] 因此，本發(fā)明涉及分離的雙鏈RNA構(gòu)建體，其包含如下表示的至少一種核苷酸序 列之RNA等價(jià)物的至少兩個(gè)拷貝：
[0111] SEQ ID 吣1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49至158，1599，160-163，168，173， 178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,2249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586， 591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799， 801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702， 1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095， 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368， 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或者其長(zhǎng)度為至少 17 個(gè)堿基對(duì)、 優(yōu)選其長(zhǎng)度為至少18、19、20或21個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選至少22、23或24個(gè)堿基對(duì)之片段的 RNA等價(jià)物的至少兩個(gè)拷貝，。優(yōu)選地，所述雙鏈RNA包含核苷酸序列SEQ ID N0159或160 的RNA等價(jià)物，或者其長(zhǎng)度為至少17、優(yōu)選至少18、19、20或21、更優(yōu)選至少22、23或24個(gè) 堿基對(duì)的片段。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的雙鏈RNA構(gòu)建體，其包含核苷酸序列 SEQ ID N0159或160的RNA等價(jià)物的至少兩個(gè)拷貝。
[0112] 因此，本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一 條退火互補(bǔ)鏈包含與昆蟲(chóng)靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)并包含彼此獨(dú)立選擇 的至少兩種核苷酸序列的RNA等價(jià)物的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述dsRNA包含獨(dú) 立選自如下表示的序列之至少兩種、優(yōu)選至少三種、四種或五種核苷酸序列的RNA等價(jià)物 ：
[0113] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586， 591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799， 801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702， 1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095， 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368， 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或者其長(zhǎng)度為至少 17 個(gè)堿基對(duì)， 優(yōu)選至少18、19、20或21、更優(yōu)選至少22、23或24個(gè)堿基對(duì)的片段。
[0114] 所述至少兩種核苷酸序列可以來(lái)源于本文所述的靶基因。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案，所述dsRNA命中對(duì)昆蟲(chóng)生存、生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖必需的至少一種靶基因，并命中參與上 文所述的致病性或感染性的至少一種基因?；蛘?，所述dsRNA命中同類的多種基因，例如所 述dsRNA命中至少兩種必需基因或者至少兩種參與同樣細(xì)胞功能的基因。根據(jù)又一實(shí)施方 案，所述dsRNA命中至少兩種靶基因，所述靶基因參與不同的細(xì)胞功能。例如，所述dsRNA 命中參與蛋白質(zhì)合成（例如核糖體亞基）、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞核mRNA剪接或者參與表 1A中所述功能之一的兩種或更多種基因。
[0115] 優(yōu)選地，本發(fā)明延伸至本文所述的方法，其中所述昆蟲(chóng)靶基因包含選自以下的序 列：
[0116] (i)與如下表示的任意序列具有至少75%-致性的序列：SEQ ID N01，3,5,7， 9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互補(bǔ)序列，以及
[0117] (ii)包含以下任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列：SEQ ID N01、3、5、7、9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互補(bǔ)序列，
[0118] 或者其中所述昆蟲(chóng)靶基因是包含以下任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 昆蟲(chóng)直系同源物：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460 或其互補(bǔ)序列。
[0119] 所述雙鏈RNA中的dsRNA區(qū)域（或片段）可如下進(jìn)行組合：
[0120] a)當(dāng)組合那些靶向單一靶基因的多個(gè)dsRNA區(qū)域時(shí)，在RNA構(gòu)建體中可以以原始 的順序（即，該區(qū)域在靶基因中出現(xiàn)的順序）對(duì)它們進(jìn)行組合，
[0121] b)或者，可以不管所述片段的原始順序，將它們隨機(jī)地或有目的地以任意順序組 合成雙鏈RNA構(gòu)建體，
[0122] c)或者，一種片段可以在所述dsRNA構(gòu)建體中重復(fù)若干次，例如1?10次，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 次，或者
[0123] d)所述dsRNA區(qū)域（靶向一種或不同的靶基因）可以以有義或反義的方向進(jìn)行組 合。
[0124] 另外，所述待組合的靶基因可選自以下種類的一種或多種基因：
[0125] e)上述"必需的"基因或"致病性基因"包括對(duì)于一種或多種靶昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)關(guān)鍵性的 基因，當(dāng)其被沉默時(shí)導(dǎo)致致死的或嚴(yán)重的（例如，進(jìn)食、繁殖、生長(zhǎng)）表型。選擇強(qiáng)致死性靶 基因?qū)е掠行У腞NAi效果。在本發(fā)明的RNA構(gòu)建體中，靶向相同或不同的（非常有效的） 致死基因的多個(gè)dsRNA區(qū)域可以進(jìn)行組合，以進(jìn)一步增強(qiáng)RNAi作用在防治害蟲(chóng)中的效力、 功效或速度。
[0126] f) "弱"基因包括在本文所述的細(xì)胞途徑之一中具有特別感興趣的功能、但當(dāng)其被 單獨(dú)沉默時(shí)導(dǎo)致弱表型效果的靶基因。在本發(fā)明的RNA構(gòu)建體中，靶向一種或不同弱基因 的多個(gè)dsRNA區(qū)域可以進(jìn)行組合從而獲得較強(qiáng)的RNAi效果。
[0127] g) "昆蟲(chóng)特異性"基因包括在非昆蟲(chóng)生物中沒(méi)有顯著同源性對(duì)應(yīng)物的基因，其可以 通過(guò)生物信息同源性檢索來(lái)確定，例如通過(guò)BLAST檢索。選擇昆蟲(chóng)特異性靶基因?qū)е挛锓N 特異性的RNAi作用，而在非靶生物中沒(méi)有作用或沒(méi)有顯著的（不利）作用。
[0128] h) "保守基因"包括在靶生物和非靶生物之間（在氨基酸水平上）保守的基因。 為了降低對(duì)非靶物種的可能的作用，分析這些有效但保守的基因，并選擇這些保守基因可 變區(qū)域的靶序列作為RNA構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)域的靶標(biāo)。此時(shí)，在核酸序列水平評(píng)估保守 性。因此，這些可變區(qū)域包括保守靶基因中最不保守的部分（核酸序列水平）。
[0129] i) "保守途徑"基因包括參與相同生物學(xué)途徑或細(xì)胞過(guò)程的基因，或者包括在不同 昆蟲(chóng)物種中具有相同功能的基因，其導(dǎo)致特異性且有力的RNAi作用并更有效地防治昆蟲(chóng)；
[0130] j)或者，本發(fā)明的RNA構(gòu)建體靶向來(lái)自不同生物學(xué)途徑的多種基因，其導(dǎo)致廣泛 的細(xì)胞RNAi作用并更有效地防治害蟲(chóng)。
[0131] 根據(jù)本發(fā)明，所有雙鏈RNA區(qū)域包含與本文所述任何靶基因之至少一部分核苷酸 序列互補(bǔ)的至少一條鏈。然而，如果一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域包含與本文所述任一靶基因的核苷 酸序列一部分互補(bǔ)的至少一條鏈，則另一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域可包含與任何其它昆蟲(chóng)靶基因 (包括已知靶基因）的一部分互補(bǔ)的至少一條鏈。
[0132] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了本文所述的分離的雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體，其 還包含至少一種另外的序列以及任選地包含接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另一序列選自 ： (i)有利于大規(guī)模生產(chǎn)所述dsRNA構(gòu)建體的序列；（ii)提高或降低所述dsRNA穩(wěn)定性的序 列；（iii)允許結(jié)合蛋白質(zhì)或其它分子從而有利于昆蟲(chóng)攝取所述RNA構(gòu)建體的序列；（iv) 適配子序列，其結(jié)合昆蟲(chóng)表面上或細(xì)胞質(zhì)中的受體或分子，從而有利于昆蟲(chóng)的攝取、胞吞和 /或轉(zhuǎn)胞吞；或者（v)催化dsRNA區(qū)域加工的其它序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭是條 件性自切割RNA序列，優(yōu)選pH敏感性接頭或疏水敏感性接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接 頭是內(nèi)含子。
[0133] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA構(gòu)建體的多個(gè)dsRNA區(qū)域通過(guò)一個(gè)或多個(gè)接頭 進(jìn)行連接。在另一實(shí)施方案中，所述接頭存在于所述RNA構(gòu)建體中使得所述dsRNA區(qū)域與 另一目的區(qū)域分隔的位點(diǎn)。本發(fā)明提供了用于所述dsRNA構(gòu)建體的不同類型接頭。
[0134] 在另一實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA構(gòu)建體的多個(gè)dsRNA區(qū)域不使用接頭而進(jìn)行連 接。
[0135] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述接頭可用于隔開(kāi)害蟲(chóng)中多個(gè)較小的dsRNA 區(qū)域。有利的是，在該情形中所述接頭序列可以在特定的條件下促使將長(zhǎng)的dsRNA拆分為 較小的dsRNA區(qū)域，這導(dǎo)致在這些條件下釋放單獨(dú)的dsRNA區(qū)域，并且這些較小的dsRNA 區(qū)域?qū)е赂行У鼗虺聊?。適當(dāng)?shù)臈l件性自切割接頭的實(shí)例是在高pH條件下自切割的 RNA 序列。這些 RNA 序列的適當(dāng)實(shí)例由 Borda 等（Nucleic Acids Res. 2003Mayl5;31(10): 2595-600)描述，該文獻(xiàn)通過(guò)參考并入本文中。所述序列源自錘頭核酶HH16的催化核心。
[0136] 在本發(fā)明的另一方面，接頭定位于所述RNA構(gòu)建體中使得所述dsRNA區(qū)域與例如 另一目的序列分隔的位點(diǎn)，所述另一目的序列優(yōu)選地向所述RNA構(gòu)建體提供某種額外的功 能。
[0137] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的dsRNA構(gòu)建體包含適配子從而有利于 昆蟲(chóng)攝取該dsRNA。設(shè)計(jì)所述適配子使之結(jié)合昆蟲(chóng)攝取的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)可來(lái)源于昆蟲(chóng) 或植物。適配子的一個(gè)具體實(shí)例是結(jié)合跨膜蛋白（例如，昆蟲(chóng)的跨膜蛋白）的適配子?；?者，所述適配子可以結(jié)合昆蟲(chóng)攝取的（植物）代謝物或營(yíng)養(yǎng)物。
[0138] 或者，所述接頭在內(nèi)體中進(jìn)行自切割。這在本發(fā)明的構(gòu)建體通過(guò)胞吞作用或轉(zhuǎn)胞 吞作用被昆蟲(chóng)攝取并因此在昆蟲(chóng)的內(nèi)體中被區(qū)室化時(shí)可能是有利的。所述內(nèi)體可具有低的 pH環(huán)境，導(dǎo)致所述接頭被切害|]。
[0139] 當(dāng)通過(guò)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)從一個(gè)細(xì)胞向另一細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，例如當(dāng)穿過(guò)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的細(xì)胞壁 時(shí)，上述在疏水條件中自切割的接頭對(duì)于本發(fā)明的dsRNA構(gòu)建體尤其有用。
[0140] 內(nèi)含子也可用作接頭。本文使用的"內(nèi)含子"可以是信使RNA的任何非編碼RNA序 列。用于本發(fā)明構(gòu)建體的適當(dāng)?shù)木唧w內(nèi)含子序列為⑴富含U(35-45%) ; (2)平均長(zhǎng)度為 100bp (在約50和約500bp之間變化），可隨機(jī)選擇其堿基對(duì)或者可以基于已知的內(nèi)含子序 列；（3)在5'端以-AG :GT-或-CG :GT-起始，和/或⑷在其3'端具有-AG :GC-或-AG : AA。
[0141] 約1個(gè)堿基對(duì)至約10, 000個(gè)堿基對(duì)的非互補(bǔ)RNA序列也可用作接頭。
[0142] 不希望拘泥于任何特定的理論或機(jī)制，認(rèn)為昆蟲(chóng)從其鄰近的環(huán)境攝取長(zhǎng)的雙鏈 RNA。雙鏈RNA被攝取進(jìn)入腸道并轉(zhuǎn)移至腸上皮細(xì)胞，然后通過(guò)內(nèi)源核酸內(nèi)切酶的作用在細(xì) 胞內(nèi)加工成為短的雙鏈RNA (稱為小干擾RNA(siRNA))。然后，所得的siRNA通過(guò)形成多組 分的RNA酶復(fù)合體（稱為RISC或RNA干擾性沉默復(fù)合體）來(lái)介導(dǎo)RNAi。
[0143] 為了實(shí)現(xiàn)在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)下調(diào)靶基因，加至細(xì)胞壁外部的雙鏈RNA可以是可被攝取 進(jìn)入細(xì)胞然后在細(xì)胞內(nèi)加工成siRNA從而介導(dǎo)RNAi的任何dsRNA或dsRNA構(gòu)建體，或者加 至細(xì)胞外部的RNA本身可以是可被攝取進(jìn)入細(xì)胞從而指導(dǎo)RNAi的siRNA。
[0144] siRNA通常是短的雙鏈RNA，其長(zhǎng)度范圍為19?25個(gè)堿基對(duì)，或20?24個(gè)堿基 對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用對(duì)應(yīng)于待下調(diào)靶基因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、 24或25個(gè)堿基對(duì)，尤其是21或22個(gè)堿基對(duì)。然而，本發(fā)明不意在限于這樣的siRNA的用 途。
[0145] siRNA可以在雙鏈部分側(cè)翼的一端或兩端包含單鏈突出端。在一個(gè)特別優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述siRNA可包含3'突出的核苷酸，優(yōu)選兩個(gè)3'突出的胸苷（dTdT)或尿苷 (UU)。如果緊接所述dsRNA雙鏈部分所包含序列的上游靶基因序列是AA，則在siRNA中可 包含3'TT或UU突出端。這使得所述siRNA中的TT或UU突出端與靶基因雜交。盡管所述 siRNA的另一端也可包含3' TT或UU突出端，然而所述siRNA雙鏈部分所包含序列的下游 靶序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA嵌合體形式的siRNA也涵蓋在內(nèi)。這些 嵌合體包括：例如，包含具有3'DNA堿基突出端（例如，dTdT)的雙鏈RNA的siRNA (如上所 述），以及其中一個(gè)或多個(gè)RNA堿基（或核糖核苷酸）或者甚至整條鏈上所有核糖核苷酸被 替換為DNA堿基（或脫氧核糖核苷酸）的多核苷酸形式的雙鏈RNA。
[0146] 所述dsRNA可由通過(guò)（非共價(jià)）堿基配對(duì)退火到一起的兩條單獨(dú)的（有義和反義） RNA鏈形成?；蛘?，所述dsRNA可具有折回的莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述dsRNA的兩條退 火鏈?zhǔn)枪矁r(jià)連接的。在該實(shí)施方案中，所述dsRNA的有義鏈和反義鏈由部分自我互補(bǔ)的單 個(gè)多核苷酸分子的不同區(qū)域形成。如果所述dsRNA欲通過(guò)體內(nèi)表達(dá)（例如在如下所述的宿 主細(xì)胞或生物中）或通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行合成，則具有該結(jié)構(gòu)的RNA是方便的。除了不應(yīng)當(dāng) 破壞所述分子的雙鏈部分介導(dǎo)RNAi的能力以外，連接所述兩條RNA鏈的"環(huán)"的確切性質(zhì) 和序列對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)通常是不重要的。用于RNAi中的"發(fā)夾"或"莖-環(huán)"RNA的特征通 常是本領(lǐng)域已知的（參見(jiàn)，例如CSIR0名下的W099/53050,其內(nèi)容通過(guò)參考并入本文中）。 在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，所述環(huán)結(jié)構(gòu)可包含接頭序列或如上所述的其它序列。
[0147] 所述雙鏈RNA或構(gòu)建體可以通過(guò)本身已知的方式進(jìn)行制備。例如，可以使用本領(lǐng) 域公知的化學(xué)或酶促RNA合成技術(shù)在體外合成雙鏈RNA。在一個(gè)方法中，可以分別合成兩 條單獨(dú)的RNA鏈，然后退火從而形成雙鏈。在另一實(shí)施方案中，可以在宿主細(xì)胞或生物中從 適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體通過(guò)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)來(lái)合成雙鏈RNA或構(gòu)建體。以下將進(jìn)一步詳細(xì)地討論該方 法。
[0148] 昆蟲(chóng)接觸的所述雙鏈RNA的量要能夠?qū)崿F(xiàn)特異性下調(diào)所述一種或多種靶基因。所 述RNA可以以每個(gè)細(xì)胞遞送至少一拷貝的量被引入。然而，在某些實(shí)施方案中，較高劑量 (例如，每個(gè)細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個(gè)拷貝）的雙鏈1?^可得到更有效地抑制。對(duì) 于任意給定的昆蟲(chóng)基因靶標(biāo)來(lái)說(shuō)，可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定有效抑制的最佳dsRNA量。
[0149] 所述昆蟲(chóng)可以以允許昆蟲(chóng)直接攝取所述雙鏈RNA的任何適當(dāng)?shù)姆绞脚c所述雙鏈 RNA接觸。例如，所述昆蟲(chóng)可以接觸純凈或基本純凈形式的所述雙鏈RNA，例如含有所述 dsRNA的水溶液。在該實(shí)施方案中，可以僅用含有所述雙鏈RNA的水溶液將所述昆蟲(chóng)"浸 濕"。在另一實(shí)施方案中，可通過(guò)用包含所述雙鏈RNA的液體組合物向昆蟲(chóng)噴灑從而使所述 昆蟲(chóng)與所述雙鏈RNA進(jìn)行接觸。
[0150] 或者，所述雙鏈RNA可以與所述昆蟲(chóng)的食物組分（如哺乳動(dòng)物病原性昆蟲(chóng)的食物 組分）連接，從而增強(qiáng)該昆蟲(chóng)對(duì)所述dsRNA的攝取。
[0151] 還可以將所述雙鏈RNA摻入所述昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，或者被該昆蟲(chóng)侵?jǐn)_的物品 或基層中（或其上），或者浸入對(duì)昆蟲(chóng)侵害敏感的基層或物品中。
[0152] 根據(jù)另一實(shí)施方案，所述dsRNA表達(dá)在細(xì)菌或真菌的細(xì)胞中，并且所述細(xì)菌或真 菌的細(xì)胞被所述昆蟲(chóng)攝取或攝食。
[0153] 如實(shí)施例中舉例說(shuō)明的，可以改造細(xì)菌從而產(chǎn)生本發(fā)明的任何dsRNA或dsRNA構(gòu) 建體。這些細(xì)菌可被昆蟲(chóng)攝食。一旦被攝取，所述dsRNA可以起始RNAi應(yīng)答，其導(dǎo)致靶mRNA 降解并削弱或殺死攝食昆蟲(chóng)。
[0154] 因此，在更具體的實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體通過(guò)原核的（如細(xì)菌） 或真核的（如酵母）宿主細(xì)胞或宿主生物來(lái)表達(dá)。根據(jù)該實(shí)施方案，可以使用能夠表達(dá) dsRNA或dsRNA構(gòu)建體的任何細(xì)菌或酵母細(xì)胞。所述細(xì)菌選自革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌，例如但不限于埃希氏菌屬物種（Escherichia spp.)(例如，大腸桿菌（E.coli)、芽 孢桿菌屬物種（Bacillus spp.)(例如，蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis))、根瘤菌屬物 種（Rhizobium spp·)、乳桿菌屬物種（Lactobacillus spp·)、乳球菌屬物種（Lactococcus spp.)等。所述酵母可選自酵母屬物種（Saccharomyces spp.)等。
[0155] 某些細(xì)菌與宿主植物具有非常緊密的相互作用，例如但不限于共生的根瘤菌與豆 科植物（Legminosea)(例如，大豆）。這樣的重組細(xì)菌可以與種子混合（例如，作為涂層） 并用作土壤改良劑。
[0156] 因此，本發(fā)明還包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。 本發(fā)明還包括原核細(xì)胞（例如但不限于革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞）和真核細(xì)胞 (例如但不限于酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞）。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞或藻類細(xì) 胞。
[0157] 在另一些實(shí)施方案中，所述昆蟲(chóng)可以與本文進(jìn)一步描述的組合物接觸。除了所述 dsRNA或DNA，所述組合物還可包含賦形劑、稀釋劑或載體。這樣的組合物的優(yōu)選特征在以 下更詳細(xì)地討論。
[0158] 或者，可以將產(chǎn)生dsRNA的細(xì)菌或酵母細(xì)胞直接噴灑到作物上。
[0159] 因此，如上所述，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的RNA構(gòu)建體和/或DNA構(gòu)建體和/或表 達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌或酵母的細(xì)胞，也可以是例如病毒?？?以使用特異性感染昆蟲(chóng)的病毒（如桿狀病毒）。這確保了對(duì)哺乳動(dòng)物（尤其是人類）的安 全性，因?yàn)樗霾《静粫?huì)感染哺乳動(dòng)物，所以不會(huì)發(fā)生不希望的RNAi作用。
[0160] 優(yōu)選地，所述細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞在用作生物殺蟲(chóng)劑前應(yīng)被滅活，例如當(dāng)該試劑 用于人類或其它哺乳動(dòng)物可能接觸的環(huán)境（如廚房）時(shí)?？赏ㄟ^(guò)任何方法實(shí)現(xiàn)滅活，如通 過(guò)熱處理、苯酚或甲醛處理，或通過(guò)機(jī)械處理。
[0161] 在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，可利用滅活的病毒（如適當(dāng)修飾的桿狀病毒）來(lái)遞 送本發(fā)明的dsRNA區(qū)域用于介導(dǎo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的RNAi。
[0162] 可能的應(yīng)用包括集中的溫室培育（例如從GM0角度而言意義較小的作物）以及更 廣泛的農(nóng)田作物（如大豆）。
[0163] 該方法具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，例如：因?yàn)椴淮嬖诳赡艿闹参锼拗髑懈睿╠icing)的問(wèn)題， 所以它允許將大的dsRNA片段遞送進(jìn)入攝食害蟲(chóng)的腸內(nèi)腔；使用細(xì)菌作為殺蟲(chóng)劑不涉及產(chǎn) 生轉(zhuǎn)基因作物，尤其是對(duì)于某些難以獲得轉(zhuǎn)基因變體的作物；存在廣泛和靈活的應(yīng)用，因?yàn)?可以在同一塊農(nóng)田上同時(shí)處理不同的作物和/或可以同時(shí)靶向不同的害蟲(chóng)，例如通過(guò)組合 那些產(chǎn)生不同dsRNA的不同細(xì)菌。
[0164] 本發(fā)明的另一方面是本文公開(kāi)的昆蟲(chóng)靶基因的靶核苷酸序列。所述靶核苷酸序列 對(duì)于設(shè)計(jì)本發(fā)明的dsRNA構(gòu)建體特別重要。這些靶核苷酸序列的長(zhǎng)度優(yōu)選至少17、優(yōu)選至 少18、19、20或21、更優(yōu)選至少22、23或24個(gè)核苷酸。優(yōu)選靶核苷酸序列的非限制性實(shí)例 在實(shí)施例中給出。
[0165] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了編碼本文所述的雙鏈RNA或雙鏈RNA構(gòu)建體的 分離的核苷酸序列。
[0166] 根據(jù)一個(gè)更具體的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及由如下表示的任意序列組成的分離的核 酸序列：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040、 1161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460,或者其至少 17、優(yōu)選至少 18、19、20 或21、更優(yōu)選至少22、23或24個(gè)核苷酸的片段。
[0167] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以找到這些靶基因的同源物，并且這些同源物也用 于本發(fā)明的方法。
[0168] 如果蛋白質(zhì)或核苷酸序列顯示"顯著"水平的序列相似性或更優(yōu)選地序列一致 性，則它們可能是同源的。真正同源的序列通過(guò)從共同的祖先基因趨異從而具有相關(guān)性。 序列同源物可以有兩種類型：（i)當(dāng)同源物存在于不同物種中時(shí)，它們被稱為直系同源物 (orthologue)。例如，小鼠和人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。（ii)旁系同源物是在一 個(gè)物種內(nèi)部的同源基因，例如小鼠中的α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物（paralogue)。
[0169] 優(yōu)選的同源物是包含與選自如下表示的序列具有至少約85 %或87. 5 %，更優(yōu)選 約90%，更優(yōu)選至少約95%以及最優(yōu)選至少約99%-致性的序列的基因 ：SEQ ID N01，3， 5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198， 203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483， 488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101, 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互補(bǔ)序列。用于確定序列一致性的方法是本領(lǐng)域 常規(guī)的，其包括使用 Blast 軟件和 EMBOSS 軟件（The European Molecular Biology Open Software Suite(2000), Rice, P.Longden, I.and Bleasby, A.Trends in Geneticsl6, (6) PP276-277)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"一致性"是指序列之間在核苷酸水平上的關(guān)系。通過(guò)在比 較窗中對(duì)最優(yōu)比對(duì)的序列（例如，兩條或更多）進(jìn)行比較來(lái)確定"一致性百分比"，其中所述 比較窗中的序列部分與最優(yōu)序列比對(duì)的參考序列相比可包含插入或缺失。所述參考序列不 包含插入或缺失。所述參考窗選自至少10個(gè)連續(xù)核苷酸至約50、約100或者至約150個(gè)核 苷酸，優(yōu)選約50?150個(gè)核苷酸。然后，通過(guò)測(cè)定所述窗中的序列之間一致的核苷酸數(shù)目 并將該數(shù)目除以所述窗中的核苷酸數(shù)并乘以100來(lái)計(jì)算"一致性百分比"。
[0170] 另一些同源物是包含如下表示的任意序列的等位基因 ：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll， 13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208， 215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493， 498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607， 609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873， 878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073， 1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103， 1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607， 1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682， 1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045， 2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108, 2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460， 2461，2466，2471，2476或2481。另一些優(yōu)選的同源物是與包含如下表示的任意序列的基因 相比包含至少一種單核苷酸多態(tài)性（SNP)的基因 ：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19， 21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225， 230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513， 515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767， 768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888， 890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359,2364, 2366, 2368, 2370, 2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481。
[0171] 根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序列的基因的 昆蟲(chóng)直系同源物的靶基因 ：SEQ ID 吣1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49 至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253， 255.257.259.275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788， 793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481。舉例來(lái)說(shuō)，直 系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N049至123、275至434、533至562、 621 至 738、813 至 852、908 至 1010U161 至 1437U730 至 1987、2120 至 2290 以及 2384 至 2438,或其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個(gè)核苷酸的片段。表4中給出了包 含本發(fā)明所述序列之一的至少17bp片段的昆蟲(chóng)或蛛形綱直系同源物基因或序列的非限制 性列表。
[0172] 根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序列的基因的 線蟲(chóng)直系同源物的靶基因：1、3、5, 7,9,11，13,15,17,19, 21，23,49 至 158,159,160-163， 168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257， 259.275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091， 1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577， 1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652， 1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700， 1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090， 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366， 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 248。舉例來(lái)說(shuō)，線蟲(chóng)直系同源物 可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N0124至135、435至446、563至564、739至 751、853、854、1011 至 1025U438 至 1473U988 至 200U2291 至 2298、2439 或 2440,或者其 至少17、18、19、20或21個(gè)核苷酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明因此包括本文所述的用于 控制線蟲(chóng)在生物中生長(zhǎng)的任何方法，或者用于防止線蟲(chóng)侵害對(duì)線蟲(chóng)感染敏感的生物的任何 方法，所述方法包括將線蟲(chóng)細(xì)胞與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其 中一條退火互補(bǔ)鏈包含與祀基因的核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其包含如 下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21個(gè)核苷酸的片段 ：SEQIDN0124至135、435 至 446、563 至 564、739 至 751、853、854、1011 至 1025U438 至 1473U988 至 200U2291 至 2298、2439或2440,所述雙鏈RNA被線蟲(chóng)攝取并因此控制生長(zhǎng)或防止侵害。表5中給出了 包含本發(fā)明的序列之一的至少17bp片段的線蟲(chóng)直系同源物基因或序列的非限制性列表。
[0173] 根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明包括那些包含如下表不的任意核苷酸序列的基因的 真菌直系同源物的靶基因：1、3、5、7、9,11，13,15,17,19, 21，23,49 至 158,159,160-163， 168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257， 259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，566,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091， 1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577， 1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652， 1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700， 1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090， 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366， 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481。舉例來(lái)說(shuō)，真菌直系同源 物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N0136至158、447至472、565至575、752至 767、855 至 862U026 至 1040U475 至 157U2002 至 2039、2299 至 2338、2441 至 2460,或者 其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個(gè)核苷酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明因 此包括本文所述的用于控制真菌在細(xì)胞或生物上的生長(zhǎng)、或者用于防止真菌侵害對(duì)真菌感 染敏感的細(xì)胞或生物的任何方法，該方法包括將真菌細(xì)胞與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈 RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含與祀基因的核苷酸序列之至少一部分互 補(bǔ)的核苷酸序列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21個(gè)核苷酸的片段： SEQ ID N0136 至 158、447 至 472、565 至 575、752 至 767、855 至 862U026 至 1040、1475 至 157U2002至2039、2299至2338、2441至2460,所述雙鏈RNA被真菌攝取并因此控制生長(zhǎng) 或防止侵害。表6中給出了包含本發(fā)明的序列之一的至少17bp片段的真菌直系同源物基 因或序列的非限制性列表。
[0174] 術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"涉及較寬的范圍，其指能夠?qū)崿F(xiàn)與其有效連接之序列的表達(dá)的調(diào) 節(jié)性核酸。
[0175] 上述術(shù)語(yǔ)包括激活或增強(qiáng)核酸表達(dá)的啟動(dòng)子和核酸或其合成的融合分子或衍生 物，稱為激活子或增強(qiáng)子。本文使用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"是指在"啟動(dòng)子"序列與目的核酸 分子之間的功能性連接，使得所述"啟動(dòng)子"序列能夠起始核酸分子轉(zhuǎn)錄從而產(chǎn)生適當(dāng)?shù)?dsRNA〇
[0176] 優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列是啟動(dòng)子，其可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子是誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子，從而嚴(yán)格控制所述RNA分子的表達(dá)。優(yōu)選可通過(guò)使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑（如 IPTG)來(lái)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子?；蛘?，將編碼所述RNA分子的轉(zhuǎn)基因置于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的控制 下。優(yōu)選地，所使用的任何啟動(dòng)子將指導(dǎo)所述RNA強(qiáng)烈表達(dá)。所使用啟動(dòng)子的性質(zhì)可部分 地由用于產(chǎn)生所述RNA的特定宿主細(xì)胞來(lái)決定。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列包含噬 菌體啟動(dòng)子，如T7、T3、SV40或SP6啟動(dòng)子，最優(yōu)選T7啟動(dòng)子。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案 中，使用用于表達(dá)RNA的另一些啟動(dòng)子，其包括但不限于來(lái)自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II 或RNA聚合酶III的啟動(dòng)子。也可以酌情使用來(lái)源于酵母或病毒基因的其它啟動(dòng)子。
[0177] 在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列包含啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子選自公知的 tac、trc和lac啟動(dòng)子。適用于細(xì)菌宿主的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括β -內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子、大腸 桿菌λ噬菌體PL和PR啟動(dòng)子以及大腸桿菌半乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子和堿性磷酸 酶啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明還包括用于得到本發(fā)明的任何RNA分子或RNA構(gòu)建體的方法。該 方法包括以下步驟：在允許所述核酸或重組（DNA)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄從而產(chǎn)生下調(diào)目的靶基因的 RNA (當(dāng)所述宿主細(xì)胞被靶生物攝食時(shí)，或者當(dāng)宿主細(xì)胞或從其來(lái)源的提取物被靶生物攝取 時(shí)）的條件下，將本發(fā)明的分離的核酸或重組（DNA)構(gòu)建體引入（例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或 注射）本發(fā)明的宿主細(xì)胞中。
[0178] 任選地，也可以將一種或多種轉(zhuǎn)錄終止序列或"終止子"引入本發(fā)明的重組構(gòu)建體 中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄終止序列"包括轉(zhuǎn)錄單元末端的控制序列，其發(fā)出初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3'加工和 多聚腺苷酸化作用以及轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)。所述轉(zhuǎn)錄終止序列用于防止轉(zhuǎn)錄的連讀，從而所 述RNA分子在宿主細(xì)胞中或者由宿主細(xì)胞正確地產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述終止子包 括T7、T3、SV40或SP6終止子，優(yōu)選T7終止子。也可以酌情使用來(lái)源于酵母或病毒基因的 其它終止子。
[0179] 可以將另外的調(diào)節(jié)元件（如轉(zhuǎn)錄或翻譯的增強(qiáng)子）引入所述表達(dá)構(gòu)建體中。
[0180] 本發(fā)明的重組構(gòu)建體還可包含在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起 點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是表達(dá)構(gòu)建體需要作為細(xì)胞中的附加型遺傳元件（例如，質(zhì)?；蛘沉７肿樱?在細(xì)菌細(xì)胞中維持的情形。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colElori。
[0181] 所述重組構(gòu)建體任選地可包含選擇性標(biāo)記基因。本文使用的術(shù)語(yǔ)"選擇性標(biāo)記基 因"包括賦予細(xì)胞一種表型的任何基因，該基因在所述細(xì)胞中表達(dá)從而有利于鑒定和/或選 擇用本發(fā)明的重組（表達(dá)）構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記的實(shí)例包括抗氨 芐青霉素的基因（Ampr)、抗四環(huán)素的基因（Ter)、抗卡那霉素的基因（Kanr)、抗膦絲菌素的 基因和抗氯霉素的基因（CAT)。另一些適當(dāng)?shù)臉?biāo)記基因提供了代謝性狀，例如manA。還可 使用可見(jiàn)的標(biāo)記基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶（GUS)、螢光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。
[0182] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，使用可用于表達(dá)dsRNA的另一些啟動(dòng)子，其包括 但不限于來(lái)自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚 合酶的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子通常用于體外產(chǎn)生dsRNA，然后將所述dsRNA包含在殺蟲(chóng)劑 (antiinsecticidal agent)中，例如在殺蟲(chóng)劑液體、噴霧劑或粉末中。
[0183] 因此，本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生本發(fā)明的任何雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體的方法。該方 法包括以下步驟：
[0184] a.將本發(fā)明的分離的核酸或重組DNA構(gòu)建體與無(wú)細(xì)胞組分接觸；或者
[0185] b.將本發(fā)明的分離的核酸或重組DNA構(gòu)建體引入（例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或注射） 細(xì)胞，
[0186] 以上在允許所述核酸或重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄從而產(chǎn)生所述dsRNA或RNA構(gòu)建體的 條件下進(jìn)行。
[0187] 任選地，本發(fā)明的重組構(gòu)建體中還可以引入一種或多種轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄 終止序列"包括轉(zhuǎn)錄單元末端的控制序列，其發(fā)出初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3'加工和多聚腺苷酸化作 用以及轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)?？蓪⒘硪恍┱{(diào)節(jié)元件（如轉(zhuǎn)錄或翻譯的增強(qiáng)子）引入所述表達(dá)構(gòu) 建體。
[0188] 本發(fā)明的重組構(gòu)建體還可包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起 點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是表達(dá)構(gòu)建體需要作為細(xì)胞中的附加型遺傳元件（例如，質(zhì)?；蛘沉７肿樱?在細(xì)菌細(xì)胞中維持。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于Π -ori和colElori。
[0189] 所述重組構(gòu)建體任選地可包含選擇性標(biāo)記基因。本文使用的術(shù)語(yǔ)"選擇性標(biāo)記基 因"包括賦予細(xì)胞以表型的任何基因，該基因在所述細(xì)胞中表達(dá)從而有利于鑒定和/或選擇 經(jīng)本發(fā)明的重組（表達(dá)）構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記的實(shí)例包括抗氨芐 青霉素的基因（Ampr)、抗四環(huán)素的基因（Ter)、抗卡那霉素的基因（Kanr)、抗膦絲菌素的基 因和抗氯霉素的基因（CAT)。另一些適當(dāng)?shù)臉?biāo)記基因提供了代謝性狀，例如manA。還可使 用可見(jiàn)的標(biāo)記基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶（GUS)、熒光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。
[0190] 本發(fā)明涉及用于阻止昆蟲(chóng)在植物上生長(zhǎng)或用于防止昆蟲(chóng)侵害植物的方法。根據(jù) 本發(fā)明的方法待處理的植物包括選自以下的植物：苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆筍、鱷梨、香 蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、蓖麻、胡蘿卜、木薯、花椰菜、 谷類、芹菜、櫻桃、柑桔、克萊門氏小柑橘（clemintine)、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、 桉樹(shù)、無(wú)花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、亜、檸檬、萊姆酸橙、松樹(shù)、玉米、芒 果、瓜、小米、蘑菇、燕麥（nut aot)、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹(shù)、番木瓜、歐芹、 豌豆、桃、花生、豌豆（peat)、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿 卜、油菜籽、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、黃豆（soy)、大豆（soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘 蔗、向日葵、紅薯、橘子、茶、煙草、番茄、藤本植物、西瓜、小麥、山藥或西葫蘆；優(yōu)選馬鈴薯、 茄子、番爺、胡椒、煙草、醋栗、稻米或棉花植物），或者種子或塊莖（例如，苜蓿、蘋果、杏、朝 鮮薊、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、蓖麻、胡 蘿卜、木薯、花椰菜、谷類、芹菜、櫻桃、柑桔、克萊門氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、茄子、 菊苣、桉樹(shù)、無(wú)花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、稱猴桃、萵苣、·、梓檬、萊姆酸橙、松樹(shù)、玉 米、芒果、瓜、小米、蘑燕、燕麥（nut aot)、菜秋葵、橙、觀賞性植物或花或樹(shù)、番木瓜、歐療、 豌豆、桃、花生、豌豆（peat)、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿 卜、油菜籽、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、大豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、 橘子、茶、煙草、番茄、藤本植物、西瓜、小麥、山藥或西葫蘆。
[0191] 所述靶生物攝?。▋?yōu)選攝食）靶向RNA的量要實(shí)現(xiàn)特異性下調(diào)一種或多種靶基 因。所述RNA可以以每個(gè)細(xì)胞遞送至少一拷貝的量在宿主細(xì)胞中表達(dá)。然而，在某些實(shí)施 方案中，較高劑量（例如，每個(gè)靶生物細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個(gè)拷貝）的雙鏈1?^ 可得到更有效的抑制。對(duì)于任意給定的靶基因和靶生物來(lái)說(shuō)，可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定有效 抑制的靶標(biāo)RNA分子的最佳量。
[0192] 所述靶生物可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞脚c表達(dá)所述RNA分子的宿主細(xì)胞接觸，從而允 許靶生物攝食。優(yōu)選地，表達(dá)所述dsRNA的宿主細(xì)胞可以與所述靶生物的食物組分連接，從 而增強(qiáng)該靶生物對(duì)所述dsRNA進(jìn)行攝取。還可以將表達(dá)所述dsRNA的宿主細(xì)胞引入所述靶 生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，或者被害蟲(chóng)生物侵?jǐn)_的物品或基層中（或其上），或者浸入對(duì)害蟲(chóng)生 物侵害敏感的基層或物品中。
[0193] 在可替代的實(shí)施方案中，可使用源自表達(dá)所述RNA分子的宿主細(xì)胞的適當(dāng)提取物 來(lái)實(shí)現(xiàn)下調(diào)靶生物中的靶基因。此時(shí)，所述提取物可以通過(guò)裂解表達(dá)所述RNA分子的宿主 細(xì)胞的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)產(chǎn)生。例如，可以使用如超聲處理、弗氏壓碎（French press)、凍 融和溶菌酶處理的技術(shù)（參見(jiàn) Sambrook and Russell-Molecular Cloning A laboratory manual-third edition以及表15-4中提供的參考文獻(xiàn)）來(lái)制備宿主細(xì)胞粗提物（裂解 物）?？梢宰们閷?duì)該提取物進(jìn)行進(jìn)一步純化，只要所述提取物介導(dǎo)靶基因表達(dá)的靶向下調(diào)的 能力不受不利影響即可。例如可以使用親和純化。向所述提取物添加某些成分以防止RNA 分子降解可能也是合適的。例如，可以向源自表達(dá)RNA的宿主細(xì)胞的提取物添加 RNA酶抑 制劑。在一個(gè)實(shí)例中，所述靶生物可以接觸純凈或基本純凈形式的表達(dá)RNA的宿主細(xì)胞，例 如含有所述細(xì)胞提取物的水溶液。在該實(shí)施方案中，可以簡(jiǎn)單地用含有所述宿主細(xì)胞提取 物的水溶液將所述靶生物（尤其是害蟲(chóng)生物，如昆蟲(chóng)）"浸濕"。在另一實(shí)施方案中，可通過(guò) 用包含所述細(xì)胞提取物的液體組合物向所述靶生物噴灑從而使所述靶生物與所述表達(dá)RNA 分子的宿主細(xì)胞進(jìn)行接觸。
[0194] 如果使用本發(fā)明的方法來(lái)特異性控制特定害蟲(chóng)的生長(zhǎng)或侵害，則優(yōu)選宿主細(xì)胞中 表達(dá)的RNA不與非害蟲(chóng)生物的基因具有任何顯著的同源性，尤其是不與非害蟲(chóng)生物的任何 必需基因具有任何顯著的同源性。因此，所述非害蟲(chóng)生物通常是對(duì)害蟲(chóng)侵害敏感的生物，為 此根據(jù)本發(fā)明的方法保護(hù)所述非害蟲(chóng)生物免受所述害蟲(chóng)侵害。因此，例如，非害蟲(chóng)物種可包 括植物或哺乳動(dòng)物物種。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物物種為人類。所述非靶物種還可包括除了 人以外的動(dòng)物，其可以暴露于所述保護(hù)免受侵害的生物或基層。實(shí)例包括鳥(niǎo)類（其可以以 被保護(hù)的植物為食）以及牲畜和家畜（如貓、犬、馬、牛、雞、豬、綿羊等）。在這種情況下， 優(yōu)選所述dsRNA與敏感生物或非靶生物的任一基因的核酸序列一致性低于30%，更優(yōu)選低 于20 %，更優(yōu)選低于10 %，甚至更優(yōu)選低于5 %。序列一致性百分比應(yīng)當(dāng)在所述靶標(biāo)RNA的 全長(zhǎng)區(qū)域上來(lái)計(jì)算。如果可獲得本發(fā)明待保護(hù)生物或任一非靶生物的基因組序列數(shù)據(jù)，則 可以使用標(biāo)準(zhǔn)生物信息學(xué)工具來(lái)相互校驗(yàn)與所述靶標(biāo)RNA的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述RNA分子與非害蟲(chóng)生物的基因之間不存在21個(gè)連續(xù)核苷酸上的序列一致性，即在 這種情況下，優(yōu)選所述非害蟲(chóng)生物的基因組中不存在所述RNA的21個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一 實(shí)施方案中，所述RNA與非害蟲(chóng)（敏感的）物種的任一核苷酸序列之間在24個(gè)連續(xù)核苷酸 上的序列一致性低于約10%或低于約12. 5%。特別地，可以特別注意非害蟲(chóng)物種的直向同 源基因，因?yàn)樗龊οx(chóng)生物的必需基因?？沙蔀楸景l(fā)明的方法的靶標(biāo)。因此，在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述RNA分子與非害蟲(chóng)物種直向同源基因的對(duì)應(yīng)核苷酸序列具有低于12. 5%的序列 一致性。
[0195] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于控制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和/或防止或降低昆蟲(chóng)侵害的 組合物，該組合物包含至少一種雙鏈RNA，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條 退火互補(bǔ)鏈包含與昆蟲(chóng)靶基因的核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉 及包含本文所述的至少一種核苷酸序列或至少一種重組DNA構(gòu)建體的組合物。本發(fā)明還涉 及包含至少一種細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的組合物，所述細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞表達(dá)本文所述的 至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構(gòu)建體，或者表達(dá)本文所述的至少一種核苷酸序列或重組DNA 構(gòu)建體。任選地，所述組合物還包含至少一種適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑或稀釋劑。所述靶基因可 以是本文所述的任一靶基因。優(yōu)選地，所述昆蟲(chóng)靶基因是昆蟲(chóng)生存、生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖所必 需的。
[0196] 另一方面，本發(fā)明涉及如上所述的組合物，其中所述昆蟲(chóng)靶基因包含與選自如 下表示的的任意序列具有至少75 %，優(yōu)選至少80 %、85 %、90 %，更優(yōu)選至少95 %、98 % 或99%的一致性的序列：SEQIDN01，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49 至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249， 251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517， 519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773， 778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892， 894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476， 2481或2486,或其互補(bǔ)序列，或者其中所述昆蟲(chóng)靶基因是包含如下表示的任意序列之至 少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的昆蟲(chóng)直系同源物：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21， 23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230， 240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883， 888,890,892,894,896,908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090,2095, 2100, 2102, 2104, 2106,2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466， 2471，2476, 2481或2486,或其互補(bǔ)序列。
[0197] 本發(fā)明還涉及組合物，其包含至少一種雙鏈RNA、至少一種雙鏈RNA構(gòu)建體、至少 一種核苷酸序列、至少一種重組DNA構(gòu)建體和/或至少一種表達(dá)本發(fā)明的dsRNA的宿主細(xì) 胞（例如，細(xì)菌細(xì)胞或酵母），或者編碼本發(fā)明的dsRNA的病毒，任選地還包含至少一種適當(dāng) 的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0198] 所述組合物可以采用向昆蟲(chóng)應(yīng)用的任何適當(dāng)?shù)奈锢硇问健＠?，所述組合物可以 采用固體形式（如粉劑、丸劑或餌劑）、液體形式（如，噴霧劑）或凝膠形式。
[0199] 根據(jù)非常優(yōu)選的實(shí)施方案，所述組合物采用適于昆蟲(chóng)攝食的形式。
[0200] 所述組合物可包含另外的組分，所述組分作用于在組合物長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間穩(wěn)定所述 dsRNA和/或防止dsRNA降解。
[0201] 所述組合物還可包含增強(qiáng)或促進(jìn)昆蟲(chóng)攝取所述dsRNA的組分。這些可包括例如通 常促進(jìn)RNA攝取進(jìn)入細(xì)胞的化學(xué)試劑，例如lipofectamin (脂轉(zhuǎn)染胺）等。
[0202] 所述組合物還可包含在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間保持所述宿主細(xì)胞生存力的組分。
[0203] 所述組合物可采取向昆蟲(chóng)、基層、細(xì)胞（例如，植物細(xì)胞）或者被昆蟲(chóng)感染的或?qū)?昆蟲(chóng)侵害敏感的生物應(yīng)用的任何適當(dāng)?shù)奈锢硇问健?br> [0204] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以采用噴霧劑的形式。因此，使用者可以直接用 該組合物噴灑昆蟲(chóng)或基層。
[0205] 因此，本發(fā)明涉及噴霧劑，其包含含有至少一種細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的組合物，所 述細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞表達(dá)本文所述的至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構(gòu)建體，或表達(dá)本文 所述的至少一種核苷酸序列或重組DNA構(gòu)建體。更特別地，本發(fā)明涉及如上定義的噴霧劑， 其中所述細(xì)菌細(xì)胞包含如下表示的任意序列之至少一種序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll， 13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208， 215,220,225,230,240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099， 1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597， 1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672， 1677.1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039， 2040,2045, 2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080, 2085,2090,2095,2100,2102,2104， 2106, 2108, 2120 至 2338,2339, 2344, 2349, 2354, 2359,2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至2460，2461，2466，2471，2476、2481或2486，或其至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。優(yōu)選地，所 述噴霧劑包含至少一種如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21， 23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230， 240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883， 888,890,892,894,896,908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090, 2095,2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466， 2471，2476、2481或2486,或其至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。
[0206] 本發(fā)明還涉及噴霧劑，其包含本文所述的至少一種組合物或者包含至少一種宿主 細(xì)胞，還包含至少一種佐劑以及任選地至少一種表面活性劑。
[0207] 殺蟲(chóng)劑的有效性可取決于所述噴霧劑應(yīng)用的有效性。佐劑可以減少或消除噴霧劑 應(yīng)用的許多問(wèn)題，所述問(wèn)題與殺蟲(chóng)劑的穩(wěn)定性、溶解度、不相容性、懸浮、泡沫形成、飄移、蒸 發(fā)、揮發(fā)、降解、粘附、滲透、表面張力和覆蓋范圍有關(guān)。將佐劑設(shè)計(jì)成實(shí)現(xiàn)特定的功能，包括 潤(rùn)濕、分散（spread)、粘著、降低蒸發(fā)、降低揮發(fā)、緩沖、乳化、散布（disperse)、降低噴霧劑 飄移以及減少泡沫形成。沒(méi)有一種佐劑可以實(shí)現(xiàn)所有這些功能，然而常?？梢詫⒉煌南?容性佐劑進(jìn)行組合來(lái)同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種功能。這些化學(xué)品（也叫作潤(rùn)濕劑和分散劑）從物理上 改變了噴霧劑液滴的表面張力。為了使殺蟲(chóng)劑正確地發(fā)揮其功能，噴霧劑液滴必須能夠使 葉子潤(rùn)濕并在葉上均勻散開(kāi)。表面活性劑擴(kuò)大了殺蟲(chóng)劑覆蓋的范圍，從而增加了害蟲(chóng)接觸 化學(xué)試劑的機(jī)會(huì)。將殺蟲(chóng)劑施加于蠟質(zhì)或具毛的葉時(shí)，表面活性劑尤為重要。不進(jìn)行適當(dāng) 的潤(rùn)濕和分散，則噴霧劑液滴常常流失或者不能充分地覆蓋這些表面。然而，過(guò)多的表面活 性劑可導(dǎo)致過(guò)度的流失或沉淀?yè)p失，因此降低了殺蟲(chóng)劑的功效。殺蟲(chóng)劑配方常包含表面活 性劑以改進(jìn)該殺蟲(chóng)劑活性成分的懸浮。這尤其用于可乳化濃縮物（EC)配方。
[0208] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"佐劑"指添加至殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品或殺蟲(chóng)劑噴霧劑混合物以改進(jìn)噴霧 箱中產(chǎn)品的混合和穩(wěn)定性以及應(yīng)用的任何非殺蟲(chóng)劑材料。本文另外使用的術(shù)語(yǔ)"表面活性 劑"指改變表表面張力的化學(xué)試劑。表面活性劑可以影響液體的潤(rùn)濕和分散，并且可以改變 殺蟲(chóng)劑在水中的分散、懸浮或沉淀。存在非離子型表面活性劑（不帶電荷）、陰離子表面活 性劑（負(fù)電荷）和陽(yáng)離子表面活性劑（正電荷）。
[0209] 在特別的實(shí)施方案中，所述噴霧劑中包含的所述宿主細(xì)胞是滅活的，例如通過(guò)熱 滅活或者機(jī)械破壞（如本文所詳細(xì)討論地）來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0210] 所述賦形劑的性質(zhì)和所述組合物的物理形式可根據(jù)期望處理的基層的性質(zhì)而變 化。例如，所述組合物可以是被刷至或噴灑至待處理的物品或基層上或者壓印至待處理的 物品或基層中的液體，抑或是應(yīng)用于待處理的物品或基層的涂層或粉末。因此，在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述組合物在適當(dāng)?shù)谋砻嫔喜捎猛繉拥男问?，其粘附昆蟲(chóng)并最終被接觸該涂層的 昆蟲(chóng)所攝取。
[0211] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述基層是意在針對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵害而進(jìn)行處理的植物 或作物。然后，所述組合物被昆蟲(chóng)內(nèi)化或攝食，在其中該組合物可以介導(dǎo)RNA干擾，從而防 治昆蟲(chóng)。所述噴霧劑優(yōu)選為加壓的/氣霧狀的噴霧劑或泵式噴霧劑。所述顆?？梢圆扇∵m 當(dāng)?shù)拇笮?，從而其粘附于待處理的基層或者粘附于昆蟲(chóng)，例如粘附于昆蟲(chóng)和/或蛛形綱動(dòng) 物的外骨骼，并可以從此處被吸收。
[0212] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物采用餌劑的形式。設(shè)計(jì)所述餌劑使之引誘昆蟲(chóng)與 所述組合物接觸。一旦接觸后，所述組合物被昆蟲(chóng)內(nèi)化（例如通過(guò)攝食）并介導(dǎo)RNAi從而 殺死昆蟲(chóng)。所述餌劑可包含食物，如基于蛋白質(zhì)的食物，例如魚(yú)粉。也可以使用硼酸作為餌 齊U。所述餌劑可取決于作為靶標(biāo)的物種。還可以使用引誘劑。所述引誘劑可以是信息素， 例如雄性或雌性信息素。作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明可使用《昆蟲(chóng)信息素及其在害蟲(chóng)管理中的 應(yīng)用(Insect Pheremones and their use in Pest Management)》（Howse et a 1, Chapman and Hall, 1998)中提及的信息素。所述引誘劑將昆蟲(chóng)引誘至所述餌劑，并可以靶向特定昆 蟲(chóng)或可以引誘所有昆蟲(chóng)。所述餌劑可采用任何適當(dāng)?shù)男问?，如固體、糊劑、丸劑或粉劑形式。
[0213] 所述餌劑還可被昆蟲(chóng)攜帶回群體。然后，該餌劑可以作為群體中其它成員的食物 來(lái)源，因而對(duì)大量昆蟲(chóng)并且可能對(duì)整個(gè)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)群體實(shí)現(xiàn)有效控制。使用雙鏈RNA或表達(dá) 本發(fā)明的dsRNA的細(xì)菌是有利的，因?yàn)镽NAi介導(dǎo)的對(duì)害蟲(chóng)影響的延遲作用使餌劑被攜帶回 群體，從而實(shí)現(xiàn)了在接觸昆蟲(chóng)方面的最大影響。
[0214] 另外，與所述昆蟲(chóng)接觸的組合物可殘留在該昆蟲(chóng)的角質(zhì)層上。當(dāng)清潔（一只昆蟲(chóng) 清潔其自身或昆蟲(chóng)相互清潔）時(shí)，所述組合物可以被攝取，并可以因此介導(dǎo)其在昆蟲(chóng)中的 作用。這需要所述組合物足夠穩(wěn)定，從而即使暴露于外界環(huán)境條件一段時(shí)間（例如，可以是 幾天）后，所述dsRNA或表達(dá)dsRNA的宿主細(xì)胞仍保持完好并能夠介導(dǎo)RNAi。
[0215] 所述餌劑可以以適當(dāng)?shù)?外罩"或"陷阱"來(lái)提供。這樣的外罩和陷阱是市售的， 并且現(xiàn)有的陷阱可適于包含本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的范圍包括可吸引昆蟲(chóng)進(jìn)入的任何 外罩或陷阱。所述外罩或陷阱可以例如是盒形的，并且可以例如以預(yù)成型狀態(tài)提供或者可 以由可折疊紙板形成。用于外罩或陷阱的適當(dāng)?shù)牟牧习ㄋ芰虾图埌?，尤其是瓦楞紙?(corrugated cardboard)。這樣的外罩或陷講的合適尺寸為例如7_15cm寬，15_20cm長(zhǎng)以 及l(fā)-5cm高。所述陷阱的內(nèi)表面可覆蓋粘性物質(zhì)，使得昆蟲(chóng)一旦進(jìn)入該陷阱則被限制移動(dòng)。 所述外罩或陷阱可包含適當(dāng)?shù)牟郏霾鄣膬?nèi)部可以在適當(dāng)?shù)奈恢醚b有所述餌劑。陷阱不 同于外罩是因?yàn)槔ハx(chóng)在進(jìn)入后不能輕易地逃離陷阱，而外罩作為"飼喂處"，其向昆蟲(chóng)蛛形 綱動(dòng)物提供較佳的環(huán)境，在其中它們可以進(jìn)食并且感覺(jué)遠(yuǎn)離捕食者的安全感。
[0216] 因此，本發(fā)明的另一方面提供了針對(duì)昆蟲(chóng)的外罩或陷阱，其包含本發(fā)明的組合物， 該組合物可以合并本文所述組合物的任何特征。
[0217] 本發(fā)明的"組合物"可以是"組合試劑盒（kit-of-parts) "，其包含一個(gè)容器中的 所述雙鏈RNA以及一個(gè)單獨(dú)容器中的針對(duì)含有RNA的實(shí)體（如dsRNA或dsRNA構(gòu)建體、DNA 構(gòu)建體、表達(dá)構(gòu)建體）的適當(dāng)稀釋劑、賦形劑或載體；或者包含一個(gè)容器中的宿主細(xì)胞以及 一個(gè)單獨(dú)容器中的針對(duì)該宿主細(xì)胞的適當(dāng)稀釋劑、賦形劑、載體或防腐劑。本發(fā)明還涉及提 供單獨(dú)的雙鏈RNA或宿主細(xì)胞，而沒(méi)有任何其它組分。在這些實(shí)施方案中，所述dsRNA或宿 主細(xì)胞可以以濃縮形式來(lái)提供，如濃縮的水溶液。它甚至可以以冷凍形式或者以凍干形式 來(lái)提供。后者對(duì)于長(zhǎng)期保藏來(lái)說(shuō)可能更穩(wěn)定，并且可以在臨使用前被解凍和/或用適當(dāng)?shù)?稀釋劑復(fù)原。
[0218] 本發(fā)明還包括在基層上控制害蟲(chóng)生物的生長(zhǎng)和/或防止敏感生物被害蟲(chóng)生物侵 害的方法，其包括向所述基層應(yīng)用本文所述的有效量的任何組合物和/或噴霧劑。
[0219] 本發(fā)明還包括用于治療和/或預(yù)防由靶生物導(dǎo)致的疾病或病癥的方法，其包括向 有此治療和/或預(yù)防需要的對(duì)象施用本文所述的組合物或噴霧劑，其中由所述組合物或噴 霧劑造成的所述靶生物中靶基因的表達(dá)下調(diào)對(duì)于治療和/或預(yù)防由靶生物導(dǎo)致的疾病是 有效的。優(yōu)選的靶生物是害蟲(chóng)，尤其是本文詳細(xì)描述的昆蟲(chóng)。
[0220] 本發(fā)明還涉及本文所述的任何雙鏈RNA、雙鏈RNA構(gòu)建體、核苷酸序列、重組DNA構(gòu) 建體或組合物的醫(yī)學(xué)用途。
[0221] 昆蟲(chóng)和另一些節(jié)肢動(dòng)物可通過(guò)其叮咬或螫刺而導(dǎo)致?lián)p傷甚至死亡。在美國(guó)，每年 由于蜜蜂和黃蜂螫傷而死亡的人比被蛇咬傷而死亡的人更多。許多昆蟲(chóng)可以傳播導(dǎo)致疾病 的細(xì)菌和其它病原體。在每次國(guó)家間大規(guī)模戰(zhàn)爭(zhēng)期間，由于昆蟲(chóng)傳播的疾病而受傷或死去 的人比由于子彈和炸彈而受傷或死去的人更多。叮咬人和家畜的昆蟲(chóng)大多是具有如半翅目 和某些雙翅目昆蟲(chóng)中所見(jiàn)的刺吸式口器的昆蟲(chóng)。叮咬引起的主要不適是由昆蟲(chóng)注入對(duì)象的 酶所致。蜱和恙螨是不同種類的螨（蛛形綱），其以動(dòng)物血液為食。蜱還可以傳播導(dǎo)致疾 病的病毒和另一些病原體，所述疾病包括萊姆病和落肌山斑疫熱。另一些種類的螨可引起 人、犬、貓和其它動(dòng)物的獸擠癬。半翅目包括床風(fēng)、接吻蟲(chóng)（kissing bug)和獵蝽（assassin bug)，所有這些昆蟲(chóng)具有用于刺入其宿主的喙。所有昆蟲(chóng)中最疼痛的叮咬是獵蝽的叮咬。 在中美州和南美洲，接吻蟲(chóng)參與導(dǎo)致查加斯病。某些蛾的毛蟲(chóng)可以"螫刺"。雙翅目是影響 人類的最重要的昆蟲(chóng)目。叮咬飛蟲(chóng)（biting flies)包括多種蚊、蚋、biting gnats、蛇等。 這些叮咬飛蟲(chóng)中有許多是疾病的傳播者，如傳播非洲睡眠病的舌蠅。具有舐吸式口器的蠅 (如家蠅）也傳播導(dǎo)致傷寒熱及另一些疾病的細(xì)菌和其它病原體。蛆是這兩種侵入動(dòng)物活 組織的飛蟲(chóng)的幼蟲(chóng)。蚊子傳播導(dǎo)致瘧疾、黃熱病、腦炎和另一些疾病的病原體。瘧疾由原生 動(dòng)物寄生物導(dǎo)致，所述原生動(dòng)物寄生物的部分生活周期生活在按蚊屬蚊中，部分生活周期 生活在人中。鼠疫也叫作腺鼠疫或黑死病，由感染大鼠及另一些嚙齒動(dòng)物的細(xì)菌導(dǎo)致。該 疾病針對(duì)人的主要轉(zhuǎn)播者是東方具帶病蚤（Oriental rat flea)(蚤目）。許多蜜蜂、黃蜂 和螞蟻（膜翅目）可通過(guò)其螫刺導(dǎo)致疼痛甚至死亡。死亡通常是對(duì)毒物的變態(tài)反應(yīng)的結(jié) 果。其它重要的螫刺動(dòng)物包括大黃蜂（hornets)、小黃蜂（yellow jackets)和胡蜂（paper wasps)。非洲化蜜蜂（Africanized honey bee)或"殺人蜂"（"killer"bee)是人類馴化 的蜜蜂品系。這兩種品系在外觀上幾乎相同。然而，非洲化蜜蜂品系更具攻擊性，并且以更 大的數(shù)目進(jìn)行攻擊。
[0222] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物是分別用于治療或預(yù)防人類或動(dòng)物的昆蟲(chóng) 疾病或感染的藥物組合物或獸用藥組合物。這樣的組合物包含至少一種雙鏈RNA或RNA構(gòu) 建體，或者編碼所述雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體的核苷酸序列或重組DNA構(gòu)建體（其中所述雙 鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含與導(dǎo)致所述疾病或感染的昆蟲(chóng)靶基因 的靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列）以及適用于藥物用途的至少一種載體、賦形劑或稀釋 劑。
[0223] 所述組合物可以是適于局部使用的組合物，如應(yīng)用在動(dòng)物或人的皮膚上，例如應(yīng) 用于皮膚的液體組合物（滴劑、凝膠劑、氣霧劑），或者通過(guò)刷、或噴霧劑、乳劑、軟膏等用于 局部應(yīng)用，或者作為透皮貼劑。
[0224] 或者，所述昆蟲(chóng)dsRNA由細(xì)菌（例如，乳桿菌屬）或真菌（例如酵母屬 (Sacharomyces)物種）產(chǎn)生，其可以包含在食物中并作為抗御昆蟲(chóng)感染的口服疫苗。
[0225] 也可以制備成其它常規(guī)的藥物劑型，包括片劑、膠囊、陰道栓劑、透皮貼劑、栓劑 等。所選形式取決于靶昆蟲(chóng)的性質(zhì)以及期望治療的疾病的性質(zhì)。
[0226] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物可以是涂層、糊劑或粉劑，其可以應(yīng)用于基 層從而保護(hù)所述基層免受昆蟲(chóng)和/或蛛形綱動(dòng)物的侵害。在該實(shí)施方案中，可使用所述 組合物保護(hù)對(duì)昆蟲(chóng)侵害或昆蟲(chóng)造成的破壞敏感的任何基層或物品，例如食物及其它易腐 物品，以及基層（如木材）。白蟻、粉蠹甲蟲(chóng)和木匠蟻可破壞房屋及其它木制品。散白蟻 (subterranean termite)和臺(tái)灣乳白蟻（Formosan termite)是美國(guó)南部和熱帶地區(qū)最嚴(yán) 重的房屋害蟲(chóng)。昆蟲(chóng)可以襲擊任何收獲的植物或動(dòng)物產(chǎn)品。面象蟲(chóng)、谷類象鼻蟲(chóng)、谷螟及其 它儲(chǔ)藏品害蟲(chóng)以儲(chǔ)藏的糧食、谷類、寵物食品、巧克力粉以及廚房食品柜中未得到保護(hù)的幾 乎所有其它食物為食。衣服蛀蟲(chóng)的幼蟲(chóng)蛀蝕由動(dòng)物產(chǎn)品（如毛皮、絲和羊毛）制成的衣服。 地毯甲蟲(chóng)的幼蟲(chóng)蛀蝕動(dòng)物和植物產(chǎn)品，包括皮革、毛皮、棉花、儲(chǔ)存的糧食甚至博物館標(biāo)本。 書(shū)虱和蠹蟲(chóng)是圖書(shū)館的害蟲(chóng)。這些昆蟲(chóng)蛀蝕書(shū)裝訂處的淀粉膠。侵入房屋的其它昆蟲(chóng)包括 蟑螂，其攝食幾乎任何東西。蟑螂不被認(rèn)為是疾病的特定傳播者，但是它們污染食物并帶有 令人不悅的氣味。它們非常令人討厭，許多害蟲(chóng)防治公司致力于嘗試對(duì)它們進(jìn)行防治。在 房屋、食品商店和飯店中的最常見(jiàn)的蟑螂包括德國(guó)小蠊、美洲大蠊、東方蜚蠊和長(zhǎng)須蜚蠊。
[0227] 所述組合物的賦形劑和物理形式的性質(zhì)可取決于期望處理的基層的性質(zhì)而有所 變化。例如，所述組合物可以是被刷或噴灑至待處理的物品或基層上的液體，或者壓印至待 處理的物品或基層中的液體，或者是應(yīng)用至待處理的物品或基層的涂層。
[0228] 本發(fā)明還包括用于處理和/或防治昆蟲(chóng)對(duì)基層侵害的方法，其包括向所述基層應(yīng) 用有效量的任何本文所述的組合物或噴霧劑。
[0229] 本發(fā)明還包括用于治療和/或預(yù)防昆蟲(chóng)疾病或病癥的方法，其包括向有此治療和 /或預(yù)防需要的對(duì)象施用本文所述的任何組合物或噴霧劑，所述組合物或噴霧劑包含至少 一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構(gòu)建體，其包含退火的互補(bǔ)鏈，其中一條退火互補(bǔ)鏈包含與導(dǎo)致所 述昆蟲(chóng)疾病或病癥的昆蟲(chóng)的昆蟲(chóng)靶基因核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù) 一個(gè)更具體的實(shí)施方案，所述待施用的組合物或噴霧劑包含和/或表達(dá)至少一種細(xì)菌細(xì)胞 或酵母細(xì)胞，所述細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞表達(dá)本文所述的至少一種雙鏈RNA或雙鏈RNA構(gòu)建 體；或者包含和/或表達(dá)本文所述的至少一種核苷酸序列或重組DNA構(gòu)建體，所述RNA或核 苷酸序列與導(dǎo)致所述昆蟲(chóng)疾病或病癥的昆蟲(chóng)的昆蟲(chóng)靶基因之至少一部分核苷酸序列是互 補(bǔ)的。
[0230] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述組合物用作植物或者植物的增殖或繁殖材料 (如種子）的殺蟲(chóng)劑。舉例來(lái)說(shuō)，所述組合物可通過(guò)向植物組織噴灑或應(yīng)用或者在幼苗出苗 前后向土壤噴灑或混合而用作殺蟲(chóng)劑。
[0231] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于處理和/或阻止昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和/或昆蟲(chóng)侵害 植物或者植物的增殖或繁殖材料的方法，其包括向植物或者向植物的增殖或繁殖材料應(yīng)用 有效量的任何本文所述的組合物或噴霧劑。
[0232] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及任何雙鏈RNA或RNA構(gòu)建體、或者編碼所述雙鏈 RNA或RNA構(gòu)建體的核苷酸序列或重組DNA構(gòu)建體、或者表達(dá)本發(fā)明的dsRNA的至少一種宿 主細(xì)胞（例如，細(xì)菌或酵母）、或者編碼本文所述的dsRNA的病毒、或者包含上述的任何組合 物或噴霧劑的用途，其用于控制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)，用于防治昆蟲(chóng)侵害對(duì)昆蟲(chóng)感染敏感的植物，或用 于處理植物的昆蟲(chóng)感染。針對(duì)特定昆蟲(chóng)導(dǎo)致的昆蟲(chóng)感染而進(jìn)行處理的特定植物如前所述， 并包含在所述用途中。
[0233] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含至少一種宿主細(xì)胞，或表達(dá)本發(fā)明 的dsRNA的至少一種宿主細(xì)胞（例如，細(xì)菌或酵母），或編碼本文所述的dsRNA的病毒，或者 涉及包含上述的任何組合物的噴霧劑的用途，該噴霧劑用于控制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)，用于防治昆蟲(chóng) 侵害對(duì)昆蟲(chóng)感染敏感的植物，或用于治療植物的昆蟲(chóng)感染。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞包含如下 表示的任意序列之至少一種：SEQ ID 勵(lì)1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249， 251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517， 519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773， 778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892， 894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476， 2481或2486,或其至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。
[0234] 另一方面，本發(fā)明還提供了用于防止或保護(hù)植物免受害蟲(chóng)侵害的方法組合和組合 物。例如，一種方法提供了使用轉(zhuǎn)基因方法與使用雙鏈RNA分子以及與一種或多種對(duì)靶標(biāo) 害蟲(chóng)具有毒性的Bt殺蟲(chóng)蛋白或化學(xué)的（有機(jī)的）化合物的組合物的方法組合。另一方法 提供了使用轉(zhuǎn)基因方法與使用在細(xì)菌或酵母中表達(dá)雙鏈RNA分子以及在同樣的細(xì)菌或酵 母中或者在不同的細(xì)菌或酵母中表達(dá)所述Bt殺蟲(chóng)蛋白的方法的組合。例如根據(jù)這些方法， 可以使用基于RNAi的方法或技術(shù)來(lái)靶向或殺死一種昆蟲(chóng)，而使用Bt殺蟲(chóng)劑或化學(xué)的（有 機(jī)的）殺蟲(chóng)劑可以靶向或殺死另一種昆蟲(chóng)。
[0235] 因此，本發(fā)明還涉及本文所述的用于處理植物的任何組合物、噴霧劑或方法，其中 所述組合物包含表達(dá)所述RNA分子的細(xì)菌細(xì)胞或酵母,并且還包含殺蟲(chóng)劑或者包含含有或 表達(dá)殺蟲(chóng)劑的細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞（可以與上面提及的是同一細(xì)菌或酵母細(xì)胞或者不同 的細(xì)菌或酵母細(xì)胞），所述殺蟲(chóng)劑選自化學(xué)的（有機(jī)的）殺蟲(chóng)劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢 桿菌殺蟲(chóng)蛋白、致病桿菌殺蟲(chóng)蛋白、光桿狀菌殺蟲(chóng)蛋白、側(cè)抱芽抱桿菌殺蟲(chóng)蛋白和球形芽抱 桿菌殺蟲(chóng)蛋白。優(yōu)選地，所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白選自：Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、 Cry22、二元?dú)⑾x(chóng)蛋白CryET33和CryET34、二元?dú)⑾x(chóng)蛋白CryET80和CryET76、二元?dú)⑾x(chóng)蛋 白TIC100和TIC101以及二元?dú)⑾x(chóng)蛋白PS149B1。
[0236] 所述噴霧劑可用于溫室中或農(nóng)田上。對(duì)于水基噴霧劑來(lái)說(shuō)，包含細(xì)菌的生物殺蟲(chóng) 劑（例如，作為可乳化的混懸液）的通常應(yīng)用率為25-100升/公頃（10-40升/英畝）：每 公頃包含約2. 5-5升的配制產(chǎn)品（可乳化的混懸液），其中所述配制產(chǎn)品包含約25% (體 積/體積）的'細(xì)菌細(xì)胞'加75% (體積/體積）的'其它成分，。細(xì)菌細(xì)胞的量以單位來(lái) 計(jì)，例如一個(gè)單位定義為lml中109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。取決于每公頃的作物密度和每株植物的葉 面積，1升的配制產(chǎn)品包含〇. 001?10000個(gè)單位的細(xì)菌，優(yōu)選地至少〇. 〇〇l、〇. 003、0. 005、 0· 007、0· 01、0· 03、0· 05、0· 07、0· 1、0· 3、0· 5、0· 7,更優(yōu)選至少 1、3、5、7、10、30、50、70、100、 300、500、700，或者更優(yōu)選至少1000、3000、5000、7000或者10000個(gè)單位的細(xì)菌。
[0237] 例如，馬鈴薯作物植物的通常植物密度約為每平方米4. 5株植物或者每公頃 45, 000株植物（成排種植，排與排之間距離為75cm，每排的植物之間距離為30cm)。因此，本 發(fā)明涉及噴霧劑，其包含至少 〇· 〇〇1、〇· 003、0· 005、0· 007、0· 01、0· 03、0· 05、0· 07、0· 1、0· 3、 〇· 5、0· 7,更優(yōu)選至少 1、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700,或者更優(yōu)選至少 1000、 3000、5000、7000或者10000個(gè)單位的細(xì)菌，所述細(xì)菌表達(dá)本文所述的至少一種dsRNA分子 或dsRNA構(gòu)建體。
[0238] 本發(fā)明還涉及用于處理植物中昆蟲(chóng)感染的試劑盒，其包含先前所述的至少一種雙 鏈RNA、或雙鏈RNA構(gòu)建體、或核苷酸序列、或重組DNA構(gòu)建體、或宿主細(xì)胞、或組合物或噴霧 齊U。所述試劑盒可以與適當(dāng)?shù)氖褂谜f(shuō)明書(shū)一起提供。該說(shuō)明書(shū)可印刷在提供其它組分的合 適的包裝上，或者可作為單獨(dú)的實(shí)體來(lái)提供，例如可以采用紙頁(yè)或小冊(cè)子的形式。該說(shuō)明書(shū) 可以卷起或折疊（例如在儲(chǔ)存狀態(tài)時(shí)），然后可以將其展開(kāi)從而指導(dǎo)所述試劑盒其余組分 的用途。
[0239] 參考以下非限制性實(shí)施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0240] 圖1-LD :使用以dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲的存活。使用以50 μ 1 局部應(yīng)用的dsRNA(靶標(biāo)或gfp對(duì)照）溶液處理的飼料喂食第二幼蟲(chóng)階段的昆蟲(chóng)。7天后， 將飼料替換為包含局部應(yīng)用的dsRNA的新鮮飼料。在第2、5、7、8、9和13天評(píng)估存活昆蟲(chóng) 數(shù)。相對(duì)于第〇天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分比。靶標(biāo)LD006:(SEQ ID N0178); 靶標(biāo) LD007(SEQ ID N0183);靶標(biāo) LD010(SEQ ID N0188);靶標(biāo) LD011(SEQ ID N0193);靶標(biāo) LD014(SEQ ID N0198) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0241] 圖2-LD :使用以dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲的存活。使用以50 μ 1 局部應(yīng)用的dsRNA(靶標(biāo)或gfp對(duì)照）溶液處理的飼料喂食第二幼蟲(chóng)階段的昆蟲(chóng)。7天后， 將飼料替換成僅為新鮮飼料。在第2、5、6、7、8、9、12和14天評(píng)估存活昆蟲(chóng)數(shù)。相對(duì)于第0 天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分比。靶標(biāo)LD001(SEQ ID N0163);靶標(biāo)LD002(SEQ ID N0168);靶標(biāo) LD003(SEQ ID N0173);靶標(biāo) LD015(SEQ ID N0215);靶標(biāo) LD016(SEQ ID N0220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0242] 圖3-LD :使用用dsRNA處理的馬鈴薯葉盤喂食的馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)的平均重量。使 用以20 μ 1局部應(yīng)用的dsRNA (靶標(biāo)LD002或gfp)溶液（10ng/ μ 1)處理的葉盤喂食第二 幼蟲(chóng)階段的昆蟲(chóng)。2天后，每天將昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至未經(jīng)處理的葉子上。
[0243] 圖4-LD :使用以較短形式的靶標(biāo)LD014dsRNA和多聯(lián)體dsRNA處理的人工飼料喂 食的馬鈴薯葉甲的存活。使用以50 μ 1局部應(yīng)用的dsRNA (gfp或靶標(biāo)）溶液處理的飼料喂 食第二幼蟲(chóng)階段的昆蟲(chóng)。在第3、4、5、6和7天評(píng)估存活昆蟲(chóng)數(shù)。相對(duì)于第0天（測(cè)定開(kāi)始 時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分比。
[0244] 圖5-LD :使用以不同濃度的dsRNA (靶標(biāo)LD002 (a)、靶標(biāo)LD007 (b)、靶標(biāo) LD010(c)、靶標(biāo) LDOll(d)、靶標(biāo) LD014(e)、靶標(biāo) LD015(f)、LD016(g)和靶標(biāo) LD027(h))處 理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)的存活。使用以50 μ 1局部應(yīng)用的dsRNA溶液處理的 飼料喂食第二幼蟲(chóng)階段的昆蟲(chóng)。7天后，將飼料替換為包含局部應(yīng)用的dsRNA的新鮮飼料。 以固定的時(shí)間間隔評(píng)估存活昆蟲(chóng)數(shù)。相對(duì)于第〇天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分 比。
[0245] 圖6-LD.表達(dá)dsRNA (靶標(biāo)LD010)的大腸桿菌菌株對(duì)馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)存活的隨時(shí) 間的影響。在基于人工飼料的分別的生物測(cè)定中檢測(cè)兩株細(xì)菌菌株：（a)AB301-105(DE3)， PGBNJ003和pGN29的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來(lái)自5個(gè)不同細(xì)菌克隆的平均死亡率值，（b)BL21 (DE3)， PGBNJ003和pGN29的數(shù)據(jù)點(diǎn)分別表示來(lái)自5個(gè)不同的細(xì)菌克隆以及一個(gè)單獨(dú)的細(xì)菌克隆的 平均死亡率值。誤差條線代表標(biāo)準(zhǔn)差。
[0246] 圖7-LD.表達(dá)dsRNA (靶標(biāo)LD010)的大腸桿菌菌株的不同克隆（a) ΑΒ301-105ΦΕ3)和（b)BL21(DE3)在侵害后12天對(duì)馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)存活的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn) 是PGN29和pGBNJ003的每個(gè)克隆的平均死亡率值。在該時(shí)間點(diǎn)，包含質(zhì)粒pGBNJ003的 ΑΒ301-105ΦΕ3)克隆1顯示出CPB100%死亡率。誤差條線代表標(biāo)準(zhǔn)差。
[0247] 圖8-LD.表達(dá)dsRNA (靶標(biāo)LD010)的大腸桿菌菌株的不同克?。╝) ΑΒ301-105ΦΕ3)和（b)BL21(DE3)在侵害后7天對(duì)存活的馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育的 影響?；诒?0的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)點(diǎn)是每個(gè)克?。ㄒ粋€(gè)PGN29克隆和5個(gè)pGBNJ003克隆）的 幼蟲(chóng)平均重量值的百分?jǐn)?shù)。只用飼料處理代表100%的正常幼蟲(chóng)重量。
[0248] 圖9-LD.喂食馬鈴薯植物的馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)在侵害后7天的存活，所述馬鈴薯植 物用產(chǎn)生雙鏈RNA的細(xì)菌噴灑。計(jì)算存活幼蟲(chóng)數(shù)并表示為死亡率百分?jǐn)?shù)。所使用的細(xì)菌宿 主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株AB301-105 (DE3)。昆蟲(chóng)基因靶標(biāo)是LD010。
[0249] 圖10-LD.喂食馬鈴薯植物的存活的馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)在侵害后11天的生長(zhǎng)/發(fā) 育延遲，所述馬鈴薯植物用產(chǎn)生dsRNA的細(xì)菌噴灑。所使用的細(xì)菌宿主菌株是RNA聚合酶 III缺陷型菌株ΑΒ301-105ΦΕ3)。數(shù)據(jù)圖表示正常幼蟲(chóng)重量的百分比，只用飼料的處理代 表100%的正常幼蟲(chóng)重量。昆蟲(chóng)基因靶標(biāo)是LD010。誤差條線代表標(biāo)準(zhǔn)差。
[0250] 圖11-LD.在侵害后7天，產(chǎn)生雙鏈RNA的細(xì)菌對(duì)馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)導(dǎo)致的馬鈴薯?yè)p 傷的抗性。左圖，用含有PGN29質(zhì)粒的7個(gè)單位的細(xì)菌ΑΒ301-105ΦΕ3)噴灑植物；右圖，用 含有PGBNJ003質(zhì)粒的7個(gè)單位的細(xì)菌ΑΒ301-105ΦΕ3)噴灑植物。一個(gè)單位定義為在600nm 0D值為1的lml細(xì)菌懸液的等價(jià)物。昆蟲(chóng)基因靶標(biāo)為L(zhǎng)D010。
[0251] 圖12-LD.使用以dsRNA處理的馬鈴薯葉盤喂食的馬鈴薯葉甲成蟲(chóng)的存活。開(kāi) 始兩天使用以雙鏈RNA處理的葉盤喂食年幼成蟲(chóng)，然后將其置于未經(jīng)處理的馬鈴薯葉上。 定期評(píng)估存活昆蟲(chóng)數(shù)；活的并且看起來(lái)運(yùn)動(dòng)正常的昆蟲(chóng)記錄為可動(dòng)的昆蟲(chóng)；活的但似乎有 病且運(yùn)動(dòng)緩慢的昆蟲(chóng)記錄為瀕死的昆蟲(chóng)--一旦將其背部朝下，這些昆蟲(chóng)不能翻身。靶 標(biāo) LD002(SEQ ID N0168);靶標(biāo) LD010(SEQ ID N0188);靶標(biāo) LD014(SEQ ID N0198);靶標(biāo) LD016(SEQ ID N0220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0252] 圖13-LD.細(xì)菌產(chǎn)生的靶標(biāo)雙鏈RNA對(duì)馬鈴薯葉甲幼蟲(chóng)的影響。將0D為1的經(jīng)熱 處理的表達(dá)dsRNA(SEQ ID N0188)的50μ1細(xì)菌ΑΒ301-105ΦΕ3)懸液局部應(yīng)用于48孔板 每個(gè)孔中的固體人工飼料上。將L2階段的CPB幼蟲(chóng)置于每個(gè)孔中。在第7天，對(duì)包含（a) 含有表達(dá)靶標(biāo)10雙鏈RNA的細(xì)菌的飼料，（b)含有空載體pGN29的細(xì)菌的飼料，以及（c)只 有飼料的平板中的CPB幼蟲(chóng)進(jìn)行拍照。
[0253] 圖14-LD.在昆蟲(chóng)侵害前，將不同量的含有質(zhì)粒pGBNJ003的滅活大腸桿菌 ΑΒ301-105ΦΕ3)菌株局部應(yīng)用于馬鈴薯葉對(duì)CPB幼蟲(chóng)存活和生長(zhǎng)的影響。用經(jīng)處理的馬鈴 薯喂食10只L1幼蟲(chóng)7天。噴灑在植物上的細(xì)菌懸液的量為：0. 25U、0. 08U、0. 025U、0. 008U 的靶標(biāo)10以及0. 25U的pGN29 (陰性對(duì)照；還包含Milli-Q水）。一個(gè)單位（U)定義為與在 600nm吸光度值為1的lml培養(yǎng)物中等量的細(xì)菌量。將1. 6ml總體積噴灑至每株植物上。 昆蟲(chóng)基因靶標(biāo)為L(zhǎng)D010。
[0254] 圖15-LD在侵害后7天，含有質(zhì)粒pGBNJ003的滅活大腸桿菌ΑΒ301-105ΦΕ3) 菌株對(duì)CPB幼蟲(chóng)導(dǎo)致的馬鈴薯?yè)p傷的抗性。（a)水，（b)包含pGN29的0. 25U大腸桿 菌 AB301-105 (DE3)，（c)含有 pGBNJ003 的 0· 025U 大腸桿菌 AB301-105 (DE3)，（d)含有 PGBNJ003的0. 008U大腸桿菌AB301-105 (DE3)。一個(gè)單位（U)定義為與在600nm吸光度值 為1的lml培養(yǎng)物等量的細(xì)菌量。將1. 6ml總體積噴灑至每株植物上。昆蟲(chóng)基因靶標(biāo)為 LD010。
[0255] 圖1-PC :喂食靶標(biāo)dsRNA對(duì)辣根猿葉甲幼蟲(chóng)的存活和生長(zhǎng)的影響。使用以25 μ 1 局部應(yīng)用的〇. 1 μ g/ μ ldSRNA(靶標(biāo)或gfp對(duì)照）溶液處理的油菜葉盤喂食新生幼蟲(chóng)。2天 后，將所述昆蟲(chóng)移至新鮮的經(jīng)dsRNA處理的葉盤上。在第4天，針對(duì)每種處理收集來(lái)自一次 重復(fù)實(shí)驗(yàn)的幼蟲(chóng)，并置于含有未經(jīng)處理的新鮮油菜葉的培養(yǎng)皿中。在第2、4、7、9和11天評(píng) 估所述昆蟲(chóng)。（a)使用以dsRNA處理的油菜葉盤喂食的墨西哥豆瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)的存活。相對(duì)于 第〇天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)百分比，（b)使用以dsRNA處理的油菜葉盤喂食的辣 根猿葉甲幼蟲(chóng)的平均重量。一起稱重來(lái)自每次重復(fù)的昆蟲(chóng)并確定每只幼蟲(chóng)的平均重量。誤 差條線代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶標(biāo)1 :SEQ ID473 ;靶標(biāo)3 :SEQ ID N0478 ;靶標(biāo)5 :SEQ ID N0483 ;靶 標(biāo) 10 :SEQ ID N0488 ;靶標(biāo) 14 :SEQ ID493 ;靶標(biāo) 16 :SEQ ID N0498 ;靶標(biāo)27 :SEQ ID N0503 ; gfp dsRNA ：SEQ ID N0235〇
[0256] 圖2-PC :使用以不同濃度dsRNA(a)靶標(biāo)PC010和（b)靶標(biāo)PC027處理的油菜葉 盤喂食辣根猿葉甲的存活。將初生幼蟲(chóng)置于用25 μ 1局部應(yīng)用的dsRNA溶液處理的油菜葉 盤上。在第2天，將昆蟲(chóng)移至經(jīng)處理的新鮮葉盤上。在第4天（針對(duì)靶標(biāo)PC010)和第5天 (針對(duì)靶標(biāo)PC027)，將昆蟲(chóng)移至未經(jīng)處理的葉子。在第2、4、7、8、9和11天（針對(duì)PC010) 和第2、5、8、9和12天（針對(duì)PC027)評(píng)估昆蟲(chóng)的存活數(shù)。相對(duì)于第0天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái) 計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分比。
[0257] 圖3-PC :表達(dá)dsRNA (靶標(biāo)PC010)的大腸桿菌AB301-105 (DE3)菌株對(duì)辣根猿葉 甲幼蟲(chóng)存活的隨時(shí)間的影響。每種處理的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來(lái)自3次不同重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均死亡率 值。誤差條線表示標(biāo)準(zhǔn)差。靶標(biāo)10 :SEQ ID N0488。
[0258] 圖1-EV :使用以dsRNA處理的豆葉盤喂食的墨西哥豆瓢蟲(chóng)的存活。使用以25 μ 1 局部應(yīng)用的1 μ g/ μ 1 dsRNA (靶標(biāo)或gfp對(duì)照）溶液處理的豆葉盤喂食初生幼蟲(chóng)。2天后， 將所述昆蟲(chóng)移至經(jīng)dsRNA處理的新鮮葉盤上。在第4天，收集來(lái)自一種處理的幼蟲(chóng)，并置于 含有未經(jīng)處理的新鮮豆葉的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天評(píng)估昆蟲(chóng)的死亡率。相對(duì)于 第〇天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分比。靶標(biāo)5 :SEQ ID N0576 ;靶標(biāo)10 :SEQ ID N0586 ;靶標(biāo) 15 :SEQ ID N0591 ;靶標(biāo) 16 :SEQ ID N0596 ;gfp dsRNA :SEQ ID N0235。
[0259] 圖2-EV :喂食靶標(biāo)dsRNA對(duì)墨西哥豆瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)的存活的影響，以及對(duì)食莢菜豆葉 的昆蟲(chóng)侵害的抗性。（a)使用以dsRNA處理的豆葉盤喂食的墨西哥豆瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)的存活。使 用以75 μ 1局部應(yīng)用的0. 1 μ g/μ 1 dsRNA (靶標(biāo)或gfp對(duì)照）溶液處理的豆葉盤喂食成蟲(chóng)。 24小時(shí)后，將昆蟲(chóng)移至經(jīng)dsRNA處理的新鮮葉盤上。再過(guò)24小時(shí)后，收集來(lái)自一種處理的 成蟲(chóng)，并置于包含未經(jīng)處理的新鮮的盆栽整株豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、7、8和11天 評(píng)估昆蟲(chóng)的死亡率。相對(duì)于第0天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼蟲(chóng)的百分比。靶標(biāo)10 :SEQ ID N0586 ;靶標(biāo) 15 :SEQ ID N0591 ;靶標(biāo) 16 :SEQ ID N0596 ;gfp dsRNA :SEQ ID N0235。（b) dsRNA對(duì)墨西哥豆瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)所造成豆葉損傷的抗性。在第9天，目測(cè)檢查包含來(lái)自一種處理 (參見(jiàn)（a))的昆蟲(chóng)的整株植物的葉損傷。⑴祀標(biāo)10 ; (ii)祀標(biāo)15 ; (iii)祀標(biāo)16 ; (iv) gfp dsRNA ;(v)未處理。
[0260] 圖1-TC :使用以dsRNA(靶標(biāo)14)處理的人工飼料喂食的赤擬谷盜的存活?；诤?有l(wèi)mg dsRNA (靶標(biāo)14)的面粉/奶混合物喂食初生幼蟲(chóng)。飼料中的水（不含dsRNA)是對(duì) 照。針對(duì)每種處理，進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)使用10只1齡幼蟲(chóng)。在第6、17、31、 45和60天評(píng)估昆蟲(chóng)的存活的平均數(shù)百分比。相對(duì)于第0天（測(cè)定開(kāi)始時(shí)）來(lái)計(jì)算存活幼 蟲(chóng)的百分比。誤差條線代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶標(biāo)TC014:SEQ ID N0878。
[0261] 圖1-MP :攝取dsRNA(靶標(biāo)27)對(duì)桃蚜若蟲(chóng)存活的影響。將1齡昆蟲(chóng)置于包含50μ 1 液態(tài)飼料（含有2 μ g/ μ 1 dsRNA (靶標(biāo)27或gfp dsRNA對(duì)照））的喂料室中。針對(duì)每種處 理，建立5個(gè)喂料室，其中每個(gè)喂料室包括10只齡蟲(chóng)。在生物測(cè)定開(kāi)始后的第8天評(píng)估存 活數(shù)。誤差條線代表標(biāo)準(zhǔn)差。靶標(biāo) MP027:SEQ ID N01061;gfp dsRNA:SEQ ID N0235。
[0262] 圖1-NL :使用以dsRNA處理的液體人工飼料喂食的褐飛虱的存活。在分別的生 物測(cè)定中用補(bǔ)充有2mg/ml dsRNA靶標(biāo)的溶液的飼料喂食第一至第二幼蟲(chóng)階段的若蟲(chóng)：(a) NL002、NL003、NL005、NL010 ;(b)NL009、NL016 ;(c)NL014、NL018 ;(d)NL013、NL015、NL021。 昆蟲(chóng)針對(duì)靶標(biāo)的存活與喂食相同濃度的只有飼料和含有g(shù)fp dsRNA對(duì)照的飼料進(jìn)行比較。 每?jī)商鞂暳咸鎿Q為含有dsRNA的新鮮飼料。每天評(píng)估存活昆蟲(chóng)數(shù)。
[0263] 圖2-NL :使用以不同濃度的靶標(biāo)dsRNA(NL002)處理的液體人工飼料喂食的褐飛 虱的存活。用補(bǔ)充有l(wèi)、〇. 2、0. 08和0. 04mg/ml (終濃度）NL002的飼料喂食第一至第二幼 蟲(chóng)階段的若蟲(chóng)。每?jī)商鞂暳咸鎿Q為含有dsRNA的新鮮飼料。每天評(píng)估存活昆蟲(chóng)數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0264] 實(shí)施例
[0265] 實(shí)施例1 :在高通量篩詵中沉默秀麗隱桿線蟲(chóng)中的靶某閔
[0266] 在pGN9A載體（W001/88121)中相同的兩個(gè)T7啟動(dòng)子和終止子之間制備秀麗隱桿 線蟲(chóng)基因組范圍的文庫(kù)，其在T7聚合酶表達(dá)的情況下通過(guò)IPTG誘導(dǎo)而驅(qū)動(dòng)有義和反義方 向的表達(dá)。
[0267] 以96孔板的形式，將此文庫(kù)轉(zhuǎn)化入ΑΒ301-105ΦΕ3)細(xì)菌菌株。為了在基因組范 圍進(jìn)行篩選，用這些細(xì)菌細(xì)胞喂食核酸酶缺陷型秀麗隱桿線蟲(chóng)nuc-1 (el392)株。
[0268] 遵循下述步驟，在96孔板中用所述AB301-105(DE3)細(xì)菌菌株中產(chǎn)生的dsRNA喂 食秀麗隱桿線蟲(chóng)nuc-1 (el392):將nuc-1卵移至不同的板中，并使其在20°C同時(shí)孵化從而 使L1代同步化。將包含IPTG的100 μ L液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及含有秀麗隱桿線蟲(chóng)dsRNA文 庫(kù)的〇D_l的10μ L ΑΒ301-105ΦΕ3)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物加至96孔板中，所述文庫(kù)中每個(gè)載 體包含用于表達(dá)所述dsRNA的秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組片段。將4只同步化的L1線蟲(chóng)加至每 個(gè)孔中，在25°C孵育至少4至5天。這些實(shí)驗(yàn)一式四份進(jìn)行。在所述篩選中使用了 6種對(duì) 昭. >、?、 ·
[0269] -pGN29 =陰性對(duì)照，野生型
[0270] -pGZl = unc-22 =顫搐表型
[0271] _pGZ18 =幾丁質(zhì)合酶=胚胎致死
[0272] _pGZ25 = pos-Ι =胚胎致死
[0273] -PGZ59 = bli_4D =急性致死
[0274] -ACC =乙酰輔酶A羧化酶=急性致死
[0275] 5天后，將用產(chǎn)生dsRNA的細(xì)菌喂食的秀麗隱桿線蟲(chóng)nuc-1 (el392)與用空載體 (PGN29)及其它對(duì)照喂食的線蟲(chóng)的表型進(jìn)行比較。針對(duì)親代（P0)的（急性的或幼蟲(chóng)的）致 死性、子一代（F1)的（胚胎）致死性或者針對(duì)P0的生長(zhǎng)阻滯對(duì)使用所述dsRNA喂食的線 蟲(chóng)講行篩詵，具體如下：（i)P0的急件致死：L1不發(fā)育且死亡，該表型不產(chǎn)生后代，所述孔看 h去相當(dāng)宇：（ii)P0的（幼蟲(chóng)）致死：P0在比L1更晚的階段死亡，該表型也不產(chǎn)生后代。 在孔中發(fā)現(xiàn)死亡的幼蟲(chóng)或死亡的成蟲(chóng)；(iii)Fl致死：L1發(fā)育至成蟲(chóng)階段并仍然存活。該表 型不產(chǎn)生后代。這可能是由于不育、胚胎致死（孔底部有死亡的卵）、胚胎停滯或幼蟲(chóng)停滯 (最終致死）；(iv)牛長(zhǎng)停滯及牛長(zhǎng)阻滯/延遲：與包含ιΗ常發(fā)育和ιΗ常后代數(shù)的孔講行比 較。
[0276] 對(duì)于表1A中所示的靶序列來(lái)說(shuō)，所得結(jié)論為：在線蟲(chóng)（如秀麗隱桿線蟲(chóng)）中由 dsRNA介導(dǎo)的秀麗隱桿線蟲(chóng)靶基因沉默對(duì)線蟲(chóng)的生長(zhǎng)和存活具有重要影響。
[0277] 在上述dsRNA沉默實(shí)驗(yàn)之后，在24孔板中以高通量形式對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行更細(xì) 致的表型實(shí)驗(yàn)。按照如下步驟，用如上所述ΑΒ301-105ΦΕ3)細(xì)菌菌株中得到的dsRNA文庫(kù) 喂食24孔板中的秀麗隱桿線蟲(chóng)nuc-1 (el392)，具體如下：將nuc-Ι卵移至不同的板中，并 使其在20°C同時(shí)孵化從而使L1代同步化。然后，將100只同步化的L1線蟲(chóng)浸泡于500yL S完全喂食培養(yǎng)基（含有5 μ g/mL膽固醇、4 μ L/mL PEG和ImM IPTG)和包含秀麗隱桿線蟲(chóng) dsRNA文庫(kù)的0D_為1的500μ L ΑΒ301-105ΦΕ3)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的混合物中，所述文庫(kù) 中每個(gè)載體包含用于表達(dá)所述dsRNA的秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組片段。將被浸泡的L1線蟲(chóng)在 25°C滾動(dòng)孵育2小時(shí)。
[0278] 在離心并除去950 μ L上清液后，將所剩5 μ L經(jīng)重懸的沉淀（包含約10至15只 線蟲(chóng)）移至24孔板每個(gè)孔的中部，加入一層瓊脂LB液體培養(yǎng)基。將所接種的板在25°C孵 育2天。在成蟲(chóng)階段，挑出單只成蟲(chóng)并在25°C孵育2天用于檢查其后代。在最初的24孔板 上原位檢查其它線蟲(chóng)成蟲(chóng)。一式四份地進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。
[0279] 用另一批線蟲(chóng)重復(fù)上述細(xì)致的表型篩選，唯一的區(qū)別在于第二批線蟲(chóng)在20°C孵育 3天。
[0280] 對(duì)用秀麗隱桿線蟲(chóng)dsRNA喂食的線蟲(chóng)之表型以及用所述空載體喂食的秀麗隱桿 線蟲(chóng)nuc-1 (el392)之表型進(jìn)行比較。
[0281] 基于該實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)論為：如表1A中所示秀麗隱桿線蟲(chóng)靶基因的沉默對(duì)于線蟲(chóng)的 生長(zhǎng)和存活具有重要影響，所述靶基因?qū)τ诰€蟲(chóng)的存活是必需的。因此，這些基因是利用 dsRNA介導(dǎo)的基因沉默來(lái)防治（殺死或阻止其生長(zhǎng)）線蟲(chóng)的理想靶基因。因此，本發(fā)明包括 上述秀麗隱桿線蟲(chóng)靶基因的線蟲(chóng)直向同源物用于防治線蟲(chóng)侵害（例如線蟲(chóng)對(duì)植物的侵害） 的用途。
[0282] 實(shí)施例2 :鑒定黑腹果蠅的官系同源物
[0283] 如實(shí)施例1中所述，鑒定了許多秀麗隱桿線蟲(chóng)的致死序列，并且所述致死序列 可用于鑒定其它種屬中的直向同源物。例如，所述秀麗隱桿線蟲(chóng)致死序列可用于鑒定黑 腹果蠅的直向同源序列。也就是說(shuō)，可使用每種秀麗隱桿線蟲(chóng)序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)（例如 GenBank)中檢索黑腹果蠅的直向同源物。選擇具有高度序列同源性的（E值優(yōu)選小于或等 于1E-30)可能的黑腹果蠅直向同源物，所述序列是相blast的最佳命中結(jié)果，后者指來(lái)自 不同生物（例如秀麗隱桿線蟲(chóng)和黑腹果蠅）的序列相互為最佳blast命中結(jié)果。例如，使 用BLAST將來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)的序列C與黑腹果蠅的序列D進(jìn)行比對(duì)。如果黑腹果蠅序列 D是序列C的最佳命中結(jié)果，并且與秀麗隱桿線蟲(chóng)的所有序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)序列C也是D的最 佳命中結(jié)果，那么D和C是相互最佳命中結(jié)果。該標(biāo)準(zhǔn)常用于定義直系同源物，意指不同物 種中具有相似功能的相似序列。所鑒定的黑腹果蠅序列示于表1A。
[0284] 實(shí)施例 3 :馬鈴葉葉甲(Colorado potato beetle, CPB)
[0285] A.克隆來(lái)自馬鈴薯葉甲的部分基因序列
[0286] 按照制造商的說(shuō)明，使用 TRIzol 試劑（Cat. Nr. 15596-026/15596-018， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)從4個(gè)不同幼蟲(chóng)階段的馬鈴薯葉甲（科羅拉 多甲蟲(chóng)；來(lái)源：Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbusl62,6700AD Wageningen，the Netherlands)分離高質(zhì)量的完整 RNA。按照制造 商的說(shuō)明，通過(guò)DNA酶（Cat.Nr. 1700, Promega)處理除去該RNA制備物中的基因組DNA。 按照制造商的說(shuō)明，使用市售試劑盒（Superscript? III逆轉(zhuǎn)錄酶，Cat. Nr. 18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到 cDNA。
[0287] 為了分離包含 LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014、LD015、 LD016、LC018和LD027基因一部分的cDNA序列，使用簡(jiǎn)并引物并按照制造商的說(shuō)明使用 Amplitaq Gold (Cat. Nr. N8080240, Applied Biosystems)進(jìn)行一系列 PCR 反應(yīng)。
[0288] 表2-LD中給出了用于擴(kuò)增每種基因的簡(jiǎn)并引物序列，其顯示了包括引物序列和 所得cDNA序列的馬鈴薯葉甲靶基因。使用這些引物進(jìn)行各自的PCR反應(yīng)，其使用以下條件： 95°C 10分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)的95°C 30秒、55°C 1分鐘和72°C 1分鐘，然后是72°C 10分 鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR片段，對(duì)其進(jìn)行純化（QIAquick Gel Extraction kit, Cat. Nr. 28706, Qiagen)，將其克隆入 pCR8/GW/topo 載體（Cat. Nr. K250020, Invitrogen)并 測(cè)序。表2-LD中給出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR產(chǎn)物的序列，并且其為部分序列。 表3-LD中給出了用各自SEQ ID N0表示的相應(yīng)部分氨基酸序列，其中讀碼框的起點(diǎn)在括號(hào) 中指明。
[0289] B.產(chǎn)生馬鈴薯葉甲基因的dsRNA
[0290] 使用市售試劑盒 T7Ribomax? Express RNAi System (Cat. Nr. P1700, Promega)合 成毫克級(jí)的dsRNA。在兩個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)中得到最初兩種獨(dú)立的單個(gè)5'T7RNA聚合酶啟 動(dòng)子模板，每個(gè)反應(yīng)包含與T7啟動(dòng)子方向不同的靶序列。
[0291] 對(duì)于每種靶基因來(lái)說(shuō)，使用特異性T7正向引物和特異性反向引物得到有義T7模 板。表8-LD中給出了用于擴(kuò)增每種靶序列有義模板的各引物的序列。所述PCR反應(yīng)的條件 如下：95°C4分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)的95°C30秒、55°C30秒和72°C 1分鐘，然后是72°C 10 分鐘。在使用與上述相同條件的PCR反應(yīng)中使用特異性正向引物和特異性T7反向引物得 到反義T7模板。表8-LD中給出了用于擴(kuò)增每種靶基因反義模板的各引物的序列。在瓊脂 糖凝膠上分析所得的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)PCR純化試劑盒（Qiaquick PCR Purification Kit, Cat. Nr. 28106, Qiagen)以及NaC104沉淀進(jìn)行純化。按照制造商的說(shuō)明，將所得到的T7正 向和反向模板混合從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，將所得RNA鏈退火、進(jìn)行DNA酶和RNA酶處理并利用醋酸 鈉進(jìn)行純化。表8-LD中給出了每種靶基因所得dsRNA的有義鏈。表8-LD顯示了用于制備 馬鈴薯葉甲靶序列的dsRNA片段的序列和多聯(lián)體序列，其包括引物序列。
[0292] C.針對(duì)馬鈴薯葉甲的活性，使用人工飼料對(duì)dsRNA靶標(biāo)進(jìn)行篩選
[0293] 如下制備馬鈴薯葉甲的人工飼料（修改自Gelman et al. ,2001，J. Ins. Sc.， vol. 1，no. 7,1-10):對(duì)水和瓊脂進(jìn)行高壓滅菌，當(dāng)溫度降至55°C時(shí)加入其余的成分（如下 文表A中所示）。在此溫度下，均勻混合所述成分，然后將所述飼料以每孔lml的量等分至 24孔板（Nunc)。使所述人工飼料在室溫下冷卻而固化。飼料在4°C最多保存3周。
[0294] 表A :人工飼料的成分
[0295]

【權(quán)利要求】
1.分離的核苷酸序列，其包含選自以下的核酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158， 159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247， 249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515， 517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768， 773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890， 892,894,896,908tol040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077， 1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107， 1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617， 1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686， 1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055， 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338， 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471， 2476,2481或2486,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178， 183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089， 1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572， 1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647， 1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698， 1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085， 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364， 23613, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補(bǔ)序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178， 183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089， 1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572， 1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647， 1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698， 1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085， 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364， 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N049至 158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至 1040、 1161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460,或其互補(bǔ)序列。
2. 權(quán)利要求1的多核苷酸序列表達(dá)產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)攝 取所述核糖核苷酸序列抑制所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的生長(zhǎng)。
3. 權(quán)利要求2的核糖核苷酸序列，其中攝取所述序列抑制與所述序列基本上互補(bǔ)的核 苷酸序列的表達(dá)。
4. 包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的核糖核苷酸序列的組合物，其還包含至少一種佐劑以及 任選地至少一種表面活性劑。
5. 包含至少一種雙鏈RNA的組合物，其中一條鏈包含與選自權(quán)利要求1中所限定序列 的核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其還任選地包含至少一種適當(dāng)?shù)妮d體、賦 形劑或稀釋劑。
6. 用包含權(quán)利要求1中所限定核酸序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述核酸序列任選地 與調(diào)節(jié)序列有效連接。
7. 權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞或革蘭氏陰性 細(xì)菌細(xì)胞；或者其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞或藻類細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
10. 包含至少一種細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的組合物，所述細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞包含權(quán)利 要求1中所限定的至少一種多核苷酸。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述細(xì)菌或酵母細(xì)胞被滅活或被殺死，例如通過(guò)熱處 理或機(jī)械處理。
12. 包含表達(dá)至少一種雙鏈RNA的至少一種細(xì)菌或酵母細(xì)胞的組合物，其中所述雙鏈 RNA的一條鏈包含與選自權(quán)利要求1中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互補(bǔ)的核苷 酸序列，該組合物中還任選地包含至少一種適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑或稀釋劑。
13. 權(quán)利要求5或10至12中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物還包含至少一種選自以下的 殺蟲(chóng)劑：化學(xué)殺蟲(chóng)劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白、致病桿菌殺蟲(chóng)蛋白、光桿狀 菌殺蟲(chóng)蛋白、側(cè)孢芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白，所述殺蟲(chóng)劑具有對(duì)抗與權(quán) 利要求2中所限定的同樣的植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性，或者其中所述殺蟲(chóng)劑具有對(duì)抗一種或多 種其它植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性。
14. 權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種細(xì)菌或酵母細(xì)胞還包含 或還表達(dá)至少一種選自以下的殺蟲(chóng)劑：化學(xué)殺蟲(chóng)劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋 白、致病桿菌殺蟲(chóng)蛋白、光桿狀菌殺蟲(chóng)蛋白、側(cè)抱芽抱桿菌殺蟲(chóng)蛋白和球形芽抱桿菌殺蟲(chóng)蛋 白，所述殺蟲(chóng)劑具有對(duì)抗與權(quán)利要求2中所限定的同樣的植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性，或者其中 所述殺蟲(chóng)劑具有對(duì)抗一種或多種其它植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性。
15. 權(quán)利要求5或10至12中任一項(xiàng)的組合物，其還包含至少一種其它細(xì)菌或酵母細(xì) 胞，所述細(xì)胞包含或表達(dá)至少一種選自以下的殺蟲(chóng)劑：化學(xué)殺蟲(chóng)劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金 芽抱桿菌殺蟲(chóng)蛋白、致病桿菌殺蟲(chóng)蛋白、光桿狀菌殺蟲(chóng)蛋白、側(cè)抱芽抱桿菌殺蟲(chóng)蛋白和球形 芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白，所述殺蟲(chóng)劑具有對(duì)抗與權(quán)利要求2中所限定的同樣的植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的 活性，或者其中所述殺蟲(chóng)劑具有對(duì)抗一種或多種特定植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的活性。
16. 權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的組合物，其中所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白選自： Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元?dú)⑾x(chóng)蛋白 CryET33 和 CryET34、二元?dú)⑾x(chóng)蛋白 CryET80和CryET76、二元?dú)⑾x(chóng)蛋白TIC100和TIC101以及二元?dú)⑾x(chóng)蛋白PS14981。
17. 權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的組合物，其作為殺昆蟲(chóng)試劑。
18. 權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的組合物，其用作預(yù)防或治療人或動(dòng)物機(jī)體免受昆蟲(chóng)侵 害的藥物。
19. 包含權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的至少一種組合物的噴霧劑，其還任選地包含至少 一種佐劑和至少一種表面活性劑。
20. 包含權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)所限定組合物的用于害蟲(chóng)的外罩、陷阱或誘餌。
21. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20的 外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：馬鈴薯葉甲屬物種 (Leptinotarsa spp.)(例如，馬鈴薯葉甲（L.decemlineata)、偽馬鈴薯葉甲（L.juncta)或 胡頹子葉爺葉甲（L. texana))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互補(bǔ)序列，以 及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N049至158,或其互補(bǔ)序列。
22. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：猿葉甲屬物種 (Phaedon spp.)(例如，辣根猿葉甲（P.cochleariae))并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N0247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473， 478,483,488,493,498, 503, 508 至 512,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498， 503, 508至512,或其互補(bǔ)序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N0247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498， 503, 508至512,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0275至472,或其互補(bǔ)序列。
23. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：食植瓢蟲(chóng)屬 (Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢蟲(chóng)（E.varivetis))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互補(bǔ)序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0533至575,或其互補(bǔ)序列。
24. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：花象屬物種 (Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉鈴象（A. grandis))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互補(bǔ)序列， 以及 (iii)包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0621至767,或其互補(bǔ)序列。
25. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：擬谷盜屬物種 (Tribolium spp.)(例如，赤擬谷盜（T.castaneum))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互補(bǔ)序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0813至862,或其互補(bǔ)序列。
26. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20的 外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：瘤蚜屬物種（Myzus spp.)(例如，桃姆（Μ· persicae))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID 勵(lì)888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0888,890,892,894,896,908至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互補(bǔ)序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N0888,890,892,894,896,908至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0908至1040,或其互補(bǔ)序列。
27. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：褐飛虱屬物種 (Nilaparvata spp.)(例如，褐飛風(fēng)（N. lugens))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N01071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1822,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093, 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互補(bǔ)序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N01071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093, 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N01161至1571，或其互補(bǔ)序列。
28.權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20 的外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：禾草螟屬物種 (Chilo spp.)(例如，二化螟（C.suppressalis)、臺(tái)灣稻螟（C.auricilius)或稻多麗螟 (C. polychrysus))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090或2095,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090 或 2095,或其互補(bǔ) 序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090 或 2095,或其互補(bǔ) 序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N01730至2039,或其互補(bǔ)序列。
29. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20的外 罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：Plutella屬物種（例 如，菜蛾），并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N02100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354或2359,或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N02100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339,2344, 2349, 2354 或 2359， 或其互補(bǔ)序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N02100,2102,2104,2106,2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354 或2359,或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N02120至2338,或其互補(bǔ)序列。
30. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20的 外罩、陷阱或誘餌用于殺死昆蟲(chóng)或抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的用途，所述昆蟲(chóng)選自：Acheta屬物種（例 如，居屋艾幡（A. domesticus))，并且 -其中所述組合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述組合物中的細(xì)菌或酵母細(xì)胞包含或表達(dá)多核苷酸， 所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列： (i) 以下任意序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互補(bǔ)序列， (ii) 與如下表示的任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2364 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互補(bǔ)序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互補(bǔ)序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N02384至2460,或其互補(bǔ)序列。
31. 權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求19的噴霧劑或者權(quán)利要求20的外 罩、陷阱或誘餌在藥物或獸醫(yī)應(yīng)用中的用途。
32. 用于防止昆蟲(chóng)在植物上生長(zhǎng)或者防止昆蟲(chóng)侵害植物的方法，其包括將權(quán)利要求10 至18中任一項(xiàng)的組合物或者權(quán)利要求19的噴霧劑應(yīng)用到所述植物。
33. 提高產(chǎn)量的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要 求19的噴霧劑應(yīng)用到植物。
34. 權(quán)利要求32或33的方法，其中所述植物選自：苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆筍、鱷梨、 香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、蓖麻、胡蘿卜、木薯、花椰 菜、谷類、芹菜、櫻桃、柑桔、克萊門氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、桉樹(shù)、無(wú)花 果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、萊姆酸橙、松樹(shù)、玉米、芒果、甜瓜、 小米、蘑菇、燕麥、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹(shù)、番木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、豌 豆、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、 高粱、黃豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、橘子、茶樹(shù)、煙草、番茄、藤本植 物、西瓜、小麥、山藥以及西葫蘆。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32至34中任一項(xiàng)的方法，其中所述昆蟲(chóng)選自：馬鈴薯葉甲屬（例 如，馬鈴薯葉甲、偽馬鈴薯葉甲或胡頹子葉茄葉甲）、合爪負(fù)泥蟲(chóng)屬物種（Lema spp.) (例如，三條負(fù)泥蟲(chóng)（L. trilineata))、爺跳甲屬物種（Epitrix spp.)(例如，美國(guó)馬鈴 薯跳甲（E.cucumeris)、煙草跳甲（E.hirtipennis)或塊莖跳甲（E.tuberis))、豆芫菁 屬物種（Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁（E. vittata))、食植瓢蟲(chóng)屬物種（例如， 墨西哥豆瓢蟲(chóng)）、猿葉甲屬物種（例如，辣根猿葉甲）、褐飛虱屬物種（例如，褐飛虱）、 灰飛風(fēng)屬物種（Laodelphax spp.)(例如，灰飛風(fēng)（L.striatellus))、黑尾葉蝶屬物種 (Nephotettix spp.)(例如，二點(diǎn)黑尾葉蝶（N. virescens)，或黑尾葉蝶（N. cincticeps), 或二條黑尾葉蝶（N.nigropictus))、白背飛風(fēng)屬物種（Sogatella spp.)(例如，白背飛 風(fēng)（5.：1；\11'(^€6四)）、4(3116七3屬物種（例如，居屋艾幡）、桿長(zhǎng)蝽屬物種（131188118 8口口·） (例如，美洲谷桿長(zhǎng)蝽（B. leucopterus leucopterus))、黑蝽屬物種（Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽（S. vermidulate))、綠蝽屬物種（Acrosternum spp.)(例如，擬 綠蝽（A. hilare))、稻弄蝶屬物種（Parnara spp.)(例如，直紋稻弄蝶（P. guttata))、 禾草螟屬物種（例如，二化螟、臺(tái)灣稻螟或稻多麗螟（C. polychrysus))、禾草螟屬物種 (Chilotraea spp.)(例如，稻桿螟（C.polychrysa))Ji^夜蛾屬物種（Sesamia spp.) (例如，稻駐莖夜蛾（S. inf erens))、駐禾螟屬物種（Tryporyza spp.)(例如，白稻螟 (T.innotata)或三化螟（T.incertulas))、縱卷葉野螟屬物種（Cnaphalocrocis spp.) (例如，稻縱卷葉野螟（C. medinal i s))、潛蠅屬物種（Agromyza spp.)(例如，日本稻 潛蠅（A.oryzae)或玉米斑潛蠅（A.parvicornis))、桿草螟屬物種（Diatraea spp.) (例如，小鹿螟（D. saccharalis)或西南玉米桿草螟（D. grandiosella))、Narnaga屬 物種（例如，綠稻毛蟲(chóng)（N. aenescens))、黃夜蛾屬物種（Xanthodes spp.)(例如，犁 紋黃夜蛾（X. transversa))、灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)(例如，草地貪夜蛾 (S.frugiperda)、甜菜夜蛾（S.exigua)、?；页嵋苟辏⊿.littoralis)或西部黃條夜蛾 (S. praefica))、秘夜蛾屬物種（Mythimna spp.)(例如，粘蟲(chóng)（Mythmna(Pseudaletia) seperata))、鈴夜蛾屬物種（Helicoverpa spp.)(例如，谷實(shí)夜蛾（H.zea))、Colaspis 屬 物種（Colaspis spp.)(例如，葡萄肖葉甲（C.brunnea))、稻水象屬物種（Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲（L.oryzophilus))、稻象屬物種（Echinocnemus spp.)(例如，稻 象（E. squamos))、稻鐵甲屬物種（Diclodispa spp.)(例如，水稻鐵甲（D. armigera))、 禾谷負(fù)泥蟲(chóng)屬物種（Oulema spp.)(例如，水稻負(fù)泥蟲(chóng)（0. oryzae))、米象屬物種 (Sitophilus spp.)(例如，米象（S. oryzae))、Pachydiplosis 屬物種（例如，稻癭蚊 (P.oryzae))、毛眼水蠅屬物種（Hydrellia spp.)(例如，麥葉毛眼水蠅（H.griseola)或 日稻毛眼水蠅（H. sasakii))、Chlorops屬物種（例如，稻桿潛蠅（C. oryzae))、根螢葉甲 屬物種（Diabrotica spp.)(例如，玉米根葉甲（D.virgifera virgifera)、北美玉米根 葉甲（D. barberi)、黃瓜十一星葉甲食根亞種（D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉 米根葉甲（D.virgifera zeae)、條紋黃瓜葉甲（D.balteata))、桿野螟屬物種（Ostrinia spp.)(例如，玉米螟（0. nubilalis))、地虎屬物種（Agrotis spp.)(例如，小地老虎 (A. ipsilon))、Elasmopalpus屬物種（例如，南美玉米苗斑螟（E. lignosellus))、梳爪叩 頭蟲(chóng)屬（Melanotus spp.)(線蟲(chóng)）、圓頭犀金龜屬（Cyclocephala spp.)(例如，北部偽裝 金龜（C. borealis)或南部偽裝金龜（C. immaculata))、弧麗金龜屬物種（Popillia spp.) (例如，日本弧麗金龜（P. japonica))、跳甲屬物種（Chaetocnema spp.)(例如，玉米銅色跳 甲（C.pulicaria))、龍頸象屬物種（Sphenophorus spp.)(例如，玉米長(zhǎng)_象（S.maidis))、 溢管姆屬物種（Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米姆（R.maidis))、圓尾姆屬（Anuraphis spp.)(例如，玉米根姆（A.maidiradicis))、黑幢屬物種（Melanoplus spp.)(例如，紅足 黑蟲(chóng)皇（M.femurrubrum))、特異黑幢（M.differentialis)或遷飛黑幢（M.sanguinipes))、 種蠅屬物種（Hylemya spp.)(例如，種蠅（H. platura))、呆薊馬屬物種（Anaphothrips spp.)(例如，黃呆薊馬（A. obscrurus))、火蟻屬物種（Solenopsis spp.)(例如，盜 蟻（S. milesta))、葉螨屬物種（Tetranychus spp.)(例如，二點(diǎn)葉螨（T. urticae)、朱 砂葉螨（T. cinnabarinus)、鈴夜蛾屬物種（例如，谷實(shí)夜蛾或棉鈴蟲(chóng)（H. armigera))、 Pectinophora屬物種（例如，紅鈴麥蛾（P.gossypiella))、金剛鉆屬物種（Earias spp.) (例如，翠紋鉆夜蛾（E. vittella))、實(shí)夜蛾屬物種（Heliothis spp.)(例如，煙芽夜蛾 (H.virescens))、花象屬物種（Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉鈴象（A.grandis))、 Pseudatomoscelis屬物種（例如，棉偽斑腿盲蝽（P. seriatus))、結(jié)翅粉風(fēng)屬物種 (Trialeurodes spp.)(例如，結(jié)翅粉風(fēng)（T. abutiloneus)、溫室粉風(fēng)（T. vaporariorum))、 小粉風(fēng)屬物種（Bemisia spp.)(例如，銀葉粉風(fēng)（B. argentifolii))、姆屬物種（Aphis spp.)(例如，棉姆（A. gossypii))、草盲蝽屬物種（Lygus spp.)(例如，美國(guó)牧草盲蝽 (L· lineolaris)或美洲牧草盲蝽（L. hesperus))、美洲蝽屬物種（Euschistus spp.) (例如，斑點(diǎn)美洲蝽（Ε· conspersus))、Chlorochroa屬物種（例如，賽氏蝽（C. sayi))、 綠蝽屬物種（Nezara spp.)(例如，稻綠蝽（N.viridula))、薊馬屬物種（Thrips spp.) (例如，煙薊馬（T.tabaci))、花薊馬屬物種（Frankliniella spp.)(例如，煙褐薊馬 (F.fusca)或西方花薊馬（F.occidentalis))、綠小葉蝶屬物種（Empoasca spp.)(例如， 蠶豆小綠葉蝶（E.fabae))、瘤姆屬物種（Myzus spp.)(例如，桃姆（M.persicae))、薯個(gè) 木風(fēng)屬物種（Paratrioza spp.)(例如，馬鈴薯木風(fēng)（P. cockerelli))、寬胸金針蟲(chóng)屬物 種（Conoderus spp.)(例如，南部馬鈴薯線蟲(chóng)（C.falli)或煙草線蟲(chóng)（C.vespertinus))、 麥蛾屬物種（Phthorimaea spp.)(例如，馬鈴薯麥蛾（P. operculella))、長(zhǎng)管姆屬物種 (Macrosiphum spp.)(例如，大戟長(zhǎng)管姆（M. euphorbiae))、Thyanta 屬物種（例如，紅 肩蝽象（1'.?&111(1〇^1^1^))、麥蛾屬物種（例如，馬鈴薯麥蛾）、鈴夜蛾屬物種（例如，谷 實(shí)夜蛾）、Keiferia屬物種（例如，番爺蠹蛾）、金針蟲(chóng)屬物種（Limonius spp.)(線蟲(chóng)）、 Manduca屬物種（例如，煙草天蛾（M. sexta)或番爺天蛾（M. quinquemaculata))、斑潛蠅 屬物種（Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潛蠅（L. sativae)、三葉草斑潛蠅（L. trifolli) 或南美斑潛蠅（L.huidobrensis))、果蠅屬物種（Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蠅 (D. melanogaster)、D. yakuba、擬暗果妮（D. pseudoobscura)或擬果妮（D. simulans))、 步甲屬物種（Carabus spp.)(例如，粒步甲（C.granulatus))、搖蚊屬物種（Chironomus spp.)(例如，搖蚊（C. tentanus))、柿首蚤屬物種（Ctenocephalides spp.)(例如，貓柿首 蚤（C.felis))、非耳_象屬物種（Diaprepes spp.)(例如，根象鼻蟲(chóng)（D.abbreviatus))、 齒小蠹屬物種（Ips spp.)(例如，美松齒小蠹（I.pini))、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)(例如，赤擬谷盜（Τ· castaneum))、舌蠅屬物種（Glossina spp.)(例如，刺舌蠅 (G.morsitans))、按蚊屬物種（Anopheles spp.)(例如，甘比亞按蚊（A.gambiae))、鈴夜蛾 屬物種（例如，棉鈴蟲(chóng)（H. armigera))、Acyrthosiphon屬物種（例如，豌豆蟲(chóng)牙（A. pisum))、 蜜蜂屬物種（Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂（A.melifera))、Homalodisca屬物種（例如， 琉璃葉蝶（H. coagulate))、伊蚊屬物種（Aedes spp.)(例如，埃及斑紋（Ae. aegypti))、蠶 蛾屬物種（Bombyx spp.)(例如，家蠶（B.mori))、飛幢屬物種（Locusta spp.)(例如，飛 幢（L.migratoria))、牛蝶屬物種（Boophilus spp.)(例如，微小牛蝶（B.microplus))、 Acanthoscurria屬物種（例如，紅毛巧克力捕鳥(niǎo)蛛（A. gomesiana))、甲蠊屬物種 (Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊（D.punctata))、袖蝶屬物種（Heliconius spp.) (例如，瓦氏袖蝶（H.erato)或詩(shī)神袖蝶（H.melpomene))、象蟲(chóng)屬物種（Curculio spp.) (例如，歐洲櫟象（C. glandium))、Plutella屬物種（例如，菜蛾（P. xylostella))、花 蝶屬物種（Amblyomma spp.)(例如，彩飾花蝶（A.variegatum))、作蠶屬物種（Anteraea spp.)(例如，天蠶（A. yamamai))和阿蚊屬物種（Armigeres spp.)(例如，騷擾阿蚊 (A. subalbatus)) 〇
36. 用于防止昆蟲(chóng)在基層上生長(zhǎng)的方法，其包括將權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)的組合物 或權(quán)利要求19的噴霧劑應(yīng)用到所述基層。
37. 用于治療和/或預(yù)防由靶生物導(dǎo)致的疾病或病癥的方法，其包括將權(quán)利要求10至 18中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求19的噴霧劑施用于有此治療和/或預(yù)防需要的對(duì)象。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104087577SQ201410305513
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2007年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2006年1月12日
【發(fā)明者】羅曼·雷馬克斯, 勞倫特·庫(kù)布勒, 格特·普萊廷克, 埃爾絲·萬(wàn)布勒, 蒂埃里·博蓋爾特 申請(qǐng)人:德福根有限公司